CN116773790B - 一种肿瘤组织her2梯度检测产品的制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物病理检测领域，具体公开了一种肿瘤组织HER2梯度检测产品的制备方法和应用。本发明用于染色对照区的PDX/PDTX肿瘤活组织样本均通过全外显子测序基因拷贝数变异、转录组测序初步筛选，再由苏木精‑伊红染色、免疫组织化学染色确定，并且最终经过荧光原位杂交验证，质控标准统一。PDX/PDTX肿瘤活组织对照可真实展示组织结构，能够区分出待测组织样本的特异性和非特异性染色，展示出抗体的特异性及灵敏度，可用于监测HER2抗体的免疫组化染色性能；对照区PDX/PDTX肿瘤活组织来源和形状稳定，染色质量稳定，可以长期保存；本检测产品不仅可用于监控免疫组化实验过程，还可以辅助判读病理结果。

Description

一种肿瘤组织HER2梯度检测产品的制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物病理检测领域，尤其是涉及一种肿瘤组织HER2梯度检测产品的制备方法和应用，尤其涉及到肿瘤组织HER2梯度检测产品在检测HER2个体化半定量病理的应用。
背景技术
随着基础研究和临床医学的迅速发展，越来越多的参与肿瘤发生、发展和影响预后的分子标志物被相继发现。生物标志物通常是指能被客观测量和评价，反映生理或病理过程，以及对暴露或治疗干预措施产生生物学效应的指标。生物标志物多来源于人体组织或体液，可涵盖生理、生化、免疫、细胞和分子等水平的改变。在肿瘤领域，生物标志物通常是由肿瘤细胞或非肿瘤细胞产生的、反映体内肿瘤细胞或非肿瘤细胞存在和变化的生物学物质，这是生物标志物的物质性。生物标志物还有它的计量性，即它是可以计量的。这种计量的变化紧密地与人体的生理条件，疾病发生和发展，健康状态等相关。可包括基因变异、蛋白受体异常表达或血液成分的变化等。因此，生物标志物的检测可广泛地应用于病人的筛查、诊断、临床研究、指导用药、预后等领域。
生物标志物的种类繁多，涵盖生理、生化、免疫、细胞和分子等水平的改变，其临床价值各不相同，例如HER2，约20-30%的乳腺癌患者存在HER2基因的扩增和蛋白质过表达。HER2阳性乳腺癌具有恶性程度高、易复发、易转移等特点，因此HER2是乳腺癌病理亚型和预后性生物标志物，也是抗 HER2单克隆抗体的预测性生物标志物。
大量的研究已经证实了HER2阳性对于肿瘤患者具有重要的临床价值，近年来也提出了“HER2低表达”的概念，即IHC 1+或IHC 2+/ISH-，S.Modi等公布了Enhertu（trastuzumab deruxtecan）的关键3期DESTINY-Breast04试验（NCT03734029）的详细阳性结果显示：在先前接受过治疗的HER2低表达、不可切除性和/或转移性乳腺癌患者中，Enhertu治疗使其无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）取得了统计学显著和临床意义的改善，说明HER2低表达的准确识别对于肿瘤精准治疗具有重要作用。因此，明确HER2状态具有极其重要的临床意义，相关检测的使用率、准确率也受到了高度重视。
现有HER2检测试剂盒/HER2四合一病理质控片多采用细胞系作为对照样本，主要是HER2不同表达水平的细胞团，但对照样本的生物学特征一致性不稳定，样本来源受限，通常难以追溯样本来源和实现可持续供应。细胞系来源的对照样本仅为肿瘤细胞，非肿瘤组织，因而缺失肿瘤组织的微环境，不能体现真实的组织结构。更重要的是，临床上进行免疫组化染色的待测样本为肿瘤组织，并非肿瘤细胞，利用细胞系来源的对照无法区分非特异性染色。现有分子标志物检测的对照样本和待检样本分别贴附于不同的玻片表面，免疫组化染色条件和过程不同步，对照阅片过程中需要更换玻片和显微镜重新对焦，操作繁琐，且染色结果由病理医师主观阅片判读，而不同病理医师对于免疫组化染色强度的判断尺度，存在主观上的异质性，如果是由实验系统误差导致的免疫组化染色强度有所增减，临床病理医师在阅片判读时更是无从识别。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种肿瘤组织HER2梯度检测产品的制备方法和应用，尤其涉及到肿瘤组织HER2梯度检测产品在检测HER2个体化半定量病理的应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
第一目的，本发明提供了一种肿瘤组织HER2梯度检测产品的制备方法，包括以下步骤：
1）根据HER2对应的全基因组测序（WES）基因拷贝数变异信息及RNA-seq蛋白表达特征，通过PDX/PDTX肿瘤活组织数据库中存储的样本不同基因拷贝数变异信息及蛋白表达情况初步筛选出符合特征要求的PDX/PDTX肿瘤活组织样本；
2）将步骤1）获得的PDX/PDTX肿瘤活组织样本进行取样，获得组织块，固定组织块，制得蜡块，将所述蜡块进行病理检测，首先进行HE染色，剔除掉肿瘤细胞比例＜30%及坏死比例＞20%的样本；然后进行IHC染色，在显微镜下观察PDX/PDTX肿瘤活组织样本的HER2表达水平是否符合筛选要求，最后进行FISH检测，根据HER2对应的FISH信息特征筛选HER2免疫组化染色梯度为0、1+、2+、3+的最优的PDX/PDTX肿瘤活组织样本；
3）利用PDX/PDTX技术对步骤2）获得的HER2不同染色梯度的肿瘤组织样本进行建模复苏和扩增，获得扩增的肿瘤组织，进行病理复测和FISH复测，确定最优的HER2不同染色梯度0、1+、2+、3+的PDX/PDTX肿瘤活组织样本；
4）用组织芯片阵列仪分别取不同HER2表达的组织柱，放入预铸蜡块，制备受体蜡块；
5）将步骤4）制得的受体蜡块进行连续切片，将切片贴于打印好标签的粘附性载玻片上的染色对照区，由上至下分别是HER2染色梯度为0、HER2染色梯度为1+、HER2染色梯度为2+及HER2染色梯度为3+的组织切片，自然晾干，制得肿瘤组织HER2梯度检测产品。
本发明肿瘤组织HER2梯度检测产品的制备方法具备统一的质控标准，染色质量稳定；制成的检测产品密封后可以常温长期保存；对照PDX/PDTX肿瘤活组织来源充足，可持续生产供应；在检测过程中与待测组织同步进行免疫组化染色，方便病理医师阅片，更易甄别染色强度的差异。本发明检测产品制作过程标准化，耗时少且减少了人力，大大减轻了临床工作人员的工作量。
作为本发明所述肿瘤组织HER2梯度检测产品的制备方法的优选实施方式，HER2染色梯度为0的PDX/PDTX肿瘤活组织样本对应的基因拷贝数变异为1~2；HER2染色梯度为1+的PDX/PDTX肿瘤活组织样本对应的基因拷贝数变异为1~4；HER2染色梯度为2+的PDX/PDTX肿瘤活组织样本对应的基因拷贝数变异为1~30；HER2染色梯度为3+的PDX/PDTX肿瘤活组织样本对应的基因拷贝数变异大于30。
即：
HER2染色梯度为0的PDX/PDTX肿瘤活组织样本对应的RNA-seq 的TPM归一化值在0~4之间；HER2染色梯度为1+的PDX/PDTX肿瘤活组织样本对应的RNA-seq 的TPM归一化值4~8之间；HER2染色梯度为2+的PDX/PDTX肿瘤活组织样本对应的RNA-seq 的TPM归一化值在8~50之间；HER2染色梯度为3+的PDX/PDTX肿瘤活组织样本对应的RNA-seq 的TPM归一化值为大于50。
即：
HER2染色梯度为0的PDX/PDTX肿瘤活组织样本对应的FISH信息特征中的HER2/CEP17 *比值为～1.20；
HER2染色梯度为1+的PDX/PDTX肿瘤活组织样本对应的FISH信息特征中的HER2/CEP17 *比值为～1.24；
HER2染色梯度为2+的PDX/PDTX肿瘤活组织样本对应的FISH信息特征中的HER2/CEP17 *比值为～7.00；
HER2染色梯度为3+的PDX/PDTX肿瘤活组织样本对应的FISH信息特征中的HER2/CEP17 *比值为～20.0。
作为本发明所述肿瘤组织HER2梯度检测产品的制备方法的优选实施方式，所述步骤2）中将所述蜡块进行FISH检测，包括以下步骤：
a）将所述蜡块切片、烤片、脱蜡、复水、水处理、洗涤、蛋白酶K处理、洗涤和脱水，获得组织切片；
b）取双色探针，滴于步骤a）获得的组织切片的杂交区域进行变性杂交，然后复染，观察HER2不同染色梯度PDX/PDTX肿瘤活组织样本的FISH检测结果。
作为本发明所述肿瘤组织HER2梯度检测产品的制备方法的优选实施方式，所述变性的温度为83℃，变性的时间为5min；所述杂交的温度为42℃，所述杂交的时间为2~16h。
作为本发明所述肿瘤组织HER2梯度检测产品的制备方法的优选实施方式，所述步骤5）中待测组织样本与所述染色对照区的PDX/PDTX肿瘤活组织样本同步染色。
对照PDX/PDTX肿瘤活组织与待测组织同步染色，为组织之间进行比对，可以识别出特异性染色和非特异性染色，病理医师可以根据组织形态学特点准确定位，与背景对比，辅助诊断阅片。
作为本发明所述肿瘤组织HER2梯度检测产品的制备方法的优选实施方式，所述步骤3）中，建模复苏和扩增的具体步骤包括：对步骤2）获得的HER2不同染色梯度的PDX/PDTX肿瘤活组织样本剪切，接种至小鼠，待P0代的小鼠的移植肿瘤生长体积累积至500~2000mm3，解剖取出并剪切接种至P1代的小鼠，待P1代的小鼠的移植肿瘤生长体积累积至500~2000mm3，解剖取出作为备选对照区样本。
PDX/PDTX异种移植技术已被国内外公认为最理想的模拟人源肿瘤的药效学检测模型，PDX/PDTX技术直接将患者手术切除或活检的原代肿瘤组织移植到小鼠体内，肿瘤组织扩增后进行药效检测。移植的肿瘤组织包含肿瘤细胞、基质、成纤维细胞和微血管，完整保留了原始肿瘤的三维结构、异质性及肿瘤微环境，是目前最理想的模拟人源肿瘤的药效检测模型。本发明通过PDX/PDTX技术构建肿瘤活组织数据库，将HER2稳定表达（包括0、1+、2+、3+）的肿瘤活组织样本进行石蜡包埋并用于制备检测产品，阴性/阳性对照组织来源质量可靠，且可持续生产供应。
本发明通过人源性肿瘤组织异种移植（PDX/PDTX，patient derived xenograft/patient derived tumor xenograft）技术将从真实病人取材的肿瘤组织制成石蜡切片，染色结果与真实病人组织无异。检测产品为真实病人不同程度HER2表达的肿瘤样本接种小鼠后生成的异种移植瘤石蜡组织切片。
对照PDX/PDTX肿瘤活组织样本来源充足，可持续生产供应，因取材于PDX/PDTX肿瘤活组织数据库中存储的PDX/PDTX肿瘤活样本，方便获取其HER2表达情况，可以迅速筛选出合适的PDX/PDTX肿瘤活组织制作出相应的对照组织切片。
作为本发明所述肿瘤组织HER2梯度检测产品的制备方法的优选实施方式，所述步骤3）中，IHC染色包括烤片、脱蜡和水化、抗原修复、封闭、一抗孵育、二抗孵育、显色、复染和封片。
作为本发明所述免疫组化染色梯度检测产品的制备方法的优选实施方式，所组织样本的大小为1.5cm×1.5cm×0.5cm。
每个对照组织点体积小，库存蜡块的损耗少；染色对照区的组织面积小，与待测组织之间有清楚的界限，不影响待测组织的染色。
本发明还提供了上述制备方法制备得到的肿瘤组织HER2梯度检测产品，所述肿瘤组织HER2梯度检测产品基于PDX/PDTX肿瘤活组织生物样本库和数据库。
本发明还提供了上述肿瘤组织HER2梯度检测产品在检测HER2个体化半定量病理的应用。
作为本发明所述应用的优选实施方式，取出肿瘤组织HER2梯度检测产品，将待测组织切片后，贴片于肿瘤组织HER2梯度检测产品的组织贴片区，然后对待测组织进行染色，对照染色对照区的染色结果进行待测组织的结果判读。
本发明肿瘤组织HER2梯度检测产品上对照区的组织取材于肿瘤活组织生物样本库中的PDX/PDTX肿瘤组织，即利用人源肿瘤异种移植（Patient derived xenograft/Patient derived tumor xenograft，PDX/PDTX）技术——将病人的肿瘤组织移植到免疫缺陷的小鼠身上进行扩增传代而获得的肿瘤组织。国外已有大量研究证实了PDX/PDTX肿瘤组织能够很好地保留原代肿瘤组织包括组织病理特征、肿瘤微环境、基因组学信息等在内的生物学特征。本发明同样验证了PDX/PDTX肿瘤活组织生物样本库中存储的原代肿瘤和PDX/PDTX肿瘤组织的生物学特征一致性、基因组学一致性和组织病理学一致性。
本发明基于普恩瑞自建的PDX/PDTX肿瘤活组织生物样本库和数据库，并利用基因拷贝数变异（Copy number variations，CNV）和转录组测序技术（RNA-seq）等分子技术，以及HE染色、IHC染色、荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）等病理技术，制备标准化、质量稳定可靠、可持续供应的以PDX/PDTX肿瘤活组织样本为对照的肿瘤组织HER2梯度检测产品，填补了国内外相关领域的空白，该产品可辅助分子标志物表达结果的精准判读，减小不同医院、不同医生之间的主观判读误差，可进一步提高HER2识别判读的特异性及准确度。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述待测组织切片的厚度为4μm。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述产品包括试剂盒或质控片。
本发明提供了一种肿瘤组织HER2梯度检测产品的制备方法和应用，本发明通过PDX/PDTX技术构建肿瘤活组织数据库，将HER2稳定表达（包括0、1+、2+、3+）的PDX/PDTX肿瘤活组织样本进行石蜡包埋并用于制备检测产品，阴性/阳性对照组织来源质量可靠，且可持续生产供应。用于染色对照区的组织样本均通过基因拷贝数变异、荧光原位杂交初步筛选，再由HE染色、免疫组织化学染色确定，并且最终经过荧光原位杂交验证，质控标准统一。对照PDX/PDTX肿瘤活组织可真实展示组织结构，能够区分出待测组织样本的特异性和非特异性染色，很好地展示抗体的特异性及灵敏度，在病理判读方面可以提供更多的信息，不仅可用于监控免疫组化实验过程，还可以辅助判读病理结果，具有十分重要的临床应用价值；对照组织来源和性状稳定，染色质量稳定，可以长期保存；在检测过程中对照组织与待测组织同步进行免疫组化染色，本产品可根据染色强度和定位判断免疫组织化学实验流程中是否出现失误导致染色结果不可信，同时还拥有形态学特征，将对病理医师最终结果的判读有积极的参考和对比意义。
附图说明
图1为实施例1的FISH染色样图；
图2为实施例2的FISH染色样图；
图3为肿瘤组织HER2梯度检测产品的结构图；
图4为采用免疫组化检测HER2不同表达的PDX/PDTX肿瘤活组织的结果图（圆图1:100，方图 1:200）；
图5为采用肿瘤组织HER2梯度检测产品制备流程图；
图6为实施例4的肿瘤组织HER2梯度检测产品应用于HER2个体化半定量病理检测结果图；
图7为批号202106003实时稳定性研究部分结果（圆图100×，方图200×）；
图8为批号202106004开封稳定性研究部分结果（圆图100×，方图200×）；
图9为批号202106001运输稳定性研究部分结果（圆图100×，方图200×）。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、肿瘤组织HER2梯度检测产品组织的初步筛选
本实施例提供了肿瘤组织HER2梯度检测产品组织的初步筛选：
1）筛选数据库HER2的CNV与RNA-seq结果：
根据HER2对应的基因拷贝数变异（Copy number variations，CNV）及转录组测序(RNA-seq)信息特征，通过普恩瑞自建的PDX/PDTX肿瘤活组织数据库中存储的样本测序信息初步筛选出符合特征要求的活组织样本，如表1-2所示。
表1CNV信息特征
表2RNA-seq信息特征
2）PDX/PDTX肿瘤活组织样本库中选择对应的冻存PDX/PDTX肿瘤活组织样本：
依据筛选出的样本编号和分组情况，按照每组5例进行分配，从PDX/PDTX肿瘤活组织数据库中提取保藏的低温（-196℃）冻存的PDX/PDTX肿瘤活组织样本，每份样本的取样体积8mm3，随后进行固定（中性福尔马林）和蜡块（石蜡包埋）制备。
3）HE染色
（a）将蜡块放入切片机的卡槽中，进行切片。切出4μm白片，移至45°C水浴至切片完全展片。
（b）展开后，将组织粘附于载玻片上。
（c）稍微干燥后即可烤片，一般在62°C左右烤片机烤片15-30min，特殊样本可延长烤片时间。
（d）烤片结束后，放入Leica ST5010自动染色机染色。
（e）Leica ST5010自动染色机染色的试剂顺序和染色时间如下：
表3 染色试剂顺序和时间
（f）染色后的切片，移至Leica CV5030封片机封片。
（g）显微镜下观察：剔除掉肿瘤细胞比例＜30%及坏死比例＞20%的样本。
4）免疫组化染色（IHC）
（a）组织切片：将步骤3）中的蜡块置于冷台上30min后，放在切片机上进行切片。先对蜡块进行修块：修块模式下，修块切片厚度可以调节至10μm，修切蜡块至组织全部暴露后，调整切片厚度为4μm左右，然后进行切片，切片必须保证完整、均匀、没有刀痕、无褶皱和开裂。
（b）展片：用毛笔轻轻挑起切片，用镊子移至摊片机中的水面中展开(温度45℃，将切片转移至摊片机水面的过程中，切片可以旋转但不可以翻转)。
（c）捞片：将展开的切片贴于载玻片上，捞片时右手持载玻片磨砂区，尽量避免切片和载玻片之间产生气泡。倾斜载玻片至45°使切片上多余的水流下。
（d）烤片：将载玻片置于烤片机上，62℃烘烤60min可以制成组织石蜡切片。
（e）脱蜡：烤片结束后，取出石蜡切片迅速转移至二甲苯中，二甲苯I5min→二甲苯II5min→二甲苯III5min。
（f）水化：从二甲苯中取出切片，沥干后转移至不同浓度梯度的乙醇中进行水化，无水乙醇I5min→无水乙醇II5min→95%乙醇5min→75%乙醇5min，结束后水洗。
（g）抗原修复：在染色缸里加入适量的抗原修复液进行热修复，煮沸后持续10min，待自然冷却后用PBS缓冲液冲洗3次，每次3min。
（h）封闭：切片甩干净多余的PBS缓冲液，加入内源性过氧化物酶封闭试剂，滴加100μl到组织上，37℃ 孵育10min，PBS缓冲液冲洗3次，每次3min。
（i）一抗孵育：切片甩干净多余的PBS缓冲液，加入100μl稀释过的HER2抗体，37℃孵育1h，PBS缓冲液冲洗3次，每次3min。
（j）二抗孵育：切片甩干净多余的PBS缓冲液，加入100μl二抗室温孵育20min，PBS缓冲液冲洗3次，每次3min。
（k）DAB显色：切片甩干净多余的PBS缓冲液，加入100μlDAB混合液（A液：B液=1:1）孵育5-8min，水洗终止显色。
（l）复染核：切片甩干净多余的液体，加入100μl的苏木素染液，20-60s(可根据实际调整染色时间)，流水冲洗5min。
（m）分化(根据苏木素性质选择是否需要)：切片浸入分化液中处理2-5s，迅速取出切片用自来水冲洗玻片5min。
（n）脱水、透明：将冲洗切片的水甩干，按下列顺序梯度乙醇脱水，75％乙醇： 5min→95％乙醇：5min→无水乙醇：5min，从无水乙醇中取出的切片放入二甲苯I：5min→二甲苯II：5min→二甲苯Ⅲ5min，进行透明处理。(该过程在通风橱中进行)
（o）中性树胶封片：取出切片摆放到通风橱中，在二甲苯挥发干之前滴加中性树胶，盖上盖玻片。(该过程在通风橱中进行)
（p）显微镜下观察：选出HER2评分分别为（0、1+、2+、3+）的组织。HE与IHC数据筛选如表4所示。
表4HE与IHC数据筛选记录表
5）FISH检测确定最优的目标样本：
对步骤4)中制备的蜡块进行FISH检测，根据HER2对应的FISH信息特征确定最优的目标样本。
该步骤采用基因扩增检测试剂盒（荧光原位杂交法）进行相关检测：
（a）相关试剂配置（表5）：
①20×SSC（柠檬酸钠缓冲液），pH 值为5.3±0；
表5
用800mL去离子水溶解上述试剂，室温下调节pH值至5.3±0.2，用去离子水定容至1L。高压蒸汽灭菌，2-8℃保存，保质期6个月，若试剂出现浑浊或污染则不能使用。
②2×SSC溶液，pH 值为7.0±0.2；
取100mL上述20×SSC，用 800mL去离子水稀释、混匀，室温下调节pH值至7.0±0.2，用去离子水定容至1L，2-8℃保存，保质期6个月，若试剂出现浑浊或污染则不能使用。
③乙醇溶液：70%乙醇、85%乙醇；
将700ml、850ml无水乙醇用去离子水分别稀释至1L，保质期6个月，若试剂出现浑浊或污染则不能使用。
④蛋白酶K工作液；
蛋白酶K储存液（20mg/mL）：称取0.1g蛋白酶K干粉溶于5mL 2×SSC（pH值7.0）溶液中，轻轻摇动，直至完全溶解，-20℃保存，保质期6个月。
蛋白酶K工作液（200μg/mL）：取0.8mL蛋白酶K储存液溶于80mL 2×SSC（pH值7.0）溶液中，混匀，现配现用。
⑤0.3%NP-40/0.4×SSC溶液（表6），pH值 7.0-7.5；
表6
加入150mL去离子水，混匀，室温下调节pH值至7.0-7.5，用去离子水定容至200mL，2-8℃保存，保质期6个月，若试剂出现浑浊或污染则不能使用。
⑥0.1%NP-40/0.2×SSC溶液（表7），pH值7.0±0.2；
表7
加入150mL去离子水，混匀，室温下调节pH值至7.0±0.2，用去离子水定容至200mL，2-8℃保存，保质期6个月，若试剂出现浑浊或污染则不能使用。
⑦二脒基苯基吲哚（DAPI）复染剂，请选用商品化的含有抗淬灭剂的DAPI复染剂。
⑧二甲苯。
（b）杂交前处理：
建议选择已知分子标志物基因扩增阳性和阴性的标本片作为外对照。
①切片制作：将步骤2）获得的PDX/PDTX肿瘤活组织样本经过中性福尔马林固定、石蜡包埋，切片，获得组织切片，组织切片置于干净的玻片上。
②烤片：将组织切片置于烤片机上65℃过夜烤片，老化切片。
③脱蜡：将组织切片浸于盛二甲苯的染缸中浸泡脱蜡10分钟，重复一次，然后立即浸入100%乙醇中洗涤5分钟。
④复水：室温下，将组织切片依次置于100%乙醇、85%乙醇、70%乙醇中各2分钟，随即浸入去离子水中3分钟，取出切片后用无绒纸巾沿组织周围吸去多余水分。
⑤水处理：95℃水浴下将组织切片浸泡于去离子水中30~40分钟（去离子水应用水浴预热）。
⑥洗涤：室温下，将组织切片浸泡于2×SSC溶液中漂洗两次，每次5分钟。
⑦蛋白酶K处理：将组织切片浸泡在蛋白酶K工作液中，37℃下处理5~30分钟。
⑧洗涤：室温下，将组织切片浸泡于2×SSC溶液中漂洗两次，每次5分钟。
⑨脱水：将组织切片依次置于70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇中各2分钟，取出后自然干燥。
（c）变性杂交：
以下操作需在暗室中进行。
①取出双色探针，混匀后短暂离心，取10μL滴于经过步骤（b）的组织切片杂交区域，立即盖上22mm×22mm的盖玻片，探针在盖玻片下应均匀展开，用橡皮胶封边。
②将切片置于杂交仪上，83℃共变性5分钟（杂交仪应提前预热至83℃），42℃杂交2-16小时。
（d）洗涤：
以下操作需在暗室中进行。
①取出步骤（c）变性杂交后的组织切片，移去盖玻片，立即将组织切片置于 67℃0.3%NP-40/0.4×SSC溶液中，振荡1~3秒、浸泡1~2分钟。
②室温下，将切片置于0.1%NP-40/2×SSC 溶液中，振荡1~3秒、浸泡1-2分钟。
③室温下，将切片置于70%乙醇中，浸泡1~3分钟；暗处自然干燥切片。
（e）复染：
以下操作需在暗室中进行。
将10~15μL的DAPI复染剂滴于经过步骤（d）的组织切片杂交区域，立即盖上盖切片暗处放置10~20分钟后，在荧光显微镜下选用合适的滤光片观察切片。
（f）FISH结果观察：
将复染后的组织切片置于荧光显微镜下，先在低倍物镜（10×）下确认乳腺癌细胞区域；转到 40×物镜下，找到一个细胞分布均匀的位置；在高倍物镜（60×、100×）下应选择细胞核大小一致、核边界完整、DAPI染色均一、细胞核无重叠、信号清晰的细胞，随机选取至少20个肿瘤细胞，计数细胞核中的橘红色和绿色信号。计算HER2/CEP17比值。
说明：HER2/CEP17基因双色探针，橘红色(R)信号为HER2基因，绿色(G)信号为CEP17探针。
① 水平质控：无基因扩增（～1.20 HER2/CEP17*比值）
② 1+ 水平质控：低水平基因扩增（～1.24 HER2/CEP17*比值）
③ 2+ 水平质控：基因扩增（～7.00 HER2/CEP17* 比值）
④ 3+ 水平质控：高水平基因扩增（～20.0 HER2/CEP17*比值）
HER2/CEP17 *比值是采用 FISH 法测得的三批检测产品的平均值。FISH染色样图如图1所示。
为了保证对照区PDX/PDTX肿瘤活组织样本的HER2检测有效性，根据HER2的生物学特征以及HE染色、IHC染色、FISH检测的实际情况，筛选出最优的PDX/PDTX肿瘤活组织样本（详见表8），然后按照步骤6）进行复苏和扩增。
表8 样本复苏及扩增前病理检测数据信息
6）PDX/PDTX肿瘤活组织建模复苏、扩增、取材
①将上述步骤3）经过FISH检测确认的PDX/PDTX肿瘤活组织（P0代）剪切为2×2×2mm3，接种到NCG小鼠背部皮下。
②接种后，每天观察动物状态，每周1次测量肿瘤体积大小并进行荷瘤小鼠体重称量，计算肿瘤体积V（mm3）= (a×b2)/2，a: 肿瘤长径，b: 肿瘤短径。
③待P0代移植肿瘤生长体积累积至500~2000mm3，解剖取出并剪切随机接种（P1代）到5只NCG小鼠背部皮下进行传代扩增。
④待P1代移植肿瘤生长体积累积至500~2000mm3，解剖取出并作为备选质控区样本进行石蜡包埋和切片制备。
实施例2、肿瘤组织HER2梯度检测产品PDX/PDTX肿瘤活组织的确定(HE染色、免疫组织化学染色法和荧光原位杂交法)
本实施例提供了HER2检测产品PDX/PDTX肿瘤活组织的确定：
1）组织固定：从经过实施例1获得的备选对照区样本加入10倍体积的10%中性甲醛溶液中，常温固定12-24h。
2）组织取材：将固定后的组织切成≤1.5cm×1.5cm×0.5cm的组织块，放入已打印标签的包埋盒中，放入组织脱水篮框中。
3）组织脱水：将组织依次浸入不同浓度梯度的乙醇中进行组织脱水：70%乙醇1h→80%乙醇2h→85%乙醇70min→95%乙醇1h→95%乙醇50min→无水乙醇1h→无水乙醇50min。
4）组织透明：将进行完梯度乙醇脱水的组织依次浸入到二甲苯中进行透明：二甲苯I 30min→二甲苯II 25min。
5）组织浸蜡：将进行组织透明后的组织浸入到已经融化的石蜡中进行组织浸蜡：石蜡I 1h→石蜡II 1h→石蜡III 1h。
6）组织包埋：将步骤5）获得的组织包埋在组织包埋机中进行。将融化的石蜡滴入少许至加热已经预热过的不锈钢包埋模具中，待底部石蜡稍微凝固后把组织放置于模具底部，调整组织的位置，轻压组织使组织在同一平面上，将包埋盒覆盖在模具上，继续注满蜡液，转移至提前预冷好的冷冻台上冷却30min，取下蜡块，并修去多余的石蜡。
7）通过HE染色复测，剔除掉肿瘤细胞比例＜30%及坏死比例＞20%的样本。
8）通过IHC染色复测，选出HER2评分分别为（0、1+、2+、3+）的组织。
9）通过FISH复测验证步骤7）和8）中的PDX/PDTX肿瘤活组织符合要求，确定用于制备检测产品的对照PDX/PDTX肿瘤活组织。
① 0 水平质控：无基因扩增（～1.20HER2/CEP17*比值）
② 1+ 水平质控：低水平基因扩增（～1.24 HER2/CEP17*比值）
③ 2+ 水平质控：基因扩增（～7.00HER2/CEP17* 比值）
④ 3+ 水平质控：高水平基因扩增（～20.0HER2/CEP17*比值）
* HER2/CEP17 比值是采用 FISH 法测得的三批检测产品的平均值。FISH染色样图如图2所示。
为了保证对照区PDX/PDTX肿瘤活组织样本的HER2检测有效性，对经过PDX/PDTX建模复苏和扩增后的肿瘤活组织进行病理复测和FISH复测，验证最优的PDX/PDTX肿瘤活组织样本（详见表9），然后按照实施例3步骤进行HER2检测试剂盒/质控片制备。
表9 样本复苏及扩增后病理检测数据信息
实施例3、一种肿瘤组织HER2梯度检测产品的制备方法
本发明提供了一种肿瘤组织HER2梯度检测产品的制备方法，包括以下步骤（参考图5）：
1）制备蜡块：用组织芯片阵列仪取出1mm的不同HER2表达的PDX/PDTX肿瘤活组织柱，放入预铸蜡块中，1列4个从上至下的分布。将带有组织的蜡块放入不锈钢底模，注意方向：切面朝下，置入70度烤箱30-60分钟，待蜡块完全透明，取出。组织包埋盒置于不锈钢模具上方，继续注蜡至盒底部完全浸入为宜，放置冷却。取出后在0表达组织处进行切角标记。
2）组织切片：将蜡块置于冷台上20分钟后，放在切片机上进行切片。先对蜡块进行修块：修块模式下，修块切片厚度可以调节至15-20μm，修切蜡块至的4个组织全部暴露后，调整切片厚度为4μm左右，然后进行切片，切片必须保证完整、均匀、没有刀痕、无褶皱和开裂。
3)展片：用毛笔轻轻挑起切片，用镊子移至摊片机中的水面中展开(温度45℃，将切片转移至摊片机水面的过程中，切片可以旋转但不可以翻转)。
4)捞片：将展开的切片贴于载玻片上，捞片时右手持载玻片磨砂区，尽量避免切片和载玻片之间产生气泡。倾斜载玻片至45°使切片上多余的水流下。
本实施例提供的肿瘤组织HER2梯度检测产品，包括玻片标签区，染色对照区和组织贴片区，玻片标签区含有用于标识具有对照的免疫组化载玻片所对应的目标抗体HER2的名称和产品型号；染色对照区固定有4种起对照作用的HER2染色梯度为0、HER2染色梯度为1+、HER2染色梯度为2+及HER2染色梯度为3+的PDX/PDTX肿瘤活组织样本；如图3所示，染色对照区由上至下分为独立的4块，依次为HER2染色梯度为0、HER2染色梯度为1+、HER2染色梯度为2+及HER2染色梯度为3+的染色对照区。当常规病例需要做免疫组化染色时，将待测样本的组织切片黏附在组织贴片区。
在一些具体的实施方式中，对照组织在免疫组化染色过程中与待测组织同步染色。染色对照区中表达HER2（0、1+、2+、3+）的组织均选自普恩瑞自建的肿瘤活组织数据库。
参考图4，采用免疫组化检测HER2不同表达的肿瘤组织的结果示例，a为HER2表达为0的肿瘤组织切片200倍物镜下观察结果，b为HER2表达为1+的肿瘤组织切片200倍物镜下观察结果，c为HER2表达为2+的肿瘤组织切片200倍物镜下观察结果，d为HER2表达为3+的肿瘤组织切片200倍物镜下观察结果。
实施例4、肿瘤组织HER2梯度检测产品应用于检测HER2个体化半定量病理检测
本实施例将肿瘤组织HER2梯度检测产品应用于检测HER2个体化半定量病理检测，具体步骤包括：
1）组织切片：将待检测组织蜡块置于冷台上20分钟后，放在切片机上进行切片。先对蜡块进行修块：修块模式下，修块切片厚度可以调节至15-20μm，修切蜡块至的组织最大面暴露后，调整切片厚度为4μm左右，然后进行切片，切片必须保证完整、均匀、没有刀痕、无褶皱和开裂。
2）展片：用毛笔轻轻挑起切片，用镊子移至摊片机中的水面中展开(温度45℃，将切片转移至摊片机水面的过程中，切片可以旋转但不可以翻转)。
3）捞片：将展开的切片贴于载玻片的检测区域上，捞片时右手持载玻片磨砂区，尽量避免切片和载玻片之间产生气泡。倾斜载玻片至45°使切片上多余的水流下。
4）烤片：将载玻片置于烤片机上，62℃烘烤60min可以制成组织石蜡切片。
5）脱蜡：烤片结束后，取出石蜡切片迅速转移至二甲苯中，二甲苯I 5min→二甲苯II 5min→二甲苯III 5min。
6）水化：从二甲苯中取出切片，沥干后转移至不同浓度梯度的乙醇中进行水化，无水乙醇I5min→无水乙醇II5min→95%乙醇5min→75%乙醇5min，结束后水洗。
7）抗原修复：在染色缸里加入适量的抗原修复液进行热修复，煮沸后持续10分钟，待自然冷却后用PBS缓冲液冲洗3次，每次3min。
8）封闭：切片甩干净多余的PBS缓冲液，加入内源性过氧化物酶封闭试剂，滴加100μl到组织上，37℃ 孵育10min，PBS缓冲液冲洗3次，每次3min。
9）一抗孵育：切片甩干净多余的PBS缓冲液，加入100μLHER2抗体，37℃孵育1h，PBS缓冲液冲洗3次，每次3min。
10）二抗孵育：切片甩干净多余的PBS缓冲液，加入100μL二抗室温孵育20min，PBS缓冲液冲洗3次，每次3min。
11）DAB显色：切片甩干净多余的PBS缓冲液，加入100μLDAB混合液（A液：B液=1:1）孵育5-8min，水洗终止显色。
12）复染核：切片甩干净多余的液体，加入100μL的苏木素染液，20-60s(可根据实际调整染色时间)，流水冲洗5min。
13）分化(根据苏木素性质选择是否需要)：切片浸入分化液中处理2-5s，迅速取出切片用自来水冲洗玻片5min。
14）脱水、透明：将冲洗切片的水甩干，按下列顺序梯度乙醇脱水，75％乙醇：5min→95％乙醇：5min→无水乙醇：5min，从无水乙醇中取出的切片放入二甲苯I：5min→二甲苯II：5min→二甲苯III：5min进行透明处理。(该过程在通风橱中进行)
15）中性树胶封片：取出切片摆放到通风橱中，在二甲苯挥发干之前滴加中性树胶，盖上盖玻片。(该过程在通风橱中进行)
16) 读片：在显微镜下观察染色结果。图6为免疫组化染色结果图。
本发明通过PDX/PDTX技术构建肿瘤活组织数据库，将HER2稳定表达（包括0、1+、2+、3+）的PDX/PDTX肿瘤活组织样本进行石蜡包埋并用于制备检测产品，阴性/阳性对照PDX/PDTX肿瘤活组织来源质量可靠，且可持续生产供应。
实施例5、肿瘤组织HER2梯度检测产品的稳定性试验研究
1）实时稳定性研究
实验方法：取三个不同批次的产品、每批次8盒，规格10片/盒，正常条件下保存。每个批次的产品分别在保存0个月、3个月、6个月、9个月、12个月、18个月、24个月、27个月时随机取出1盒用于实时稳定性检测。每盒随机取出3张检测片进行HER2免疫组化染色，在显微镜下观察染色结果。
实验结果：本产品在实时储存0个月、3个月、6个月、9个月、12个月、18个月、24个月、27个月后，染色结果稳定，呈现梯度显色。这说明本产品在实际储存条件下，可稳定保存24个月。
批号202106003实时稳定性研究部分结果（圆图100×，方图200×），参考图7。
2）开封稳定性研究
实验方法：取正常保存条件下在效期内的2盒产品，规格10片/盒。开封后置于试剂盒储存条件下保存。分别在开封0天、7天、14天、21天、28天、35天从盒中随机取出3张检测片，进行HER2免疫组化染色，在显微镜下观察染色结果。
实验结果：本产品在开封后储存0天、7天、14天、21天、28天、35天后，每张检测片HER2免疫组化染色稳定，均呈梯度显色。
批号202106004开封稳定性研究部分结果（圆图100×，方图200×），参考图8。
3）运输稳定性研究
实验方法：依据法规要求及产品本身的特性，特设定该产品运输稳定性研究主要考察运输途中机械保护条件（玻片盒）下检测片上组织的粘附性（是否发生脱落）及染色情况。不考虑运输温度的对产品的影响：本检测片为病理切片，其结构为经过甲醛固定及石蜡包埋的组织的病理切片贴于粘附载玻片上，石蜡融点为 58-60℃，目前国内运输温度达不到此极限温度，运输温度不会影响到切片的形态。
取常温保存条件下在效期内的1盒产品，规格10片/盒。将其放在转速60RPM的摇床上室温条件下（15~25℃）摇晃24小时，模拟运输状态的24小时。24小时后观察产品有无破损、脱片，并从盒中随机取出3张检测片，进行HER2免疫组化染色，在显微镜下观察染色结果。
实验结果：本产品在模拟运输24小时后，每张检测片组织未发生脱落现象，HER2免疫组化染色稳定，均呈梯度显色。
批号202106001运输稳定性研究部分结果（圆图100×，方图200×），参考图9。
本发明经HER2免疫组化染色确认HER2表达情况后，再进行切片、贴片到各组织对照点，阴性和不同程度的阳性PDX/PDTX肿瘤活组织都包含在内，染色结果更加可靠；对照组织点排列规整，方便病理医师阅片，更易甄别染色强度的差异，能够校正客观性的操作误差及判读主观性缺陷。
本发明提供的对照PDX/PDTX肿瘤活组织可真实展示组织结构，能够区分出待测组织样本的特异性和非特异性染色，很好地展示抗体的特异性及灵敏度；染色质量稳定，可以长期保存；在检测过程中与待测组织同步进行免疫组化染色，更易实现对每张切片的质控。对照PDX/PDTX肿瘤活组织样本来源充足，可持续生产供应，因取材于肿瘤活组织样本库中存储的石蜡样本，方便获取其HER2表达情况，可以迅速筛选出合适的组织制作出相应的对照组织切片。本发明检测产品的制作过程标准化，耗时少且减少了人力，大大减轻了临床工作人员的工作量。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (4)

1.一种肿瘤组织HER2梯度检测产品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）根据HER2对应的全基因组测序基因拷贝数变异信息及RNA-seq蛋白表达特征，通过PDTX肿瘤活组织数据库中存储的样本不同基因拷贝数变异信息及蛋白表达情况初步筛选出符合特征要求的PDTX肿瘤活组织样本；
2）将步骤1）获得的PDTX肿瘤活组织样本进行取样，获得组织块，固定组织块，制得蜡块，将所述蜡块进行病理检测，首先进行HE染色，剔除掉肿瘤细胞比例＜30%及坏死比例＞20%的样本；然后进行IHC染色，在显微镜下观察PDTX肿瘤活组织样本的HER2表达水平是否符合筛选要求，最后进行FISH检测，根据HER2对应的FISH信息特征筛选最优的PDTX肿瘤活组织样本；
步骤2）中将所述蜡块进行FISH检测，包括以下步骤：
a）将所述蜡块切片、烤片、脱蜡、复水、水处理、洗涤、蛋白酶K处理、洗涤和脱水，获得组织切片；
b）取双色探针，滴于步骤a）获得的组织切片的杂交区域进行变性杂交，所述变性的温度为83℃，变性的时间为5min；所述杂交的温度为42℃，所述杂交的时间为2~16h；然后复染，观察HER2不同染色梯度组织样本的FISH检测结果；
3）利用PDTX技术对步骤2）获得的HER2不同染色梯度的肿瘤活组织样本进行建模复苏和扩增，获得扩增的肿瘤组织，进行病理复测和FISH复测，筛选HER2不同染色梯度0、1+、2+、3+的PDTX肿瘤活组织样本；
HER2染色强度为0的PDTX肿瘤活组织样本对应的基因拷贝数变异为1~2；HER2染色强度为1+的PDTX肿瘤活组织样本对应的基因拷贝数变异为1~4；HER2染色强度为2+的PDTX肿瘤活组织样本对应的基因拷贝数变异为1~30；HER2染色强度为3+的PDTX肿瘤活组织样本对应的基因拷贝数变异大于30；
HER2染色梯度为0的PDTX肿瘤活组织样本对应的RNA-seq 的TPM归一化值在0~4之间；HER2染色梯度为1+的PDTX肿瘤活组织样本对应的RNA-seq 的TPM归一化值4~8之间；HER2染色梯度为2+的PDTX肿瘤活组织样本对应的RNA-seq 的TPM归一化值在8~50之间；HER2染色梯度为3+的PDTX肿瘤活组织样本对应的RNA-seq 的TPM归一化值为大于50；
HER2染色梯度为0的PDTX肿瘤活组织样本对应的FISH信息特征中的HER2/CEP17 比值为1.20；
HER2染色梯度为1+的PDTX肿瘤活组织样本对应的FISH信息特征中的HER2/CEP17 比值为1.24；
HER2染色梯度为2+的PDTX肿瘤活组织样本对应的FISH信息特征中的HER2/CEP17 比值为7.00；
HER2染色梯度为3+的PDTX肿瘤活组织样本对应的FISH信息特征中的HER2/CEP17 比值为20.0；
步骤3）中，建模复苏和扩增的具体步骤包括：对步骤2）获得的HER2不同染色梯度的PDTX肿瘤活肿瘤组织样本剪切，接种至小鼠，待P0代的小鼠的移植肿瘤生长体积累积至500~2000mm3，取出P0代的小鼠的肿瘤组织接种至P1代的小鼠，待P1代的小鼠的移植肿瘤生长体积累积至500~2000mm3，取出P1代的小鼠的肿瘤组织作为备选对照区样本；
步骤3）中，IHC染色包括烤片、脱蜡和水化、抗原修复、封闭、一抗孵育、二抗孵育、显色、复染和封片；
4）用组织芯片阵列仪分别取出不同HER2表达的PDTX肿瘤活组织柱，放入预铸蜡块，制备受体蜡块；
5）将步骤4）制得的受体蜡块进行连续切片，将切片的组织贴于打印好标签的粘附性载玻片上的染色对照区，由上至下分别是HER2染色强度为0、HER2染色强度为1+、HER2染色强度为2+及HER2染色强度为3+的组织切片，自然晾干，制得肿瘤组织HER2梯度检测产品；
步骤5）中，待测组织样本与所述染色对照区的PDTX肿瘤活组织样本同步染色。
2.如权利要求1所述的制备方法制备得到的肿瘤组织HER2梯度检测产品，其特征在于，所述肿瘤组织HER2梯度检测产品基于PDTX肿瘤活组织生物样本库和数据库。
3.如权利要求1所述的制备方法制备的肿瘤组织HER2梯度检测产品在检测HER2个体化半定量病理的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，取出肿瘤组织HER2梯度检测产品，将待测组织切片后，贴片于肿瘤组织HER2梯度检测产品的组织贴片区，然后对待测组织进行染色，对照染色对照区的染色结果进行待测组织的结果判读。
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