CN105699657B - 一种肾癌患者外周血Vimentin检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肾癌患者外周血Vimentin检测方法：利用膜过滤装置分离获得无法获取组织标本的晚期或复发肾癌患者外周血中的CTC，运用细胞蜡块技术制作薄层切片，进而检测Vimentin表达情况。通过该技术方法，不用取材肾癌组织即可检测到肾癌患者Vimentin表达情况。该技术属于微创甚至无创，并能够实时检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测Vimentin的新方法，尤其是通过外周血检测肾癌患者Vimentin的方法。
背景技术
波形蛋白(Vimentin)是一种重要的中间丝纤维蛋白，主要生物学功能为:维持细胞与细胞器形态、促进细胞粘附及移行、参与有丝分裂及细胞分化、创伤愈合、信号传导、移植免疫及细胞凋亡等。其主要在间叶组织中表达，可作为在组织病理学诊断中鉴别肿瘤细胞分化起源的特异性生物标记物。研究表明,Vimentin高表达与肾癌细胞的分化程度低、侵袭性强和易转移有密切关系，Vimentin可作为肾癌分期、分级及预后判断的指标，为肾癌术后靶向药物或细胞因子辅助治疗提供依据及治疗靶点，因此，正确检测肾癌患者的Vimentin表达至关重要。
目前通常使用的Vimentin检测方法有两种。一种是免疫组织化学方法，通过检测肾癌组织标本中的Vimentin蛋白表达情况判定Vimentin状态。另外一种方法是蛋白免疫印迹法(Western blot)，特异性更高，目前临床应用亦越来越多。这两种检测方法均是以肾癌组织为检测对象，尤其适用于肾癌行手术切除治疗的患者。但对于部分缺乏手术指征或存在手术禁忌症的肾癌患者(如晚期肾癌患者)，由于肿瘤组织无法切除，细针穿刺组织又容易造成肿瘤播散，Vimentin状态评估变得困难。
发明内容
循环肿瘤细胞(Circulating tumor cell，CTC)是从实体肿瘤脱落而进入外周血液循环的肿瘤细胞，它存在于肾癌、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤中，其检测对于评估肿瘤患者尤其是晚期肿瘤患者的预后以及选择合适的个体化治疗具有重要的临床意义。因CTC检测具有微创、实时等特点，被称为“液态活检”。
为了克服晚期肾癌患者不适宜组织标本取材，进而无法评估患者Vimentin状态的不足，本发明提供了一种肾癌患者外周血Vimentin检测方法：利用膜过滤装置分离获得无法获取组织标本的晚期或复发肾癌患者外周血中的CTC，运用细胞蜡块技术制作薄层切片，进而检测Vimentin表达情况。
本发明采用的技术方案如下：
一、利用膜过滤装置分离获得无法获取组织标本的晚期或复发肾癌患者外周血中的CTC：
1、采集晚期肾癌患者外周血：肘正中静脉5ml；
2、外周血样预处理：将采集的外周血样10倍稀释，稀释液成分：1mmol/l EDTA+0.1％BSA,稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定终浓度为0.25％；
3、利用膜过滤分离肿瘤细胞装置过滤外周血样，分离获得外周血循环肿瘤细胞：将预处理的外周血样加入到膜过滤分离肿瘤细胞装置的血样容器中，使其依靠重力自然过滤；
4、过滤结束后，从膜过滤分离肿瘤细胞装置中取下滤器，将循环肿瘤细胞染色液加入到滤器中，染色2min，PBS缓冲液冲洗干净，用精细镊子取下滤膜，放置在载玻片上，干燥后在显微镜下观察，确定是否存在CTC。
二、运用细胞蜡块技术制作薄层切片：
1、脱色：将上述载玻片上带有CTC的滤膜取下，置于脱色液中浸泡4-6小时，脱去CTC染色液，所述脱色液为：95％酒精与100％二甲苯按体积比1:1混匀。
2、包裹：浸泡结束后取出滤膜，用吸水纸包裹；
3、固定：将包裹物置于10％中性福尔马林中，固定4-6h；
4、浸蜡包埋：固定结束后取出包裹物，脱水后置于石蜡包埋盒中，浸蜡包埋制作细胞石蜡块；
5、薄层切片：用切片机将细胞石蜡块连续切片，制成厚度为4μm的薄层切片。
三、检测Vimentin表达情况：
1、薄层切片在染色缸中按以下步骤进行脱蜡和水化：二甲苯溶液浸泡3次，每次10分钟；无水乙醇溶液浸泡3次，每次5分钟；95％乙醇溶液浸泡5分钟；85％乙醇溶液浸泡5分钟；75％乙醇溶液浸泡5分钟；蒸馏水浸泡2次，每次3分钟；PBS(PH＝7.4)浸泡3次，每次3分钟；
2、采用柠檬酸缓冲液高温高压抗原修复法对组织抗原进行修复：取pH＝6.0柠檬酸盐缓冲液800-1500ml于压力锅中，大火加热直至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温不锈钢切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，锅盖继续加热至喷汽开始计时，1-2分钟后，压力锅离开热源，冷却至室温，取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用pH＝7.2-7.4的PBS冲洗两次，每次各3分钟；
3、3％H2O2去离子水孵育5分钟，以阻断内源性过氧化物酶，PBS冲洗3次，每次2分钟；
4、滴加Vimentin一抗，室温或37℃孵育1-2小时或4℃过夜，PBS冲洗3次，每次2分钟；
5、滴加通用型IgG抗体，室温或37℃孵育15分钟，PBS冲洗3次，每次2分钟；
6、应用DAB溶液显色：甩去PBS液，每张切片加2滴或100μl新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察3-10分钟；
7、蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明封片：蒸馏水冲洗2次，每次3分钟；苏木素复染1分钟；0.1％盐酸酒精分化；0.1％氨水返蓝；50％、70％、85％、95％、无水乙醇脱水干燥；二甲苯透明，中性树脂胶封片；
8、细胞病理学专家阅片，根据细胞着色程度判定Vimentin表达情况。
步骤中所述的膜过滤分离肿瘤细胞装置，包括滤器、血样容器、废液缸和铁架台，所述铁架台设有底座、立架和支架，所述血样容器通过支架设置于铁架台上部，血样容器的下方为滤器，滤器通过输液器联通至废液缸，废液缸设置于底座上。
所述滤器包括滤器上口、滤膜、载滤膜平台和滤器下口，滤膜置于载滤膜平台上；滤器上口接血样容器，滤器下口通过输液器接废液缸。
所述滤膜为疏水材料制成，其上均匀布满口径为10微米的滤孔。
本发明的有益效果是：通过该技术方法，不用取材肾癌组织即可检测到肾癌患者vimentin表达情况。该技术属于微创甚至无创，并能够实时检测。
附图说明
图1为本发明的膜过滤装置结构示意图；
图2为本发明膜过滤装置的滤器的结构示意剖视图；
图3为本发明膜过滤装置的滤器滤膜的结构示意图；
图4为晚期肾癌患者外周血分离获取的循环肿瘤细胞影像图；
图5为晚期肾癌患者外周血循环肿瘤细胞Vimentin免疫组化染色图像。
图中：1铁架台、2血样容器、3滤器、4输液器、5废液缸、6滤器上口、7滤膜、8载滤膜平台、9滤器下口、10滤孔、11底座、12立架、13支架。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
运用此技术方法分离获取并鉴定8例晚期肾癌患者(同时检测8例正常人样本做阴性对照)外周血循环肿瘤细胞的实施例。
一、利用膜过滤装置分离获得无法获取组织标本的晚期或复发肾癌患者外周血中的CTC：
采集各样本外周血5ml，用45ml稀释液(成分：1mmol/l EDTA+0.1％BSA)稀释外周血，然后加入3ml的4％多聚甲醛固定稀释后的血样10分钟。
在固定的间期，组装膜过滤装置：如附图1、图2、图3所示，该过滤装置由滤器3、滤膜7、血样容器2、废液缸5、铁架台1构成。
用10mlPBS润湿滤器3，然后将固定好的外周血样加入到膜过滤装置的血样容器2中，使其依靠重力自然过滤，CTC被截留在滤膜7上。
肿瘤细胞直径一般大于15微米，而血细胞(包括红细胞、白细胞)直径一般小于10微米，因此当含有CTC的外周血经过滤后，血细胞因直径小于滤孔能够被滤过，而CTC因直径大于滤孔被截留在滤膜上。
过滤结束后，从过滤装置中取下滤器3，打开并移走滤器上口6，将循环肿瘤细胞Diff染色液加入到滤器3中，染色2min。
PBS缓冲液将滤器3冲洗干净，用精细镊子取下滤膜7，细胞面朝上，放置在载玻片上。
将滤膜7适当干燥后在显微镜下观察,确定是否存在CTC。
检测结果：8例健康志愿者均未查到循环肿瘤细胞；4例晚期肾癌患者检测到循环肿瘤细胞(表1)。本次检测阳性率为50％。
二、运用细胞蜡块技术制作薄层切片：
1、脱色：将上述载玻片上带有CTC的滤膜7取下，置于脱色液中浸泡4-6小时，脱去CTC染色液，脱色液为：95％酒精与100％二甲苯按体积比1:1混匀。
2、包裹：浸泡结束后取出滤膜，用吸水纸包裹；
3、固定：将包裹物置于10％中性福尔马林中，固定4-6h；
4、浸蜡包埋：固定结束后取出包裹物，脱水后置于石蜡包埋盒中，浸蜡包埋制作细胞石蜡块；
5、薄层切片：用切片机将细胞石蜡块连续切片，制成厚度为4μm的薄层切片。
三、检测Vimentin表达情况：
1、将CTC蜡块薄层切片在染色缸中按以下步骤进行脱蜡和水化：二甲苯溶液浸泡3次，每次10分钟；无水乙醇溶液浸泡3次，每次5分钟；95％乙醇溶液浸泡5分钟；85％乙醇溶液浸泡5分钟；75％乙醇溶液浸泡5分钟；蒸馏水浸泡2次，每次3分钟；PBS(PH＝7.4)浸泡3次，每次3分钟；
2、采用柠檬酸缓冲液高温高压抗原修复法对组织抗原进行修复：取pH＝6.0柠檬酸盐缓冲液800-1500ml于压力锅中，大火加热直至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温不锈钢切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，锅盖继续加热至喷汽开始计时，1-2分钟后，压力锅离开热源，冷却至室温，取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用pH＝7.2-7.4的PBS冲洗两次，每次各3分钟；
3、3％H2O2去离子水孵育5分钟，以阻断内源性过氧化物酶，PBS冲洗3次，每次2分钟；
4、滴加Vimentin一抗，室温或37℃孵育1-2小时或4℃过夜，PBS冲洗3次，每次2分钟；
5、滴加通用型IgG抗体，室温或37℃孵育15分钟，PBS冲洗3次，每次2分钟；
6、应用DAB溶液显色：甩去PBS液，每张切片加2滴或100μl新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察3-10分钟；
7、蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明封片：蒸馏水冲洗2次，每次3分钟；苏木素复染1分钟；0.1％盐酸酒精分化；0.1％氨水返蓝；50％、70％、85％、95％、无水乙醇脱水干燥；二甲苯透明，中性树脂胶封片；
8、细胞病理学专家阅片，根据细胞着色程度判定Vimentin表达情况。
实施例检测结果：8例健康志愿者均未查到循环肿瘤细胞；4例晚期肾癌患者检测到循环肿瘤细胞(表1)。本次检测阳性率为50％，所检测的循环肿瘤细胞应用免疫组化证实Vimentin的表达，并与肾癌大体标本Vimentin结果对比，指导晚期肾癌的诊断及靶向治疗疗效判定，为晚期肾癌靶向治疗提供新的思路。
图4所示为晚期肾癌患者外周血分离获取的循环肿瘤细胞影像图，其细胞核较大，细胞核形状不规则；高核质比。
图5所示为晚期肾癌患者外周血循环肿瘤细胞Vimentin免疫组化染色图像(根据其染色分布和强度判定阳性程度：根据其染色分布和强度判定阳性程度，细胞着色占细胞小于10％为(-)，着色10％-25％为(+)，着色25％-50％为(++)，着色大于50％为(+++))。
表1实施例检测结果
Claims (4)
1.一种肾癌患者外周血Vimentin非诊断目的的检测方法，其特征在于，检测方法步骤如下：利用膜过滤装置分离获得无法获取组织标本的晚期肾癌患者外周血中的CTC，运用细胞蜡块技术制作薄层切片，进而检测Vimentin表达情况；
所述的利用膜过滤装置分离获得无法获取组织标本的晚期肾癌患者外周血中的CTC，步骤如下：
1)采集晚期肾癌患者外周血：肘正中静脉5ml；
2)外周血样预处理：将采集的外周血样10倍稀释，稀释液成分：1mmol/l EDTA+0.1％BSA,稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定终浓度为0.25％；
3)利用膜过滤分离肿瘤细胞装置过滤外周血样，分离获得外周血循环肿瘤细胞：将预处理的外周血样加入到膜过滤分离肿瘤细胞装置的血样容器(2)中，使其依靠重力自然过滤；
4)过滤结束后，从膜过滤分离肿瘤细胞装置中取下滤器(3)，将循环肿瘤细胞染色液加入到滤器(3)中，染色2min，PBS缓冲液冲洗干净，用精细镊子取下滤膜(7)，放置在载玻片上，干燥后在显微镜下观察，确定是否存在CTC；
所述的运用细胞蜡块技术制作薄层切片，步骤如下：
1)脱色：将上述载玻片上的滤膜(7)取下，置于脱色液中浸泡4-6小时，脱去CTC染色液，所述脱色液为：95％酒精与100％二甲苯按体积比1:1混匀；
2)包裹：浸泡结束后取出滤膜(7)，用吸水纸包裹；
3)固定：将包裹物置于10％中性福尔马林中，固定4-6h；
4)浸蜡包埋：固定结束后取出包裹物，脱水后置于石蜡包埋盒中，浸蜡包埋制作细胞石蜡块；
5)薄层切片：用切片机将细胞石蜡块连续切片，制成厚度为4μm的薄层切片；
所述的检测Vimentin表达情况，步骤如下：
1)将CTC蜡块薄层切片在染色缸中按以下步骤进行脱蜡和水化：二甲苯溶液浸泡3次，每次10分钟；无水乙醇溶液浸泡3次，每次5分钟；95％乙醇溶液浸泡5分钟；85％乙醇溶液浸泡5分钟；75％乙醇溶液浸泡5分钟；蒸馏水浸泡2次，每次3分钟；PH＝7.4的PBS浸泡3次，每次3分钟；
2)采用柠檬酸缓冲液高温高压抗原修复法对抗原进行修复：取pH＝6.0柠檬酸盐缓冲液800-1500ml于压力锅中，大火加热直至沸腾，将脱蜡水化后的切片置于耐高温不锈钢切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，盖上锅盖继续加热至喷汽开始计时，1-2分钟后，压力锅离开热源，冷却至室温，取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用pH＝7.2-7.4的PBS冲洗两次，每次各3分钟；
3)3％H2O2去离子水孵育5分钟，以阻断内源性过氧化物酶，PBS冲洗3次，每次2分钟；
4)滴加Vimentin一抗，室温或37℃孵育1-2小时或4℃过夜，PBS冲洗3次，每次2分钟；
5)滴加通用型IgG抗体，室温或37℃孵育15分钟，PBS冲洗3次，每次2分钟；
6)应用DAB溶液显色：甩去PBS液，每张切片加2滴或100μl新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察3-10分钟；
7)蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明封片：蒸馏水冲洗2次，每次3分钟；苏木素复染1分钟；0.1％盐酸酒精分化；0.1％氨水返蓝；50％、70％、85％、95％、无水乙醇脱水干燥；二甲苯透明，中性树脂胶封片；
8)细胞病理学专家阅片，根据细胞着色程度判定Vimentin表达情况。
2.根据权利要求1所述的肾癌患者外周血Vimentin非诊断目的的检测方法，其特征在于，所述的膜过滤装置包括滤器(3)、血样容器(2)、废液缸(5)和铁架台(1)，所述铁架台(1)设有底座(11)、立架(12)和支架(13)，所述血样容器(2)通过支架(13)设置于铁架台(1)上部，血样容器(2)的下方为滤器(3)，滤器(3)通过输液器(4)联通至废液缸(5)，废液缸(5)设置于底座(11)上。
3.根据权利要求2所述的肾癌患者外周血Vimentin非诊断目的的检测方法，其特征在于：所述滤器(3)包括滤器上口(6)、滤膜(7)、载滤膜平台(8)和滤器下口(9)，滤膜(7)置于载滤膜平台(8)上；滤器上口(6)接血样容器(2)，滤器下口(9)通过输液器(4)接废液缸(5)。
4.根据权利要求3所述的肾癌患者外周血Vimentin非诊断目的的检测方法，其特征在于：所述滤膜(7)为疏水材料制成，其上均匀布满口径为10微米的滤孔(10)。
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