CN110095599A - 无细胞损失的微量免疫荧光检测方法 - Google Patents

无细胞损失的微量免疫荧光检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种无细胞损失的微量免疫荧光检测方法，包括以下步骤：0.22um Spin‑X Centrifuge Tube灭菌；将细胞转移到灭菌过的0.22um Spin‑X Centrifuge Tube中直接进行后续步骤或者培养后进行后续步骤；后续步骤包括：PBS缓冲液冲洗、4％多聚甲醛固定、甲醇冰上处理、0.3M甘氨酸封闭液处理、4％BSA封闭液处理、荧光一抗室温避光孵育、DAPI染色液染色、过滤膜放于载玻片中封片，于激光扫描共焦显微镜下观察。该方法弥补了免疫荧光技术难以实现精确的筛选特定细胞的短板，为实现混合细胞群中筛选特定细胞提供一种简单精确以及可视化的技术。

Description

无细胞损失的微量免疫荧光检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体而言，涉及一种无细胞损失的微量免疫荧光检测技术。
背景技术
免疫荧光技术(immunofluorescence technique)是将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来，研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。其原理：先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体(或抗原)作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光(黄绿色或桔红色)，可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。
自从1941年Coons等利用荧光素对细胞进行标记并取得成功，随后经过不断改进与延伸，形成如今利用和抗原与荧光标记抗体特异性结合的免疫荧光技术。现如今免疫荧光技拥有特异性强、敏感性高、可视性好等优势，并成为生物化学、细胞学、植物学以及发育生物学等生命科学研究领域中不可或缺的科研技术。
免疫荧光可用于组织切片，培养的细胞系或单个细胞，并可用于分析蛋白质，聚糖和生物小分子和非生物分子的分布。这种技术甚至可以用于可视化结构，如中型长丝。如果尚未确定细胞膜的拓扑结构，则可以将表位插入蛋白质中与免疫荧光结合使用以确定结构。免疫荧光也可用作“半定量”方法，以深入了解DNA甲基化的水平和定位模式。免疫荧光可以与其他非抗体荧光染色方法组合使用，例如，使用DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)标记DNA。几种显微镜设计可用于免疫荧光样品的分析；最简单的是落射荧光显微镜，共聚焦显微镜也被广泛使用。还可以使用能够具有更高分辨率的各种超分辨率显微镜设计。
但是免疫荧光技术也存在一定的缺陷性，如免疫荧光仅限于固定(即死亡)细胞，因为当与荧光标记物反应时抗体不穿透细胞膜，必须使得细胞膜通透。并且抗原分子必须牢固地固定在细胞内自然定位的位置。同时在细胞标记荧光过程中要经历多次洗涤，无法避免试验过程中细胞的损失，难以鉴定出样品出微量的特殊细胞，因此限制了免疫荧光技术在细胞筛选中的应用。
传统的免疫荧光步骤为：
1、爬片：目的细胞胰酶消化后，用新鲜培养基吹打悬浮。取出载玻片平放在6孔板内，细胞接种到6孔板中，5％CO2培养箱培养24h，细胞贴附在载玻片上。
2、收片：细胞贴附24h后，去除培养基，加入预冷的1ml PBS洗片，重复三次。
3、固定；加入1ml的4％多聚甲醇，覆盖载玻片，冰上孵育10-15min,1ml PBS洗片3次。
4、透化：加入0.5ml的0.5％Triton-100，冰上孵育5min，PBS洗片3次。
5、封闭：常温下，加入2ml含2％BSA的PBS，孵育1h，PBS洗片1次。
6、一抗孵育：晾干载玻片，加入100ul稀释好的一抗，室温孵育2h，PBS洗涤3次。
7、二抗孵育：同一抗孵育。
8、染核：加入0.5mlDAPI工作液(1ug/ml，PBS稀释)，覆盖盖玻片，室温孵育5min。
9、封片：PBS洗片三次后，晾干，滴加30ul封片液，盖上盖玻片，共聚焦显微镜观察。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对免疫荧光技术在试验过程中无可避免的细胞损失问题，提供一种无细胞损失的微量免疫荧光技术。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种无细胞损失的微量免疫荧光检测方法，包括以下步骤：
1)、0.22um Spin-X Centrifuge Tube灭菌(高压蒸汽灭菌)；
2)、将细胞0.5ml转移到步骤1)所得的灭菌过的0.22um Spin-X Centrifuge Tube中直接进行后续步骤3)或者培养后进行后续步骤3)；
3)、对步骤2)所得物进行离心，除去离心所得的液体(上层液体，从而除去液体培养基)后，再加入(0.5±0.05)ml的PBS缓冲液(pH 7.4)进行冲洗后离心，除去离心所得的液体(上层液体，即，除去PBS缓冲液)；
再重复上述加入(0.5±0.05)ml的PBS缓冲液(pH 7.4)进行冲洗后离心，除去离心所得的液体；重复次数为1～3次；
4)、向步骤3)所得物中加入4％多聚甲醛(0.5±0.05)ml于室温下固定10～15min，然后离心去除液体(上层液体，即，除去4％多聚甲醛)；
5)、向步骤4)所得物中加入(0.5±0.05)ml的PBS缓冲液(pH 7.4)进行冲洗后离心，除去离心所得的液体(去除上层液体，即除去PBS缓冲液)；
再重复上述加入(0.5±0.05)ml的PBS缓冲液进行冲洗离心，除去离心所得的液体；重复次数为2～4次；
6)、向步骤5)所得物中加入(0.5±0.05)ml甲醇于冰上放置1±0.2min，再离心去除液体(上层液体，即，除去甲醇)，
然后用(0.5±0.05)ml的PBS缓冲液(pH 7.4)冲洗，除去离心所得的液体(上层液体，从而除去PBS)，
再重复上述加入(0.5±0.05)ml的PBS缓冲液冲洗后离心，除去离心所得的液体；重复次数为1～3次；
7)、向步骤6)所得物中加入0.3M甘氨酸封闭液(0.5±0.05)ml，于室温下封闭20±5min，离心，除去离心所得的液体(除去0.3M甘氨酸封闭液)；
8)、向步骤7)所得物中加入4％BSA封闭液(0.5±0.05)ml于室温下封闭2h～4h；
9)、向步骤8)所得物中加入特异性的荧光一抗(0.5±0.05)ml，于室温避光孵育至少2小时；
注：具体孵育时间根据一抗浓度和特性确定，若是实验结果中背景较深可适当增加孵育时间)；室温避光孵育2小时后，可以在倒置荧光显微镜下进行观察，若是视野没有背景或是背景少，就可以结束孵育；
10)、向步骤9)所得物中加入(0.5±0.05)ml的PBS缓冲液(pH 7.4)进行冲洗，离心，除去离心所得的液体；
再重复上述加入(0.5±0.05)ml的PBS缓冲液(pH 7.4)进行冲洗后的离心，除去离心所得的液体；重复次数为2～4次；
11)、向步骤10)所得物中加入(0.5±0.05)ml的DAPI染色液，覆盖住样品，混匀，室温放置3-5分钟；
12)、向步骤11)所得物中加入(0.5±0.05)ml的PBS缓冲液(pH 7.4)进行冲洗，离心，除去离心所得的液体；
再重复上述加入0.5ml的PBS缓冲液(pH 7.4)进行冲洗后的离心，除去离心所得的液体；重复次数为2～4次；
13)、取出步骤12)所得的0.22um Spin-X Centrifuge Tube的过滤膜，放于载玻片中，封片(90％甘油，PBS缓冲液(pH 7.4)配制)；
于激光扫描共焦显微镜下观察，或于4℃避光保存。
作为本发明的无细胞损失的微量免疫荧光检测方法的改进：
所述步骤9)的荧光一抗为Anti-HLA Class[MEM-147]abcam。
作为本发明的无细胞损失的微量免疫荧光检测方法的进一步改进：
所述步骤2)中：于37℃，5％CO2培养直至细胞贴附(完全贴附)在滤膜上，培养时间约为24小时。
作为本发明的无细胞损失的微量免疫荧光检测方法的进一步改进：
所述步骤13)中的封片采用PBS缓冲液(pH 7.4)配制的90％(体积％)甘油。
作为本发明的无细胞损失的微量免疫荧光检测方法的进一步改进：
步骤3)冲洗时间为(2±0.5)分钟；
步骤5)、步骤6)、步骤10)、步骤12)的冲洗时间为(5±1)分钟。
作为本发明的无细胞损失的微量免疫荧光检测方法的进一步改进：
所述离心为(1500±300)g离心(60±10)s。
在本发明中，非贴壁的细胞(例如白血病细胞)，在步骤2)中无需培养，可直接进行后续的步骤3)。
发明过程中的注意事项：
1、检测样品中的细胞数量不可过多，最好小于10000个(步骤2)培养之后的目标细胞数量)。
2、实验过程中配置的所有液体试剂必须要过0.22um的滤膜，防止后续过程由于液体试剂中的不溶成分封堵0.22um Spin-X Centrifuge Tube。
上述液体试剂包括PBS缓冲液(pH 7.4)、4％多聚甲醛、0.3M甘氨酸封闭液、4％BSA的封闭液。
3、按照现有方法(根据细胞表面特异性抗原进行选择、或根据细胞特定表达的蛋白质进行选择)针对不同的细胞选择特异性的荧光一抗，从而达到良好的检测效果。
在本发明中，所选的特异性荧光一抗例如为特异性识别人HLA家族蛋白的抗体(https://www.abcam.cn/hla-class-i-antibody-mem-147-phycoerythrin-ab52451.html)Anti-HLA Class[MEM-147]abcam，主要是用来区分人的肿瘤细胞与小鼠的3T3细胞。
4、由于0.22um Spin-X Centrifuge Tube中滤膜本身材料的限制，做免疫荧光或有较高的背景，因此选用4％的BSA封闭液并延长封闭时间为2h-4h。
5、实验过程中选取4％的多聚甲醛作为固定液，所以在加一抗之前用含0.3M甘氨酸的封闭液封闭。因为甘氨酸能结合自由醛基，而这些醛基会与一抗结合造成高背景染色。使用多聚甲醛或戊二醛固定时，由自由醛基导致的高背景很有可能发生。
6、多聚甲醛固定时间不可超过15min，否则会造成蛋白交联，使得抗体难以结合细胞特异性抗原。
本发明的主要发明点为：
1、通过0.22um Spin-X Centrifuge Tube代替爬片和培养皿可以消除常规细胞免疫荧光技术中细胞损失，起到精确定量分析特性的混合细胞样品中的某一种细胞。
2、通过0.22um Spin-X Centrifuge Tube，可以检测不同种类的细胞，包括贴壁或是不贴壁；并且适合检测血液样品中的肿瘤细胞。
3、在0.22um Spin-X Centrifuge Tube中滤膜是乙酸纤维素材料，其做免疫荧光实验会有高背景，不利于观察细胞。本发明通过多次尝试，利用甲醇活化、提高甘氨酸和BSA的浓度，可以极大降低实验背景。
4、利用90％甘油(PBS配制)封片，可以将白色不透明的乙酸纤维素0.22um Spin-XCentrifuge Tube滤膜转变为透明，极大的提高了可视性(不透光就无法使用正置荧光显微镜，只能使用倒置显微镜)。
5、本发明可以应用于对特定的悬浮细胞进行精确定量(例如人早幼粒急性白血病细胞HL60)。说明该技术具有应用于检测血液样品中肿瘤细胞的能力。
本发明与传统的免疫荧光技术相比：
免疫荧光技术主要是针对贴壁培养的细胞，并且限于固定死亡细胞，本发明中利用0.22um Spin-X Centrifuge Tube可以用于对悬浮的细胞(如实施例2的白血病细胞)进行直接的荧光一抗的标记，过程中主要是通过离心将悬浮的细胞固定在0.22um Spin-XCentrifuge Tube底部滤膜上。本发明无需细胞爬片的步骤，直接用0.22um Spin-XCentrifuge Tube取代载玻片，可以减少实验过程中的细胞损失。因为0.22um Spin-XCentrifuge Tube滤膜的孔径是0.22um小于细胞的直径，细胞无法通过滤膜，因此实验过程中的洗涤步骤，通过离心除去洗涤液，不会造成细胞的损失。本发明直接用荧光一抗孵育，无需加二抗。本发明的核心就在于用于精确检测特定的悬浮细胞或是贴壁细胞在混合的多种细胞样品，例如血液中检测白血病细胞。可解决普通免疫荧光技术无法进行细胞数量分析的缺陷，同时具有良好的可视化以及可重复性。即，本发明可以精确的对悬浮细胞进行计数，以及筛选血液中的肿瘤细胞(实施例2)。本发明直接在0.22um Spin-X CentrifugeTube中进行细胞的培养和收集工作，可以精确控制细胞的数量，同时利用离心去除废液的过程，也可以减少实验过程中细胞的损伤，可以做到精确的细胞定量。再则实验的过程简单高效，可以直接对血液以及白细胞等悬浮生长的细胞，进行检测。本发明利用甲醇活化0.22um Spin-X Centrifuge Tube的滤膜，提高滤膜吸附蛋白质的能力，进而提高BSA的封闭效果，最终降低背景颜色，提高清晰度。
综上所述，本发明公开了无细胞损失的微量免疫荧光技术，利用Spin-XCentrifuge Tube作为细胞的载体进行免疫荧光，具有非常好的精确性，可以保证实验过程中不存在细胞损失，使得免疫荧光技术可以很好的运用到混合细胞样品中检测特定细胞的数量。同时可以通过选择不同的荧光抗体对不同的细胞进行特异性的标记，达到同时检测两种细胞的数量和相对应的比例关系。并且该无细胞损失的微量免疫荧光技术也可以对血液和悬浮的细胞样品中特定的肿瘤细胞进行定量检测，为血液中循环肿瘤细胞的检测提供了一定基础，具有良好的应用性。即，本发明可应用于检测人体血液中的循环肿瘤细胞，以及病变的细胞，具有临床应用的价值。本发明弥补了免疫荧光技术难以实现精确的筛选特定细胞的短板，为实现混合细胞群中筛选特定细胞提供一种简单精确以及可视化的技术。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是不同细胞比例下精确免疫荧光实验结果(实施例1)：
A：本发明制成的载玻片(步骤11)得到的可以直接进行观察的玻片)；B：A549肺癌细胞于3T3细胞的比例为1％；C：A549肺癌细胞于3T3细胞的比例为10％；D：A549肺癌细胞于3T3细胞的比例为100％。
图2为对图1的统计图分析结果。
图3是本发明对人急性白血病细胞HL60的检测结果(实施例2)；
A:100倍视野下Anti-HLA Class一抗无细胞的背景；
B：100倍视野下Anti-HLA Class一抗和DAPI染3T3细胞的合并图；
C:100倍视野下Anti-HLA Class一抗染人急性白血病细胞HL60；
D：100倍视野下Anti-HLA Class一抗和DAPI染人急性白血病细胞HL60的合并图；
E、F：200倍视野下Anti-HLA Class一抗和DAPI染人急性白血病细胞HL60的合并图；E图中人急性白血病细胞HL60没有在0.22um Spin-X Centrifuge Tube中培养，直接进行实验；F图中人急性白血病细胞HL60在0.22um Spin-X Centrifuge Tube中培养24h后再进行实验。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
主要试剂和仪器以及具体实验步骤如下：
主要试剂
DMEM/HIGH GLUCOSE(HyClone Cat#SH30243.01)
胎牛血清(FBS)(SERANA)
胰酶(GIBICO)
Penicillin-Streptomycin双抗(HyClone)
PBS(吉诺生物医药技术有限公司)
4％牛血清蛋白(BSA)(sigma)
甘氨酸(sigma)
多聚甲醛(sigma)
荧光一抗(Anti-HLA ClassI[MEM-147]abcam)
DAPI(sigma)
甲醇
PBS缓冲液(pH 7.4)。
主要仪器
0.22um Spin-X Centrifuge Tube(costar)
细胞培养箱(Thermo)
移液器(Thermo Fisher)
15ml，50ml离心管(BIOFIL)
移液器枪头，1.5ml离心管(依科赛生物)
倒置相差显微镜(OLYMPUS)
超净工作台(苏州佳宝)
4℃，-20℃和-80℃冰箱(Hair)
离心机(Eppendorf 5424R)
高压灭菌锅(SANYO)
本发明中，没有明确限定温度的均是在室温下进行。
实施例1、一种无细胞损失的微量免疫荧光检测方法，依次进行以下步骤：
1)、将0.22um Spin-X Centrifuge Tube高压蒸汽灭菌(103.4KPa的压力，温度为121℃，灭菌时间为30分钟)；
2)、利用细胞计数板取一定的A549细胞和3T3细胞混合，分别得到以下实验组：
实验组1：A549细胞的比例为1％(即，A549细胞：3T3细胞＝1:99)；
实验组2：A549细胞的比例为10％(即，A549细胞：3T3细胞＝1:9)；
实验组3：A549细胞的比例为100％(即，全部为A549细胞)；
上述3个实验组均满足以下条件：细胞总量为1*105个；体积量为0.5ml；
将上述3个实验组分别进行以下操作：转移到步骤1)所得的灭菌过的0.22umSpin-X Centrifuge Tube内于细胞培养箱中培养24小时，培养箱内设定的参数为37℃，5％CO2培养24个小时后，上述3个实验组均满足细胞完全贴附在滤膜上的条件；此时：
实验组1的A549细胞密度为1％；实验组2的A549细胞密度为10％；实验组3的A549细胞密度为100％；
注：A549细胞和3T3细胞均为贴壁培养的细胞；
将上述3个培养24小时后的实验组分别进行后续步骤。
3)、对步骤2)所得物进行离心(1500g离心60s，从而除去液体培养基)，除去离心所得的上层液体(即，离心后过滤，倒出过滤液)，向0.22um Spin-X Centrifuge Tube内加0.5ml的PBS缓冲液(pH7.4)进行冲洗，冲洗时间为2分钟；然后1500g离心60s去除离心所得液体(上层液体)，即，除去PBS缓冲液；
再重复上述加入0.5ml的PBS缓冲液进行冲洗、离心，除去离心所得的液体；重复次数为两次；
4)、向步骤3)所得物中加入4％多聚甲醛0.5ml于室温下固定15min，然后1500g离心1min，除去离心所得的液体，以除去4％多聚甲醛；
4％多聚甲醛的制备方法为：将4g多聚甲醛溶于80ml PBS缓冲液(pH7.4)，加热至60～80℃，滴加NaOH溶液(pH14，约2ml)至澄清，冷却至室温后加PBS缓冲液至100ml；得4％多聚甲醛。
5)、向位于0.22um Spin-X Centrifuge Tube内的步骤4)所得物中加入0.5ml的PBS缓冲液(pH7.4)进行冲洗(冲洗时间为5min)，1500g离心60s，除去离心所得的液体，从而除去PBS缓冲液；
再重复上述加入0.5ml的PBS缓冲液冲洗、离心，除去离心所得的液体；重复次数为三次；
6)、向位于0.22um Spin-X Centrifuge Tube内的步骤5)所得物中加入0.5ml甲醇放于冰上1min，再1500g离心60s去除液体(以除去甲醇)，然后用0.5ml的PBS缓冲液(pH7.4)冲洗(冲洗时间为5min)，离心(1500g离心60s)，除去离心所得的液体，从而除去PBS；
再重复上述加入0.5ml的PBS缓冲液冲洗、离心，除去离心所得的液体；重复次数为2次；
7)、向位于0.22um Spin-X Centrifuge Tube内的步骤6)所得物中加入0.3M甘氨酸封闭液0.5ml，于室温下封闭20min，离心(1500g离心60s)，除去离心所得的液体，从而除去0.3M甘氨酸封闭液；
0.3M甘氨酸封闭液的制备方法为：将2.2521g甘氨酸溶于90ml PBS缓冲液(pH7.4)，震荡至溶液澄清后加PBS缓冲液至100ml，得0.3M甘氨酸封闭液。
8)、向位于0.22um Spin-X Centrifuge Tube内的步骤7)所得物中加入4％BSA封闭液0.5ml，于室温下封闭2h-4h；
4％BSA封闭液的制备方法为：将4g的BSA(牛血清白蛋白)加入到6ml的PBS缓冲液(Ph7.4)溶液中，震荡待BSA全部溶解后，加入PBS缓冲液定容到10ml；
9)、向位于0.22um Spin-X Centrifuge Tube内的步骤8)所得物中加入特异性的荧光一抗0.5ml(特异性结合A549细胞的荧光一抗为Anti-HLA Class[MEM-147]abcam，浓度为5ug/ml)，于室温避光孵育约2小时；
室温避光孵育2小时后，可以在倒置荧光显微镜下进行观察，若是视野没有背景或是背景少，就可以结束孵育。
10)、向位于0.22um Spin-X Centrifuge Tube内的步骤9)所得物中加入0.5ml的PBS缓冲液(pH 7.4)进行冲洗(冲洗时间为5min)，离心(1500g离心60s)；除去离心所得的液体；
再重复上述加入0.5ml的PBS缓冲液、离心，除去离心所得的液体；重复次数为三次；
11)、向步骤10)所得物中加入0.5ml DAPI染色液，覆盖住样品，混匀，室温放置4-5分钟。
12)、向步骤11)所得物中加入0.5ml的PBS缓冲液(pH 7.4)进行冲洗(冲洗时间为5min)，离心(1500g离心60s)；除去离心所得的液体；
再重复上述加入0.5ml的PBS缓冲液进行冲洗、离心，除去离心所得的液体；重复次数为三次；
13)、取出步骤12)所得的0.22um Spin-X Centrifuge Tube的过滤膜，放于载玻片中，90％甘油(PBS配制)封片；得到可以直接进行观察的玻片。
90％甘油(PBS配制)的制备方法为：将甘油与PBS缓冲液(pH 7.4)按照9:1的体积比混合而得。
于激光扫描共焦显微镜下观察，所得结果如图1所示；
在图1中，B、C、D之间的区别是A549肺癌细胞于小鼠的3T3成纤维细胞之间的比例不同。B中A549的比例为1％，C中A549细胞的比例为10％，D中A549的比例为100％。
因此，根据图1可得知：本发明可以对混合细胞样品中某一特定细胞(数量非常少)进行细胞数量的可视化定量分析，同时也解决了常规免疫荧光实验过程中存在细胞损失的问题。
实验组1：A549细胞的比例为0.954％，实验组2：A549细胞的比例为11.21％，实验组3：A549细胞的比例为98.23％。
根据图2可得知：针对于A549肺癌细胞(属于贴壁细胞)、小鼠的成纤维细胞3T3细胞混合的细胞样品中检测A549细胞的数量，实验结果与理论值之间不存在显著性的差异。说明本发明解决了常规免疫荧光实验过程中存在细胞损失的问题。可以精确的进行细胞可视化的定量分析细胞数量。
备注：利用倒置的荧光显微镜进行拍照，然后利用imageJ软件进行细胞计数。此为最常用的细胞计数方法。
实施例2：相对于实施例1仅改变步骤2；其余等同于实施例1。
2)、分别设置以下实验组：
实验组1(阴性对照实验):将0.5ml细胞培养基直接转移到步骤1)所得的灭菌过的0.22um Spin-X Centrifuge Tube中；
实验组2:将贴壁细胞---小鼠成纤维3T3细胞(浓度为1*104)0.5ml直接转移到步骤1)所得的灭菌过的0.22um Spin-X Centrifuge Tube中；
实验组3：将非贴壁的细胞----人急性白血病细胞HL60(浓度为1*104)0.5ml直接转移到步骤1)所得的灭菌过的0.22um Spin-X Centrifuge Tube中；
实验组4：将非贴壁的细胞----人急性白血病细胞HL60(浓度为1*104)0.5ml转移到步骤1)所得的灭菌过的0.22um Spin-X Centrifuge Tube内于细胞培养箱中培养24小时，培养箱内设定的参数为37℃，5％CO2培养24个小时；
将上述实验组分别进行后续步骤。
注：实验组3、4有DAPI染色，DAPI是用来染细胞核，确定总细胞数量。
人早幼粒急性白血病细胞HL60是突变导致肿瘤化的白细胞，也就是说是由白细胞变为肿瘤细胞。
最终所得的结果如图3所述：实验1对应于图A，实验2对应于图B，实验3对应于图C、D、E，实验4对应于图F。
在图3中，
A：仅只有细胞培养基，经过利用特异性的荧光一抗染色后得到的结果。
B:仅只有小鼠成纤维3T3细胞，将DAPI染色的结果于特异性荧光一抗(特异性识别人HLA家族蛋白的抗体)染色结果进行合并之后的结果。
C:仅具有一定数量的HL60，特异性荧光一抗(特异性识别人HLA家族蛋白的抗体)染色结果(100倍视野)。
D仅具有一定数量的HL60，将DAPI染色的结果于特异性荧光一抗(特异性识别人HLA家族蛋白的抗体)染色结果进行合并之后的结果(100倍视野)。
E仅具有一定数量没有在0.22um Spin-X Centrifuge Tube培养的HL60，将DAPI染色的结果于特异性荧光一抗(特异性识别人HLA家族蛋白的抗体)染色结果进行合并之后的结果(200倍视野)。
F仅具有一定数量在0.22um Spin-X Centrifuge Tube培养24h的HL60，将DAPI染色的结果于特异性荧光一抗(特异性识别人HLA家族蛋白的抗体)染色结果进行合并之后的结果(200倍视野)。
因此，根据图3，可得知：
(1)该特异性的荧光一抗具有非常好的特异性。
(2)该技术用于检测悬浮细胞如人急性白血病细胞HL60具有高精确度，可解决普通免疫荧光技术无法进行细胞数量分析的缺陷，同时具有良好的可视化以及可重复性。
因此该技术可以应用于检测人体血液中的循环肿瘤细胞，以及病变的细胞，具有临床应用的价值。
综上所述，利用本发明技术的优势，可以对血液样本中的白血病细胞进行细胞数量的检测实验。血液中主要的细胞为：白细胞、红细胞。红细胞没有细胞核，并且容易去除，因此本实施例将一定数量的人早幼粒急性白血病细胞HL60作为实验的主要对象。测试本技术对于急性白血病细胞检测的灵敏度。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (6)

1.无细胞损失的微量免疫荧光检测方法，其特征是包括以下步骤：
1)、0.22um Spin-X Centrifuge Tube灭菌；
2)、将细胞0.5ml转移到步骤1)所得的灭菌过的0.22um Spin-X Centrifuge Tube中直接进行后续步骤3)或者培养后进行后续步骤3)；
3)、对步骤2)所得物进行离心，除去离心所得的液体后，再加入(0.5±0.05)ml的PBS缓冲液(pH7.4)进行冲洗后离心，除去离心所得的液体；
再重复上述加入(0.5±0.05)ml的PBS缓冲液(pH7.4)进行冲洗后离心，除去离心所得的液体；重复次数为1～3次；
4)、向步骤3)所得物中加入4％多聚甲醛(0.5±0.05)ml于室温下固定10～15min，然后离心去除液体(上层液体，即，除去4％多聚甲醛)；
5)、向步骤4)所得物中加入(0.5±0.05)ml的PBS缓冲液(pH7.4)进行冲洗后离心，除去离心所得的液体；
再重复上述加入(0.5±0.05)ml的PBS缓冲液进行冲洗离心，除去离心所得的液体；重复次数为2～4次；
6)、向步骤5)所得物中加入(0.5±0.05)ml甲醇于冰上放置1±0.2min，再离心去除液体，
然后用(0.5±0.05)ml的PBS缓冲液(pH7.4)冲洗，除去离心所得的液体，
再重复上述加入(0.5±0.05)ml的PBS缓冲液冲洗后离心，除去离心所得的液体；重复次数为1～3次；
7)、向步骤6)所得物中加入0.3M甘氨酸封闭液(0.5±0.05)ml，于室温下封闭20±5min，离心，除去离心所得的液体；
8)、向步骤7)所得物中加入4％BSA封闭液(0.5±0.05)ml于室温下封闭2h～4h；
9)、向步骤8)所得物中加入特异性的荧光一抗(0.5±0.05)ml，于室温避光孵育至少2小时；
10)、向步骤9)所得物中加入(0.5±0.05)ml的PBS缓冲液(pH7.4)进行冲洗，离心，除去离心所得的液体；
再重复上述加入(0.5±0.05)ml的PBS缓冲液(pH7.4)进行冲洗后的离心，除去离心所得的液体；重复次数为2～4次；
11)、向步骤10)所得物中加入(0.5±0.05)ml的DAPI染色液，混匀，室温放置3-5分钟；
12)、向步骤11)所得物中加入(0.5±0.05)ml的PBS缓冲液(pH7.4)进行冲洗，离心，除去离心所得的液体；
再重复上述加入0.5ml的PBS缓冲液(pH7.4)进行冲洗后的离心，除去离心所得的液体；重复次数为2～4次；
13)、取出步骤12)所得的0.22um Spin-X Centrifuge Tube的过滤膜，放于载玻片中，封片；
于激光扫描共焦显微镜下观察，或于4℃避光保存。
2.根据权利要求1所述的无细胞损失的微量免疫荧光检测方法，其特征是：
所述步骤9)的荧光一抗为Anti-HLA Class[MEM-147]abcam。
3.根据权利要求2所述的无细胞损失的微量免疫荧光检测方法，其特征是：
所述步骤2)中：于37℃，5％CO2培养直至细胞贴附在滤膜上。
4.根据权利要求1～3任一所述的无细胞损失的微量免疫荧光检测方法，其特征是：
所述步骤13)中的封片采用PBS缓冲液(pH7.4)配制的90％甘油。
5.根据权利要求1～3任一所述的无细胞损失的微量免疫荧光检测方法，其特征是：
步骤3)冲洗时间为(2±0.5)分钟；
步骤5)、步骤6)、步骤10)、步骤12)的冲洗时间为(5±1)分钟。
6.根据权利要求1～3任一所述的无细胞损失的微量免疫荧光检测方法，其特征是：
所述离心为(1500±300)g离心(60±10)s。
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