CN110495447A - 一种免疫细胞玻璃化冻存保护液及冻存免疫细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种免疫细胞玻璃化冻存保护液及冻存免疫细胞的方法，冻存保护液是在基础培养基RPMI 1640培养液中加入聚乙烯醇、二甲亚砜、丙三醇、乙二醇、海藻糖、胎牛血清和人血清白蛋白。聚合物非渗透剂聚乙烯醇、人血清白蛋白的加入可以减少因降温而形成细胞内冰晶，减少损伤，在一定程度上替代二甲基亚砜或乙二醇的使用，从而可以减少二甲亚砜及乙二醇的用量，聚乙烯醇、二甲亚砜、乙二醇、人血清白蛋白的这种配合使用在降低了冻存液对细胞的毒性的同时，提升了细胞的存活率，保障细胞的正常发育。采用本发明的冻存保护液具有很好的玻璃化冻存效果，其存活率增加及细胞复苏后有更高活率。

Description

一种免疫细胞玻璃化冻存保护液及冻存免疫细胞的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种冻存保护剂，特别涉及一种免疫细胞玻璃化冻存保护液及冻存免疫细胞的方法。

技术背景

随着现代环境的变化，癌症的发病率越来越高，而目前有关免疫细胞在肿瘤免疫治疗的研究主要集中在自体免疫细胞过继免疫治疗，如CAR-T细胞治疗，取得了显著成效。年轻时的细胞比衰老时的功能强大很多，将自身免疫细胞进行存储用于将来的疾病治疗已经变成趋势，而早期细胞的低温储存显得尤为重要。

传统的细胞低温保存方法有连续慢速降温法、程序性降温法和梯度降温法等，其主要的区别在于细胞的降温速率及各个降温阶段停留的时间不同，所采用的冷冻保护剂成分及浓度也有区别，文献报道在这些方法中目前低温保存细胞存活率最高的为程序性降温法，人们采用类似的降温技术低温保存细胞已取得了一定的进展。但是，传统的低温保存方法有很多局限性，如无法避免冷冻过程中细胞内冰晶的形成，且操作过程繁琐，需要昂贵的程序降温仪。

玻璃化冻存法是近年来发展起来的一项新的冷冻技术，在极快速降温过程中，使高浓度的冷冻保护液由液态转变为黏度很高的类似玻璃样的固态，并以这种状态在低温下长期保存。其超快的降温速率可以避免细胞内冰晶的形成，极大的降低了冷冻过程中的细胞损伤。到目前为止，已经成功保存了人的精子、卵母细胞、胚胎、红细胞、胚胎干细胞、造血干细胞、胰岛等。玻璃化冻存法可以保持原有细胞的活性和完整性，并能降低其抗原性，其冷冻保护剂的组分及配方已可用于保存人体的组织和器官。在玻璃化冷冻过程中，现有的玻璃化液主要依靠渗透型冷冻保护剂，例如，二甲基亚砜、乙二醇或脯氨酸，渗入到细胞内部，提高细胞内渗透压，避免因降温而形成细胞内冰晶。但二甲基亚砜和乙二醇对细胞具有较大的毒性。而且现有技术中的冻存液一般用于冻存胚胎细胞，由于免疫细胞量大，密度大，降温中更易形成细胞内冰晶，为了避免细胞内冰晶的形成，需要更高浓度的二甲基亚砜和乙二醇，但这又会导致更低的存活率，难以保障细胞的正常发育。

发明内容

为解决现有技术的上述不足，本发明提供一种免疫细胞玻璃化冻存保护液及冻存免疫细胞的方法。本发明冻存液为在基础培养基加入胎牛血清、人血清白蛋白、聚乙烯醇、二甲亚砜、丙三醇、乙二醇、海藻糖。聚合物非渗透剂聚乙烯醇、人血清白蛋白的加入可以减少因降温而形成细胞内冰晶，减少损伤，在一定程度上替代二甲基亚砜或乙二醇的使用，从而可以减少二甲亚砜及乙二醇的用量，聚乙烯醇、二甲亚砜、乙二醇、人血清白蛋白的这种配合使用在降低了冻存液对细胞的毒性的同时，提升了细胞的存活率，保障细胞的正常发育。采用本发明的冻存保护液具有很好的玻璃化冻存效果，其存活率增加及细胞复苏后有更高活率。

本发明的具体技术方案如下：

一种免疫细胞玻璃化冻存保护液，所述冻存保护液是在基础培养基RPMI 1640培养液中加入胎牛血清、人血清白蛋白、聚乙烯醇、二甲亚砜、丙三醇、乙二醇、海藻糖，各组分的用量如下(v/v为体积比)：

聚乙烯醇 1％-5％(v/v)

二甲亚砜 2.0～3.0mol/L

丙三醇 2.0～3.0mol/L

乙二醇 2.0～3.0mol/L

海藻糖 1.0～2.0mol/L

胎牛血清 10～15％

人血清白蛋白 1％-3％。

聚合物非渗透剂聚乙烯醇、人血清白蛋白的加入可以减少因降温而形成细胞内冰晶，聚乙烯醇能够优先结合溶液中水分子，降低细胞外溶液的电解质浓度，减少阳离子进入细胞的数量，从而减少损伤，在一定程度上替代二甲基亚砜或乙二醇的使用，从而可以减少二甲亚砜及乙二醇的用量，聚乙烯醇、二甲亚砜、乙二醇、人血清白蛋白的这种配合使用在降低了冻存液对细胞的毒性的同时，提升了细胞的存活率，保障细胞的正常发育。

进一步地，各组分的优化用量如下：

聚乙烯醇 2％(v/v)

二甲亚砜 2.5mol/L

丙三醇 2.5mol/L

乙二醇 2.5mol/L

海藻糖 1.5mol/L

胎牛血清 15％(v/v)

人血清白蛋白 2％。

本发明进一步提供一种使用上述玻璃化冻存液冻存免疫细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

①制备冻存保护液；

②培养免疫细胞；

③用步骤①制备的冻存保护液悬浮免疫细胞并注入冻存麦管；

④直接放入液氮中进行玻璃化冻存。

其中，步骤①中制备冻存保护液的方法如下：在基础培养基RPMI 1640培养液中依次加入胎牛血清、人血清白蛋白、聚乙烯醇、海藻糖、丙三醇、乙二醇，过滤除菌，加入二甲亚砜，放入4℃保存。各组分的用量如下(v/v为体积比)：

聚乙烯醇 1％-5％(v/v)

二甲亚砜 2.0～3.0mol/L

丙三醇 2.0～3.0mol/L

乙二醇 2.0～3.0mol/L

海藻糖 1.0～2.0mol/L

胎牛血清 10～15％

人血清白蛋白 1％-3％。

进一步地，各组分的优化用量如下：

聚乙烯醇 2％(v/v)

二甲亚砜 2.5mol/L

丙三醇 2.5mol/L

乙二醇 2.5mol/L

海藻糖 1.5mol/L

胎牛血清 15％(v/v)

人血清白蛋白 2％。

步骤②包括：采集人的外周静脉血，梯度离心获得单个核细胞，洗涤并用无血清培养液重悬，调整细胞密度到1～2×106/ml，第0天加入IFN-γ(γ干扰素)，培养20～28小时后加入抗CD3(分化簇3)单抗、IL-1α(白细胞介素1)、 IL-2(白细胞介素2)，继续放置于37℃、5％CO2培养箱中培养。将激活的细胞每2天补加含有IL-2的无血清Medium CTS^TM培养液，调整细胞密度到 1～2×106/ml，连续培养11～15天。培养11～15天后，在细胞数量和细胞毒活性达到预期要求后收集细胞。步骤②中加入的IFN-γ浓度为300～1000IU/ml，抗CD3单抗浓度为50～500ng/ml，IL-1α浓度为0.5～5ng/ml，IL-2浓度为50～ 1000IU/ml。这种处理可以大幅度提高复苏后培养免疫细胞的活性和稳定性，使其保持原有细胞高活性，从而使免疫细胞很好地保持了细胞复苏后的生理功能和生物学特性，可有效解决细胞复苏后直接规模化扩增问题。

步骤③包括：将用步骤②培养制备的免疫细胞进行离心，用步骤①制备的冻存保护液悬浮免疫细胞并调整密度至2～10×106/ml，注入冻存麦管，并密封。

对步骤③中注入免疫细胞的冻存麦管进行编号，按照步骤④迅速放入液氮罐中进行玻璃化冷冻。

本发明所述的制备的冻存保护液也可用于其他细胞的玻璃化冻存。

本发明创造的有益效果是：

1、本发明冻存液中聚合物非渗透剂聚乙烯醇、人血清白蛋白的加入可以减少因降温而形成细胞内冰晶，聚乙烯醇能够优先结合溶液中水分子，降低细胞外溶液的电解质浓度，减少阳离子进入细胞的数量，从而减少损伤，在一定程度上替代二甲基亚砜或乙二醇的使用，从而可以减少二甲亚砜及乙二醇的用量，聚乙烯醇、二甲亚砜、乙二醇、人血清白蛋白的这种配合使用在降低了冻存液对免疫细胞的毒性的同时，提升了细胞的存活率，保障细胞的正常发育。

2、使用本发明冻存液冻存免疫细胞，免疫细胞复苏率达到90％以上，存活率达到85％以上，较常规冻存细胞相比，其复苏率和存活率都明显增加，大大提高了冻存效果。

3、运用本发明的冻存保护液，可进行免疫细胞的冻存，亦可用于其他细胞的冻存，同时还具有制备成本低廉、工序简单、条件易控、对设备的要求较低、易于规模化生产等优势。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例的冻存保护液组分及用量如下：

制备冻存保护液的方法如下：在基础培养基RPMI 1640培养液中依次加入胎牛血清、人血清白蛋白、聚乙烯醇、海藻糖、丙三醇、乙二醇，过滤除菌，加入二甲亚砜，放入4℃保存。各组分的优化用量如下：

聚乙烯醇 2％(v/v)

二甲亚砜 2.5mol/L

丙三醇 2.5mol/L

乙二醇 2.5mol/L

海藻糖 1.5mol/L

胎牛血清 15％

人血清白蛋白 2％。

聚合物非渗透剂聚乙烯醇的加入可以减少因降温而形成细胞内冰晶，减少损伤，在一定程度上替代二甲基亚砜或乙二醇的使用，从而可以减少二甲亚砜及乙二醇的用量，降低了冻存液对细胞的毒性，提升细胞的存活率，保障细胞的正常发育。

(应用例)

用实施例1制备的冻存保护液冻存免疫细胞，包括以下步骤：

⑴培养免疫细胞；

⑵用步骤1制备的冻存保护液悬浮免疫细胞并注入冻存麦管；

⑶直接放入液氮中进行玻璃化冻存。

步骤⑴包括：采集人的外周静脉血，梯度离心获得单个核细胞，洗涤并用无血清培养液重悬，调整细胞密度到1×106/ml，第0天加入IFN-γ，培养20～ 28小时后加入抗CD3单抗、IL-1α、IL-2，继续放置于37℃、5％CO2培养箱中培养。将激活的细胞每2天补加含有IL-2的无血清Medium CTS^TM培养液，调整细胞密度到1×106/ml，连续培养15天。培养15天后收集淋巴细胞细胞，收集细胞是指在细胞数量和细胞毒活性达到预期要求后收集细胞。步骤②中所述加入的IFN-γ浓度为500IU/ml，抗CD3单抗浓度为200ng/ml，IL-1α浓度为5ng/ml，IL-2浓度为1000IU/ml。这种处理可以大幅度提高复苏后培养免疫细胞的活性和稳定性，使其保持原有细胞高活性，从而使免疫细胞很好地保持了细胞复苏后的生理功能和生物学特性，可有效解决细胞复苏后直接规模化扩增问题。

步骤⑵包括：将步骤⑴培养制备的免疫细胞进行离心，用制备的冻存保护液悬浮免疫细胞并调整密度至5×106/ml，注入冻存麦管，并密封。

对步骤⑵中注入免疫细胞的冻存麦管进行编号，按照步骤⑶迅速放入液氮罐中进行玻璃化冷冻。

1个月后放入37℃水浴复苏，细胞计数仪检测细胞复苏率，台盼蓝检测存活率，结果如表1：

表1：玻璃化冻存的外周血来源免疫细胞复苏结果(n＝3)

玻璃化冻存前后	细胞复苏率％	细胞存活率％
			冻存前	100％	92.23±4.66
复苏后	90.61±6.83	86.97±8.74

本发明的冻存保护液可以进行玻璃化冻存优势：免疫细胞复苏率达到90％以上，存活率达到80％以上，相比普通冻存方法，其复苏率和存活率都明显增加，大大提高了冻存效果。运用本发明的冻存保护液，可进行免疫细胞的冻存，亦可用于其他细胞的冻存，同时还具有制备成本低廉、工序简单、条件易控、对设备的要求较低、易于规模化生产等优势。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

Claims (8)

1.一种免疫细胞玻璃化冻存保护液，其特征在于，所述冻存保护液是在基础培养基RPMI1640培养液中加入胎牛血清、人血清白蛋白、聚乙烯醇、二甲亚砜、丙三醇、乙二醇、海藻糖，各组分的用量如下(v/v为体积比)：

聚乙烯醇1％-5％(v/v)

二甲亚砜2.0～3.0mol/L

丙三醇2.0～3.0mol/L

乙二醇2.0～3.0mol/L

海藻糖1.0～2.0mol/L

胎牛血清10～15％

人血清白蛋白1％-3％。

2.根据权利要求1所述的免疫细胞玻璃化冻存保护液，其特征在于，各组分的优化用量如下：

聚乙烯醇2％(v/v)

二甲亚砜2.5mol/L

丙三醇2.5mol/L

乙二醇2.5mol/L

海藻糖1.5mol/L

胎牛血清15％(v/v)

人血清白蛋白2％。

3.一种使用权利要求1-2任一项所述的免疫细胞玻璃化冻存保护液冻存免疫细胞的方法，其特征在于，具有以下步骤：

①制备冻存保护液；

②培养免疫细胞；

③用步骤①制备的冻存保护液悬浮免疫细胞并注入冻存麦管；

④直接放入液氮中进行玻璃化冻存。

4.根据权利要求3所述的冻存免疫细胞的方法，其特征在于：步骤①中制备培养液的方法如下：在基础培养基RPMI 1640培养液中依次加入胎牛血清、人血清白蛋白、聚乙烯醇、海藻糖、丙三醇、乙二醇，过滤除菌，加入二甲亚砜，放入4℃保存，各组分的优化用量如下：

聚乙烯醇2％(v/v)

二甲亚砜2.5mol/L

丙三醇2.5mol/L

乙二醇2.5mol/L

海藻糖1.5mol/L

胎牛血清15％(v/v)

人血清白蛋白2％。

5.根据权利要求3所述的冻存免疫细胞的方法，其特征在于，步骤②中采集人的外周静脉血，梯度离心获得单个核细胞，洗涤并用无血清培养液重悬，调整细胞密度到1～2×106/ml，第0天加入IFN-γ，培养20～28小时后加入抗CD3单抗、IL-1α、IL-2，继续放置于37℃、5％CO2培养箱中培养，将激活的细胞每2天补加含有IL-2的无血清AIM-V(R)Medium CTS(TM)培养液，调整细胞密度到1～2×106/ml，连续培养11～15天，培养11～15天后收集淋巴细胞细胞，收集细胞是指在细胞数量和细胞毒活性达到预期要求后收集细胞。

6.根据权利要求3所述的冻存免疫细胞的方法，其特征在于：步骤②中所述加入的IFN-γ浓度为300～1000IU/ml，抗CD3单抗浓度为50～500ng/ml，IL-1α浓度为0.5～5ng/ml，IL-2浓度为50～1000IU/ml。

7.根据权利要求3所述的冻存免疫细胞的方法，其特征在于，步骤③中将用步骤②培养制备的免疫细胞进行离心，用步骤①制备的冻存保护液悬浮免疫细胞并调整密度至2～10×106/ml，注入冻存麦管，并密封。

8.根据权利要求3所述的冻存免疫细胞的方法，其特征在于，步骤③中对注入免疫细胞的冻存麦管进行编号后，迅速放入液氮罐中进行玻璃化冷冻。