CN114557337A - 脐带间充质干细胞无蛋白非程序冻存液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及干细胞培养技术领域，具体涉及一种脐带间充质干细胞无蛋白非程序性冻存液及其制备方法和应用。所述冻存液包括基础液、营养补充剂、渗透性保护剂、非渗透性保护剂、细胞沉降稳定剂、细胞膜保护剂、凋亡抑制剂、抗氧化剂；所述的基础液是葡萄糖含量≤1000mg/L的DMEM/F‑12。本冻存液适用于在体外扩增后干细胞治疗前直接在‑80℃中冻存脐带间充质干细胞。该冻存液无血清、无蛋白、化学成分明确，冻存后的脐带间充质干细胞无外源污染风险，使用更加安全；细胞复苏后活率高、贴壁率高，细胞扩增快；可维持间充质干细胞的表面标志物特征（表型），以及三系分化潜能；根据脐带间充质干细胞冻存和培养特征进行优化，提高其冻存效果，不需要程序性降温，省时省力。

Description

脐带间充质干细胞无蛋白非程序冻存液及其制备方法

技术领域

本发明涉及干细胞培养技术领域，具体涉及一种脐带间充质干细胞无蛋白非程序性冻存液及其制备方法和应用。

背景技术

干细胞(stem cells,SCs)是人体内具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，干细胞在一定的条件下能够诱导分化成神经细胞、肝脏细胞、心肌细胞等构成人体的220多种功能细胞。干细胞存在于早期的胚胎、胎盘以及其附属物、骨髓、外周血和成年人组织当中。干细胞可根据其发育潜能分为全能干细胞、多能干细胞以及单能干细胞。全能干细胞是具有无限分化潜能，能分化成所有组织和器官的干细胞，即具有形成完整个体分化的潜能的细胞，如胚胎干细胞。多能干细胞是具有分化出多种细胞组织的潜能，但失去发育成完整个体的能力的细胞，如间充质干细胞、皮肤干细胞等。而单能干细胞则是只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化的细胞，如上皮组织基底层的干细胞、肌肉中的成肌细胞。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一种多能干细胞，源于发育早期的中胚层和外胚层，具有自我更新和多向分化能力，在体内或外界特定的诱导条件下，可分化成神经、血管内皮、软骨、肌肉、肝脏、心肌等多种组织细胞。脐带组织中可分离出间充质干细胞，为脐带间充质干细胞，它不仅保持了间充质干细胞的生物学特性，而且还具备以下优点：①脐带中的干细胞是祖细胞更原始，有更强的增殖分化能力，且干细胞含量相对丰富，易于分离，纯度高，经过培养可达到十亿个，供多次使用。②免疫细胞较为幼稚，免疫原性低，且有免疫调节功能，使用一般不会触发免疫反应及引起移植物抗宿主病。③基因稳定、不易突变，使用安全可靠，致癌风险比胚胎干细胞和诱导多能干细胞小很多。④扩增时培养体系能统一，便于质控。⑤可制成种子细胞冷冻，多次使用，冷冻后细胞损失小，易于保存和运输。⑥从新生儿的脐带中分离而得，避免了受到细菌、病毒等病原微生物的污染以及后天疾病的影响。潜伏性病毒和病原微生物的感染及传播几率比较低。⑦采集时对产妇及新生儿无任何危害及损伤，伦理学争议少，且临床应用不存在组织配型的问题。在间充质干细胞临床应用方面，目前我国共有23个间充质干细胞新药项目获得国家临床默示许可，其中脐带间充质干细胞占52.2％，适应证包括了肺纤维化、银屑病、膝骨关节炎、急性移植物抗宿主病、急性呼吸窘迫综合征、肝衰竭、炎症性肠炎、类风湿关节炎等。由此可见，脐带间充质干细胞具有非常重要的临床价值和广泛的应用前景。

目前临床使用的脐带间充质干细胞大多都是经体外培养后冻存，之后再复苏移植使用的，因此，脐带间充质干细胞的高效冻存是维持其移植时细胞状态和有效性的必要条件。目前现有技术中，脐带间充质干细胞的常规冻存液主要有三种：一是以DMSO与血清或白蛋白为主要成分，二是以培养基、DMSO和血清或白蛋白为主要成分，三是在前两种的基础上添加细胞保护剂，配合以一定的冻存速率(程序性降温)从室温降到-80℃后再放入液氮中或液氮气相中。这些常规脐带间充质干细胞冻存液仍然存在一些问题，如：1.往往需要添加外源血清至少添加人员或重组白蛋白以达到较好的冻存效果，但使用外源血清增加了外源病原体污染的可能性，且批次间差异大，人源和重组白蛋白来源困难，成本高，且外源蛋白可能引起机体免疫反应，安全性低，后续会影响细胞临床治疗推广。2.冻存液在脐带间充质干细胞的冻存过程中容易引起细胞黏附成团，对细胞造成一定量的损伤，复苏后影响脐带间充质干细胞的活率和贴壁能力，细胞扩增能力下降，总细胞数减少。3.冻存液成分中的不确定因素会影响复苏后的脐带间充质干细胞的表型，甚至是诱导干细胞分化。4.在冻存过程中需进行程序性降温，耗时费力，时长，专用设备昂贵，无法满足大批量细胞处理的需要。5.有研究显示，使用同种冻存液冻存来自不同组织的间充质干细胞，复苏后存活率也不尽相同，因此商品化的冻存液配方并非针对脐带间充质干细胞优化和专用的。

因此，随着干细胞治疗技术在临床上的应用和推广，研发出一种更安全、更高效、更稳定、更方便、更专一的脐带间充质干细胞无蛋白非程序冻存液有着非常重要的意义。

发明内容

针对上述情况，本发明的目的是克服上述现有产品和技术缺陷，提供一种脐带间充质干细胞无蛋白非程序性冻存液，适用于在体外扩增后干细胞治疗前直接在-80℃中冻存脐带间充质干细胞。该冻存液无血清、无蛋白、化学成分明确，冻存后的脐带间充质干细胞无外源污染风险，使用更加安全；细胞复苏后活率高、贴壁率高，细胞扩增快；可维持间充质干细胞的表面标志物特征(表型)，以及三系分化潜能；不需要程序性降温，省时省力；配方根据脐带间充质干细胞冻存和培养特征进行优化，提高其冻存效果，为脐带间充质干细胞药物的临床研究提供支持。

本发明的技术方案如下：

一种脐带间充质干细胞无蛋白非程序性冻存液，包括基础液、营养补充剂、渗透性保护剂、非渗透性保护剂、细胞沉降稳定剂、细胞膜保护剂、凋亡抑制剂、抗氧化剂；所述的基础液是葡萄糖含量≤1000mg/L的DMEM/F-12。

进一步的，上述一种脐带间充质干细胞无蛋白非程序性冻存液，所述的营养补充剂包括0.2-0.8mg/L钼酸钠二水、0.05-0.2mg/L氯化镍、0.06-0.2mg/L二氯化锰四水、0.05-0.5mg/L胆固醇、0.1-0.5mg/L亚油酸、0.1-10mg/L亚麻酸、0.5-4mg/L精胺盐酸盐、0.5-5g/L黄体酮。上述浓度为最终冻存液中的终浓度，以下不在赘述。

进一步的，上述一种脐带间充质干细胞无蛋白非程序性冻存液，所述的渗透性保护剂为4.5-6.5％二甲基亚砜和10-50mg/L水合硼酸钠。

进一步的，上述一种脐带间充质干细胞无蛋白非程序性冻存液，所述的非渗透性保护剂包括羟乙基淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、右旋糖酐中的两种或三种，按照一定质量比例混合而成的，总含量为4-10％。优选的为羟乙基淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和右旋糖酐按照5:4:1的质量比例混合，总含量为10％。

进一步的，上述一种脐带间充质干细胞无蛋白非程序性冻存液，所述的细胞沉降稳定剂为0.5-5％Lutrol F68。

进一步的，上述一种脐带间充质干细胞无蛋白非程序性冻存液，所述的细胞膜保护剂包括1-10g/L赤藓糖醇和5-20g/L海藻糖。

进一步的，上述一种脐带间充质干细胞无蛋白非程序性冻存液，所述的凋亡抑制剂为20-50nM Q-VD-OPh。

进一步的，上述一种脐带间充质干细胞无蛋白非程序性冻存液，所述的抗氧化剂包括5-10mg/L亚硒酸钠和0.01-0.05mg/L毛蕊异黄酮。

进一步的，上述脐带间充质干细胞无蛋白非程序性冻存液的制备方法，包括如下步骤：

1)称取营养补充剂、细胞膜保护剂、凋亡抑制剂、抗氧化剂，溶解于葡萄糖浓度≤1000mg/L的DMEM/F-12基础培养基；

2)添加渗透性保护剂、非渗透性保护剂和细胞沉降稳定剂，依次缓慢溶解；

3)pH调节至6.7-7.2，定容；优选为pH6.9；

4)用滤膜过滤除菌，即为配制的脐带间充质干细胞无蛋白非程序性冻存液。

进一步的，上述脐带间充质干细胞无蛋白非程序性冻存液的应用，应用于5×10⁵-2×10⁷个脐带间充质干细胞的的非程序冻存。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

第一，本发明脐带间充质干细胞无蛋白非程序冻存液不含有血清或任何来源蛋白，不存在细菌、真菌、病毒、支原体感染的风险，批间差异小，成本低，避免外源蛋白可能引起的机体免疫反应，安全性高。

第二，本发明脐带间充质干细胞无蛋白非程序冻存液采用渗透性保护剂、非渗透性保护剂、细胞沉降稳定剂、细胞膜保护剂、凋亡抑制剂组合的方案对脐带间充质干细胞进行全方位低温保护，可以使冻存过程中溶液冰点降低，提高细胞膜对水的通透性，使细胞内水分在冻结前透出细胞，防止或减少冰晶对细胞的损伤，同时降低冰冻时细胞周围电解质浓度，避免电解质损伤，还可减缓细胞在冻存时的沉降速度，减轻细胞的相互挤压作用和黏附成团，从而有效提高细胞复苏率和活力。不需要程序性降温，复苏后的脐带间充质干细胞存活率可以达到95％以上，且不影响细胞贴壁生长能力，增殖速度与冻存前相同。

第三，本发明脐带间充质干细胞无蛋白非程序冻存液采用1000mg/L的低葡萄糖浓度，在抗氧化剂毛蕊异黄酮的配合下可以减少冻存过程中活性氧的产生，同时添加LutrolF68和水合硼酸钠，可以抑制PKCβ信号通路，阻止间充质干细胞在冻存时造成的分化，保护细胞膜表面抗原，从而维持脐带间充质干细胞表型，维持间充质干细胞向成脂、成骨、成软骨方向三系分化潜能。

第四，本发明脐带间充质干细胞无蛋白非程序冻存液含有脐带间充质干细胞生长所需的多种营养成分，包括氨基酸、维生素、脂类、微量元素、多胺、激素等，选用最适宜脐带间充质干细胞生长的DMEM/F-12作为基础液，成分配比经过优化，针对性的提高了脐带间充质干细胞的冻存效果。

本发明符合临床应用需求，有助于提高国内干细胞治疗产品研发和生产过程的安全性和高效性。

附图说明

图1为本发明实施例1与对照冻存液冻存人脐带间充质干细胞复苏后细胞贴壁生长情况结果图；

图2为本发明实施例1与对照例冻存液冻存人脐带间充质干细胞复苏后细胞表面标志物流式结果图；

图3为本发明实施例1冻存人脐带间充质干细胞复苏后细胞分化潜能的鉴定结果图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1

脐带间充质干细胞无蛋白非程序性冻存液1L使用量的配制方法：

1、配制基础液：按照DMEM/F-12配方配制，其中葡萄糖含量减少为1000mg/L，其他成分含量不变，制成基础液。

2、称取0.4mg钼酸钠二水，0.1mg氯化镍，0.15mg二氯化锰四水，0.28mg胆固醇，0.36mg亚油酸，6mg亚麻酸，2.5mg精胺盐酸盐，4g黄体酮，10g赤藓糖醇，15g海藻糖，25nmolQ-VD-OPh，7.5mg亚硒酸钠，0.03mg毛蕊异黄酮，依次溶解于基础液中；

3、再向其中依次加入50ml二甲基亚砜，10mg水合硼酸钠，50g羟乙基淀粉、40g聚乙烯吡咯烷酮，10g右旋糖酐，15g Lutrol F68，充分溶解；

4、用盐酸调节pH至6.9，再用超纯水定容至1L，然后采用孔径为0.22μm的滤膜进行过滤除菌，每100ml装于1个灭菌的100ml试剂瓶中，即得到脐带间充质干细胞无蛋白非程序性冻存液。

实施例2

脐带间充质干细胞无蛋白非程序性冻存液1L使用量的配制方法：

1、配制基础液：按照DMEM/F-12配方配制，其中葡萄糖含量减少为1000mg/L，其他成分含量不变，制成基础液。

2、称取0.8mg钼酸钠二水，0.2mg氯化镍，0.05mg二氯化锰四水，0.1mg胆固醇，0.1mg亚油酸，0.5mg亚麻酸，4mg精胺盐酸盐，1.5g黄体酮，6g赤藓糖醇，20g海藻糖，30nmolQ-VD-OPh，5mg亚硒酸钠，0.02mg毛蕊异黄酮，依次溶解于基础液中；

3、再向其中依次加入45ml二甲基亚砜，40mg水合硼酸钠，30g羟乙基淀粉、30g聚乙烯吡咯烷酮，20g右旋糖酐，30g Lutrol F68，充分溶解；

4、用盐酸调节pH至6.9，再用超纯水定容至1L，然后采用孔径为0.22μm的滤膜进行过滤除菌，每100ml装于1个灭菌的100ml试剂瓶中，即得到脐带间充质干细胞无蛋白非程序性冻存液。

对比例

传统冻存液1L使用量的配制方法：

1、量取200ml胎牛血清、100ml二甲基亚砜，加入到700ml的DMEM/F-12基础培养基中。

2、充分混合后，采用孔径为0.22μm的滤膜进行过滤除菌，每100ml装于1个灭菌的100ml试剂瓶中，即得到传统冻存液。

应用实施例

为了评估本发明所述的脐带间充质干细胞无蛋白非程序性冻存液对脐带间充质干细胞的冻存效果，采用实施例1所述的脐带间充质干细胞无蛋白非程序性冻存液和对比例所述的传统冻存液以及一种市售的某国外品牌同类冻存液，在相同的实验条件下进行人脐带间充质干细胞的冻存和复苏。

细胞冻存步骤如下：

1.制备细胞悬液：

(1)确保脐带间充质干细胞细胞处于指数生长期后，将旧培养基吸除，用PBS清洗两遍。

(2)在培养瓶中加入少许胰酶，置于培养箱中消化约1-2分钟，期间在显微镜下观察，一旦发现细胞间隙增大、细胞变圆、比较松动后，立即终止消化。

(3)加入适量温浴好的完全培养基终止消化，轻轻吹打均匀细胞。

2.细胞冻存：

(1)取少量细胞悬液细胞计数，将细胞的冻存密度调整为5×10⁶个/ml。

(2)将所需量的细胞悬液转移至离心管中，250×g，离心5分钟，弃上清收集细胞。

(3)向细胞沉淀中加入适量预冷的细胞冻存液，用移液器轻轻吹打以重悬细胞，分装于1.5-2ml无菌细胞冻存管中，严密封口后，注明细胞名称、代数、日期、冻存液种类。

(4)若使用本发明所述的脐带间充质干细胞无蛋白非程序性冻存液和市售的某国外品牌同类冻存液，则将冻存管直接放入-80℃；若使用对比例所述的传统冻存液，则需要将冻存管置于可逐步降温的装置如程序性冻存盒内，-80℃放置约24小时(确保冷却速度约为1-2℃/min)。

细胞复苏步骤如下：

1.准备好37℃水浴锅，并将完全培养基置于37℃水浴锅中回温。在15ml离心管中加入9ml回温后的培养基备用。

2.自-80℃冰箱中取出冷冻管，立即放入37℃水浴中快速解冻，轻摇冷冻管使其在2分钟内全部融化。以75％酒精擦拭冻存管外部，移入无菌操作台内。

3.将解冻后的细胞悬液全部移入装有9ml培养基的离心管中，轻轻吹打混匀。250×g，离心5分钟。

4.在超净台内，尽量去除上清液，向细胞沉淀中加入2ml预热的完全培养基，轻轻吹打混匀。

5.细胞计数，将全部细胞接种到合适的培养瓶或培养皿中，再加入完全培养基，轻轻摇晃使细胞分布均匀。放入37℃，5％CO₂培养箱中静置培养。

按照以下方法评估本发明脐带间充质干细胞无蛋白非程序性冻存液的效果：

1.为了检测本发明脐带间充质干细胞无蛋白非程序性冻存液冻存人脐带间充质干细胞后复苏存货率，按照上述步骤，分别使用实施例1制得的脐带间充质干细胞无蛋白非程序性冻存液、对比例所述的传统冻存液以及一种市售的某国外品牌同类冻存液，同时冻存三批(P10-1,P10-2,P10-3)人脐带间充质干细胞样品三个月后，按照上述步骤进行细胞复苏，检测细胞存活率，每种样品重复三次，结果如表1所示。

2.为了检测本发明脐带间充质干细胞无蛋白非程序性冻存液冻存人脐带间充质干细胞复苏后细胞后续贴壁生长情况，按照上述步骤，分别使用实施例1制得的脐带间充质干细胞无蛋白非程序性冻存液、对比例所述的传统冻存液以及一种市售的某国外品牌同类冻存液，同时冻存两批(P10-2，P10-4)人脐带间充质干细胞样品三个月后，按照上述步骤进行细胞复苏，将细胞数调整至1×10⁵/ml，正常培养24h后换液并观察细胞贴壁和生长情况，结果如附图1所示。

3.为了检测本发明脐带间充质干细胞无蛋白非程序性冻存液冻存人脐带间充质干细胞复苏后细胞间充质干细胞标志物表达的情况，按照上述步骤，使用实施例1制得的脐带间充质干细胞无蛋白非程序性冻存液，冻存一批(P10-5)人脐带间充质干细胞样品三个月后，按照上述步骤进行细胞复苏，传代两次后，用流式细胞仪对细胞表面标志物CD105、CD90、CD45的表达情况进行检测，结果如附图2所示。

4.为了检测本发明脐带间充质干细胞无蛋白非程序性冻存液冻存人脐带间充质干细胞复苏后细胞的三系分化能力，按照上述步骤，使用实施例1制得的脐带间充质干细胞无蛋白非程序性冻存液冻存一批(P10-6)人脐带间充质干细胞样品三个月后，按照上述步骤进行细胞复苏，传代后将细胞分别向成脂、成骨和成软骨方向进行诱导分化培养，分别进行油红O、茜素红、阿利新蓝染色，结果如附图3所示。

表1和图1结果显示，与对照培养基相比，使用本发明所述的脐带间充质干细胞无蛋白非程序性冻存液冻存的人脐带间充质干细胞，复苏后活率更高，细胞存活率可以达到95％以上，细胞贴壁和生长情况更好。

图2结果显示，使用本发明所述的脐带间充质干细胞无蛋白非程序性冻存液冻存的人脐带间充质干细胞，复苏后能够维持CD105和CD90的阳性表达(＞95％)，和CD45阴性(＜0.1％)，说明该冻存液截图保护细胞膜表面抗原，从而维持脐带间充质干细胞表型。

图3结果显示，使用本发明所述的脐带间充质干细胞无蛋白非程序性冻存液冻存的人脐带间充质干细胞，复苏后向成脂方向诱导的细胞形成可见的脂质空泡，呈现出典型的成脂分化(A)；向成骨方向诱导细胞形成大量的钙结节，呈现典型的成骨分化(B)；向成软骨方向诱导的软骨细胞球体的切片和染色证明了硫酸软骨素和硫酸胶质等蛋白的存在，呈现典型的成软骨分化(C)。说明用改冻存液冻存后细胞保留了三系分化的潜能。

表1复苏后细胞存活率平均值

	P10-1	P10-2	P10-3
				实施例1	98.0	96.4	98.4
对照例	89.3	85.5	89.6
				市售的某国外品牌同类冻存液	92.7	91.2	93.8

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (10)

1.一种脐带间充质干细胞无蛋白非程序性冻存液，其特征在于，包括基础液、营养补充剂、渗透性保护剂、非渗透性保护剂、细胞沉降稳定剂、细胞膜保护剂、凋亡抑制剂、抗氧化剂；所述的基础液是葡萄糖含量≤1000mg/L的DMEM/F-12。

2.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞无蛋白非程序性冻存液，其特征在于，所述的营养补充剂包括0.2-0.8mg/L钼酸钠二水、0.05-0.2mg/L氯化镍、0.06-0.2mg/L二氯化锰四水、0.05-0.5mg/L胆固醇、0.1-0.5mg/L亚油酸、0.1-10mg/L亚麻酸、0.5-4mg/L精胺盐酸盐、0.5-5g/L黄体酮。

3.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞无蛋白非程序性冻存液，其特征在于，所述的渗透性保护剂为4.5-6.5%二甲基亚砜和10-50mg/L水合硼酸钠。

4.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞无蛋白非程序性冻存液，其特征在于，所述的非渗透性保护剂包括羟乙基淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、右旋糖酐中的两种或三种，按照一定质量比例混合而成的，总含量为4-10%。

5.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞无蛋白非程序性冻存液，其特征在于，所述的细胞沉降稳定剂为0.5-5% Lutrol F68。

6.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞无蛋白非程序性冻存液，其特征在于，所述的细胞膜保护剂包括1-10g/L赤藓糖醇和5-20g/L海藻糖。

7.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞无蛋白非程序性冻存液，其特征在于，所述的凋亡抑制剂为20-50nM Q-VD-OPh。

8.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞无蛋白非程序性冻存液，其特征在于，所述的抗氧化剂包括5-10mg/L亚硒酸钠和0.01-0.05mg/L毛蕊异黄酮。

9.如权利要求1-8任一项所述的脐带间充质干细胞无蛋白非程序性冻存液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）称取营养补充剂、细胞膜保护剂、凋亡抑制剂、抗氧化剂，溶解于葡萄糖浓度≤1000mg/L的DMEM/F-12基础培养基；

2）添加渗透性保护剂、非渗透性保护剂和细胞沉降稳定剂，依次缓慢溶解；

3）pH调节至6.7-7.2，定容；

4）用滤膜过滤除菌，即为配制的脐带间充质干细胞无蛋白非程序性冻存液。

10.如权利要求1-8所述的脐带间充质干细胞无蛋白非程序性冻存液的应用，其特征在于，应用于5×10⁵-2×10⁷个脐带间充质干细胞的的非程序冻存。

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