CN101971796A - 无蛋白非程序细胞冻存液 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了无蛋白细胞冻存液，含有细胞膜保护剂1～23w/v％、渗透性细胞膜内保护剂1.0～16w/v％、细胞沉降稳定剂3.0～28％，余量为pH缓冲液。本发明的细胞冻存液，由纯化学物质组成，无蛋白，成分稳定可控，保质期长，批次间稳定性好；对细胞的保护作用好，冻存后细胞复苏率高，对细胞特性没有影响，不影响细胞正常的生长和分化；本发明的细胞冻存液，可直接应用于细胞保存，无需稀释或自行配制冻存程序简单，只需将待冻存细胞投入细胞冻存液中，直接置于-80℃的环境中冻存，无需程序性降温，大大提高的细胞冻存的效率，操作方便。

Description

无蛋白非程序细胞冻存液
技术领域
本发明涉及一种细胞冻存液，特别涉及一种无蛋白的细胞冻存液。
背景技术
细胞，特别是干细胞等高价值的细胞，具有潜在的医用价值等其他价值，细胞保存技术是实现这些价值的基础。
常用的细胞保存方法有培养保存和冻存。培养保存，耗时耗力，程序繁琐，在培养的过程中，特别是长期继代培养时，细胞容易发生变异，细胞特性丧失，失去保存价值。因此，培养保存一般应用于易于培养，不易发生变异的细胞中，如部分瘤细胞。
细胞冻存即将细胞置于低温环境下保存，以使细胞暂时脱离生长状态，保存其细胞特性。这样保存的成本较低，可以在需要时将细胞复苏培养。与些同时，也避免了培养保存中因细胞污染而导致的细胞品种损失。
现有的细胞冻存液一般由DMSO、血清、细胞培养液组成，为即用型冻存液，需要现配现用，由于血清的成分不定，冻存液批次间稳定性差。血清待蛋白质的存在，使得这种细胞冻存液的保质期也较短，保存条件也较为苛刻。
细胞冻存液中蛋白的存在，对细胞特性有一定的影响，如血清中的一些成分会影响细胞(如神经干细胞NSC)、神经元细胞等特殊细胞的生长与分化。
在细胞治疗中，外源蛋白的存在，特别是未知蛋白的存在，会引起不必要的，甚至是未知的不良反应，严重影响治疗结果。人们希望，至少在细胞治疗用细胞的冻存中不添加外源蛋白。而不添加外源蛋白的话，又难以保证冻存细胞的复苏率。
即使在细胞添加蛋白类保护剂，为保证细胞冻存的成功率，使用这些细胞冻存液冻存细胞时，还是要使用程序降温的方式，缓慢冰冻细胞。这种程序性降温用时长，需要购置昂贵的专用仪器，处理能力极其有限，仅能用于实验室的小批量处理，远不能满足大批量处理的需要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种无蛋白非程序细胞冻存液。
本发明所采取的技术方案是：
无蛋白细胞冻存液，含有细胞膜保护剂1～23w/v％、渗透性细胞膜内保护剂1.0～16w/v％、细胞沉降稳定剂3.0～28％，余量为pH缓冲液。
优选的，冻存液中还添加有抗氧化剂0.1～0.4w/v％，细胞营养剂0.3～2.0w/v％。
细胞膜保护剂包括非还原性双糖、多糖、糖酐。
本发明的有益效果是：
本发明的细胞冻存液中，成分完全清楚，没有添加蛋白质类物质，所使用的各种用料，均为生物体可接受的，不会对基体造成损害，至少不会对基体造成未知的损害，特别适用于细胞治疗用细胞的冻存。
本发明的细胞冻存液，对细胞的保护作用好，冻存后细胞复苏率高，实验表明，使用本发明的细胞冻存液冻存的间质干细胞(MSCs)的复苏率超过90％，皮层神经元细胞(CNCs)的复苏率超过75％，胚胎干细胞(ESCs)的复苏率超过也高达94％。在细胞冻存效果优异的同时，本发明的细胞冻存液对细胞特性没有影响，不影响细胞正常的生长和分化。
使用本发明的细胞冻存液，冻存程序简单，只需将待冻存细胞投入细胞冻存液中，直接置于-80℃的环境中冻存，无需程序性降温，大大提高的细胞冻存的效率。
本发明的细胞冻存液，由纯化学物质组成，成分稳定可控，保质期长，批次间稳定性好，可直接应用于细胞保存，无需稀释或自行配制，大大方便了操作。
附图说明
图1是SD大鼠间充质干细胞MSCs复苏后的生长曲线图；
图2是未诱导的SD大鼠MSCs细胞图；
图3是本发明细胞冻存液冻存的SD大鼠MSCs复苏后，成骨诱导28d的细胞图；
图4是常规细胞冻存液程序冻存的SD大鼠MSCs复苏后，成骨诱导28d的细胞图；
图5是常规细胞冻存液非程序冻存的SD大鼠MSCs复苏后，成骨诱导28d的细胞图；
图6是本发明细胞冻存液冻存的SD大鼠MSCs复苏后，成脂诱导20d的细胞图；
图7是常规细胞冻存液程序冻存的SD大鼠MSCs复苏后，成脂诱导20d的细胞图；
图8是常规细胞冻存液非程序冻存的SD大鼠MSCs复苏后，成脂诱导20d的细胞图。
具体实施方式
本发明中使用的细胞膜保护剂、渗透性细胞膜内保护剂、细胞沉降稳定剂，既可以单独使用，也有可以根据需要混合使用。
本发明中使用的渗透性细胞膜内保护剂，包括二甲基亚砜(DMSO)、丙二醇、丙三醇等。
本发明中使用的细胞沉降稳定剂，包括甲基纤维素、羟乙基淀粉、糊精、可溶性淀粉，用以防止或延缓细胞在冻存过程中的沉降，防止细胞互相挤压，影响细胞冻存效果。
本发明细胞冻存液中所使用的pH缓冲液，在于提供一个适合细胞生存的稳定pH，可以为常规的PBS缓冲液，缓冲液的pH值、Na+、K+含量可以根据具体的冻存细胞类型进行相应的调节。这种调节是本领域技术人员所熟知的。常用的pH缓冲液的pH为7.2～7.4，Na+含量为20～30mM，K+含量为110～130mM。
本发明细胞冻存液中使用的抗氧化剂，为常规的抗氧化剂，包括维生素C、谷胱甘肽等，抗氧化剂既可以单独使用，也可以混用。本领域的技术人员可以根据需要选择其他的抗氧化剂。
本发明细胞冻存液中使用的细胞营养剂，为常规的细胞营养剂，包括谷氨酰胺、丙酮酸钠等，用以补充细胞代谢时消耗的部分能量。细胞营养剂既可以单独使用，也可以混用。本领域的技术人员可以根据需要选择其他的细胞营养剂。
下面结合实施例，进一步说明本发明。
以下实施例中，如无特别说明，百分比均指w/v％。
实施例1
细胞冻存液的组成如下：
细胞膜保护剂1％，由蔗糖0.5％、高分子糖酐-500 0.5％组成，DMSO 8％，
细胞沉降稳定剂25％，由甲基纤维素4000 CP 15％、羟乙基淀粉10％组成，
抗氧化剂0.2％，由维生素C 0.1％、谷胱甘肽0.1％组成，
细胞营养剂1.0％，由谷氨酰胺0.4％、丙酮酸钠0.6％组成，
PBS缓冲液，余量。
实施例2
细胞冻存液的组成如下：
细胞膜保护剂23％，由海藻糖11％、潘糖5％、中分子糖酐-70 7％组成，
渗透性细胞膜内保护剂5％，由丙二醇2％、丙三醇3％组成，
细胞沉降稳定剂8％，由可溶性淀粉5％、糊精3％组成，
谷胱甘肽0.3％，
谷氨酰胺0.3％
PBS缓冲液，余量。
实施例3
细胞冻存液的组成如下：
细胞膜保护剂5％，由海藻糖2％、木糖3％组成，
渗透性细胞膜内保护剂13％，由DMSO 5％、丙二醇8％组成，
细胞沉降稳定剂20％，由甲基纤维素1500 CP 5％、羟乙基淀粉15％组成，
抗氧化剂0.1％，由维生素C组成，
细胞营养剂0.5％，由丙酮酸钠组成，
pH缓冲液，余量。
实施例4
细胞冻存液的组成如下：
细胞膜保护剂17％，由海藻糖组成，
渗透性细胞膜内保护剂16％，由DMSO组成，
细胞沉降稳定剂2％，由甲基纤维素4000 CP组成，
抗氧化剂0.2％，由维生素C组成，
细胞营养剂0.8％，由谷氨酰胺0.1％、丙酮酸钠0.7％组成，
pH缓冲液，余量。
实施例5
细胞冻存液的组成如下：
细胞膜保护剂10％，由海藻糖6.0％、蔗糖4.0％组成，
渗透性细胞膜内保护剂9％，由丙三醇组成，
细胞沉降稳定剂23％，由甲基纤维素400CP 18％、可溶性淀粉5％组成，
抗氧化剂0.4％，由维生素C 0.12％、谷胱甘肽0.28％组成，
细胞营养剂2％，由谷氨酰胺、丙酮酸钠各1.0％组成，
pH缓冲液，余量。
实施例6
细胞冻存液的组成如下：
细胞膜保护剂14％，由棉子糖4％、木糖3％、潘糖7％组成，
渗透性细胞膜内保护剂1％，由DMSO组成，
细胞沉降稳定剂13％，由甲基纤维素1500 CP 8％、羟乙基淀粉5％组成，
抗氧化剂0.1％，由维生素C组成，
细胞营养剂1.5％，由丙酮酸钠组成，
pH缓冲液，余量。
实施例7
细胞冻存液的组成如下：
细胞膜保护剂7％，由糖酐-40 1％、棉子糖3％、蔗糖3％组成；
渗透性细胞膜内保护剂10％，由DMSO组成，
细胞沉降稳定剂17％，由可溶性淀粉组成，
抗氧化剂0.26％，由谷胱甘肽组成，
细胞营养剂1.8％，由谷氨酰胺组成，
pH缓冲液，余量。
使用不同配比细胞膜保护剂的细胞冻存液，非程序性冻存SD大鼠间充质干细胞MSCs，检测其复苏率，结果如表1所示。
表1、细胞膜保护剂配比-细胞复苏率比较表
Figure GDA0000021755020000081
表中，细胞膜保护剂为单独使用，从表中的数据可知，不同的用量对细胞的复苏率有一定的影响。细胞膜保护剂的用量在1.2％～27％之间，细胞复苏率都比较高，综合其他实验数据和冻存细胞品种考虑，本发明中，细胞膜保护剂的最佳用量为1～23％。
使用不同配比渗透性细胞膜内保护剂的细胞冻存液，非程序性冻存SD大鼠间充质干细胞MSCs，检测其复苏率，结果如表2所示。
表2、渗透性细胞膜内保护剂配比-细胞复苏率比较表
Figure GDA0000021755020000082
从表中数据可知，渗透性细胞膜内保护剂的用量在3～13％之间，细胞的复苏率比较高，综合考虑，本发明的细胞冻存液中，渗透性细胞膜内保护剂的用量为1～16％。
使用不同配比细胞沉降稳定剂的细胞冻存液，非程序性冻存SD大鼠间充质干细胞MSCs，检测其复苏率，结果如表3所示。
表3、细胞沉降稳定剂配比-细胞复苏率比较表
Figure GDA0000021755020000091
表中，甲基纤维素4000CP、羟乙基淀粉为单独使用。
由表中数据可知，细胞沉降稳定剂的用量在3～23％之间，细胞的复苏率比较高，综合考虑，本发明的细胞冻存液中，细胞沉降稳定剂的用量为2～25％。
实验数据
复苏率比较
使用本发明的细胞冻存液常规冻存液按程序/非程序冻存间质干细胞(MSCs)、皮层神经元细胞(CNCs)及胚胎干细胞(ESCs)，之后测试其细胞复苏率，结果如表4所示。
表4、不同冻存液/冻存方法-细胞复苏率比较表
Figure GDA0000021755020000092
从表中数据可知，使用常规冻存液程序冻存细胞，其冻存效果明显好于非程序冻存，而采用本发明的细胞冻存液非程序冻存，细胞复苏率明显高于常规冻存液程序冻存，可见，本发明的细胞冻存液，优势明显。
细胞增殖力比较
分别使用本发明细胞冻存液非程序冻存、常规冻存液程序冻存和常规冻存液非程序冻存SD大鼠间充质干细胞MSCs，复苏后均接种1×105个细胞培养，培养7天，每天计算细胞数量，绘制其生长曲线，其生长曲线如图1所示。从图中可知，常规冻存液非程序冻存的细胞增殖速度差，常规冻存液程序冻存的细胞增殖速度较快，本发明细胞冻存液非程序冻存的细胞增殖速度最快，本发明细胞冻存液的效果最好。
不同细胞冻存液对细胞分化能力的影响
分别使用本发明细胞冻存液非程序冻存、常规冻存液程序冻存和常规冻存液非程序冻存SD大鼠间充质干细胞MSCs，复苏后传一代使用诱导液进行成骨诱导及成脂肪细胞诱导，诱导后对细胞进行染色观察。成骨诱导28d后的细胞使用茜素红染色；成脂诱导20d后的细胞使用油红O染色，细胞诱导结果如图3～8所示。图2是未诱导的SD大鼠MSCs细胞图；图3是本发明细胞冻存液非程序冻存的SD大鼠MSCs复苏后，成骨诱导28d的细胞图；图4是常规细胞冻存液程序冻存的SD大鼠MSCs复苏后，成骨诱导28d的细胞图；图5是常规细胞冻存液非程序冻存的SD大鼠MSCs复苏后，成骨诱导28d的细胞图。
图6是本发明细胞冻存液非程序冻存的SD大鼠MSCs复苏后，成脂诱导20d的细胞图；图7是常规细胞冻存液程序冻存的SD大鼠MSCs复苏后，成脂诱导20d的细胞图；图8是常规细胞冻存液非程序冻存的SD大鼠MSCs复苏后，成脂诱导20d的细胞图。
从图中可以看出，本发明的细胞冻存液对细胞的分化能力没有影响，效果明显好于常规细胞冻存液程序冻存。

Claims (10)

1.无蛋白细胞冻存液，含有细胞膜保护剂1.0～23w/v％、渗透性细胞膜内保护剂1.0～16w/v％、细胞沉降稳定剂2.0～25％，余量为pH缓冲液。
2.根据权利要求1所述的无蛋白细胞冻存液，其特征在于：所述冻存液中还添加有抗氧化剂0.1～0.4w/v％。
3.根据权利要求1所述的无蛋白细胞冻存液，其特征在于：所述冻存液中还添加有细胞营养剂0.3～2.0w/v％。
4.根据权利要求1所述的无蛋白细胞冻存液，其特征在于：细胞膜保护剂包括非还原性双糖、多糖、糖酐。
5.根据权利要求4所述的无蛋白细胞冻存液，其特征在于：非还原性双糖包括海藻糖、蔗糖。
6.根据权利要求1所述的无蛋白细胞冻存液，其特征在于：多糖包括棉子糖、木糖、潘糖。
7.根据权利要求1所述的无蛋白细胞冻存液，其特征在于：糖酐包括低分子糖酐-40、中分子糖酐-70、高分子糖酐-500。
8.根据权利要求1所述的无蛋白细胞冻存液，其特征在于：渗透性细胞膜内保护剂包括二甲基亚砜(DMSO)、丙二醇、丙三醇。
9.根据权利要求1所述的无蛋白细胞冻存液，其特征在于：细胞沉降稳定剂包括甲基纤维素、羟乙基淀粉、糊精、可溶性淀粉。
10.根据权利要求1所述的无蛋白细胞冻存液，其特征在于：pH缓冲液的pH为7.2～7.4。
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