CN113310963B - 一种改进的中性粒细胞NETs免疫荧光检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种改进的中性粒细胞NETs免疫荧光检测方法，该方法的核心发明点是在多聚甲醛固定前先常温干燥6～12小时。本发明改进方法在NETs的验证实验中，能帮助排除因多聚甲醛固定导致的假阳性，且能明显减少实验过程中细胞被洗掉的风险，有利于中性粒细胞的NETs的相关实验的开展。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种改进的中性粒细胞NETs免疫荧光检测方法。
背景技术
中性粒细胞是先天免疫系统的主要效应细胞之一，具有多种免疫功能，如吞噬、脱颗粒、产生活性氧类以及形成和释放中性粒细胞胞外陷阱(neutrophil extracellulartraps，NETs)。 NETs是以解聚的DNA为骨架，并与中性粒细胞颗粒蛋白组成的网状结构。NETs的产生受到多种诱导因素的影响，如豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)。
NETs与多种疾病的发病和治疗存在密切关联，表现为“双刃剑”作用。一方面它既能在感染性疾病中防止病原微生物的扩散和起杀灭作用，如金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、结核分枝杆菌和呼吸道合胞体病毒等；另一方面NETs是引起部分免疫性疾病的发病因素，如小血管炎、系统性红斑狼疮等自身免疫缺陷性疾病。因此，准确、可靠地对中性粒细胞NETs 进行检测是非常重要的实验技术。
免疫荧光试验是用特异性抗体与标本中相应抗原反应后，再用荧光素标记的第二抗体(抗抗体)与之结合，然后在荧光显微镜下观察实验结果。该方法具有诸多优点，因而被广泛应用于细胞生物学研究中。
但是，使用免疫荧光试验检测中性粒细胞NETs时，容易产生假阳性。这主要是因为在多聚甲醛固定步骤中，固定剂多聚甲醛容易诱导中性粒细胞产生NETs。这种现象导致科研人员在该实验中，为了更好地呈现对照组(理应不产生NETs)结果时，在荧光显微镜下挑选符合要求的视野，避免选择产生NETs的视野。这显然有违实验原则。
为了克服现有技术存在的缺陷，特提出本发明。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种改进的中性粒细胞NETs免疫荧光检测方法。
本发明上述目的通过如下技术方案实现：
一种改进的中性粒细胞NETs免疫荧光检测方法，在多聚甲醛固定前先常温干燥6～12小时。在具体实施例中，图3～4与图1～2相比，未刺激组(PMA-)没有观察到任何NETs现象，说明在使用本发明改进方法观察中性粒细胞NETs现象时，不会产生假阳性。而且，值得说明的是，虽然改进方法与传统方法相比仅仅是延长了第5步多聚甲醛固定前的常温干燥时间，但是却将未刺激组的NETs完全消除，这种改进不是缓解了现有技术的不足，而是彻底消除了现有技术的不足，这种量变已经达到质变。而且，将图1～2与图3～4对比可以发现，传统方法刺激组和未刺激组的细胞密度均明显少于改进方法，改进方法细胞密度适中，便于实验观察。同时，需要说明的是，目前仅发现固定剂多聚甲醛会诱导中性粒细胞产生NETs，尚未在其他细胞中发现这种现象。因此，本发明改进方法存在特定的使用对象，解决特定对象的特定不足。
优选地，所述的免疫荧光检测方法包括如下步骤：
步骤S1、提取中性粒细胞，并调整中性粒细胞浓度；
步骤S2、将中性粒细胞加入细胞培养板内，给予或不给予中性粒细胞NETs刺激剂，37℃细胞培养箱孵育；
步骤S3、收集细胞进行甩片机离心；
步骤S4、甩完片后，取出甩完片的细胞黏附片子；
步骤S5、常温干燥6～12h后，多聚甲醛常温固定，Triton透化，BSA常温封闭，T-PBS洗涤；孵育一抗，T-PBS洗涤，常温孵育二抗，DAPI染核封片荧光镜下观察。
有益效果：
本发明方法在NETs的验证实验中，能帮助排除因多聚甲醛固定导致的假阳性，且能明显减少实验过程中细胞被洗掉的风险，有利于中性粒细胞的NETs的相关实验的开展。
附图说明
图1中A为未刺激组(常温分别干燥1h、2.5h、5h，DAPI染核，200X)，B为刺激组 (常温分别干燥1h、2.5h、5h，DAPI染核，200X)；
图2中C为未刺激组(常温分别干燥1h、2.5h、5h，DAPI染核+MPO蛋白，400X)， D为刺激组(常温分别干燥1h、2.5h、5h，DAPI染核+MPO蛋白，400X)；
图3中E为未刺激组(常温分别干燥6h、9h、12h，DAPI染核，200X)，F为刺激组(常温分别干燥6h、9h、12h，DAPI染核，200X)；
图4中G为未刺激组(常温分别干燥6h、9h、12h，DAPI染核+MPO蛋白，400X)，H为刺激组(常温分别干燥6h、9h、12h，DAPI染核+MPO蛋白，400X)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
一、实验材料
实验耗材：口罩、手套、帽子、一次性静脉采血针、5mL无菌EDTA抗凝管、黏附载玻片、盖玻片、15mL离心管、1.5mLEP管、24孔细胞培养板、免疫组化笔、巴氏吸管等。
实验试剂：RPMI-1640培养基、人外周血淋巴细胞分离液、红细胞裂解液、Phorbol12-Myristate 13-Acetate(PMA)、1％多聚甲醛、Triton-X100、Tween-20、Fluoromount-G荧光封片剂(含DAPI染核染料)、PBS粉末、胎牛血清蛋白、一抗(驴抗兔MPO抗体)、二抗(抗兔-594)等。
实验仪器：SW-CJ-2FD超净工作台、Mini-Q-Liocel超纯水机、低温高速离心机、4℃冰箱、-20℃冰箱、制冰机、37℃CO2培养箱、电子天平、细胞计数仪、倒置荧光显微镜、移液枪(2.5ul、20ul、200ul、1000ul)、AF26-C通用细胞离心甩片机等。
二、实验方法
1、提取人外周血中性粒细胞(PMN)，调整PMN浓度为：1*106个/ml cell；
2、PMN加入细胞培养板内，分别给予100nm PMA刺激或未刺激，37℃细胞培养箱孵育 1h后；
3、分别收集细胞进行甩片机离心3000RPM，20min；接着2000RPM，10min；
4、甩完片后，取出甩完片的细胞黏附片子；
5、下一步：
①传统方法
常温干燥，1h、2.5h、5h后，1％多聚甲醛常温固定15min，0.1％Triton透化10min，1％ BSA常温封闭1h，0.05％T-PBS洗3遍；孵育一抗(MPO)4℃过夜，0.05％T-PBS洗3遍，常温孵育二抗1h，DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚，是一种能够与DNA强力结合的荧光染料) 染核封片荧光镜下观察。荧光图：DNA(红色)、MPO(绿色)。
②改进方法
常温干燥，6h、9h、12h后，1％多聚甲醛常温固定15min，0.1％Triton透化10min，1％BSA 常温封闭1h，0.05％T-PBS洗3遍；孵育一抗(MPO)4℃过夜，0.05％T-PBS洗3遍，常温孵育二抗1h，DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚，是一种能够与DNA强力结合的荧光染料)染核封片荧光镜下观察。荧光图：DNA(红色)、MPO(绿色)。
三、实验结果
1、传统方法
200X镜下观察结果如图1所示，PMA刺激组(即图B，常温干燥1～5h)可以观察到明显的解聚染色质(DNA骨架)，说明中性粒细胞在PMA刺激下产生了NETs。但是，无PMA 刺激组(即图A，常温干燥1～5h)也观察到了解聚染色质(DNA骨架)(如图中三角标示处)，说明无PMA刺激组中性粒细胞也产生了NETs，这是典型的假阳性结果。
400X镜下观察结果如图2所示，PMA刺激组(即图D，常温干燥1～5h)除了可以观察到明显的解聚染色质(DNA骨架)，还观察到NETs的经典颗粒酶MPO的存在，进一步验证了中性粒细胞在PMA刺激下产生了NETs。但是，无PMA刺激组(即图C，常温干燥1～5h) 也观察到了解聚染色质(DNA骨架)和颗粒酶MPO的存在(如图中五角星角标示处)，说明无PMA刺激组中性粒细胞也产生了NETs，这是典型的假阳性结果。
2、改进方法
200X镜下观察结果如图3所示，PMA刺激组(即图F，常温干燥6-12h)可以观察到明显的解聚染色质(DNA骨架)，说明中性粒细胞在PMA刺激下产生了NETs。无PMA刺激组(即图E，常温干燥1～5h)细胞形态完整，未观察到解聚染色质(DNA骨架)，没有出现任何NETs。
400X镜下观察结果如图4所示，PMA刺激组(即图H，常温干燥6-12h)除了可以观察到明显的解聚染色质(DNA骨架)，还观察到NETs的经典颗粒酶MPO的存在，进一步验证了中性粒细胞在PMA刺激下产生了NETs。无PMA刺激组(即图G，常温干燥6-12h) 未观察到解聚染色质(DNA骨架)及颗粒酶MPO的存在，说明无PMA刺激组中性粒细胞没有产生NETs，没有假阳性的产生。
图3E/4G与图1A/2C相比，在没有PMA刺激的情况下没有观察到任何NETs现象，说明在使用本发明改进方法观察中性粒细胞NETs现象时，不会产生假阳性。而且，值得说明的是，虽然改进方法与传统方法相比仅仅是延长了第5步多聚甲醛固定前的常温干燥时间，但是却将未刺激组的NETs完全消除，这种改进不是缓解了现有技术的不足，而是彻底消除了现有技术的不足，这种量变已经达到质变。而且，将图1～2与图3～4对比可以发现，传统方法刺激组和未刺激组的细胞密度均明显少于改进方法，改进方法细胞密度适中，便于实验观察。同时，需要说明的是，目前仅发现固定剂多聚甲醛会诱导中性粒细胞产生NETs，尚未在其他细胞中发现这种现象。因此，本发明改进方法存在特定的使用对象，解决特定对象的特定不足。
综上可见，本发明提供的改进方法，在NETs的验证实验中，能帮助排除因多聚甲醛固定导致的假阳性，且能明显减少实验过程中细胞被洗掉的风险，有利于中性粒细胞的NETs 的相关实验的开展。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。
Claims (1)
1.一种改进的中性粒细胞NETs免疫荧光检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1、提取中性粒细胞，并调整中性粒细胞浓度；
步骤S2、将中性粒细胞加入细胞培养板内，给予或不给予中性粒细胞NETs刺激剂，37℃细胞培养箱孵育；
步骤S3、收集细胞进行甩片机离心；
步骤S4、甩完片后，取出甩完片的细胞黏附片子；
步骤S5、常温干燥6~12h后，多聚甲醛常温固定，Triton透化，BSA常温封闭，T-PBS洗涤；孵育一抗，T-PBS洗涤，常温孵育二抗，DAPI染核封片荧光镜下观察。
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