CN112300984A - 一种医用hUC-MSCs-MVs批量制备流程及质控 - Google Patents

一种医用hUC-MSCs-MVs批量制备流程及质控 Download PDF

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CN112300984A CN202010997119.6A CN202010997119A CN112300984A CN 112300984 A CN112300984 A CN 112300984A CN 202010997119 A CN202010997119 A CN 202010997119A CN 112300984 A CN112300984 A CN 112300984A
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黎艳红
陈安平
谢艳
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程瑞娟
吴邱红
赵雪婷
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Abstract

本发明公开了一种医用hUC‑MSCs‑MVs批量制备流程及质控，包括HUC‑MSCs‑MVs原料及质控、HUC‑MSCs‑MVs制备（流程）及质控、HUC‑MSCs‑MVs存储和运输及质控和一套完整的批量制备及质控流程；本发明能够快速有效的医用批量培养制备hUC‑MSCs‑MVs，且制备效果好，且能够更精准的对hUC‑MSCs‑MVs进行质量把控检测，实用性高，制备流程完善，便于运用批量生产。

Description

一种医用hUC-MSCs-MVs批量制备流程及质控
技术领域
本发明涉及医用培养技术领域，具体是一种医用hUC-MSCs-MVs批量制备流程及质控。
背景技术
外泌体是指包含了复杂 RNA 和蛋白质的小膜泡 (30-150nm)，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现， 1987年Johnstone将其命名为“exosome”。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中 。
所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。 有关他们分泌和摄取及其组成、“运载物”和相应功能的精确分子机制刚刚开始研究。 外泌体目前被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯，对外泌体的研究兴趣日益增长，无论是研究其功能还是了解如何将其用于微创诊断的开发。
现有培养技术培养制备效率低，质控把关较差。
发明内容
本发明的目的在于提供一种医用hUC-MSCs-MVs批量制备流程及质控，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种医用hUC-MSCs-MVs批量制备流程及质控，包括HUC-MSCS-MVS原料及质控、HUC-MSCS-MVS制备流程及质控和HUC-MSCS-MVS存储和运输及质控，所述HUC-MSCS-MVS原料及质控步骤为：
1.自愿捐赠，以自愿的原则，按照国家伦理委员会相关规定，遵守相关法律的前提下，在捐赠者知情同意的情况下，自愿捐赠脐带。
2.产前母体检查，梅毒螺旋体、艾滋病病毒(HIV)、巨细胞病毒(CMV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)等病原体检测;
3.产前母胎儿检查，排除胎儿及胎盘疾病，如：胎儿无先天畸形，无遗传病等；
4.脐带细胞排查，对脐带来源的干细胞进行基因验证测序，排除重大疾病因素；检验干细胞活性；检测细胞有核细胞比例；细菌、霉菌、衣原体等培养阴性等；
5.备用，完善上述检测后，入库冻存备用；
所述HUC-MSCS-MVS制备流程及质控步骤为：
S1、医院捐赠脐带来源，脐带来源进行上述质控检测合格后，在液氮中冻存备用。
S2、将S1步骤中干细胞复苏增殖至80%以上汇合时，进行细胞传代，步骤如下：提前将所需PBS、培养基、胰蛋白酶复温；在超净台中，弃去培养瓶中的细胞上清液，加入5mlPBS，轻轻摇晃，后倒掉，重复3遍。每孔加入1ml0.25%胰蛋白酶，轻轻摇晃使胰酶充分淹没底部细胞，立即放入37℃恒温箱消化3min。3min后取出培养瓶，于光学显微镜下观察细胞是否变圆浮起，可轻轻震荡培养瓶，使大部分细胞在镜下呈漂浮游动状态。迅速于超净台中加入5ml完全培养基终止消化，并将转移至15ml离心管，用PBS冲洗1次瓶内剩余细胞，一同转入离心管中，800rpm离心5min。弃上清，用6ml培养基重悬，轻轻吹打混匀细胞，向已提前加入8ml培养基的3个新培养瓶中各加入2ml细胞混悬液，轻轻摇晃使细胞分布均匀，于光学显微镜下观察确认后，放入37℃/CO2培养箱中培养。
S3、提前将所需PBS、培养基拿出复温。待第5代UC-MSCS增殖至80%以上融合时，弃去细胞上清，加入5mlPBS，冲洗3遍。吸尽瓶中残留的PBS，用不加血清血清培养基，于37℃CO2培养箱中饥饿培养48小时，诱导HMSCS释放MVS。使用梯度离心法提取MVs：hMSCs饥饿培养48小时后，置于无菌操作台中，用电动移液枪吹打细胞表面数次后，收集细胞上清液至50ml离心管中，弃去细胞。4℃400g离心10min后，再4℃2000g离心20min。仔细的将上清液转移到一个新的50ml离心管中，弃去沉淀。此为细胞碎片。将收集的上清液，转移到超高速离心机专用离心管中。将离心管置于超高速离心机中，用电子秤严格配平，4℃50000g离心2小时，弃去上清，将多瓶离心管中的沉淀用PBS洗涤并转移到一个离心管中，用PBS将离心管中的液体补至标准线处，电子秤严格配平，4℃50000g离心2小时，弃去上清，用1mlPBS重悬沉淀，即得提取的MVs，将MVs转移至无菌EP管中，BCA蛋白定量后于-80度保存备用。
S4、质控：所述HUC-MSCS培养扩增至第5代后，按照MSC国际标准，检测hUC-MSCs的干性，检测如下：一、贴壁细胞；二、具有关键表面标志分子；三、多系分化能力，可在体外分化成成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞和其它结缔组织。BCA蛋白定量鉴定步骤为：1、稀释样品：取30μl待测微粒样本，用超纯水稀释，取原液10μl、1/2原液10μl、1/4原液10μl；2、制备蛋白标准品：分别配制6个浓度的蛋白标准品（0、0.05、0.1、0.25、0.4、1μg/μl）；3、制备BCA工作液：BCA反应液与4%硫酸铜按50:1比例配制成工作液；4、上样：先在96孔板中加入100μlBCA工作液，然后在各孔中加入10μl不同浓度的蛋白标准品和待测样本;5、孵育：37℃孵箱孵育45分钟；6、计算蛋白浓度：酶标仪检测各孔在562nm处的OD值，根据标曲线浓度来计算样本浓度。流式细胞术鉴定hMSC-MVs步骤为：（1）从-80度冰箱中取出装有微粒的EP管，置于室温待其完全融化，分别取300ul纳米粒子计数为2×1011个的微粒分装到EP管中；（2）标记6管流式管，每管加入50μl细胞悬液；每管中加入Annexin-Ⅴ-BV4212ul避光孵育10min。再按以下方案在各流式管中加入流式抗体：第1管：CD90-FITC5μl；第2管：CD105-PerCP-Cy5.55μl；第3管：CD73-APC5μl；第4管：空白对照管5μl；第5管：hMSCPositiveIsotypeControlCocktail120μl及PEhMSCNegativeIsotypeControlCocktail20μl；第6管：hMSCPositiveCocktail20μl及PEhMSCNegativeCocktail20μl。（3）轻柔拍打流式管混匀抗体，室温下避光孵育30min；（4）没管中加入PBS150μl使总体积达200μl；（5）加入10.0μl1.33μm的标准定量微球，上机检测。微生物检测：在自动化过程中，选择样本进行微生物检测筛查，确保产品不含细菌、病毒等有害成分；
S5、遵循以下流程：完善母体和胎儿检测—签订自愿捐赠协议—12小时内收集脐带干细胞—对脐带干细胞进行干性、活性、菌体检测—确定安全后采用饥饿方法获得含有MVs的上清—使用梯度离心法获取高含量的MVs—对获得的MVs进行流式、蛋白、粒径、电镜、菌体检测—安全后选用硅化容器保存在-80°以下环境3-6月—使用时迅速融化后用PBS重悬—注射前对其进行形态观测—注射后密切观测患者；
所述HUC-MSCS-MVS存储和运输及质控步骤为：
在上述步骤生产后，选择合适的容器，可以保证其有效性；
国际血栓和止血会（international Society on Thrombosis and Hemostasis,ISTH）推荐使用柠檬酸钠盐为载体，使用硅化容器储存和运输，选用PBS重悬和稀释，尽量保存在-80°以下的温度，避免反复冻融；融化后应在24小时内使用，24小时的温度不高于4°。储存时间在3-6个月，使用时应该进行电镜观察。
作为本发明进一步的方案：纳米粒子跟踪分析法鉴定hMSC-MVs步骤为：取10-30μl微粒样本，用超纯水稀释500-2000倍（根据上机检测情况调整稀释比例），调整至样本上机浓度在107-109颗粒数之间，用1ml注射器抽取稀释好的样本于纳米粒子跟踪分析仪，上机检测粒子直径及粒子数。
作为本发明再进一步的方案：选用无菌硅化容器在-80°下储存，储存时间为3-6月；运输采用干冰运输，温度保持在-10°以下。
作为本发明再进一步的方案：根据临床治疗情况，选择合适的患者，根据体重指定注射剂量，37°水浴迅速解冻，解冻后用0.9%的生理盐水稀释，稀释比为1：200ml，在室温为25°的生物治疗室进行注射，静脉给药时按照40滴/min注射，局部用药时适量。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：所述BCA蛋白定量检测、纳米粒子跟踪分析法鉴定hMSC-MVs和流式细胞术鉴定hMSC-MVs，能够精准有效的进行检测质控，所述选用无菌玻璃瓶在-80°下储存，储存时间可达到3-6个月的时间，本发明能够快速有效的批量培养制备hUC-MSCs-MVs，且制备效果好，且能够更精准的对hUC-MSCs-MVs进行质量把控检测，实用性高。
附图说明
图1为医用hUC-MSCs-MVs批量制备流程及质控的流程示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中，一种医用hUC-MSCs-MVs批量制备流程及质控，包括HUC-MSCS-MVS原料及质控、HUC-MSCS-MVS制备流程及质控和HUC-MSCS-MVS存储和运输及质控，所述HUC-MSCS-MVS原料及质控步骤为：
1.自愿捐赠，以自愿的原则，按照国家伦理委员会相关规定，遵守相关法律的前提下，在捐赠者知情同意的情况下，自愿捐赠脐带。
2.产前母体检查，梅毒螺旋体、艾滋病病毒(HIV)、巨细胞病毒(CMV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)等病原体检测;
3.产前母胎儿检查，排除胎儿及胎盘疾病，如：胎儿无先天畸形，无遗传病等；
4.脐带细胞排查，对脐带来源的干细胞进行基因验证测序，排除重大疾病因素；检验干细胞活性；检测细胞有核细胞比例；细菌、霉菌、衣原体等培养阴性等；
5.备用，完善上述检测后，入库冻存备用；
所述HUC-MSCS-MVS制备流程及质控步骤为：
S1、医院捐赠脐带来源，脐带来源进行上述质控检测合格后，在液氮中冻存备用。
S2、将S1步骤中干细胞复苏增殖至80%以上汇合时，进行细胞传代，步骤如下：提前将所需PBS、培养基、胰蛋白酶复温；在超净台中，弃去培养瓶中的细胞上清液，加入5mlPBS，轻轻摇晃，后倒掉，重复3遍。每孔加入1ml0.25%胰蛋白酶，轻轻摇晃使胰酶充分淹没底部细胞，立即放入37℃恒温箱消化3min。3min后取出培养瓶，于光学显微镜下观察细胞是否变圆浮起，可轻轻震荡培养瓶，使大部分细胞在镜下呈漂浮游动状态。迅速于超净台中加入5ml完全培养基终止消化，并将转移至15ml离心管，用PBS冲洗1次瓶内剩余细胞，一同转入离心管中，800rpm离心5min。弃上清，用6ml培养基重悬，轻轻吹打混匀细胞，向已提前加入8ml培养基的3个新培养瓶中各加入2ml细胞混悬液，轻轻摇晃使细胞分布均匀，于光学显微镜下观察确认后，放入37℃/CO2培养箱中培养。
S3、提前将所需PBS、培养基拿出复温。待第5代UC-MSCS增殖至80%以上融合时，弃去细胞上清，加入5mlPBS，冲洗3遍。吸尽瓶中残留的PBS，用不加血清血清培养基，于37℃CO2培养箱中饥饿培养48小时，诱导HMSCS释放MVS。使用梯度离心法提取MVs：hMSCs饥饿培养48小时后，置于无菌操作台中，用电动移液枪吹打细胞表面数次后，收集细胞上清液至50ml离心管中，弃去细胞。4℃400g离心10min后，再4℃2000g离心20min。仔细的将上清液转移到一个新的50ml离心管中，弃去沉淀。此为细胞碎片。将收集的上清液，转移到超高速离心机专用离心管中。将离心管置于超高速离心机中，用电子秤严格配平，4℃50000g离心2小时，弃去上清，将多瓶离心管中的沉淀用PBS洗涤并转移到一个离心管中，用PBS将离心管中的液体补至标准线处，电子秤严格配平，4℃50000g离心2小时，弃去上清，用1mlPBS重悬沉淀，即得提取的MVs，将MVs转移至无菌EP管中，BCA蛋白定量后于-80度保存备用。
S4、质控：所述HUC-MSCS培养扩增至第5代后，按照MSC国际标准，检测hUC-MSCs的干性，检测如下：一、贴壁细胞；二、具有关键表面标志分子；三、多系分化能力，可在体外分化成成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞和其它结缔组织。BCA蛋白定量鉴定步骤为：1、稀释样品：取30μl待测微粒样本，用超纯水稀释，取原液10μl、1/2原液10μl、1/4原液10μl；2、制备蛋白标准品：分别配制6个浓度的蛋白标准品（0、0.05、0.1、0.25、0.4、1μg/μl）；3、制备BCA工作液：BCA反应液与4%硫酸铜按50:1比例配制成工作液；4、上样：先在96孔板中加入100μlBCA工作液，然后在各孔中加入10μl不同浓度的蛋白标准品和待测样本;5、孵育：37℃孵箱孵育45分钟；6、计算蛋白浓度：酶标仪检测各孔在562nm处的OD值，根据标曲线浓度来计算样本浓度。流式细胞术鉴定hMSC-MVs步骤为：（1）从-80度冰箱中取出装有微粒的EP管，置于室温待其完全融化，分别取300ul纳米粒子计数为2×1011个的微粒分装到EP管中；（2）标记6管流式管，每管加入50μl细胞悬液；每管中加入Annexin-Ⅴ-BV4212ul避光孵育10min。再按以下方案在各流式管中加入流式抗体：第1管：CD90-FITC5μl；第2管：CD105-PerCP-Cy5.55μl；第3管：CD73-APC5μl；第4管：空白对照管5μl；第5管：hMSCPositiveIsotypeControlCocktail120μl及PEhMSCNegativeIsotypeControlCocktail20μl；第6管：hMSCPositiveCocktail20μl及PEhMSCNegativeCocktail20μl。（3）轻柔拍打流式管混匀抗体，室温下避光孵育30min；（4）没管中加入PBS150μl使总体积达200μl；（5）加入10.0μl1.33μm的标准定量微球，上机检测。微生物检测：在自动化过程中，选择样本进行微生物检测筛查，确保产品不含细菌、病毒等有害成分；
S5、遵循以下流程：完善母体和胎儿检测—签订自愿捐赠协议—12小时内收集脐带干细胞—对脐带干细胞进行干性、活性、菌体检测—确定安全后采用饥饿方法获得含有MVs的上清—使用梯度离心法获取高含量的MVs—对获得的MVs进行流式、蛋白、粒径、电镜、菌体检测—安全后选用硅化容器保存在-80°以下环境3-6月—使用时迅速融化后用PBS重悬—注射前对其进行形态观测—注射后密切观测患者；
所述HUC-MSCS-MVS存储和运输及质控步骤为：
在上述步骤生产后，选择合适的容器，可以保证其有效性；
国际血栓和止血会（international Society on Thrombosis and Hemostasis,ISTH）推荐使用柠檬酸钠盐为载体，使用硅化容器储存和运输，选用PBS重悬和稀释，尽量保存在-80°以下的温度，避免反复冻融；融化后应在24小时内使用，24小时的温度不高于4°。储存时间在3-6个月，使用时应该进行电镜观察。
本发明的工作原理是：将所需PBS、培养基、胰蛋白酶复温；在超净台中，弃去培养瓶中的细胞上清液，加入5mlPBS，轻轻摇晃，后倒掉，重复3遍。每孔加入1ml0.25%胰蛋白酶，轻轻摇晃使胰酶充分淹没底部细胞，立即放入37℃恒温箱消化3min。3min后取出培养瓶，于光学显微镜下观察细胞是否变圆浮起，可轻轻震荡培养瓶，使大部分细胞在镜下呈漂浮游动状态。迅速于超净台中加入5ml完全培养基终止消化，并将转移至15ml离心管，用PBS冲洗1次瓶内剩余细胞，一同转入离心管中，800rpm离心5min。弃上清，用6ml培养基重悬，轻轻吹打混匀细胞，向已提前加入8ml培养基的3个新培养瓶中各加入2ml细胞混悬液，轻轻摇晃使细胞分布均匀，于光学显微镜下观察确认后，放入37℃/CO2培养箱中培养，提前将所需PBS、培养基拿出复温。待第5代UC-MSCS增殖至80%以上融合时，弃去细胞上清，加入5mlPBS，冲洗3遍。吸尽瓶中残留的PBS，用不加血清血清培养基，于37℃CO2培养箱中饥饿培养48小时，诱导HMSCS释放MVS。使用梯度离心法提取MVs：hMSCs饥饿培养48小时后，置于无菌操作台中，用电动移液枪吹打细胞表面数次后，收集细胞上清液至50ml离心管中，弃去细胞。4℃400g离心10min后，再4℃2000g离心20min。仔细的将上清液转移到一个新的50ml离心管中，弃去沉淀。此为细胞碎片。将收集的上清液，转移到超高速离心机专用离心管中。将离心管置于超高速离心机中，用电子秤严格配平，4℃50000g离心2小时，弃去上清，将多瓶离心管中的沉淀用PBS洗涤并转移到一个离心管中，用PBS将离心管中的液体补至标准线处，电子秤严格配平，4℃50000g离心2小时，弃去上清，用1mlPBS重悬沉淀，即得提取的MVs，将MVs转移至无菌EP管中，BCA蛋白定量后于-80度保存备用。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (4)

1.一种医用hUC-MSCs-MVs批量制备流程及质控，其特征在于，包括HUC-MSCs-MVs原料及质控、HUC-MSCs-MVs制备（流程）及质控和HUC-MSCs-MVs存储和运输及质控，所述HUC-MSCs-MVs原料及质控步骤为：
1.自愿捐赠，以自愿的原则，按照国家伦理委员会相关规定，遵守相关法律的前提下，在捐赠者知情同意的情况下，自愿捐赠脐带；
2.产前母体检查，梅毒螺旋体、艾滋病病毒(HIV)、巨细胞病毒(CMV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)等病原体检测；
3.产前母胎儿检查，排除胎儿及胎盘疾病，如：胎儿无先天畸形，无遗传病等；
4.脐带细胞排查，对脐带来源的干细胞进行基因验证测序，排除重大疾病因素；检验干细胞活性；检测细胞有核细胞比例；细菌、霉菌、衣原体等培养阴性等；
5.备用，完善上述检测后，入库冻存备用；
所述HUC-MSCs-MVs制备（流程）及质控步骤为：
S1、医院捐赠脐带来源，脐带来源进行上述质控检测合格后，在液氮中冻存备用；
S2、将S1步骤中干细胞复苏增殖至80%以上汇合时，进行细胞传代，步骤如下：提前将所需PBS、培养基、胰蛋白酶复温；在超净台中，弃去培养瓶中的细胞上清液，加入5mlPBS，轻轻摇晃，后倒掉，重复3遍；
每孔加入1ml0.25%胰蛋白酶，轻轻摇晃使胰酶充分淹没底部细胞，立即放入37℃恒温箱消化3min；
3min后取出培养瓶，于光学显微镜下观察细胞是否变圆浮起，可轻轻震荡培养瓶，使大部分细胞在镜下呈漂浮游动状态；
迅速于超净台中加入5ml完全培养基终止消化，并将转移至15ml离心管，用PBS冲洗1次瓶内剩余细胞，一同转入离心管中，800rpm离心5min；
弃上清，用6ml培养基重悬，轻轻吹打混匀细胞，向已提前加入8ml培养基的3个新培养瓶中各加入2ml细胞混悬液，轻轻摇晃使细胞分布均匀，于光学显微镜下观察确认后，放入37℃/CO2培养箱中培养；
S3、提前将所需PBS、培养基拿出复温；
待第5代UC-MSCS增殖至80%以上融合时，弃去细胞上清，加入5mlPBS，冲洗3遍；
吸尽瓶中残留的PBS，用不加血清血清培养基，于37℃CO2培养箱中饥饿培养48小时，诱导HMSCS释放MVS；
使用梯度离心法提取MVs：hMSCs饥饿培养48小时后，置于无菌操作台中，用电动移液枪吹打细胞表面数次后，收集细胞上清液至50ml离心管中，弃去细胞；
4℃400g离心10min后，再4℃2000g离心20min；
仔细的将上清液转移到一个新的50ml离心管中，弃去沉淀；
此为细胞碎片；
将收集的上清液，转移到超高速离心机专用离心管中；
将离心管置于超高速离心机中，用电子秤严格配平，4℃50000g离心2小时，弃去上清，将多瓶离心管中的沉淀用PBS洗涤并转移到一个离心管中，用PBS将离心管中的液体补至标准线处，电子秤严格配平，4℃50000g离心2小时，弃去上清，用1mlPBS重悬沉淀，即得提取的MVs，将MVs转移至无菌EP管中，BCA蛋白定量后于-80度保存备用；
S4、质控：所述HUC-MSCS培养扩增至第5代后，按照MSC国际标准，检测hUC-MSCs的干性，检测如下：一、贴壁细胞；二、具有关键表面标志分子；三、多系分化能力，可在体外分化成成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞和其它结缔组织；
BCA蛋白定量鉴定步骤为：1、稀释样品：取30μl待测微粒样本，用超纯水稀释，取原液10μl、1/2原液10μl、1/4原液10μl；2、制备蛋白标准品：分别配制6个浓度的蛋白标准品（0、0.05、0.1、0.25、0.4、1μg/μl）；3、制备BCA工作液：BCA反应液与4%硫酸铜按50:1比例配制成工作液；4、上样：先在96孔板中加入100μlBCA工作液，然后在各孔中加入10μl不同浓度的蛋白标准品和待测样本;5、孵育：37℃孵箱孵育45分钟；6、计算蛋白浓度：酶标仪检测各孔在562nm处的OD值，根据标曲线浓度来计算样本浓度；
流式细胞术鉴定hMSC-MVs步骤为：（1）从-80度冰箱中取出装有微粒的EP管，置于室温待其完全融化，分别取300ul纳米粒子计数为2×1011个的微粒分装到EP管中；（2）标记6管流式管，每管加入50μl细胞悬液；每管中加入Annexin-Ⅴ-BV4212ul避光孵育10min；
再按以下方案在各流式管中加入流式抗体：第1管：CD90-FITC5μl；第2管：CD105-PerCP-Cy5.55μl；第3管：CD73-APC5μl；第4管：空白对照管5μl；第5管：hMSCPositiveIsotypeControlCocktail120μl及PEhMSCNegativeIsotypeControlCocktail20μl；第6管：hMSCPositiveCocktail20μl及PEhMSCNegativeCocktail20μl；
（3）轻柔拍打流式管混匀抗体，室温下避光孵育30min；（4）没管中加入PBS150μl使总体积达200μl；（5）加入10.0μl1.33μm的标准定量微球，上机检测；
微生物检测：在自动化过程中，选择样本进行微生物检测筛查，确保产品不含细菌、病毒等有害成分；
S5、遵循以下流程：完善母体和胎儿检测—签订自愿捐赠协议—12小时内收集脐带干细胞—对脐带干细胞进行干性、活性、菌体检测—确定安全后采用饥饿方法获得含有MVs的上清—使用梯度离心法获取高含量的MVs—对获得的MVs进行流式、蛋白、粒径、电镜、菌体检测—安全后选用硅化容器保存在-80°以下环境3-6月—使用时迅速融化后用PBS重悬—注射前对其进行形态观测—注射后密切观测患者；
所述HUC-MSCS-MVS存储和运输及质控步骤为：
在上述步骤生产后，选择合适的容器，可以保证其有效性；
国际血栓和止血会（international Society on Thrombosis and Hemostasis,ISTH）推荐使用柠檬酸钠盐为载体，使用硅化容器储存和运输，选用PBS重悬和稀释，尽量保存在-80°以下的温度，避免反复冻融；融化后应在24小时内使用，24小时的温度不高于4°；
储存时间在3-6个月，使用时应该进行电镜观察。
2.根据权利要求1所述的医用hUC-MSCs-MVs批量制备流程及质控，其特征在于，纳米粒子跟踪分析法鉴定hMSC-MVs步骤为：取10-30μl微粒样本，用超纯水稀释500-2000倍（根据上机检测情况调整稀释比例），调整至样本上机浓度在107-109颗粒数之间，用1ml注射器抽取稀释好的样本于纳米粒子跟踪分析仪，上机检测粒子直径及粒子数。
3.根据权利要求1所述的医用hUC-MSCs-MVs批量制备流程及质控，其特征在于，选用无菌硅化容器在-80°下储存，储存时间为3-6月；运输采用干冰运输，温度保持在-10°以下。
4.根据权利要求1所述的医用hUC-MSCs-MVs批量制备流程及质控，其特征在于，根据临床治疗情况，选择合适的患者，根据体重指定注射剂量，37°水浴迅速解冻，解冻后用0.9%的生理盐水稀释，稀释比为1：200ml，在室温为25°的生物治疗室进行注射，静脉给药时按照40滴/min注射，局部用药时适量。
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