CN114946829A - 一种毛囊组织玻璃化冻存液 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种毛囊组织玻璃化冻存液，包括以下体积百分数的组分：18％‑25％的二甲基亚砜，12％‑18％的乙酰胺，3％‑6％的1,2‑丙二醇，3％‑8％的2，3‑丁二醇，5％‑7％的聚乙二醇，1‑5％右旋糖酐，10％胎牛血清FBS，余量为平衡缓冲液；所述的毛囊组织玻璃化冻存液中还包括有0.2‑0.9g/ml的海藻糖；所有组分的体积百分数总和为100％。本发明的毛囊组织玻璃化冻存液在进行冻存毛囊组织时减少冰晶的形成，从而有效防止毛囊组织细胞冻伤，提高毛囊组织细胞冷冻保存的存活率，内含有胎牛血清FBS和右旋糖酐配合使用，在冷冻时以及解冻后及时提供相应的营养物质和生存环境，可以提高解冻时的存活率，使得解冻后的毛囊组织细胞复苏率高。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种毛囊组织玻璃化冻存液。
背景技术
低温冷冻保存是活体组织长期保存的一种有效方法，主要通过降低细胞的代谢率来起到保护作用，冻伤是低温保护最大的副反应，其原因可能为冰晶所致的机械性损伤和渗透性损伤。目前组织的冻存主要有两种方法：快速冻存法，即玻璃化法；慢速冻存法，即程序降温法。其中玻璃化法是指利用多种高浓度的冷冻保护剂联合形成的玻璃化冷冻保护液保护悬浮细胞，直接投入液氮进行冻存的方法，以该种方法冻结的细胞悬液没有冰晶的形成，直接液体转变为非晶态的固化过程。利用玻璃化方法在动植物细胞保存中普遍获得成功，但在微生物保存领域极为少见；而且，现有玻璃化冻存液中所含成分繁多，除了水之外多数由5-6种化合物组成。由于乙二醇对动物有毒性，所以基本上都是以聚乙二醇等作为玻璃化冻存液组成成分。
毛囊干细胞是在人的毛囊外根鞘隆突部中的一种。毛囊干细胞属于成体干细胞，在体内处于静止状态，在体外培养作用下表现出惊人的增殖能力。研究发现，毛囊干细胞具有多向分化潜能，它可以分化成表皮、毛囊、皮脂腺，参与皮肤创伤愈合的过程。毛囊干细胞具有很高的增殖潜能，在体外培养时呈克隆性生长，可诱导分化为神经元细胞，神经胶质细胞，平滑肌细胞和黑色素细胞等细胞，而植入体内则可分化形成神经元、黑色素细胞和角化细胞等。因此，毛囊干细胞对于细胞工程的研究至关重要，在对毛囊干细胞进行研究开发时，需要将毛囊组织进行冷冻储存，之后在需要使用时再进行解冻和复苏，但是，现有技术中的并没有主用于毛囊组织的玻璃化冻存液，且使用现有的冻存液对毛囊组织进行冻存使用时，其复苏效果差。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种毛囊组织玻璃化冻存液，该毛囊组织玻璃化冻存液在进行冻存毛囊组织时可以有效防止毛囊组织细胞冻伤，提高毛囊组织细胞冷冻保存的存活率，在冷冻时以及解冻后及时提供相应的营养物质和生存环境，可以提高存活率，使得解冻后的毛囊组织细胞复苏率高。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种毛囊组织玻璃化冻存液，包括以下体积百分数的组分：18％-25％的二甲基亚砜，12％-18％的乙酰胺，3％-6％的1,2-丙二醇，3％-8％的2，3-丁二醇，5％-7％的聚乙二醇，1-5％右旋糖酐，10％胎牛血清FBS，余量为平衡缓冲液；
所述的毛囊组织玻璃化冻存液中还包括有0.2-0.9g/ml的海藻糖；
所有组分的体积百分数总和为100％。
一种毛囊组织玻璃化冻存液，包括以下体积百分数的组分：18％-25％的二甲基亚砜，22％的二甲基亚砜，15％的乙酰胺，5％的1,2-丙二醇，5％的2，3-丁二醇，5％的聚乙二醇，5％右旋糖酐，10％胎牛血清FBS，余量为平衡缓冲液；
所述的毛囊组织玻璃化冻存液中还包括有0.2-0.9g/ml的海藻糖；
所有组分的体积百分数总和为100％。
进一步地，所述的平衡缓冲液由HEPES缓冲液和基础培养基按照体积比1:(35-40)配制而成。
进一步地，所述的基础培养基为DMEM、DMEM-F12或1640培养基。
进一步地，所述海藻糖为α，α-型海藻糖、α，β-型海藻糖和β，β-型海藻糖中的其中一种或多种。
上述的毛囊组织玻璃化冻存液由以下步骤制备而成：
1)将平衡缓冲液、胎牛血清FBS、右旋糖酐进行混合，得到混合基质液A；
2)将乙酰胺、2,3-丁二醇和聚乙二醇加入到步骤1)中的混合基质液A中混合后，得到混合基质液B；
3)将二甲基亚砜、1,2-丙二醇和海藻糖加入到步骤2)中的混合基质液B中，得到毛囊组织玻璃化冻存液
毛囊组织玻璃化冻存液在冻存毛囊干细胞方法中的应用，取保存完整毛球部的毛囊组织放入到5ml冻存管内，每支冻存管中放入30-40个保存完整毛球部的毛囊组织，向冻存管内加入毛囊组织玻璃化冻存液，浸泡5min后，将冻存管转移至液氮中冻存。
本发明具有的优点和积极效果是：
1、该毛囊组织玻璃化冻存液在对毛囊组织进行冻存后，在解冻后进行提取干细胞时，其存活率均可以达94％以上，解冻后的毛囊组织细胞复苏率高，具有实践性意义。
2、该玻璃化冻存液并且在进行冻存毛囊组织少有冰晶形成，有效防止毛囊组织细胞冻伤，提高毛囊组织细胞冷冻保存的存活率，各组分配合使用，在冷冻时以及解冻后及时提供相应的营养物质和生存环境，可以提高解冻时的存活率，使得解冻后的毛囊组织细胞复苏率高。
附图说明
图1为本发明实施例1中DPC细胞状态图；
图2为本发明空白对照组中DPC细胞状态图；
图3为本发明对比例1中DPC细胞状态图；
图4为本发明对比例2中DPC细胞状态图；
图5为本发明实施例1中DSC细胞状态图；
图6为本发明空白对照组中DSC细胞状态图；
图7为本发明对比例1中DSC细胞状态图；
图8为本发明对比例2中DSC细胞状态图；
图9为本发明实施例1中ORSC细胞状态图；
图10为本发明空白对照组中ORSC细胞状态图；
图11为本发明对比例1中ORSC细胞状态图；
图12为本发明对比例2中ORSC细胞状态图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作详细说明。
实施例1：
一种毛囊组织玻璃化冻存液，包括以下体积百分数的组分：
18％的二甲基亚砜、12％的乙酰胺、3％的1,2-丙二醇、3％的2,3-丁二醇、5％的聚乙二醇、15％的右旋糖酐，10％的胎牛血清FBS、34％的平衡缓冲液和0.2g/ml的海藻糖。
其中，平衡缓冲液由HEPES缓冲液和DMEM按照体积比1:35配制而成；海藻糖为α，α-型海藻糖。
毛囊组织玻璃化冻存液的制备步骤如下：
1)将平衡缓冲液、胎牛血清FBS、右旋糖酐进行混合，得到混合基质液A；
2)将乙酰胺、2,3-丁二醇和聚乙二醇加入到步骤1)中的混合基质液A中混合后，得到混合基质液B；
3)将二甲基亚砜、1,2-丙二醇和海藻糖加入到步骤2)中的混合基质液B中，得到毛囊组织玻璃化冻存液。
实施例2：
一种毛囊组织玻璃化冻存液，包括以下体积百分数的组分：
25％的二甲基亚砜、18％的乙酰胺、6％的1,2-丙二醇、8％的2,3-丁二醇、7％的聚乙二醇、5％的右旋糖酐，10％的胎牛血清FBS、21％的平衡缓冲液和0.9g/ml的海藻糖。
其中，平衡缓冲液由HEPES缓冲液和DMEM按照体积比1:40配制而成；海藻糖为α，β-型海藻糖。
毛囊组织玻璃化冻存液的制备步骤同实施例1。
实施例3：
一种毛囊组织玻璃化冻存液，包括以下体积百分数的组分：
22％的二甲基亚砜、15％的乙酰胺、5％的1,2-丙二醇、5％的2,3-丁二醇、5％的聚乙二醇、5％的右旋糖酐，10％的胎牛血清FBS、33％的平衡缓冲液和0.5g/ml的海藻糖。
其中，平衡缓冲液由HEPES缓冲液和DMEM按照体积比1:35配制而成；海藻糖为β，β-型海藻糖。
毛囊组织玻璃化冻存液的制备步骤同实施例1。
实施例4：
一种毛囊组织玻璃化冻存液，包括以下体积百分数的组分：
20％的二甲基亚砜、12％的乙酰胺、5％的1,2-丙二醇、8％的2,3-丁二醇、7％的聚乙二醇、3％的右旋糖酐，10％的胎牛血清FBS、35％的平衡缓冲液和0.7g/ml的海藻糖。
其中，平衡缓冲液由HEPES缓冲液和DMEM按照体积比1:35配制而成；海藻糖为α，β-型海藻糖。
毛囊组织玻璃化冻存液的制备步骤同实施例1。
对比例1：
一种生物组织细胞玻璃化冻存液，包括以下体积百分数的组分：
21.5％的二甲基亚砜、16.5％的乙酰胺、5.5％的1,2-丙二醇、6.5％的2,3-丁二醇、7％的聚乙二醇。
生物组织细胞玻璃化冻存液在制备时，直接取相应体积的二甲基亚砜、乙酰胺、1,2-丙二醇、2,3-丁二醇和聚乙二醇混合均匀即制得。
对比例2：
一种用于冻存液，由以下组分组成，80vol％KSR+10vol％DMSO+10vol％海藻糖的KSR溶液，其中海藻糖的KSR溶液的浓度为2mol/L。
实验例：
一、毛囊组织冻存：
剪取头发毛囊根部，清洗干净，取18支5ml冻存管分为六组，分别标号为a、b、c、d、e、f，且每组包括九支，向每支冻存管内放入40个保存完整毛球部的毛囊组织，之后向每支冻存管中加入4ml毛囊组织玻璃化冻存液；其中三组分别加入不同的冻存液，其中，a组中的冻存管中加入实施例1中制得的毛囊组织玻璃化冻存液，b组中的冻存管中加入实施例2中制得的毛囊组织玻璃化冻存液，c组中的冻存管中加入实施例3中制得的毛囊组织玻璃化冻存液，d组中的冻存管中加入实施例4中制得的毛囊组织玻璃化冻存液，e组中的冻存管中加入对比例1中制得的玻璃化冻存液，f组中的冻存管中加入对比例2中制得的冻存液；浸泡5min后，将冻存管转移至液氮中冻存3个月。
二、毛囊组织解冻活化：
(1)将新鲜培养基置于37℃水槽回温，回温后喷以75％酒精并擦拭之，移入无菌操作台内；
(2)将冻存后的冻存管从液氮中取出，放入37℃水槽中快速解冻，轻摇冻存管使其在1分钟内全部融化，以75％酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。解冻后的a、b、c、d、e、f中的毛囊组织分为三组，每组三支，分别用于提取DPC干细胞、DSC干细胞以及ORSC干细胞。
三、制备培养DPC干细胞：
1、空白对照组：取保存完整毛球部的毛囊组织120个，分为三组分别g1、g2、g3，作为空白对照组进行制备培养DPC干细胞。
2、培养操作：
用含双抗的PBS溶液清洗保留完整毛球部的毛囊组织2-3次。
显微镜下用手术刀头将毛乳头部整个分离出来，将残留的毛母质清除干净，用移液枪将组织移至一新的含PBS的培养皿中。加入0.1％胶原酶IV，37℃消化1h-2h，间隔10min观察消化状态，同时用吸管吹打组织，待观察到有毛乳头组织周边的真皮鞘组织全部解离出来后，在显微镜下用移液枪挑选出单个毛乳头，放置入含双抗的PBS溶液清洗，30秒后放入含有毛囊DPC培养基的培养皿中，放入37℃，5％培养箱中培养。
10天左右可见DPC从毛乳头中爬出，而后每3天进行细胞换液。培养15天后，待细胞铺满培养皿底部约80～90％面积时，进行胰酶消化传代；传代培养2天。
解冻后的初代DPC细胞的状态图如图1-4所示，其中，图1为实施例1中DPC细胞状态图，图2为空白对照组中DPC细胞状态图，图3为对比例1中DPC细胞状态图，图4为对比例2中DPC细胞状态图。
3、将扩增后的DPC干细胞进行细胞计数与活率检测
原理：
细胞计数采用血球计数盘，血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm＝1.0*10-4ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目。该实验中支计算正方形方格内的细胞数即可。
细胞活率检测：利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。本次实验使用trypan blue染料。
计算细胞存活率＝活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100％。
具体步骤：
(1)取50μl细胞悬浮液与50μl trypan blue等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。
(2)取少许混合液(约15μl)自血球计数盘chamber上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色。
(3)将步骤(2)中的活细胞和死细胞进行统计，之后计算细胞存活率。
注意：计数板计数时，最适浓度为5-10*105细胞/ml，若浓度偏高，可取出部分作稀释或连续稀释后计数。
每组的细胞数以及细胞活率如表1所示：
表1DPC干细胞存活率计算数据
由表1的实验数据可知：
本发明的实施例1-4与空白对照组的实验数据进行对比可知，本发明的毛囊组织玻璃化冻存液冻存后的毛囊组织其解冻后的细胞存活率较高，其细胞存活率大于94％，接近于新鲜毛囊组织的细胞存活率。
本发明的实施例与对比例1和对比例2的实验数据进行对比可知，本发明的毛囊组织玻璃化冻存液的性能远高于现有技术中的冻存液，其解冻后毛囊组织的存活率高，比现有技术中的细胞存活率至少提高10％以上。
由表1的实验数据可知，使用该冻存液冻存后的毛囊组织在复苏后制备DPC干细胞的成活率与新鲜的毛囊组织接近，由此可知，本申请要求保护的毛囊组织玻璃化冻存液具有良好的冻存效果，适用于毛囊组织。
四、制备培养DSC干细胞：
1、空白对照组：取保存完整毛球部的毛囊组织120个，分为三组分别为g4、g5、g6，作为空白对照组进行制备培养DPC干细胞。
2、培养操作：
用含双抗的PBS溶液清洗保留完整毛球部的毛囊组织2-3次。
显微镜下用手术刀头将毛乳头部整个分离出来，将残留的毛母质清除干净，用移液枪将组织移至一新的含PBS的培养皿中。加入0.1％胶原酶IV，37℃消化1h-2h，间隔10min观察消化状态，同时用吸管吹打组织，待观察到有毛乳头组织周边的真皮鞘组织全部解离出来后，在显微镜下用移液枪挑选出单个毛乳头，剩余消化液进行离心，收集DSC细胞，并用PBS溶液清洗2遍，放入含有毛囊DSC培养基的培养皿中，放入37℃，5％培养箱中培养。
2天左右可见DSC贴壁生长，而后每3天进行细胞换液。培养15天后，待细胞铺满培养皿底部约80～90％面积时，进行胰酶消化传代；传代培养2天。
解冻后的初代DSC细胞的状态图如图5-8所示，其中，图5为实施例1中DSC细胞状态图，图6为空白对照组中DSC细胞状态图，图7为对比例1中DSC细胞状态图，图8为对比例2中DSC细胞状态图。
3、将扩增后的DSC干细胞进行细胞计数与活率检测
原理：
细胞计数采用血球计数盘，血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm＝1.0*10-4ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目。该实验中支计算正方形方格内的细胞数即可。
细胞活率检测：利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。本次实验使用trypan blue染料。
计算细胞存活率＝活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100％。
具体步骤：
(4)取50μl细胞悬浮液与50μl trypan blue等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。
(5)取少许混合液(约15μl)自血球计数盘chamber上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色。
(6)将步骤(2)中的活细胞和死细胞进行统计，之后计算细胞存活率。
注意：计数板计数时，最适浓度为5-10*105细胞/ml，若浓度偏高，可取出部分作稀释或连续稀释后计数。
每组的细胞数以及细胞活率如表2所示：
表2DSC干细胞存活率计算数据
由表2的实验数据可知：
本发明的实施例1-4与空白对照组的实验数据进行对比可知，本发明的毛囊组织玻璃化冻存液冻存后的毛囊组织其解冻后的细胞存活率较高，其细胞存活可达94％及以上，接近于新鲜毛囊组织的细胞存活率。
本发明的实施例与对比例1和对比例2的实验数据进行对比可知，本发明的毛囊组织玻璃化冻存液的性能远高于现有技术中的冻存液，其解冻后毛囊组织的存活率高，比现有技术中的细胞存活率至少提高10％以上。
由表2的实验数据可知，使用该冻存液冻存后的毛囊组织在复苏后制备DSC干细胞的成活率与新鲜的毛囊组织接近，由此可知，本申请要求保护的毛囊组织玻璃化冻存液具有良好的冻存效果，适用于毛囊组织。
五、制备培养ORSC干细胞
1、空白对照组：取保存完整毛球部的毛囊组织120个，分为三组分别g7、g8、g9，作为空白对照组进行制备培养DPC干细胞
2、培养操作：
用含双抗的PBS溶液清洗组织2-3次。
0.25％Dispase酶4℃过夜消化，第二天提前半小时放入37℃培养箱中回温。
用眼科镊将毛囊组织加入含双抗的PBS溶液的培养皿中清洗。将毛干顺毛囊方向夹出，将残留的毛母质清除干净，放入0.5％不含EDTA的2ml胰酶中，37℃消化5-10min，加入2mlFBS终止消化。离心，弃上清，将沉淀用4mlORSC培养基重悬加入到含有毛囊ORSC培养基的培养皿中，放入37℃，5％培养箱中培养。
2天左右可见ORSC贴壁生长，而后每3天进行细胞换液。培养15天后，待细胞铺满培养皿底部约80～90％面积时，进行胰酶消化传代。传代培养2天。
解冻后的初代ORSC细胞的状态图如图9-12所示，其中，图9为实施例1中ORSC细胞状态图，图10为空白对照组中ORSC细胞状态图，图11为对比例1中ORSC细胞状态图，图12为对比例2中ORSC细胞状态图。
3、将扩增后的ORSC干细胞进行细胞计数与活率检测
原理：
细胞计数采用血球计数盘，血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm＝1.0*10-4ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目。该实验中支计算正方形方格内的细胞数即可。
细胞活率检测：利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。本次实验使用trypan blue染料。
计算细胞存活率＝活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100％。
具体步骤：
(7)取50μl细胞悬浮液与50μl trypan blue等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。
(8)取少许混合液(约15μl)自血球计数盘chamber上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色。
(9)将步骤(2)中的活细胞和死细胞进行统计，之后计算细胞存活率。
注意：计数板计数时，最适浓度为5-10*105细胞/ml，若浓度偏高，可取出部分作稀释或连续稀释后计数。
每组的细胞数以及细胞活率如表1所示：
表3ORSC干细胞存活率计算数据
由表3的实验数据可知：
本发明的实施例1-4与空白对照组的实验数据进行对比可知，本发明的毛囊组织玻璃化冻存液冻存后的毛囊组织其解冻后的细胞存活率较高，其细胞存活率达96％及以上，接近于新鲜毛囊组织的细胞存活率。
本发明的实施例与对比例1和对比例2的实验数据进行对比可知，本发明的毛囊组织玻璃化冻存液的性能远高于现有技术中的冻存液，其解冻后毛囊组织的存活率高，比现有技术中的细胞存活率至少提高10％以上。
由表3的实验数据可知，使用该冻存液冻存后的毛囊组织在复苏后制备ORSC干细胞的成活率与新鲜的毛囊组织接近，由此可知，本申请要求保护的毛囊组织玻璃化冻存液具有良好的冻存效果，适用于毛囊组织。
由以上的几组试验比对可知，本申请的玻璃化冻存液对于毛囊组织具有较好的应用效果，使用该玻璃化冻存液冻存后的毛囊组织，在解冻后进行提取干细胞时，其存活率均可以达94％以上，具有实践性意义；由此可知，本申请的玻璃化冻存液可以有效防止毛囊组织细胞冻伤，提高毛囊组织细胞冷冻保存的存活率，且其解冻后的毛囊组织细胞的复苏率高。
以上对本发明的具体实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
Claims (7)
1.一种毛囊组织玻璃化冻存液，其特征在于：包括以下体积百分数的组分：18％-25％的二甲基亚砜，12％-18％的乙酰胺，3％-6％的1,2-丙二醇，3％-8％的2，3-丁二醇，5％-7％的聚乙二醇，1-5％右旋糖酐，10％胎牛血清FBS，余量为平衡缓冲液；
所述的毛囊组织玻璃化冻存液中还包括有0.2-0.9g/ml的海藻糖；
所有组分的体积百分数总和为100％。
2.根据权利要求1所述的毛囊组织玻璃化冻存液，其特征在于：包括以下体积百分数的组分：22％的二甲基亚砜，15％的乙酰胺，5％的1,2-丙二醇，5％的2，3-丁二醇，5％的聚乙二醇，5％右旋糖酐，10％胎牛血清FBS，余量为平衡缓冲液；
所述的毛囊组织玻璃化冻存液中还包括有0.2-0.9g/ml的海藻糖；
所有组分的体积百分数总和为100％。
3.根据权利要求1或2所述的一种毛囊组织玻璃化冻存液，其特征在于：所述的平衡缓冲液由HEPES缓冲液和基础培养基按照体积比1:(35-40)配制而成。
4.根据权利要求3所述的一种毛囊组织玻璃化冻存液，其特征在于：所述的基础培养基为DMEM、DMEM-F12或1640培养基。
5.根据权利要求1或2所述的一种毛囊组织玻璃化冻存液，其特征在于：所述海藻糖为α，α-型海藻糖、α，β-型海藻糖和β，β-型海藻糖中的其中一种或多种。
6.根据权利要求1所述的一种毛囊组织玻璃化冻存液，其特征在于：由以下步骤制备而成：
1)将平衡缓冲液、胎牛血清FBS、右旋糖酐进行混合，得到混合基质液A；
2)将乙酰胺、2,3-丁二醇和聚乙二醇加入到步骤1)中的混合基质液A中混合后，得到混合基质液B；
3)将二甲基亚砜、1,2-丙二醇和海藻糖加入到步骤2)中的混合基质液B中，得到毛囊组织玻璃化冻存液。
7.根据权利要求1-5任意一项所述的毛囊组织玻璃化冻存液在冻存毛囊干细胞方法中的应用，其特征在于：取保存完整毛球部的毛囊组织放入到5ml冻存管内，每支冻存管中放入30-40个保存完整毛球部的毛囊组织，向冻存管内加入毛囊组织玻璃化冻存液，浸泡5min后，将冻存管转移至液氮中冻存。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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Denomination of invention: A type of hair follicle tissue vitrification cryopreservation solution Granted publication date: 20231103 Pledgee: Bank of Jiangsu Limited by Share Ltd. Hangzhou branch Pledgor: ZHEJIANG HEALTHFUTURE BIOMEDICAL TECHNOLOGY CO.,LTD. Registration number: Y2024980002379 |