CN117721076A - 一种间充质干细胞规模化培养的方法及应用 - Google Patents

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CN117721076A CN202311759805.XA CN202311759805A CN117721076A CN 117721076 A CN117721076 A CN 117721076A CN 202311759805 A CN202311759805 A CN 202311759805A CN 117721076 A CN117721076 A CN 117721076A
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张博洋
许文华
韩素云
顾雨春
吴理达
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Abstract

本发明公开了一种间充质干细胞规模化培养的方法及应用，本发明提供了一种间充质干细胞规模化培养的方法，同时提供了用于该规模化培养的方法的间充质干细胞培养基，本发明提供的间充质干细胞规模化培养的方法可以实时监测细胞增殖状态，有效提高MSC细胞的收获效率及质量，本发明提供的方法细胞回收率接近100％，且消化的细胞没有结块现象，是非常好的MSC细胞规模化生产的方法，具有广阔的应用和市场潜力。

Description

一种间充质干细胞规模化培养的方法及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种间充质干细胞规模化培养的方法及应用。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一种具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞，不仅支持造血干细胞的生长，还可以在不同诱导条件下，可分化为脂肪、骨、肌肉、神经、肝、心肌、胰岛β细胞和内皮等多种组织细胞。MSCs可用于治疗神经系统疾病、肝肾损伤、自身免疫疾病、心脏疾病、骨疾病、缺血性血管疾病、糖尿病并发症和肿瘤等疾病，具有广阔的临床应用前景。因此如何提高MSCs数量及质量，满足临床应用的实际需求，是实现MSCs产业化主要的研究重点。与其他大规模培养工艺，比如多层“细胞工厂”，普通2D平皿培养细胞并不占优势，通常需要20个150mm皿扩增的细胞才可以达到一个十层“细胞工厂”的细胞产量，但MSCs在“细胞工厂”各层分布不均匀、收获的细胞质量批次间差异大，且不易观察，无法实时监测细胞增殖状态和质量，且收获细胞时面临着胰酶消化时间长，细胞的收获效率及质量都难以保障。
发明内容
为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供了以下技术方案：
本发明的第一方面提供了一种间充质干细胞规模化培养的方法，所述方法包括：
1)使用间充质干细胞培养基悬浮间充质干细胞，调整细胞浓度，接种到铺有纤维膜的容器中；
2)连续培养4-12天，待观察到MSC细胞长势明显后，使用DPBS洗涤，后用干细胞消化酶消化，得到间充质干细胞。
进一步，所述间充质干细胞培养基包括基础培养基与添加剂，所述基础培养基为α-MEM培养基，所述添加剂为血小板裂解物和Penicillin-Streptomycin。
进一步，所述血小板裂解物包括人血小板裂解物。
进一步，所述人血小板裂解物包括人血小板裂解液。
进一步，所述血小板裂解液的终浓度为5％。
术语“人血小板裂解液”，用于间充质干细胞培养，人血小板裂解液来源于混合人的血小板裂解物，与含有在胎牛血清(FBS)和人AB血清中相同的生长因子和细胞因子相当的水平。
进一步，步骤2)中干细胞消化酶消化后用于细胞计数或流式检测则使用DPBS进行收集。
进一步，步骤2)中干细胞消化酶消化后用于继续培养接种则使用完全培养基进行收集，其中完全培养基为商业来源的常规间充质干细胞完全培养基。
进一步，步骤2)中干细胞消化酶消化后直接冻存则使用细胞冻存液进行收集，其中细胞冻存液为商业来源的常规间充质干细胞细胞冻存液。
术语“间充质干细胞”是指一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力。所述间充质干细胞来源于骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺、口腔、颅颌面(脱落乳牙、牙髓、牙周膜、牙龈、根尖牙乳头等)等组织以及羊水、脐带血，即所述间充质干细胞是骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、滑膜间充质干细胞、骨骼间充质干细胞、肌肉间充质干细胞、肺间充质干细胞、肝间充质干细胞、胰腺间充质干细胞、羊水间充质干细胞、脐带血间充质干细胞等。
术语“分化”是指一个细胞从原始阶段朝着更成熟的细胞(即非原始)的细胞发展。在本发明的具体实施方案中，所述“分化”具体为间充质干细胞向多方向进行分化，更具体的，MSC细胞可分化为骨、软骨、脂肪、成纤维等多种组织细胞。
进一步，所述Penicillin-Streptomycin的终浓度为1％。
进一步，所述步骤2)连续培养4-12天期间，还包括观察MSC细胞长势的步骤，具体步骤包括：取部分涤纶纤维膜中未消化的细胞用DPBS洗涤，4％PFA固定，再使用DPBS洗涤，然后加结晶紫染色，最后加DPBS在显微镜下观察MSC细胞。
进一步，所述结晶紫终浓度为0.005％。
进一步，所述步骤2)连续培养4-12天期间，还包括观察MSC细胞长势的步骤，具体步骤包括：取部分涤纶纤维膜中未消化的细胞用DPBS洗涤，4％PFA固定10min，再使用DPBS洗涤，然后加0.005％结晶紫染色10min，最后加DPBS在显微镜下观察MSC细胞。
在一些实施方案中，所述间充质干细胞规模化培养的细胞暂时不进行应用时，使用细胞冻存液进行最后的收集，并进行常规化冻存处理。所述细胞冻存液来自于常规商业来源。
在一些实施方案中，所述连续培养的天数包括4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天，具体天数计算为MSC细胞能够保持对数期增殖的时间。
进一步，所述容器包括低吸附容器。
术语“低吸附容器”是指，表面具有涂层的容器，该涂层可以阻止蛋白质在容器表面吸附，从而尽可能减少了单层细胞与容器的粘附。此类容器是本领域技术人员熟知的。
术语“容器”是指其中可以发生生化反应(例如，靶蛋白和抗体结合、核酸杂交和引物延伸)或细胞生长的隔室(例如，微流通道、孔、管或液滴)。术语“容器”和“隔室”可以互换使用。容器或隔室可以是固体壁的(当容器或隔室的边界是固体，如玻璃、塑料或聚二甲基硅氧烷(PDMS))，或液体壁的(当容器或隔室的边界是液体，如油)。固体壁容器可以含有一个固体支架，它是连接所有容器的连续固体。隔室的体积可以大至可允许工业化、规模化生产，或小至1皮升。隔室中水性内含物的体积可以小于或约等于隔室的体积。容器可以包含多种可聚合或可胶凝的聚合物和/或单体。多种可聚合或可胶凝的聚合物和/或单体可以在聚合或胶凝时形成水凝胶或硬化基质，从而形成硬化颗粒。硬化颗粒可以是珠。硬化颗粒可以是多孔颗粒。硬化颗粒可以是水凝胶颗粒。水凝胶颗粒可以由凝胶状聚合物，如交联聚丙烯酰胺、交联PEG、琼脂糖或海藻酸盐制成。硬化颗粒经处理或刺激后可以熔化。容器可以包含多种细胞生长，且该容器对细胞生长本身不产生任何正面或负面的影响。
进一步，所述步骤1)间充质干细胞包括原代间充质干细胞、传代间充质干细胞。
术语“原代间充质干细胞”是指，直接从机体取出的组织(例如脂肪组织、脐带、骨髓或脐血)中分离获得的间充质干细胞。
进一步，所述调整细胞浓度包括1000-50000个/cm2。
在一些实施方案中，所述调整细胞浓度包括1000个/cm2、2000个/cm2、3000个/cm2、4000个/cm2、5000个/cm2、6000个/cm2、7000个/cm2、8000个/cm2、9000个/cm2、10000个/cm2、15000个/cm2、20000个/cm2、25000个/cm2、30000个/cm2、35000个/cm2、40000个/cm2、45000个/cm2、50000个/cm2及50000个/cm2以上。
进一步，所述调整细胞浓度为5000个/cm2。
进一步，所述纤维膜可以是单层或多层。
进一步，所述纤维膜包括涤纶纤维膜、海藻纤维膜、蚕丝纤维膜。
进一步，所述纤维膜使用前经高压蒸汽灭菌。
术语“纤维膜”是指天然或人工制造的具备孔隙结构的膜层。术语“涤纶纤维膜”是指合成纤维中的一个重要品种，是我国聚酯纤维的商品名称。是以聚对苯二甲酸(PTA)或对苯二甲酸二甲酯(DMT)和乙二醇(MEG)为原料经酯化或酯交换和缩聚反应而制得的成纤高聚物--聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)，经纺丝和后处理制成的纤维。术语“海藻纤维膜”是指从海洋中一些棕色藻类植物中提取得到的海藻酸为原料制得的纤维。术语“蚕丝纤维膜”是指蚕吐丝后的蚕丝为原料制得的纤维膜。
进一步，所述DPBS为无钙离子、无镁离子DPBS。
术语“DPBS”是指杜氏磷酸盐缓冲液。
进一步，所述干细胞消化酶包括干细胞温和消化酶。
在某些具体的实施方案中，所述干细胞温和消化酶来自具有商业来源的干细胞消化酶，如TrypLE，Accutase等。
进一步，所述干细胞消化酶的终浓度为1×。
进一步，所述方法的实施过程中可通过普通显微镜肉眼观察细胞增殖与消化情况。
术语“规模化培养”指工厂有组织、有秩序，按照固定模式进行大批量培养细胞的工艺。
在一些实施方案中，所述间充质干细胞规模化培养的方法包括以下步骤：1)使用间充质干细胞培养基悬浮间充质干细胞，调整间充质干细胞浓度为1000-50000个/cm2，接种到铺有单层或多层的纤维膜的容器中，其中所述间充质干细胞培养基由基础培养基为α-MEM培养基，添加剂为终浓度为5％的人血小板裂解液和终浓度为1％的Penicillin-Streptomycin组成；2)连续培养4-12天，使用不含有钙离子与镁离子的DPBS洗涤，然后使用终浓度为1×的干细胞消化酶消化，最终得到间充质干细胞。在某个具体的实施方案中，所述纤维膜可以是涤纶纤维膜、海藻纤维膜、蚕丝纤维膜，更具体的为涤纶纤维膜。在某个具体的实施方案中，所述干细胞消化酶为干细胞温和消化酶。
术语“干细胞消化酶”在本发明中代指用于间充质干细胞传代消化的无动物源基因重组消化酶。
术语“增殖”是指有丝分裂后细胞的生长和分裂。在一些实施方案中，术语“增殖”在本文中关于有丝分裂后细胞使用时是指在一段时间内数量增加的有丝分裂后细胞群体。术语“扩增”应理解为具有其在本领域中的通常含义，即已在体外增殖的细胞。可以扩增MSC以提供在标准培养条件下保留MSC的至少一种生物学功能(通常是粘附到塑料表面的能力)的细胞群。扩增的细胞群可以保留分化成一种或多种细胞类型的能力。
本发明的第二方面提供了一种前面任一项所述的方法中使用的间充质干细胞培养基，所述间充质干细胞培养基包括基础培养基与添加剂，所述基础培养基为α-MEM培养基，所述添加剂为血小板裂解物和Penicillin-Streptomycin。
进一步，所述血小板裂解物包括人血小板裂解物。
进一步，所述人血小板裂解物包括人血小板裂解液。
进一步，所述人血小板裂解液的终浓度为5％。
进一步，所述Penicillin-Streptomycin的终浓度为1％。
术语“Penicillin-Streptomycin”是指青霉素-链霉素。
术语“培养基”是本领域公认的，并且通常是指用于培养活细胞的任何物质或制备物。如在提及细胞培养中所使用的术语“培养基”包括细胞周围环境的组分。培养基可以是固体、液体、气体或相和材料的混合物。培养基包括液体生长培养基以及不维持细胞生长的液体培养基。培养基还包括凝胶状培养基，例如琼脂、琼脂糖、明胶和胶原基质。示例性气体培养基包括在培养皿或其他固体或半固体支持物上生长的细胞所暴露的气相。术语“培养基”还指意图用于细胞培养的材料，即使其尚未与细胞接触。换言之，准备用于细胞培养的营养丰富的液体是培养基。类似地，当与水或其它液体混合时变得适于细胞培养的粉末混合物可被称为“粉状培养基”。术语“基础培养基”是指促进不需要任何特殊营养补充剂的许多类型的微生物生长的培养基。大多数基础培养基通常包含四种基本化学基团：氨基酸、碳水化合物、无机盐和维生素。基础培养基通常用作更复杂的培养基的基础，向该基础培养基中加入补充剂如血清、缓冲液、生长因子、脂质等。
本发明的第三方面提供了前面任一项所述的方法制备的间充质干细胞。
本发明的第四方面提供了一种组合物，所述组合物包括前面任一项所述的方法中使用的试剂。
进一步，所述组合物包括前面所述的间充质干细胞培养基、DPBS溶液、干细胞消化酶。
术语“组合物”涵盖并公开任何包含各自列举的物质(或由其组成或基本上由其组成)的物理实体，组合物的物理形式不受限制。例如，术语“组合物”涵盖并公开了一种粉末，其中所述列举的物质各自以粉末形式存在。在一个实施方案中，术语“组合物”还涵盖并公开了一种液体溶液，其中所述列举的物质各自以可溶性形式存在。在一个实施方案中，术语“组合物”还涵盖并公开了一种乳液，其中存在列举的物质。在一个实施方案中，术语“组合物”还涵盖并公开了一种悬浮液，其中存在列举的物质。在一个实施方案中，术语“组合物”还涵盖并公开了混合物，其中如上定义的试剂呈一种形式。
本发明的第五方面提供了前面任一项所述的方法、前面所述的间充质干细胞培养基在规模化制备间充质干细胞中的应用。
本发明的第六方面提供了前面任一项所述的方法、前面所述的间充质干细胞培养基在制备自动化生产间充质干细胞的系统或装置的应用。
术语“自动化”是指无需“通过手工”(即手动)执行程序或方法的任何一个或多个步骤(例如细胞收集)的情况，但其中所述所希望的步骤或程序(例如细胞收集)可以通过一个或多个合适的装置或系统诸如一个或多个机器人、液体处理机器人和/或其他(例如溶剂配制)液体转移装置进行，该装置或系统在进行一个或多个步骤之前被编程，使得相应的步骤和模式(特别是收集步骤)根据已编程的内容以自动化方式进行。
本发明的第七方面提供了一种系统或装置，所述系统或装置包括处理器，所述处理器用于实施前面任一项所述的方法的步骤。
进一步，所述处理器包括单个或多个。
进一步，所述系统或装置还包括存储器。
进一步，所述存储器存储计算机程序。
进一步，所述计算机程序用于编程前面任一项所述的方法的步骤。
进一步，所述计算机程序由处理器执行具体操作。
进一步，所述存储器包括一个或多个。
术语“系统”或术语“装置”不仅指具有多台计算机、各件硬件、各装置等经由诸如网络等通信单元而彼此连接(包括以一对一方式建立的通信连接)的构造的系统或装置，而且指由一台计算机、一件硬件、一个装置等实现的系统或装置。术语“装置”和术语“系统”用作具有相同含义的术语。在一些实施方案中，所述系统或装置配置的硬件以及相应计算机储存的软件及计算机程序共同实施生产的功能，具体的为生产间充质干细胞。
在具体的实施方案中，所述计算机程序中的一个即可构造一个处理器，或者可利用一个程序构造多个处理器。相反，可利用多个计算机程序构造一个处理器。此外，可由一台计算机执行多个计算机程序，亦可由一台计算机操控多个处理器；同样的，可由多台计算机执行单个计算机程序，亦可由多台计算机操作单个处理器。在某些实施方案中，所述计算机储存有存储器。在另一些实施方案中，存储器可单独存储。
在某些实施方案中，由各个处理器进行的每个处理或在一个处理器中进行多个处理的情况下的每个处理，从存储器或计算机中读取作为对象的信息。在进行处理之后，将处理结果写入存储器或计算机中。相应地，在一些情况下省略描述在进行处理之前从存储器或计算机中读取及在进行处理之后写入存储器或计算机。这里的存储器的实例可包括硬盘(HD)、随机存取存储器(RAM)、外部存储介质、经由通信线路连接的存储介质以及中央处理单元(CPU)中包括的寄存器，这些存储器可单独存储，也可在计算机中以存储装置形式存在。
术语“处理器”旨在包括能够对至少一个指令语进行操作，例如执行其从存储介质访问的指令、代码、计算机程序和脚本的任何集成电路或其他电子设备与机械设备。然而，术语“处理器”不应被解释为仅限于能够执行软件的硬件，而是以一般方式指代处理设备，其可以例如包括微处理器、集成电路或可编程的逻辑设备(PLD)。处理器还可以涵盖一个或多个图形处理单元(GPU)，无论是用于计算机图形和图像处理还是其他功能。此外，能够执行相关的和/或产生的功能性的指令和/或数据可以存储在任何处理器可读介质上，包括但不限于集成电路、硬盘、磁带(包括软盘和压缩磁盘)、光盘(包括蓝光、激光光盘和数字通用光盘)、闪存(包括存储卡和USB闪存驱动器)、随机存取存储器(RAM)(包括动态和静态RAM)、只读存储器(ROM)或高速缓存。指令尤其可以存储在硬件、软件、固件或其任何组合中。
本发明的第八方面提供了一种间充质干细胞的培养试剂盒，所述试剂盒包括前面任一项所述的方法中使用的试剂、容器、和纤维膜。
进一步，所述纤维膜包括涤纶纤维膜、海藻纤维膜、蚕丝纤维膜。
单数(例如“一个”或“一种”)的使用可包括复数，除非另外明确说明。如本文所用，“一个或多个”是“至少一个”的同义词，并且旨在指代一种试剂或多于一种试剂的任何组合。如下文所用，单数“一个试剂”或“一种试剂”旨在指代如上定义的一种或多种试剂。当成分与不同于一种或多种试剂的附加试剂一起使用时，该附加试剂被定义为“其他试剂”。此外，术语“包括”以及诸如“包括了”和“包括的”之类的其他语法形式的使用不是限制性的。
术语“包含”具有广泛的标准含义“包括”、“涵盖”或“含有”。它包括明确列举的一个或多个元素，并且还允许但不要求，存在其他或另一个未引用的一个或多个元素。除了本文所用的这种广泛含义之外，术语“包括”还涵盖限制性含义“由……组成”，根据该含义，仅存在明确列举的一个或多个元素，不存在其他一个或多个元素。此外，术语“包括”还包括“基本上由……组成”的含义，这意味着除了明确列举的那些之外，还可以存在额外一个或多个元素，前提是额外存在的一个或多个元素不会改变通过明确列举的一个或多个元素所实现的技术效果。
如本文所用，术语“约”、“大约”及其同义词在涉及特定值时，例如一个范围的一个或多个端点，除了具体列举的值本身之外，还涵盖并公开了围绕具体列举的值的某种变化。这种变化可以例如由正常的测量可变性引起，例如通过技术人员已知的方法称重或分配各种物质。术语“约”、“大约”及其同义词应理解为涵盖和公开高于和低于指定的具体值的可变性范围。
本发明的优点和有益效果：
本发明提供了一种间充质干细胞规模化培养的方法，该方法在普通显微镜下可肉眼观察到间充质干细胞在纤维膜上生长。该方法培养间充质干细胞更有利于细胞的贴壁和增殖，达到细胞倍数扩增，而且在获取扩增后细胞是只需要使用普通消化液处理即可。
本发明提供的方法得到的扩增的间充质干细胞数量可达初始数量的7.5倍，且消化液在纤维膜上易于消化间充质干细胞，细胞回收率接近100％，消化的细胞没有结块现象产生，因此十分适合间充质干细胞规模化生产，拥有广阔的应用和市场前景。
附图说明
图1是MSC细胞在涤纶纤维膜上的生长情况图；
图2是MSC细胞在涤纶纤维膜上结晶紫的染色情况图；
图3是扩增后的MSC细胞的流式检测结果图。
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
除非特别指明，否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。
实施例1
1、实验材料
本实施例中使用的试剂如表1所示。
表1
2、实验方法
(1)脐带来源MSC的制备方法
a.手术室洁净条件下，将脐带组织放入预先加注有100mL脐带保存液的保存瓶中，密封，2-8℃条件下运输至实验室。
b.将脐带放置于超净台内，用100mL 75％医用酒精倒入脐带采集瓶中，消毒约1min后，用无菌的钩齿镊取出脐带，置于提前准备好的含生理盐水的10cm培养皿中，清洗2～3遍(最多5个10cm皿)，测量脐带的长度。将组织表面血污清洗干净，用手术剪将脐带剪成小段(3-5cm)，用无菌剪刀沿静脉血管平行方向剪开脐带，再用钩齿镊慢慢沿边撕掉静脉膜，然后平摊开脐带，寻找两根动脉血管；用钩齿镊去除脐带内2条动脉，剩余部分即为华通氏胶和脐带表面羊膜；用两个钩齿镊子分离出华通氏胶，慢慢剥离胶体、注意不能连带羊膜层。
c.将分离出的华通氏胶置于25mL灭菌好的烧杯中，用手术剪剪碎成尽量小的组织块(0.5mm3)。
d.将组织块转入50mL离心管中，按每1cm脐带加入1mL预温的0.1％胶原酶I的用量加入相应用量的胶原酶I，放入到37℃二氧化碳培养箱中进行酶解，每隔20分钟剧烈震荡一次，酶解2小时左右观察酶解效果，当组织块已被酶解成“糊”状时停止酶解，用移液管抽取酶解液于400目细胞筛过滤至新的50mL离心管中，补加生理盐水至50mL，2100g，20min离心，弃上清，按每1cm脐带加入1mL生长培养基重悬细胞，重悬后将细胞转移至10cm培养皿中培养，每皿加入10毫升细胞重悬液(每10cm脐带最少培养一个10cm培养皿)。将培养瓶放入二氧化碳培养箱培养。
e.前4天不要摇动培养瓶，让单细胞充分贴壁。第五或第六天，观察细胞贴壁情况；第7或第8天进行换液，更换10mL新鲜MSC培养基，放置于二氧化碳培养箱中培养。
f.第10至12天，观察皿中MSCs细胞集落生长情况，根据细胞集落的生长情况执行传代操作(密度在75％-80％左右)。
(2)MSC细胞的规模化培养方法
1)将涤纶纤维膜提前进行高压蒸汽灭菌，将灭菌过的涤纶纤维膜单层或多层铺于低吸附24孔板底；
2)使用常规方法收集的MSC细胞(或商业来源的MSC细胞)，将收集到的MSC细胞通过间充质干细胞无血清培养基进行悬浮，并将悬浮MSC细胞密度调整到1000-50000个/cm2，优选为5000个/cm2，接种于低吸附铺有涤纶纤维膜的24孔板，所述间充质干细胞无血清培养基包括α-MEM培养基、5％终浓度的人血小板裂解液、1％终浓度的Penicillin-Streptomycin；
3)每天显微镜下观察在涤纶纤维膜中的间充质干细胞的细胞长势；
4)培养4-12天，期间使用结晶紫染色法观察MSC细胞长势，具体包括：取部分涤纶纤维膜未消化孔的细胞用DPBS洗1-2次，4％PFA固定10min，再使用DPBS洗1-2次，然后加0.005％结晶紫染色10min，最后加DPBS在显微镜下观察MSC细胞。
5)MSC细胞观察到长势明显后，对贴于涤纶纤维膜的MSC细胞使用DPBS洗涤1-2次，然后使用干细胞消化酶消化处理并使用常规完全培养基收集，得到最终扩增的间充质干细胞。若直接保存，则使用细胞冻存液收集干细胞消化酶消化处理的细胞，并进行冻存处理。
该方法中的涤纶纤维膜可更换为海藻纤维膜或者蚕丝纤维膜。
(3)MSC细胞在纤维膜中的观察
1)将涤纶纤维膜提前进行高压蒸汽灭菌，将灭菌过的涤纶纤维膜单层或多层铺于低吸附24孔板底；
2)使用常规方法收集的MSC细胞，将收集到的MSC细胞通过间充质干细胞无血清培养基(实验材料中提到的培养基)进行悬浮，并将悬浮MSC细胞密度调整到5000个/cm2，接种于低吸附铺有涤纶纤维膜的24孔板；
3)每天显微镜下观察在涤纶纤维膜中的间充质干细胞的细胞长势；
4)待观察到MSC细胞在涤纶纤维膜中长势明显，对其进行结晶紫染色剂消化计数处理；对贴于涤纶纤维膜的MSC细胞先DPBS洗1-2次，后用干细胞消化酶消化处理并计数；同时将涤纶纤维膜中未消化孔的细胞用DPBS洗1-2次，4％PFA固定10min，再使用DPBS洗1-2次，然后加0.005％结晶紫染色10min，最后加DPBS在显微镜下观察MSC细胞。
该方法中的涤纶纤维膜可更换为海藻纤维膜或者蚕丝纤维膜。
(4)流式检测MSC的marker-检测CD73、CD105和CD90
1)流式检测所需试剂和抗体
(1)清洗试剂：Buffer A(PBS+4％ FBS)。
(2)直标一抗：PE anti-human CD73，PerCP anti-human CD105，PE anti-humanCD90。
2)待测样品的准备
(1)将收获的MSC细胞，用移液枪转移至15mL离心管中，1000rpm离心5分钟，弃上清。
(2)用Buffer A清洗细胞2次，每次3mL，1000rpm离心5分钟，弃上清。
(3)孵育直标一抗：用Buffer A稀释抗体后每管加入100μL，重悬细胞，4℃孵育30分钟，并每隔10分钟轻弹离心管，使细胞与抗体充分结合。
(4)用Buffer A清洗细胞3次，每次3mL，1000rpm离心5分钟，弃上清。
(5)每管加入200μL DPBS重悬细胞，并经70μm孔径滤网过滤细胞，以除去未消化开的细胞团块，转移至流式管中，置于4℃避光保存，等待上机检测。
3)流式上机检测
(1)开启流式细胞仪Guava easyCyte HT和电脑。
(2)设置流式仪；打开流式软件，设置各种参数。
(3)待机器变为Ready状态后，清洗机器。
(4)首先通过同型对照样品，设置FSC和SSC的电压和增益，使离散细胞群位于象限的合适位置，一般左下角为细胞碎片，右上角为较大的细胞团块。圈出目标细胞群，设置Gate，进入下一步分析。
(5)根据抗体偶联的荧光素，选择合适的检测通道。通过调节相应通道电压和补偿，使得阴性细胞群和阳性细胞群可以明显地区分，然后依次检测实验样品。
(6)检测完毕，清洗流式仪，关闭流式仪和电脑。
3、实验结果
1)在显微镜下实际拍摄MSC细胞在涤纶纤维膜上的生长情况，结果如图1所示，在图1的结果中，MSC细胞在60目与80目的涤纶纤维膜上均能够生长，这种生长结果是能够使用倒置显微镜肉眼可见的。
2)对在涤纶纤维膜上生长的MSC细胞进行结晶紫染色，其染色结果如图2所示，结果显示，结晶紫染色情况下在倒置显微镜拍照同样显示MSC细胞在涤纶纤维膜可以生长，且方便观察细胞增殖以及消化时的状态。培养4天通过细胞计数，单层的纤维膜的收获量为7.5×104/cm2，达到接种量的7.5倍以上。且涤纶纤维膜便于消化，细胞回收率接近100％，消化的细胞没有结块等现象，是非常好的MSC规模化生产的媒介，就有广阔的应用和市场潜力。
3)流式检测MSC的标志基因，结果如图3所示，结果显示，扩增后的MSC细胞与原代间充质干细胞差别不大，CD73，CD105和CD90的阳性率皆在98％以上，说明扩增之后的MSC细胞的细胞多能性保持效果好。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种间充质干细胞规模化培养的方法，其特征在于，所述方法包括：
1)使用间充质干细胞培养基悬浮间充质干细胞，调整细胞浓度，接种到铺有纤维膜的容器中；
2)连续培养4-12天，待观察到MSC细胞长势明显后，使用DPBS洗涤，后用干细胞消化酶消化，最后使用得到间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述间充质干细胞培养基包括基础培养基与添加剂，所述基础培养基为α-MEM培养基，所述添加剂为血小板裂解物和Penicillin-Streptomycin；
优选地，所述血小板裂解物包括人血小板裂解物；
优选地，所述人血小板裂解物包括人血小板裂解液；
优选地，所述人血小板裂解液的终浓度为5％；
优选地，所述Penicillin-Streptomycin的终浓度为1％；
优选地，所述步骤2)连续培养4-12天期间，还包括观察MSC细胞长势的步骤，具体步骤包括：取部分涤纶纤维膜中未消化的细胞用DPBS洗涤，4％PFA固定，再使用DPBS洗涤，然后加结晶紫染色，最后加DPBS在显微镜下观察MSC细胞；
优选地，所述结晶紫终浓度为0.005％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述调整细胞浓度包括1000-50000个/cm2；
优选地，所述调整细胞浓度为5000个/cm2；
优选地，所述容器包括低吸附容器；
优选地，所述步骤1)间充质干细胞包括原代间充质干细胞、传代间充质干细胞；
优选地，所述纤维膜可以是单层或多层；
优选地，所述纤维膜包括涤纶纤维膜、海藻纤维膜、蚕丝纤维膜；
优选地，所述纤维膜使用前经高压蒸汽灭菌；
优选地，所述DPBS为无钙离子、无镁离子DPBS；
优选地，所述干细胞消化酶包括干细胞温和消化酶；
优选地，所述干细胞消化酶的终浓度为1×；
优选地，所述方法的实施过程中可通过普通显微镜肉眼观察细胞增殖与消化情况。
4.一种权利要求1-3任一项所述的方法中使用的间充质干细胞培养基，其特征在于，所述间充质干细胞培养基包括基础培养基与添加剂，所述基础培养基为α-MEM培养基，所述添加剂为血小板裂解物和Penicillin-Streptomycin；
优选地，所述血小板裂解物包括人血小板裂解物；
优选地，所述人血小板裂解物包括人血小板裂解液；
优选地，所述人血小板裂解液的终浓度为5％；
优选地，所述Penicillin-Streptomycin的终浓度为1％。
5.权利要求1-3任一项所述的方法制备的间充质干细胞。
6.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求1-3任一项所述的方法中使用的试剂；
优选地，所述组合物包括权利要求1-3任一项所述的间充质干细胞培养基、DPBS溶液、干细胞消化酶。
7.权利要求1-3任一项所述的方法、权利要求4所述的间充质干细胞培养基在规模化制备间充质干细胞中的应用。
8.权利要求1-3任一项所述的方法、权利要求4所述的间充质干细胞培养基在制备自动化生产间充质干细胞的系统或装置的应用。
9.一种系统或装置，其特征在于，所述系统或装置包括处理器，所述处理器用于实施权利要求1-3任一项所述的方法的步骤；
优选地，所述处理器包括单个或多个；
优选地，所述系统或装置还包括存储器；
优选地，所述存储器存储计算机程序；
优选地，所述计算机程序用于编程权利要求1-3任一项所述的方法的步骤；
优选地，所述计算机程序由处理器执行具体操作；
优选地，所述存储器包括一个或多个。
10.一种间充质干细胞的培养试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-3任一项所述的方法中使用的试剂、容器、和纤维膜。
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