CN1670193A

CN1670193A - 生物组织细胞玻璃化冻存液

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Publication number: CN1670193A
Application number: CNA2005100491023A
Authority: CN
Inventors: 胡军祥; 姜玉新
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2005-02-05
Filing date: 2005-02-05
Publication date: 2005-09-21

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种能够保持深低温冻存生物组织细胞活性的组合物质。进一步，涉及一种深低温冻存生物组织细胞的玻璃化冻存液。所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种适合多种生物组织细胞深低温冻存的玻璃化溶液，该溶液能有效保持冷冻后的生物组织细胞的活性，并具有配置简单即不需昂贵的程序降温仪、操作方便、价格低廉和容易推广的特点。技术方案是：生物组织细胞玻璃化冻存液，其各成分的体积百分比中含有19.5－21.5的二甲基亚砜，该冻存液中还含有：14.5－16.5的乙酰胺，3.5－5.5的丙二醇，4.5－6.5的2，3－丁二醇，5－7的聚乙二醇。所述的聚乙二醇的分子量为6000。

Description

生物组织细胞玻璃化冻存液

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种能够保持深低温冻存生物组织细胞活性的组合物。进一步，涉及一种深低温冻存生物组织细胞的玻璃化冻存液。

背景技术

目前深低温冻存生物组织细胞采用的常规方式是慢速冻存法。该法一般需配备冻存液和程序降温仪，并且操作过程比较复杂。以深低温冻存大鼠胚胎神经细胞为例：所采用的冻存液为含有20％DMSO(二甲基亚砜)和40％小牛血清的RPMI 1640液(培养液).与大鼠胚胎神经细胞悬浮液等量混合，使DMSO的终浓度为10％，4℃平衡20min后，用程序降温仪控温，以1℃/min的降温速率冷却至-75℃，再以3℃/min降至-95℃，投入液氮(-196℃)冻存。在冻存20d(天)后，检测细胞的回收率为86.57±6.87％，存活率为81.74±8.47％，琥珀酸脱氢酶(SDH)活性为0.598±0.086。电镜下观察，大部分胚胎神经细胞的超微结构没有发生变化，细胞膜和细胞器结构完整，核膜清晰可见。

由于慢速冻存法所配备的程序降温仪价格昂贵，一般规模的应用单位无能力购置；程序降温仪又体积较大，携带不便，在草原、牧场等畜兽养殖地区授精应用量较大的地方使用尤感困难；而且程序降温仪使用时，由于是慢速降温故处理过程时间较长，一般需要一个多小时。由于慢速冻存法存在的上述诸多缺陷，因而其应用受到了很大的限制。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术的不足，提供一种适合多种生物组织细胞深低温冻存的玻璃化溶液，该溶液能有效保持冷冻后的生物组织细胞的活性，并具有配置简单即不需昂贵的程序降温仪、操作方便、价格低廉和容易推广的特点。

本发明提供的技术方案是：生物组织细胞玻璃化冻存液，其各成分的体积百分比中含有19.5-21.5的二甲基亚砜，该冻存液中还含有：14.5-16.5的乙酰胺，3.5-5.5的丙二醇，4.5-6.5的2，3-丁二醇，5-7的聚乙二醇。

所述的聚乙二醇的分子量为6000。

本发明提供的玻璃化冻存液能有效地防止生物组织细胞在极快的降温和复温过程中冰晶形成对生物组织细胞造成冷冻损伤，因而显著提高了生物组织细胞冷冻保存的存活率。所需的配置除常规的冷冻设备外不需配备昂贵的程序降温仪，大幅度简化了现有的生物组织细胞的冷冻保存程序，而且方便携带，操作也变得十分简单，进而显著降低了冷冻保存的成本。由于容易推广使用，对于草原、牧场等畜兽养殖地区尤其具有积极意义。

具体实施方式

玻璃化概念实质上就是液体固化时不产生晶体，而溶液的粘滞度极度升高的一种状态。在玻璃化过程中，溶液被认为变成非晶体状态，分子间的运动受到很大程度的束缚。把生物材料用玻璃化方法进行低温冻存的概念，首先由B.J.Luyet在1937年提出。他认为生命是生物活体系统的原子或其他结构元的一种特殊排列，改变这种原子或结构元的位置，将可能破坏其平衡引起死亡，而结晶会使水分子从这些结构元中被撕裂开来，导致构筑生命物质的结构元遭到破坏。低温损伤就是由于细胞内外的结晶，造成细胞质和生物膜破坏而引起的。

本发明对玻璃化冻存液的筛选、低温保护剂的毒性、冷冻-复温、冻存液的洗脱等程序进行了比较研究，并通过对冻存后细胞膜及其内部结构的变化、胞内有关离子、超氧化物歧化酶(SOD)活性、琥珀酸脱氢酶(SDH)活性、三磷酸腺苷(ATP)含量以及细胞冻存后的体外培养等结构和功能变化的研究，获得了理想的冻存液配方。经使用该玻璃化冻存液仍然能够保持多种生物组织细胞的活性，进而为建立细胞和组织库提供技术支持。

本发明提供的生物组织细胞玻璃化冻存液，其组成成分中含有体积百分比19.5-21.5的二甲基亚砜、14.5-16.5的乙酰胺、3.5-5.5的丙二醇、4.5-6.5的2，3-丁二醇、5-7的聚乙二醇。所述的聚乙二醇包括不同分子量的所有聚乙二醇。

聚乙二醇中，分子量6000的优先选用。

这些低温保护剂可分为渗透性和非渗透性两类，全部可外购获得。

本发明提供的玻璃化冻存液进行了以下测试：

一、采用以下三个实施例：

实施例1中的玻璃化溶液含有：(体积百分比)DMSO-19.5，乙酰胺-14.5，丙二醇-3.5，2，3-丁二醇-4.5，聚乙二醇-5。

实施例2中的玻璃化溶液含有：(体积百分比)DMSO-21.5，乙酰胺-16.5，丙二醇-5.5，2，3-丁二醇-6.5，聚乙二醇-7。

实施例3中的玻璃化溶液含有：(体积百分比)DMSO-20.5，乙酰胺-15.5，丙二醇-4.5，2，3-丁二醇-5.5，聚乙二醇-6。

二、将前述实施例同时按以下方式测试：

1.玻璃化冻存液对胚胎神经细胞回收率的影响

测试前处理：引颈处死孕18d的SD大鼠孕鼠，剖腹取出胚胎，分离出大脑皮层，置于D-Hank’s液(无钙无镁的生理溶液)中，仔细剔除脑膜及血管组织，漂洗2次。将其切碎后用0.25％胰蛋白酶在37℃水浴中搅拌消化。收集到的细胞悬液，加入等量含10％小牛血清的DMEM培养液(细胞培养基)终止消化。用220目的尼龙网过滤，滤液以1000r/min离心8min，弃上清，加D-Hank’s液制成悬液，调整细胞浓度至10⁸个/mL。该处理过程与背景技术的前处理过程相同。

玻璃化冻存：取10⁸个/mL的细胞悬液1份(体积份)，加1/3份冻存液，在4℃平衡10min；再加2/3份冻存液，平衡10min；最后加0℃的冻存液8份。分装到冻存管中，直接投入液氮中。将冻存20d的胚胎神经细胞在37℃水浴中快速复温，然后用1.5M(摩尔)和0.5M的蔗糖溶液0℃或室温平衡10min，离心洗去冻存液，再用D-Hank’s液洗脱2次，最后用D-Hank’s液重新悬浮。按照实验要求调节细胞浓度。

回收率测定：细胞回收率的计算公式为：

回收率＝(洗脱后细胞数/洗脱前细胞数)×100％

结果实施例1至3的细胞回收率分别为84.68±5.42％，87.87±6.54％，86.58±7.11％。

2.玻璃化冻存液对胚胎神经细胞存活率的影响

测试前处理和玻璃化冻存与上述1相同。

存活率测定：细胞存活率计算公式为：

存活率＝(洗脱后活细胞数/洗脱后细胞总数)×100％

结果实施例1至3的细胞存活率分别为79.87±6.48％，82.72±7.11％，80.27±6.21％。

3.玻璃化冻存液对胚胎神经细胞琥珀酸脱氢酶(SDH)活性的影响

测试前处理：四唑盐(MTT)比色法是一种快速、简便的检测细胞存活和生长的测定方法。活细胞中的线粒体能够将黄绿色的MTT还原形成蓝紫色的结晶(甲臜)沉积在细胞中，用酶联免疫检测仪测定甲臜的含量以定量测定酶活性的变化。

将玻璃化冻存20d的大鼠胚胎神经细胞，复温洗脱冻存液后，加入到96孔培养板，每孔200μL，浓度为10⁶个/mL。每孔加入20μL MTT(5mg/mL)，在37℃细胞培养箱中孵化4h，使MTT充分被还原，弃上清液，加入100μL DMSO溶解MTT结晶，30min后用酶联检测仪测定570nm处吸光度(OD值)，比较甲臜值即细胞活性变化。该处理过程与背景技术的前处理过程相同。

结果实施例1至3的胚胎神经细胞SDH活性分别为0.557±0.132，0.623±0.097，0.598±0.102。

4.玻璃化冻存液冻存后胚胎神经细胞的超微结构变化

测试前处理：将冻存20d的胚胎神经细胞洗脱冻存液后，经2000r/min离心10min，弃上清，2.5％戊二醛固定1～2h，0.1M的磷酸缓冲液(pH7.2)洗涤3次，每次15min，再加入锇酸固定1～4h，也用0.1M的磷酸缓冲液(pH7.2)洗涤3次，每次15min(以上各步均在冰浴中进行)，然后在不同浓度丙酮溶液中进行脱水，其顺序为30％→50％→70％→80％→90％→95％→100％→100％→100％(以上各步时间均为15min)，充分脱水后将样品分为二部分。

一部分样品放入醋酸异戊酯中置换20min，然后把样品放入CO2临界干燥仪中临界点干燥，然后用离心溅射法镀铂，日立S-570扫描电镜观察。

另一部分样品加入以1/2包埋剂和1/2脱水剂配成的渗透剂进行渗透。然后将渗透完全的样品注入包埋剂，在室温聚合12～20h。再放入恒温箱中37℃中聚合12h、45℃聚合12h，最后在60℃中聚合24h。样品经聚合后进行切片，厚度为500-700，然后进行染色。用2～7％醋酸铀染40min，用双蒸水洗3遍，再用柠檬酸铀染12min，同样用双蒸水洗3遍。干燥后用日立-300透射电镜观察。该处理过程与背景技术的前处理过程相同。

结果实施例1至3的胚胎神经细胞，从电镜照片中可见，细胞膜和细胞器结构完整，核膜平滑整齐，核孔清晰可见，核仁明显，表明超微结构没有发生变化。

Claims

1.一种生物组织细胞玻璃化冻存液，其各成分的体积百分比中含有19.5-21.5的二甲基亚砜，其特征在于该冻存液中还含有：14.5-16.5的乙酰胺，3.5-5.5的丙二醇，4.5-6.5的2，3-丁二醇，5-7的聚乙二醇。

2.根据权利要求1所述的一种生物组织细胞玻璃化冻存液，其特征在于所述的聚乙二醇的分子量为6000。