CN104694473B - 从成人外周血中自动化提取免疫细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种简单有效的从成人外周血中自动化提取免疫细胞的方法，特别是涉及一种使用AXP全自动细胞分离设备来从成人外周血中自动化提取免疫细胞的方法，以及相配套使用的冻存和复苏的方法，以及复苏后免疫细胞扩增的方法，其包括如下步骤：全血样本预处理、自动分离、单个核细胞收集和任选的对所得免疫细胞检测以下项目的至少一项：单个核细胞总数、单个核细胞活率、细胞污染、遗传病、HLA‑ABC/DR配型。本发明发现使用特定操作步骤的提取、冻存、复苏以及扩增，可以有效地获得免疫细胞，该免疫细胞可用于治疗肿瘤。
Description
技术领域
本发明涉及从血液特别是外周血中自动分离免疫细胞的方法及其在治疗疾病中的应用，具体涉及从健康人体的血液中特别是外周血中自动分离免疫细胞并冻存，以及在出现免疫低下或发生疾病症状时，将免疫细胞进行体外扩增并施用于患者进行免疫细胞治疗的方法。
背景技术
免疫细胞(immune cell)是白细胞的俗称，包括淋巴细胞和各种吞噬细胞，也特指能识别抗原、产生特异性免疫应答的淋巴细胞。淋巴细胞是免疫系统的基本成分，在体内分布很广泛。研究发现血液中蕴含丰富的淋巴细胞，由于这类细胞具有免疫调控和自我复制等特点，所以一直受到人们的关注。淋巴细胞具有自然杀伤和自我保护的特性，针对病毒、细菌、真菌感染的治疗均起到关键的作用，在癌症的治疗中具有很大的临床应用价值。
免疫细胞在健康人体的血液中蕴含丰富，但由于年龄老化、亚健康、罹患疾病等原因，血液中的免疫细胞数目会显著降低，增殖分化能力亦大幅度衰退；而其他健康人的免疫细胞移植给患者则可能引起免疫排斥反应；提取免疫细胞过程对患者的损伤性和在采集时遇到的其他问题，都直接影响了免疫细胞的临床应用，使得寻找一种稳定可靠的免疫细胞获取来源成为一个重要的问题。
研究显示，健康人的新鲜血液中含有大量有效的免疫细胞并且能有效分离，这种组织来源的免疫细胞不仅保持了免疫细胞的特异性免疫应答的生物学特性，而且分离出来的免疫细胞具有原始的、强劲的增殖能力，同时还易于冷冻保存和复苏。由于免疫细胞起源于自身，大大减低了触发免疫反应及引起移植物抗宿主病的风险。潜伏性病毒和微生物的感染及传播几率比较低。采集过程简单，对健康的被采集者无任何危害及损伤。以上原因足以令从血液中分离免疫细胞成为获得免疫细胞的有效途径。
但是，目前关于血液免疫细胞的分离和扩增方法不一，且大多步骤复杂，获得较多数量血液免疫细胞也存在一定困难，同时患者在罹患疾病时采集血液存在一定风险。因此，本领域需要有从血液中分离、保存和扩增免疫细胞的简单、有效的方法，以满足医药、科研、临床应用等领域的需求。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术提取、冻存、复苏血液免疫细胞方法的缺陷，提供一种简单有效的血液免疫细胞的提取方法，以及相配套使用的冻存和复苏的方法，以及复苏后免疫细胞扩增的方法。本发明发现使用特定操作步骤的提取、冻存、复苏以及扩增，可以有效地获得免疫细胞。本发明基于此发现而得以完成。
本发明方法中使用到一种称为AXP(Auto Xpress Platform)的全自动细胞分离设备，其是美国TG公司(ThermoGenesis)制造的，TG公司是全球范围内专业从事干细胞与再生医学相关医疗设备与技术开发的国际领导型企业。公司研发的AXP、BioArchive等干细胞全自动化技术设备，获得国际干细胞行业的广泛认可，并已得到美国食品药品管理局(FDA)和美国血库协会(AABB)等行业管理机构与协会的认同。目前，世界最大的CBR私人血库，纽约NYBC公共血库以及台湾、香港等地区的170多家血库都纷纷引进他们的设备，全面实现干细胞技术自动化。AXP全自动干细胞分离设备根据国际干细胞、血库的行业技术要求设计发明的，不仅能全密闭式分离干细胞，将污染程度降到最低点，还能将干细胞的质量从手工采集的70％提升到98.7％。自动化将是国内干细胞产业技术的一个里程碑。
本发明第一方面提供了从健康哺乳动物的新鲜血液中获取免疫细胞的方法，具体提供了从成人外周血中自动化提取免疫细胞的方法，该方法包括以下分离步骤：
(a)全血样本预处理：将采集的成人外周血血样，转移至AXP处理袋中，加入羟乙基淀粉溶液放置在摇床上充分混匀(其中血样与羟乙基淀粉溶液的混合体积比为2～6：1，例如3～5：1，例如4：1)；
(b)自动分离：将AXP处理袋放入AXP全自动细胞分离设备后，进行自动分离；
(c)单个核细胞(在本文中可用缩写MNC表示)收集：由AXP全自动细胞分离设备自动分离得到的免疫细胞自动收集于AXP全自动细胞分离设备内所附的冻存袋中；
以及任选的下列步骤：
(d)针对步骤(c)所得免疫细胞，检测以下项目的至少一项：单个核细胞总数、单个核细胞活率、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型。
根据本发明第一方面的方法，该方法还包括以下对提取的免疫细胞进行冻存的步骤：
(e)单个核细胞冻存：向步骤(c)提取的免疫细胞中加入冻存液，重悬免疫细胞，将免疫细胞加入冻存容器，程序降温，然后再将冻存容器置于液氮罐中长期储存；
以及任选的下列步骤：
(f)建立包含步骤以上信息的免疫细胞的数据库，并使该数据库与步骤(e)的冻存免疫细胞进行关联。
根据本发明第一方面的方法，该方法还包括以下对冻存的免疫细胞进行复苏的步骤：
(g)细胞复苏：将步骤(e)冻存的冻存容器从液氮罐中取出，水浴，清洗冻存容器表面后转移至生物安全柜中，将免疫细胞转移至装有培养基的离心容器中，重悬，混匀，补加培养基，离心洗涤；
以及任选的下列步骤：
(h)针对步骤(g)所得复苏的免疫细胞，检测以下项目的至少一项：单个核细胞总数、单个核细胞活率及复苏率、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型。
根据本发明第一方面的方法，该方法还包括以下对复苏的免疫细胞进行扩增的步骤：
(i)细胞扩增：用含有培养基和血清的细胞培养液对复苏后的单个核细胞进行重悬培养，吸出细胞培养液，转移至离心容器，反复吹洗贴壁细胞，直至贴壁细胞完全不被吹洗下来，获得未成熟树突状细胞(iDC)，添加培养基重悬未成熟树突状细胞(iDC)，将离心容器中的细胞培养液进行离心处理，获得的细胞沉淀为细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)，针对iDC细胞和CIK细胞进行细胞计数，再分别针对iDC细胞及CIK细胞进行培养。
根据本发明第一方面的方法，所述哺乳动物是人。例如是成年人。
根据本发明第一方面的方法，所述新鲜血液是外周血。
根据本发明第一方面的方法，所述羟乙基淀粉溶液中羟乙基淀粉的浓度为4-8％，例如5-7％，例如6％。
根据本发明第一方面的方法，所述羟乙基淀粉溶液是将羟乙基淀粉添加到0.9％氯化钠溶液中配制得到的。
根据本发明第一方面的方法，所述羟乙基淀粉溶液中还包含麦芽糖。
根据本发明第一方面的方法，所述羟乙基淀粉溶液中还包含麦芽糖，麦芽糖的浓度为0.2～2％，特别是0.25～1.5％，特别是0.5～1％。已经出人意料地发现，在用AXP全自动细胞分离设备进行从外周血中自动分离免疫细胞时，使用添加了适量麦芽糖的羟乙基淀粉溶液稀释血样后，免疫细胞的收率至少可以提高15％，这具有极其重大的临床意义。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)中在AXP全自动细胞分离设备中进行自动分离时，执行两次离心处理，第一次离心条件为：1430rcf、20min、15℃，第二次离心条件为：80rcf、10min、15℃。众所周知，rcf(relative centrifugal force)系指相对离心力。
根据本发明第一方面的方法，在步骤(a)中，转移至AXP处理袋中的血液留取5ml血样于15ml离心容器中，用于血型检测。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(d)所述的检测单个核细胞总数和单个核细胞活率是向步骤(c)收集的细胞沉淀中加入10-30ml生理盐水，优选20ml，用10ml移液管反复吹吸细胞，充分混匀，吸取20μl细胞，加入180μl台盼蓝染液，充分混匀后加入计数板计算细胞总数与活率，记录结果。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(e)所述的冻存液是按照20-60重量份的X-VIVO无血清培养基、10-50重量份的人血清白蛋白和5-15重量份的DMSO的配方配制而成的，优选X-VIVO无血清培养基的配方量为30重量份、40重量份或50重量份，优选人血清白蛋白的配方量为20重量份、30重量份或40重量份，优选DMSO的配方量为8重量份、10重量份或12重量份。在一个实施方案中，冻存液中含有约50重量份的X-VIVO无血清培养基、约40重量份的人血清白蛋白和约10重量份的DMSO的冻存液。本发明人发现，含有约50重量份的X-VIVO无血清培养基、约40重量份的人血清白蛋白和约10重量份的DMSO的冻存液是特别优选的，比之于使该冻存液的任一成分含量变化10％以上的配方在提高冷冻效果、保护冷冻细胞等效果方面具有显著优势。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(e)所述的冻存液配置10-20ml，优选15ml，放置于0-7℃冰箱中备存，优选4℃。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(e)所述的重悬免疫细胞是将步骤(c)获得的细胞沉淀按照2×105-2×109/ml的密度用冻存液充分混匀，优选2×107/ml的密度。
根据本发明第一方面的方法，其中所述的冻存容器为冻存管，优选2ml的冻存管。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(e)所述的将免疫细胞加入冻存容器后，将冻存容器用封口膜封口，并标示免疫细胞的相关信息，优选标示免疫细胞来源的标签。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(e)所述的程序降温是将冻存容器放入程序降温装置(优选程序降温盒)中，放入0-7℃(优选4℃)冰箱中备用，转移至-100℃至-40℃(优选-80℃)的冰箱中储存20-36小时(优选24小时)，再将冻存容器从程序降温装置中取出。在一个实施方案中，冻存容器取出后，程序降温装置放入4℃冰箱以备下一次使用。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(e)所述冻存容器置于液氮罐中长期储存，同时记录样本储存的位置。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(g)所述水浴是将从液氮中取出的冻存容器迅速放入水浴装置(优选水浴锅)中实施的。在一个具体实施方式中，所述水浴装置的温度在体温附近，优选37℃。在一个具体实施方式中，所述冻存容器在水浴装置中反复震荡5-15次，优选8-10次，震荡时间控制在5min以内，优选控制在2min以内。在一个具体实施方式中，直至看到冻存容器中只剩下一团冰晶后从水浴装置中取出冻存容器。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(g)所述清洗冻存容器表面是用蘸有75％酒精的无尘布将冻存容器表面水滴擦拭。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(g)所述将免疫细胞转移至装有培养基的离心容器中、重悬和混匀的步骤是用1ml移液枪将冻存容器中复苏后的免疫细胞迅速吸出转移至装有2-10ml(优选5ml)X-VIVO无血清培养基的10-20ml(优选15ml)离心容器中重悬，并用枪头反复吹洗混匀2-8次(优选3-5次)。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(g)所述补加培养基是补加X-VIVO无血清培养基至5-15ml(优选10ml)。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(g)所述离心洗涤是设置水平离心机升速为9，降速为9，转速为1000-3000rpm，离心时间为5-20min，离心温度为15-30℃，优选转速为1500-2500rpm，优选转速为1800rpm，优选离心时间为10min，优选离心温度为20℃。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(h)所述的检测单个核细胞总数和单个核细胞活率及复苏率是向步骤(g)收集的细胞沉淀中加入10-30ml生理盐水，优选20ml，用10ml移液管反复吹吸细胞，充分混匀，吸取20μl细胞，加入180μl台盼蓝染液，充分混匀后加入计数板计算细胞总数、活率及复苏率，记录结果。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(i)所述细胞培养液为含有X-VIVO无血清培养基及10％的自体人血清。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(i)所述重悬培养是将细胞密度为4×104-4×108(优选4×106)的免疫细胞置于体温条件下(优选37℃)，在2-10％(优选5％)的二氧化碳培养箱中孵育1-4小时(2小时)。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(i)所述转移至离心容器为50ml离心管。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(i)所述贴壁细胞吹洗1-5遍，优选2-3遍。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(i)所述重悬未成熟树突状细胞(iDC)通过施加1-5ml的X-VIVO无血清培养基重悬，优选2-3ml。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(i)所述细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)细胞计数为吸取20μl细胞，加入180μl台盼兰染液，充分混匀后加入计数板计算细胞总数和活率。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(i)所述未成熟树突状细胞(iDC)细胞计数为单个核细胞总数减去细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)总数。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(i)所述未成熟树突状细胞(iDC)的培养为第1天，加入含有X-VIVO无血清培养基及10％自体人血清的细胞培养液、粒细胞集落刺激生物因子(GM-CSF)1000U/ml和白细胞介素4(IL-4)500U/ml；第4天，半量换液；第5天，加入抗原负载；第6天，加入人肿瘤坏死因子α(TNF-α)1000U/ml过夜；第7天，DC第一次收获，计数，测定CD80、CD86、CD83、CD11c、HLA-DR等细胞表面抗原的表达量；第9天，DC第二次收获，计数，测定CD80、CD86、CD83、CD11c、HLA-DR等细胞表面抗原的表达量；第11天，DC第三次收获，计数，测定CD80、CD86、CD83、CD11c、HLA-DR等细胞表面抗原的表达量；第13天，DC第四次收获，计数，测定CD80、CD86、CD83、CD11c、HLA-DR等细胞表面抗原的表达量。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(i)所述细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)的培养为第1天，加入含有X-VIVO无血清培养基及10％自体人血清的细胞培养液及细胞因子INF-γ1000U/ml；第2天，加入含有X-VIVO无血清培养基及10％自体人血清的细胞培养液及细胞因子CD3单抗375ng/ml、白细胞介素2(IL-2)1000U/ml、白细胞介素1α(IL-1α)500U/ml；第4天，半量换液；第6天，加入含有X-VIVO无血清培养基及10％自体人血清的细胞培养液、白细胞介素2(IL-2)1000U/ml、白细胞介素1α(IL-1α)500U/ml；第8天，补加一倍含有X-VIVO无血清培养基及10％自体人血清的细胞培养液、白细胞介素2(IL-2)1000U/ml、白细胞介素1α(IL-1α)500U/ml；第12天，CIK第一次收获，计数，测定CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+、CD3-CD19+、CD4/CD8等细胞表面抗原的表达量；第14天，CIK第二次收获，计数，测定CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+、CD3-CD19+、CD4/CD8等细胞表面抗原的表达量。
根据本发明第一方面的方法，该方法包括以下步骤：
(a)全血样本预处理：将采集的成人外周血血样，转移至AXP处理袋中，加入羟乙基淀粉溶液放置在摇床上充分混匀，其中血样与羟乙基淀粉溶液的混合体积比为2～6：1，例如3～5：1，例如4：1，该羟乙基淀粉溶液是将羟乙基淀粉添加到0.9％氯化钠溶液中配制得到的；
(b)自动分离：将AXP处理袋放入AXP全自动细胞分离设备后，进行自动分离；
(c)单个核细胞收集：由AXP全自动细胞分离设备自动分离得到的免疫细胞自动收集于AXP全自动细胞分离设备内所附的冻存袋中；
(d)单个核细胞计数：重悬所收集的单个核细胞，于细胞沉淀中加入20ml生理盐水，用10ml移液管反复吹吸细胞，充分混匀；细胞计数，吸取20μl细胞，加入180μl台盼蓝染液，充分混匀后加入计数板计算细胞总数与活率，记录结果。
进一步地，可以包括以下对提取的免疫细胞进行冻存的步骤：
(e)单个核细胞冻存：按照50％X-VIVO无血清培养基+40％人血白蛋白+10％DMSO的配方配制冻存液15ml，放置4℃冰箱中备用，将上述获得的细胞沉淀按照2×107/ml的密度用冻存液充分混匀重悬，将细胞转移至2ml冻存管中，用封口膜封口并贴上客户标签，将冻存管放入程序降温盒中，放入4℃冰箱储存一个小时，转移至-80℃冰箱储存过夜，次日，从程序降温盒中取出冻存管，转至液氮罐内进行储存，同时程序降温盒放入4℃冰箱以备下一次使用，冻存管在液氮罐中长期储存；
(f)记录步骤(e)的冻存样本储存的位置，建立免疫细胞的数据库。
进一步地，可以包括以下对冻存的免疫细胞进行复苏的步骤：
(g)细胞复苏：从液氮罐中取出单个核细胞冻存管，迅速放入预先准备的37℃的水浴锅中，反复振荡8-10次，时间控制在2min以内，直至看到冻存管中只剩下一团冰晶后从水浴锅中取出冻存管，用蘸有75％酒精的无尘布将冻存管表面水滴擦拭后，迅速转移至生物安全柜中，用1ml移液枪将冻存管中复苏后的免疫细胞迅速吸出转移至一装有5ml X-VIVO无血清培养基的15ml离心管中重悬，并用枪头反复吹洗混匀3-5次，补加X-VIVO无血清培养基至10ml，离心洗涤，水平离心机升速为9，降速为9，转速为1800rpm，离心时间为10min，离心温度为20℃；
(h)单个核细胞计数：重悬，于细胞沉淀中加入20ml生理盐水，用10ml移液管反复吹吸细胞，充分混匀；细胞计数，吸取20μl细胞，加入180μl台盼蓝染液，充分混匀后加入计数板计算细胞总数、活率及复苏率；
进一步地，可以包括以下对复苏的免疫细胞进行扩增的步骤：
(i)细胞扩增：用含有X-VIVO无血清培养基及10％的自体人血清的细胞培养液对复苏后的单个核细胞进行重悬培养，细胞密度为4×106个细胞，置于37℃温度条件下，5％的二氧化碳培养箱中孵育2小时，2小时后，取出细胞培养瓶，将细胞培养液吸出，转移至50ml离心管中，剩下瓶中的贴壁细胞用生理盐水反复吹洗2-3遍，直至贴壁细胞完全不被吹洗下来，此时的细胞为未成熟树突状细胞(iDC)，添加2-3ml的X-VIVO无血清培养基重悬未成熟树突状细胞(iDC)，将上述转移至50ml的离心管中的细胞培养液进行离心，获得的细胞沉淀为细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)，吸取20μl细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)，加入180μl台盼蓝染液，充分混匀后加入计数板计算细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)细胞总数和活率，单个核细胞总数减去细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)总数为未成熟树突状细胞(iDC)细胞计数，然后分别针对细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)和未成熟树突状细胞(iDC)进行细胞培养；
优选未成熟树突状细胞(iDC)的培养步骤如下：
第1天，加入含有X-VIVO无血清培养基及10％自体人血清的细胞培养液、粒细胞集落刺激生物因子(GM-CSF)1000U/ml和白细胞介素4(IL-4)500U/ml；
第4天，半量换液；第5天，加入抗原负载；
第6天，加入人肿瘤坏死因子α(TNF-α)1000U/ml过夜；
第7天，DC第一次收获，计数，测定CD80、CD86、CD83、CD11c、HLA-DR等细胞表面抗原的表达量；
第9天，DC第二次收获，计数，测定CD80、CD86、CD83、CD11c、HLA-DR等细胞表面抗原的表达量；
第11天，DC第三次收获，计数，测定CD80、CD86、CD83、CD11c、HLA-DR等细胞表面抗原的表达量；
第13天，DC第四次收获，计数，测定CD80、CD86、CD83、CD11c、HLA-DR等细胞表面抗原的表达量；
优选细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)的培养步骤如下：
第1天，加入含有X-VIVO无血清培养基及10％自体人血清的细胞培养液及细胞因子INF-γ1000U/ml；
第2天，加入含有X-VIVO无血清培养基及10％自体人血清的细胞培养液及细胞因子CD3单抗375ng/ml、白细胞介素2(IL-2)1000U/ml、白细胞介素1α(IL-1α)500U/ml；
第4天，半量换液；
第6天，加入含有X-VIVO无血清培养基及10％自体人血清的细胞培养液、白细胞介素2(IL-2)1000U/ml、白细胞介素1α(IL-1α)500U/ml；
第8天，补加一倍含有X-VIVO无血清培养基及10％自体人血清的细胞培养液、白细胞介素2(IL-2)1000U/ml、白细胞介素1α(IL-1α)500U/ml；
第12天，CIK第一次收获，计数，测定CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+、CD3-CD19+、CD4/CD8等细胞表面抗原的表达量；
第14天，CIK第二次收获，计数，测定CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+、CD3-CD19+、CD4/CD8等细胞表面抗原的表达量。
此外，在本发明的第一方面，提供了对血液免疫细胞的提取方法，以及相配套使用的冻存和复苏的方法，以及复苏后免疫细胞扩增的方法。因此，本发明第二方面提供了一种免疫细胞。
根据本发明第二方面的免疫细胞，其是根据本发明第一方面任一实施方案所述方法获得的。
根据本发明第二方面的免疫细胞，其细胞纯度大于90％，例如大于95％。在一个实施方案中，所述免疫细胞经3代以上传代后，细胞纯度大于90％，例如大于95％。
此外，在本发明的第二方面，提供了一种免疫细胞。因此，本发明第三方面提供了一种免疫细胞用于治疗疾病的用途，同时提供了一种免疫细胞制备用于治疗疾病的药物中的用途。
根据本发明第三方面的用途，其是根据本发明第一方面任一实施方案所述方法获得的。
根据本发明第三方面的用途，其疾病选自肿瘤、肉瘤、淋巴瘤、霍奇金病、黑色素瘤、间皮瘤、伯基特淋巴瘤、鼻咽癌、白血病和骨髓癌，优选肿瘤。
此外,在本发明的第二方面，提供了一种免疫细胞。因此，本发明第四方面提供了一种免疫细胞用于非治疗目的保健中的应用，同时提供了一种免疫细胞制备保健品中的用途。
根据本发明第四方面的用途，其非治疗目的保健是在出现免疫低下时提高免疫力。
在本发明中，如未特别另外地说明，％表示重量/重量的百分数。
下面对本发明作进一步的说明。本发明所引用的文献，以及该文献中所引用的文献，它们的全部内容通过引用并入本文。
在本发明中，本发明任一方面的任一技术方案中，其任一技术特征同样适用于本发明的任一方面的任一实施方案，只要它们不会引起矛盾，并且这种相互适用在必要时可以作适当的修改。
附图说明
图1为细胞冻存过程的流程图的示意图。
图2为细胞冻存步骤的流程图的示意图。
图3为细胞复苏扩增步骤的流程图。
图4为张三细胞培养测试图。
图5为李四细胞培养测试图。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细的描述。
实施例1、免疫细胞提取和冻存的方法
免疫细胞提取方法包括以下步骤：
(1)全血样本预处理：将采集的成人外周血血样，转移至AXP处理袋中，加入羟乙基淀粉溶液放置在摇床上充分混匀；其中血样与羟乙基淀粉溶液的混合体积比为4：1；羟乙基淀粉溶液的浓度为6％，其是将羟乙基淀粉添加到0.9％氯化钠溶液中配制得到的，并且该羟乙基淀粉中还添加0.75％麦芽糖；
(2)自动分离：将AXP处理袋放入AXP全自动细胞分离设备后，进行自动分离；该自动分离执行两次离心处理，第一次离心条件为：1430rcf、20min、15℃，第二次离心条件为：80rcf、10min、15℃；
(3)单个核细胞收集：由AXP全自动细胞分离设备自动分离得到的免疫细胞自动收集于AXP全自动细胞分离设备内所附的冻存袋中；
(4)单个核细胞计数：重悬，于细胞沉淀中加入20ml生理盐水，用10ml移液管反复吹吸细胞，充分混匀；细胞计数，吸取20μl细胞，加入180μl台盼蓝染液，充分混匀后加入计数板计算细胞总数与活率，记录结果。
步骤(3)所收集的单个核细胞计数值为N1；另同法对步骤(1)所处理的全部血样中单个核细胞计数，为N0；以下式计算单个核细胞收率：
收率＝(N1÷N0)×100％
结果表明，本发明上述步骤(1)-(3)中单个核细胞收率达97.7％。
另外，重复以上步骤(1)-(3)，不同的仅是羟乙基淀粉溶液中羟乙基淀粉的浓度分别为5％和7％，以执行两次提取操作；结果表明，两次操作的单个核细胞收率均在97～99％范围内。
另外，重复以上步骤(1)-(3)，不同的仅是血样与羟乙基淀粉溶液的混合体积比为3：1和5：1，以执行两次提取操作；结果表明，两次操作的单个核细胞收率均在97～99％范围内。
另外，重复以上步骤(1)-(3)，不同的仅是羟乙基淀粉溶液中麦芽糖的浓度分别为0.5％和1％，以执行两次提取操作；结果表明，两次操作的单个核细胞收率均在97～99％范围内。
另外，重复以上步骤(1)-(3)，不同的仅是羟乙基淀粉溶液中麦芽糖的浓度分别为0％(不添加麦芽糖)和0.2％，以执行两次提取操作；或者，参照以上步骤(1)-(3)，不同的仅是将其中的麦芽糖替换为等浓度的甘露醇或葡萄糖，以执行两次提取操作；或者，参照CN102876631B说明书[0117]至[0119]所述的方法处理同样的血样以进行一次提取操作；结果表明，五次操作的单个核细胞收率均在68～72％范围内。以上结果表明使用现有技术方法或者在羟乙基淀粉溶液中不添加麦芽糖或者改用其它同样是常规的糖类，结果完全令人遗憾的显示它们的收率显著地更低。
在上述步骤(1)-(4)的基础上，继续执行以下操作。
与提取方法配套使用的冻存方法包括以下步骤：
(5)单个核细胞冻存：按照50％X-VIVO无血清培养基+40％人血白蛋白+10％DMSO的配方配制冻存液15ml，放置4℃冰箱中备用，将上述获得的细胞沉淀按照1×107/ml的密度用冻存液充分混匀重悬，将细胞转移至2ml冻存管中，用封口膜封口并贴上客户标签，将冻存管放入程序降温盒中，放入4℃冰箱储存一个小时，转移至-80℃冰箱储存过夜，次日，从程序降温盒中取出冻存管，转至液氮罐内进行储存，同时程序降温盒放入4℃冰箱以备下一次使用，冻存管在液氮罐中长期储存；
(6)记录步骤(5)的冻存样本储存的位置，建立免疫细胞的数据库。
志愿者张三(化名)，年龄42岁，性别男，采血量150ml。步骤(4)计算得到单个核细胞收集总量3.20×108个细胞，折合成100ml血量计算为2.13×108个细胞。步骤(5)冻存管数为18管，其中至少有9管是按照1×107/ml的密度冻存。
实施例2、免疫细胞提取和冻存的方法
参考实施例1的方法进行。志愿者李四(化名)，年龄41岁，性别女，采血量115ml。步骤(4)计算得到单个核细胞收集总量1.40×108个细胞，折合成100ml血量计算为1.22×108个细胞。步骤(5)冻存管数为12管，其中至少有7管是按照1×107/ml的密度冻存。
实施例3、免疫细胞提取和冻存的方法
参考实施例1的方法进行。志愿者王五(化名)，年龄33岁，性别男，采血量120ml。步骤(4)计算得到单个核细胞收集总量1.69×108个细胞，折合成100ml血量计算为1.41×108个细胞。步骤(5)冻存管数为14管，其中至少有2管是按照5×106/ml的密度冻存，至少有3管是按照1×107/ml的密度冻存，其中至少有2管是按照2×107/ml的密度冻存。
实施例4、免疫细胞提取和冻存的方法
参考实施例1的方法进行。志愿者孙六(化名)，年龄63岁，性别女，采血量135ml。步骤(4)计算得到单个核细胞收集总量2.44×108个细胞，折合成100ml血量计算为1.81×108个细胞。步骤(5)冻存管数为16管。
根据实施例1-4可以得出以下结论：
1.年龄在30-60岁之间的健康人群，100ml的采血量都可以获取MNC在1×108个细胞以上，符合要求；
2.健康人群的MNC在性别选择上没有显著性差异。
实施例5、免疫细胞复苏的方法
冻存后免疫细胞复苏的方法包括以下步骤：
(7)细胞复苏：从液氮罐中取出单个核细胞冻存管，迅速放入预先准备的37℃的水浴锅中，反复振荡8-10次，时间控制在2min以内，直至看到冻存管中只剩下一团冰晶后从水浴锅中取出冻存管，用蘸有75％酒精的无尘布将冻存管表面水滴擦拭后，迅速转移至生物安全柜中，用1ml移液枪将冻存管中复苏后的免疫细胞迅速吸出转移至一装有5ml X-VIVO无血清培养基的15ml离心管中重悬，并用枪头反复吹洗混匀3-5次，补加X-VIVO无血清培养基至10ml，离心洗涤，水平离心机升速为9，降速为9，转速为1800rpm，离心时间为10min，离心温度为20℃；
(8)单个核细胞计数：重悬，于细胞沉淀中加入20ml生理盐水，用10ml移液管反复吹吸细胞，充分混匀；细胞计数，吸取20μl细胞，加入180μl台盼蓝染液，充分混匀后加入计数板计算细胞总数、活率及复苏率；
志愿者张三(化名)，冻存密度为1×107/ml的冻存免疫细胞复苏9管，细胞数量为1.6×108，复苏后细胞数量为7.4×107，复苏率为66％。
实施例6、免疫细胞复苏的方法
参考实施例5的方法进行。志愿者李四(化名)，冻存密度为1×107/ml的冻存免疫细胞复苏7管，细胞数量为7.9×107，复苏后细胞数量为5.5×107，复苏率为70％。
实施例7、免疫细胞复苏的方法
参考实施例5的方法进行。志愿者王五(化名)，冻存密度为5×106/ml的冻存免疫细胞复苏2管，细胞数量为1.52×107，复苏后细胞数量为9.52×106，复苏率为62％。
实施例8、免疫细胞复苏的方法
参考实施例5的方法进行。志愿者王五(化名)，冻存密度为1×107/ml的冻存免疫细胞复苏3管，细胞数量为4.57×107，复苏后细胞数量为3.42×107，复苏率为75％。
实施例9、免疫细胞复苏的方法
参考实施例5的方法进行。志愿者王五(化名)，冻存密度为2×107/ml的冻存免疫细胞复苏2管，细胞数量为6.1×107，复苏后细胞数量为5.16×107，复苏率为85％。
根据实施例5-9可以得出结论：以2×107冻存密度保存的免疫细胞复苏率是最高的。
实施例10、复苏后免疫细胞扩增的方法
复苏后免疫细胞扩增的方法包括以下步骤：
(9)细胞扩增：用含有X-VIVO无血清培养基及10％的自体人血清的细胞培养液对复苏后的单个核细胞进行重悬培养，细胞密度为4×106个细胞，置于37℃温度条件下，5％的二氧化碳培养箱中孵育2小时；
2小时后，取出细胞培养瓶，将细胞培养液吸出，转移至50ml离心管中，剩下瓶中的贴壁细胞用生理盐水反复吹洗2-3遍，直至贴壁细胞完全不被吹洗下来，此时的细胞为未成熟树突状细胞(iDC)，添加2-3ml的X-VIVO无血清培养基重悬未成熟树突状细胞(iDC)；
将上述转移至50ml的离心管中的细胞培养液进行离心，获得的细胞沉淀为细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)；
吸取20μl细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)，加入180μl台盼蓝染液，充分混匀后加入计数板计算细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)细胞总数和活率，单个核细胞总数减去细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)总数为未成熟树突状细胞(iDC)细胞计数；
未成熟树突状细胞(iDC)的培养为第1天，加入含有X-VIVO无血清培养基及10％自体人血清的细胞培养液、粒细胞集落刺激生物因子(GM-CSF)1000U/ml和白细胞介素4(IL-4)500U/ml；第4天，半量换液；第5天，加入抗原负载；第6天，加入人肿瘤坏死因子α(TNF-α)1000U/ml过夜；第7天，DC第一次收获，计数，测定CD80、CD86、CD83、CD11c、HLA-DR等细胞表面抗原的表达量；第9天，DC第二次收获，计数，测定CD80、CD86、CD83、CD11c、HLA-DR等细胞表面抗原的表达量；第11天，DC第三次收获，计数，测定CD80、CD86、CD83、CD11c、HLA-DR等细胞表面抗原的表达量；第13天，DC第四次收获，计数，测定CD80、CD86、CD83、CD11c、HLA-DR等细胞表面抗原的表达量；
细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)的培养为第1天，加入含有X-VIVO无血清培养基及10％自体人血清的细胞培养液及细胞因子INF-γ1000U/ml；第2天，加入含有X-VIVO无血清培养基及10％自体人血清的细胞培养液及细胞因子CD3单抗375ng/ml、白细胞介素2(IL-2)1000U/ml、白细胞介素1α(IL-1α)500U/ml；第4天，半量换液；第6天，加入含有X-VIVO无血清培养基及10％自体人血清的细胞培养液、白细胞介素2(IL-2)1000U/ml、白细胞介素1α(IL-1α)500U/ml；第8天，补加一倍含有X-VIVO无血清培养基及10％自体人血清的细胞培养液、白细胞介素2(IL-2)1000U/ml、白细胞介素1α(IL-1α)500U/ml；第12天，CIK第一次收获，计数，测定CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+、CD3-CD19+、CD4/CD8等细胞表面抗原的表达量；第14天，CIK第二次收获，计数，测定CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+、CD3-CD19+、CD4/CD8等细胞表面抗原的表达量。
扩增结果在100X显微镜下拍摄图片，见图4。
志愿者张三(化名)的免疫细胞扩增，在第8天细胞开始增殖，克隆球明显，视野中仍有少许血小板(见图4a)，故在此换液，吹散克隆球，继续培养；在第10天细胞克隆明显增大，细胞已经有活化现象，视野清亮，血小板较少(见图4b)，此后继续加液即可。
实施例11、复苏后免疫细胞扩增的方法
参考实施例10的方法进行。扩增结果在100×显微镜下拍摄图片，见图5。志愿者李四(化名)的免疫细胞扩增，在第8天细胞开始增殖，克隆球明显，视野中仍有少许血小板(见图5a)，故在此换液，吹散克隆球，继续培养；在第10天细胞克隆明显增大，细胞已经有活化现象，视野清亮，血小板较少(见图5b)，此后继续加液即可。
实施例12、复苏后免疫细胞的药效实验
生物分布：通过生物分布分析来评价体内靶向性能。通过在10至12周龄的Balb/c雌性裸鼠体内皮下注射107个MDA-MB-231人乳癌细胞来获得荷瘤小鼠(Charles RiverLabor atories)。当可明显触及肿瘤时将小鼠分组(n≥5)并在生物分布8天、24h或2h之前，将复苏扩增的免疫细胞进行放射性碘化并注射到所有小鼠的侧向尾静脉中。在注射后24小时处死小鼠(12.5μg，3.3μCi/小鼠)。对器官进行称重并用Packard Cobra伽玛计数器读出其放射性。代表性器官的放射性含量被表示为每克组织注射剂量的百分比(％ID/g)。
这些实验的结果表明，冻存、复苏和扩增不会削弱免疫细胞的肿瘤靶向作用。
治疗：过在10至12周龄的Balb/c雌性裸鼠体内皮下注射2×107个MDA-MB-231人乳癌细胞来获得荷瘤小鼠(Charles River Laboratories)。在肿瘤细胞植入9天后，当可明显触及肿瘤时将小鼠分组(n＝5)并在侧向尾静脉通过静脉注射盐水和复苏扩增后的免疫细胞。每天监测小鼠并且每周用测径器测量三次肿瘤生长，利用以下公式计算体积：体积＝长度×宽度2×0.5。当肿瘤达到体积＞2000mm3或当肿瘤坏死时，将动物处死。肿瘤的尺寸由平均值±SE表示。
在植入到裸鼠体内的MDA-MB231人乳癌模型中观察到复苏扩增后的免疫细胞具有抑制肿瘤的活性。
Claims (15)
1.从成人外周血中自动化提取免疫细胞的方法，该方法包括以下分离步骤：
(a)全血样本预处理：将采集的成人外周血血样，转移至AXP处理袋中，加入羟乙基淀粉溶液放置在摇床上充分混匀，其中血样与羟乙基淀粉溶液的混合体积比为3~5：1，所述羟乙基淀粉溶液中羟乙基淀粉的浓度为5-7%，所述羟乙基淀粉溶液是将羟乙基淀粉添加到0.9%氯化钠溶液中配制得到的；所述羟乙基淀粉溶液中还包含麦芽糖，麦芽糖的浓度为0.5~1%；
(b)自动分离：将AXP处理袋放入AXP全自动细胞分离设备后，进行自动分离；
(c)单个核细胞收集：由AXP全自动细胞分离设备自动分离得到的免疫细胞自动收集于AXP全自动细胞分离设备内所附的冻存袋中；
(d)针对步骤(c)所得免疫细胞，检测以下项目的至少一项：单个核细胞总数、单个核细胞活率、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型；
(e)单个核细胞冻存：向步骤(c)提取的免疫细胞中加入冻存液，重悬免疫细胞，将免疫细胞加入冻存容器，程序降温，然后再将冻存容器置于液氮罐中长期储存；所述的冻存液中含有50重量份的X-VIVO无血清培养基、40重量份的人血清白蛋白和10重量份的DMSO的冻存液；
(f)建立包含以上步骤信息的免疫细胞的数据库，并使该数据库与步骤(e)的冻存免疫细胞进行关联；
(g)细胞复苏：将步骤(e)冻存的冻存容器从液氮罐中取出，水浴，清洗冻存容器表面后转移至生物安全柜中，将免疫细胞转移至装有培养基的离心容器中，重悬，混匀，补加培养基，离心洗涤；
(h)针对步骤(g)所得复苏的免疫细胞，检测以下项目的至少一项：单个核细胞总数、单个核细胞活率及复苏率、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型；任选的
(i)对复苏的免疫细胞细胞扩增：用含有培养基和血清的细胞培养液对复苏后的单个核细胞进行重悬培养，吸出细胞培养液，转移至离心容器，反复吹洗贴壁细胞，直至贴壁细胞完全不被吹洗下来，获得未成熟树突状细胞即iDC细胞，添加培养基重悬未成熟树突状细胞，将离心容器中的细胞培养液进行离心处理，获得的细胞沉淀为细胞因子诱导的杀伤细胞即CIK细胞，针对iDC细胞和CIK细胞进行细胞计数，再分别针对iDC细胞及CIK细胞进行培养。
2.根据权利要求1的方法，其中血样与羟乙基淀粉溶液的混合体积比为4：1。
3.根据权利要求1的方法，步骤(b)中在AXP全自动细胞分离设备中进行自动分离时，执行两次离心处理，第一次离心条件为：1430rcf、20min、15℃，第二次离心条件为：80 rcf、10min、15℃。
4.根据权利要求1的方法，步骤(a)中，转移至AXP处理袋中的血液留取5ml血样于15ml离心容器中，用于血型检测。
5.根据权利要求1的方法，步骤(d)所述的检测单个核细胞总数和单个核细胞活率是向步骤(c)收集的细胞沉淀中加入10-30ml生理盐水，用10ml移液管反复吹吸细胞，充分混匀，吸取20μl细胞，加入180μl台盼蓝染液，充分混匀后加入计数板计算细胞总数与活率，记录结果。
6.根据权利要求1的方法，步骤(e)所述的冻存液配置10-20ml，放置于0-7℃冰箱中备存。
7.根据权利要求1的方法，步骤(e)所述的重悬免疫细胞是将步骤(c)获得的细胞沉淀按照2×105-2×109/ml的密度用冻存液充分混匀。
8.根据权利要求1的方法，步骤(e)所述的程序降温是将冻存容器放入程序降温装置中，放入0-7℃冰箱中备用，转移至-100℃至-40℃的冰箱中储存20-36小时，再将冻存容器从程序降温装置中取出。
9.根据权利要求1的方法，步骤(g)所述补加培养基是补加X-VIVO无血清培养基至5-15ml。
10.根据权利要求1的方法，步骤(g)所述离心洗涤是设置水平离心机升速为9，降速为9，转速为1000-3000rpm，离心时间为5-20min，离心温度为15-30℃。
11.根据权利要求1的方法，步骤(i)所述细胞培养液为含有X-VIVO无血清培养基及10%的自体人血清。
12.根据权利要求1的方法，步骤(i)所述重悬培养是将细胞密度为4×104-4×108的免疫细胞置于体温条件下，在2-10%的二氧化碳培养箱中孵育1-4小时。
13.根据权利要求1的方法，步骤(i)所述重悬未成熟树突状细胞通过施加1-5ml的X-VIVO无血清培养基重悬。
14.根据权利要求1的方法，步骤(i)所述细胞因子诱导的杀伤细胞细胞计数为吸取20μl细胞，加入180μl台盼兰染液，充分混匀后加入计数板计算细胞总数和活率。
15.根据权利要求1的方法，步骤(i)所述未成熟树突状细胞细胞计数为单个核细胞总数减去细胞因子诱导的杀伤细胞总数。
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