CN110055219A - 一种利用非动员外周血制备异质性造血干祖细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种利用非动员外周血制备异质性造血干祖细胞的方法，是利用胶囊状培养体系去捕获、扩增非动员的外周血中稀有造血干祖细胞，并制备异质性的造血干祖细胞克隆。本发明通过捕获非动员外周血中的稀有的异质性干细胞，并从形态学上验证了非动员外周血中存在异质性造血干祖细胞。本发明方法具有造血重建、药物开发、移植和免疫治疗、基因编辑的细胞种类等特点。本发明方法为获得病人特异的功能性造血干细胞提供可靠的细胞来源，并积极促进非动员造血干祖细胞在临床上的应用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术，涉及细胞生物学、不动员外周血、异质性造血干祖细胞以及细胞捕获、培养、扩增、功能维持等生物技术。尤其涉及一种利用非动员外周血制备异质性造血干祖细胞的方法。
更具体的，本发明提供了具有捕获、扩增不动员外周血中稀有异质性造血干祖细胞的技术体系和具有造血重建、药物开发、移植和免疫治疗、基因编辑的细胞种类的一种技术方法。
背景技术
癌症已经成为威胁人类健康的第一号杀手。2015年，全世界每年新发癌症病例达2100多万例，中国占全球新发病例约20％，为429.2万例，死亡281.4万例，相当于平均每天12000人新患癌症，7500人死于癌症。在美国，2016年，就有1685210新癌症发病例确诊，其中595690万人死于该类疾病。2017年3月中国最新癌症数据表明，全国每天约1万人确诊癌症；每分钟约7人确诊患癌；到85岁，一个人患癌风险36％；此外，预计至2025年中国癌症患者数量逐年递增至1900万人，到2030年，亚洲将预计增加大约40％的癌症病例，2035年将达到2400万人，其死亡率将增加大约50％。癌症防治已成为我国和世界的重要公共卫生问题。
放化疗和手术是目前癌症治疗的主要方法。手术治疗主要针对没有转移的实体瘤。对于手术不能切除干净的肿瘤患者和中晚期患者，放、化疗是挽救和延长患者生命最有效的治疗方法之一。无论是化疗、手术或放疗，癌症的治疗都是对身体有极大负担，并且在发生恶性转移后，无论是何种方式都是很难彻底治愈。所以在癌症的治疗仍然是人类面对的极大考验。
在大剂量放化疗后，病人的免疫细胞等血液系统受到严重损伤，造血干细胞移植成为支持大剂量放化疗的肿瘤治疗的重要手段之一。目前，其应用范围日益广泛，包括多种恶性肿瘤、血液系统恶性肿瘤等，恶性肿瘤有乳腺癌、卵巢癌、睾丸癌、神经母细胞瘤、小细胞肺癌等，恶性血液疾病的治疗包括慢性粒细胞白血病、急性髓系白血病、急性淋系白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征等，非恶性血液系统肿瘤主要为骨髓纤维化、再生障碍性贫血、无巨核细胞性血小板减少症、地中海贫血、范可尼贫血、镰状细胞贫血、重型阵发性睡眠性血红蛋白尿症等。其它非血液系统疾病主要为重症联合免疫缺陷、严重自身免疫性疾病等重症难治自身免疫性疾病。造血干细胞移植逐渐成为包括肿瘤在内的多种疾病治疗的重要手段。
造血干细胞移植研究始于1939年，但第一次移植试验并未获成功。经过近四十年的广泛讨论、动物实验和重新评估，人类对骨髓移植逐渐有了更加深入的认识，并在1975年，始第一次大规模异基因造血干细胞移植。从此，造血干细胞移植开始在人类抗癌历史上扮演重要角色。目前，造血干祖细胞移植的细胞来源主要是、动员后外周血造血干祖细胞(来源于骨髓)和脐血造血干祖细胞。脐血来源的造血干祖细胞数量少，重建造血系统延迟，不适合成人临床造血干祖细胞移植数量的需求。现在临床用的细胞，主要来源于动员后的外周血，其中含有来源于骨髓的造血干祖细胞。在这种情况下，捐献者需要连续服用动员药物粒细胞集落刺激因子G-CSF、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF等一周左右，将骨髓中的造血干祖细胞动员到外周血中，然后利用细胞采集器采集造血干祖细胞行细胞移植。但是用于移植的造血干祖细胞需要与病人配型成功，而且病人需要长期服用免疫抑制剂，以降低移植物抗宿主病(GVHD)的反应。鉴于造血干细胞配型成功率很低，造血干细胞来源的严重短缺制约了该项技术在临床应用的广泛性和有效应；长期服用免疫抑制剂，也给病人带来复发、感染、二次肿瘤等危险。另外，临床需要使用的血源如红细胞、血小板等高度紧张，包括稀有血型的储存和使用等，血源污染和血制品传播疾病等都是全球面临的难题，探索新的造血干祖细胞、病人特异性造血干祖细胞的来源是一个亟待解决的问题。
二十世纪五十年代，研究人员将外周血中淋巴样白细胞输入辐射动物体内，经过一段时间，辐射动物的粒细胞系统具有一定程度的恢复，辐射动物的生命得到一定程度的保护和延长。1957年，Congdons C.C.等研究人员发现，将外周血淋巴样白细胞移植给致死剂量辐射的动物，动物存活率与移植细胞的数量紧密相关。1968年Lewis等研究人员将外周血淋巴样白细胞移植小鼠，一段时间后可以在移植小鼠的脾脏中发现结节，进一步实验证明，这些结节中的细胞来自于移植的淋巴样外周血，证明了这群淋巴样细胞具有骨髓来源的造血干祖细胞的多向分化潜能。
上述研究历史，主要是基于动物体内同类动物外周血中淋巴样细胞移植，并检测移植动物脾脏结节形成的数目，以检测外周血中造血干祖细胞存在的可能性，在20世纪60-70年代研究相对较多。但一方面由于外周血中的造血干祖细胞数量的极其稀少(称之为循环造血干祖细胞)，至今并没有有效的捕获、维持和扩增体系，所以这群细胞在正常的人体外周血中是否存在还存在较大的争议，循环造血干祖细胞的生物学特征更是一片空白。现在很少有相关研究报道。目前主要是针对疾病状态下循环内皮细胞对疾病进展期的作用和功能的探讨，主要技术手段也只是流式细胞术和克隆形成实验进行检测，但是没有有效的捕获、扩增和培养体系来进一步探索循环造血干祖细胞的生物学特征，特别是自我更新和分化能力的检测。
由于造血干祖细胞在肿瘤治疗、造血免疫重建、基因治疗、延缓衰老等方面具有重要作用，探索捕获、扩增和培养功能性循环造血干祖细胞及其功能维持将有巨大的经济和社会效益。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种利用非动员外周血制备异质性造血干祖细胞的方法，是利用胶囊状培养体系捕获非动员外周血中稀有的造血干祖细胞，在此基础上制备异质性造血干祖细胞克隆，并扩增造血干祖细胞，维持造血干祖细胞的生物学功能。上述方法是通过以下技术方案实现的：
1.起始细胞的来源和准备。
起始培养的细胞来源使用非动员药物处理的正常外周血。血液的量不限，可以是少于1ml，也可以多于1ml，具体的血液用量可以根据需要进行采集。将获得的血液制品，用淋巴细胞分离液或者利用红细胞裂解液去除红细胞，获得的单个核细胞用不含钙离子和镁离子的磷酸盐缓冲液进行洗涤2-3次，作为起始培养细胞来进行造血干祖细胞的制备、培养和捕获。
2.异质性造血干祖细胞克隆的捕获和制备。
将上述获得的单个核细胞用适当软硬程度的细胞培养材料包括水凝胶但不限定于水凝胶进行包裹并种植，称之为胶囊状培养体系。10％蔗糖溶液洗涤一次，20％蔗糖重悬，按照一定细胞密度与材料混合，种植在相应的孔板中。用含有干细胞生长因子SCF(20-150ng/ml)，FMS样酪氨酸激酶3配体抗体(20-150ng/ml)，血小板生成素TPO(20-100ng/ml)，白介素6IL6(10-50ng/ml)，白介素3IL3(10-50ng/ml)，血管生长因子VEGF(2-10ng/ml)，维生素C(Vc，10-20ug/ml)、嘌呤霉素衍生物StemRegenin1(SR1)等适合造血干祖细胞生长的培养系统进行培养。每2-3天更换培养液。经过5天左右时间的培养，血液中大部分分化的终末血液细胞逐渐死亡，胶囊状细胞培养体系中开始出现不同形态的克隆。随着培养时间的延长，克隆逐渐增大。这些克隆包括致密型克隆，血管状克隆，铺路石状克隆，自由分散型克隆等。对比同等条件下非胶囊状细胞培养，既没有使用包括水凝胶等材料包裹目的细胞，其它培养条件一样的体系中，没有产生上述描述的各种细胞克隆。
3.单细胞测序技术检测造血干祖细胞克隆的异质性。
根据形态特征，挑选不同克隆中的单个细胞，进行单细胞测序。提取单细胞RNA，用带有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA，以打断后的mRNA为模板合成cDNA。试剂盒纯化回收，PCR扩增建库；构建好的文库测序，检测单细胞测序转录表达情况。根据基因测序获得的reads数，分析基因表达、基因结构优化、可变剪接、新转录本预测及注释、SNP检测等，并从基因表达结果中，筛选出样品间差异表达的基因，基于差异表达基因，进行GO功能显著性富集分析和pathway显著性富集分析。对单细胞进行主成份的细胞聚类分析，以检测上述各种克隆的异质性。
4.异质性造血干祖细胞克隆的表面分子表达。
胶囊状培养体系中各种克隆长至一定大小，大约每个克隆包含30-80个细胞，将体系打散，混合，用乙二胺四乙酸消化液进行消化，过70um网筛，离心，收获细胞，获得的细胞利用流式细胞仪技术检测造血干祖细胞表面分子表达的情况，包括CD34、CD43、CD45、CD90等。
5.体外分化潜能检测。
对胶囊状培养体系中出现的几种细胞类型克隆，包括致密型克隆，血管状克隆，铺路石状克隆，自由分散型克隆等，根据克隆形状进行挑选，每种克隆挑选200-300个细胞，于含有生长因子的甲基纤维素半固体培养基进行克隆形成实验，检测不同克隆的多向分化潜能，包括瀑式红系集落，一般小的红系集落，粒系细胞集落，粒系-巨噬细胞集落，红系-粒系-巨噬混合细胞集落等。
6.不同克隆的生长潜能检测。
对胶囊状培养体系中出现的几种细胞类型克隆，包括致密型克隆，血管状克隆，铺路石状克隆，自由分散型克隆等，根据克隆形状进行挑选，将不同的克隆单独挑出，于含有造血干祖细胞生长因子的培养基中进行生长潜能研究验，检测不同克隆的自我更新潜能。
7.胶囊状培养体系中造血干细胞转录因子表达的检测。
胶囊状细胞培养体系整体细胞群体在分子水平的生物学特征研究。利用RNA测序的方式检测胶囊状培养体系中的细胞在转录组水平的变化，特别是造血干细胞相关的转录因子、信号通路和与微环境相关因子，转录因子包括CD34，Runx1，GATA2，c-MYC，HoxA9，HoxB4，GATA1，Tie2等，信号通路主要有造血干细胞干性维持、代谢、分化通路基因，微环境相关因子主要为归巢、细胞粘附等相关因子等。
8.整个胶囊状细胞培养体系整体细胞群体体内造血分化潜能的检测。各种造血集落打散后形成的细胞群体,进行移植实验，骨髓腔移植目的细胞，检测细胞体内长期自我更新和多向分化潜能。定期检测小鼠体内人源化细胞的植入情况。以同等条件下非胶囊状细胞培养的细胞作为对照。
本发明方法的特点是利用胶囊状培养体系去捕获、扩增非动员的外周血中稀有造血干祖细胞，并制备异质性的造血干祖细胞克隆。该体系首次捕获非动员外周血中的稀有的异质性干细胞，并首次从形态学上验证了非动员外周血中存在异质性造血干祖细胞。该方法为获得病人特异的功能性造血干细胞提供可靠的细胞来源，并积极促进非动员造血干祖细胞在临床上的应用。
附图说明(所有图都要结合到下面实施例中，也即在实施例中要提到)
图1利用不动员外周血获取造血干祖细胞的技术流程。抽取捐赠者非动员外周血。获得单个核细胞，用胶囊状培养体系进行上述单个核细胞的处理和培养，定期检测不同形态克隆的产生和生长情况。
图2非动员外周血出现不同形态克隆，形态学发生显著变化。
图3流式细胞术检测胶囊状培养非动员外周血细胞中造血干祖细胞的标记表达变化情况。
图4非动员外周血胶囊状培养产生的细胞和动员后分离的造血干细胞在克隆形成能力的比较。
图5非动员外周血通过胶囊状和非胶囊状培养后细胞生长情况比较分析。
图6非动员外周血通过胶囊状和非胶囊状培养后细胞体内长期自我更新和多向分化潜能检测示意图。
图7非动员外周血通过胶囊状和非胶囊状培养后细胞体内获得T细胞检测。
图8非动员外周血通过胶囊状和非胶囊状培养后细胞体内获得髓系细胞检测。
图9非动员外周血通过胶囊状和非胶囊状培养后细胞体内获得B细胞检测。
图10非动员外周血通过胶囊状和非胶囊状培养后细胞体内获得人Th1细胞检测。
图11非动员外周血通过胶囊状和非胶囊状培养后细胞体内获得人Th2细胞检测。
图12非动员外周血通过胶囊状培养后外周血中含人细胞的检测流式图。
图13非动员外周血通过胶囊状培养后骨髓中含人细胞的检测流式图。
图14非动员外周血通过胶囊状培养后肝脏中含人细胞的检测流式图。
图15非动员外周血通过胶囊状培养后脾脏中含人细胞的检测流式图。
图16非动员外周血通过胶囊状培养后长期自我更新和分化能力的检测。二次移植外周血中人的细胞检测。
图17非动员外周血通过胶囊状培养后长期自我更新和分化能力的检测。二次移植骨髓中人的细胞检测。
图18非动员外周血通过胶囊状培养后长期自我更新和分化能力的检测。二次移植肝脏中人的细胞检测。
图19非动员外周血通过胶囊状培养后长期自我更新和分化能力的检测。二次移植脾脏中人的细胞检测。
图20非动员外周血经过胶囊状培养、非胶囊状培养后，与非动员外周血以及动员后造血干细胞中造血关键转录因子表达检测。
图21利用单细胞荧光定量PCR技术检测关键转录因子、信号通路等在胶囊状培养、非胶囊状培养非动员外周血、非动员外周血以及动员后造血干细胞中表达情况比较分析。
图22利用透射电镜观察细胞内细胞器超微结构。动员后的造血干细胞作为阳性对照。胶囊状培养和非胶囊状培养的核质比均有增加。在胶囊状培养和非胶囊状培养的培养过程中观察到大量的内质网、活跃的线粒体数和嵴折叠。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例一利用不动员外周血制备异质性造血干祖细胞克隆简述如下：
1.本发明提供了利用胶囊状培养体系，捕获不动员外周血中稀有干细胞，并制备异质性造血干祖细胞克隆的方法，在获得异质性造血干祖细胞克隆的基础上，利用少量不动员外周血即可以获得大量造血干祖细胞，并可以继续用于下游分子和细胞生物学功能检测。具体方案如图1所示。
2.利用不动员外周血获得单个核细胞。
招募志愿者，根据实验需要，可以无菌抽取少于1ml，也可以多于1ml的血制品，用无菌抗凝管进行收集。
2.1利用红细胞裂解液裂解红细胞。
利用红细胞裂解液裂解红细胞，每1ml不动员外周血加入2-4ml裂解液，冰上裂解5-8分钟，观察血制品颜色的变化，由原来的深红色变成淡淡的红色，血制品由原来的不透明逐渐变成透明状，既可加入适量不含钙离子和镁离子的磷酸盐缓冲液进行中和，1500转，5分钟，离心，获得单个核细胞，不含钙离子和镁离子的磷酸盐缓冲液洗涤2-3次，获得的单个核细胞进行下一步实验。
2.2利用淋巴细胞分离液进行血制品单个核细胞的分离。
淋巴细胞分离液与不动员外周血按照1:2的比例加入离心管，2500转每分钟，25分钟，4度，吸取中间的白膜层，不含钙离子和镁离子的磷酸盐缓冲液洗涤2-3次，获得的单个核细胞进行下一步实验。
3.异质性造血干祖细胞克隆制备
用软硬程度适中的水凝胶包被不动员外周血中获得的单个核细胞，细胞包被在材料中，形似胶囊，称之为胶囊状培养体系，用含有20-200ng/ml SCF、20-200ng/ml FLT3L、10-20ng/ml IL-3、10-20ng/ml IL-6、10-100ng/ml TPO、2-10ng/ml VEGF、5-30ug/ml维生素C的无血清造血干细胞扩增培养基SFEM(STEMCELL TECHNOLOGY)进行培养，每2天更换培养基。显微镜下观察细胞和克隆生长状态。记录克隆生长形态及其变化。形态学变化由图2所示。
4.流式细胞术检测胶囊状培养体系中造血干祖细胞相关表面标记表达情况。
待克隆长至一定大小，将克隆细胞打散，用缓冲液进行洗涤，流式细胞术检测胶囊状培养体系中细胞表达造血干祖细胞标记的情况。
具体如下：
待胶囊状培养体系中克隆长至50-80um左右，用枪头轻轻吹打整个体系，分解胶囊状体系，离心，收集细胞，0.25％胰酶/乙二胺四乙酸消化10分钟，用含有胎牛血清的培养基终止消化，轻轻吹打，过70um细胞过滤器，1000转/分，5分钟，收集细胞。用不含钙离子镁离子的磷酸盐缓冲液洗涤2-3次，收集细胞。调整细胞密度，106-107细胞每毫升，加入相应的流式抗体，包括CD34、CD45、CD43、CD90、CD309、CD117、CD19、CD15、CD3等，室温避光孵育30分钟，磷酸盐缓冲液洗涤2-3次，500微升磷酸盐酸缓冲液(加入1％FBS和1mM乙二胺四乙酸)重悬细胞，BD FACScalibur instrument(Becton Dickinson)检测胶囊状培养体系中多种造血细胞表面抗原表达情况。同型Ig作为对照。FlowJo Version 7.2.5的软件对数据进行分析。流式检测统计分析结果如图3所示。
5.胶囊状培养体系中各种克隆的体外克隆形成潜能检测。
根据克隆形态，每种克隆挑选200-300细胞于含有造血生长因子20ng/mL SCF,20ng/mL IL-3,20ng/mL IL-6,20ng/mL G-CSF，20ng/mL GM-CSF,20ng/mL TPO,3U/mL EPO的甲基纤维素半固体培养基中培养，2周左右，检测各种造血克隆的形成情况。根据造血集落形成的结构、细胞大小、颜色和折光率等形态学特征等，判断和计数各种造血细胞集落的形成情况。结果参见图6。图6是不动员外周血中获得的铺路石状克隆在含有造血生长因子的甲基纤维素半固体培养基中，培养2周左右，产生的瀑式红系、巨核系、粒系/巨噬系、红系/粒系/巨噬系/巨核系造血集落。不同培养体系中细胞的克隆形成能力检测如图4所示。
6.胶囊状培养体系中各种克隆的生长潜能分析。
根据克隆形态，挑选不同的克隆，计数，每种克隆挑取5000个细胞于含有20-200ng/ml SCF、20-200ng/ml FLT3L、10-20ng/ml IL-3、10-20ng/ml IL-6、10-100ng/mlTPO、2-10ng/ml VEGF、5-30ug/ml维生素C的无血清造血干细胞扩增培养基SFEM(STEMCELLTECHNOLOGY)进行传代培养，每2天更换培养基，培养7-14天，细胞计数，计算细胞的扩增情况。不同培养体系中细胞的生长情况的检测如图5所示。
7.胶囊状培养体系和非胶囊状培养体系中获得的细胞体内自我更新和多向分化潜能检测。
非动员外周血单个核细胞经过胶囊状培养体系和非胶囊状培养体系培养2周左右,移植免疫缺陷小鼠,体内检测细胞的自我更新和多向分化潜能，定期检测小鼠体内人细胞的嵌合情况,包括外周血、骨髓、脾脏和肝脏等脏器，细胞类型包括人的T细胞，B细胞，髓系细胞，T细胞包括Th1和Th2类型。胶囊状和非胶囊状培养的非动员外周血细胞体内自我更新和多向分化能力的检测结果如图6-图15所示。
8.胶囊状培养体系和非胶囊状培养体系中获得的细胞体内长期自我更新和多向分化潜能检测。
移植成功的小鼠中存在人的细胞嵌合体，说明移植的细胞具有自我更新和多向分化潜能。移植4个月后，取其骨髓细胞，进行第二次移植，以检测细胞的长期自我更新和多向分化潜能。1个月，2个月，3个月和4个月检测人的细胞含量，具体内容包括外周血、骨髓、脾脏和肝脏等脏器，细胞类型包括人的T细胞，B细胞，髓系细胞。结果如图16-图19所示。
9.转录组测序检测胶囊状培养体系细胞在分子水平的调控机制
具体步骤为：提取样品总RNA并使用DNase I消化DNA后，用带有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA,加入打断试剂,在Thermomixer中,适温将mRNA打断成短片段，以打断后的mRNA为模板合成一链cDNA，然后配制二链合成反应体系合成二链cDNA，并使用试剂盒纯化回收、粘性末端修复、cDNA的3’末端加上碱基“A”并连接接头，然后进行片段大小选择，最后进行PCR扩增；构建好的文库用Agilent 2100Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real-Time PCR System质检合格后，使用Illumina HiSeqTM 2000测序仪进行测序。
对Illumina HiSeqTM 2000测序所得的数据进行信息分析，对原始数据raw reads进行质控(QC)，确定测序数据是否适用于后续分析。经过滤得到的clean reads比对到参考序列。比对完，通过统计比对率、reads在参考序列上的分布情况等，判断比对结果是否通过第二次质控(QC of alignment)。若通过，则进行基因和转录本定量分析、基于基因表达水平的各项分析(主成分、相关性、条件特异表达、差异基因筛选等等)、外显子定量、基因结构优化、可变剪接、新转录本预测及注释、SNP检测、Indel分析、基因融合等一系列后续分析，并对筛选出的样品间差异表达基因，进行关键转录因子挖掘分析。结果如图20所示。
10.高通量荧光定量PCR检测胶囊状和非胶囊状培养的非动员外周血细胞中造血关键转录调控因子的表达情况。引物序列见分型序列表。结果如图21所示。
11.扫描和透射电镜检测细胞的形态和内部结构特征
采用透射电镜(TEM)分析细胞超微结构。样品经2.5％戊二醛溶液固定超过4小时。不含钙离子镁离子的磷酸盐缓冲液洗涤后，1％锇酸处理1h，蒸馏水洗涤2-3次。固定在2％醋酸铀后,在一系列浓度为50％,70％,90％,100％的乙醇进行细胞脱水，每次10-15分钟,最后在100％丙酮中浸泡2次，每次10-15分钟。渗透后,截留、聚合和铀酰醋酸铅柠檬酸液染色后,在低温下用透射电镜TEM(Tecnai Spirit)进行细胞内部结构的观察。结果如图22所示。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种利用非动员外周血制备异质性造血干祖细胞的方法
<160> 86
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 11
cgttctgctc ctactgcttc g 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 12
cccacgcgga ctattaagtc t 21
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 13
atctcccgaa tcgaacagat gt 22
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 14
tgcttggcaa taacagacca ac 22
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 15
aggagaagtc tgccgttact g 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 16
ccgagcactt tcttgccatg a 21
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 17
ggctcctggc aaaaggtca 19
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 18
ctgcgtagtt gtgctgatgt 20
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 19
acgccaccaa cagtcagag 19
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 20
agtcgggaat agtcagcagg a 21
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 21
gctgcgaagt ggaaaccatc 20
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 22
cctccttctg cacacatttg aa 22
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 23
atttttccct cgacacccga t 21
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 24
tcccaggcgt agaccaaga 19
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 25
atcaacctct ctcatcggga a 21
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 26
cagtctgcta ttctcccaat gg 22
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 27
tcacgcacca attctaacgc 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 28
cacggcttgc ttactgaagg 20
<210> 29
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 29
ctgggctaca ctgagcacc 19
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 30
aagtggtcgt tgagggcaat g 21
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 31
ttgtcagtaa acgggcaggt a 21
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 32
cttgcggttt cgagtctgaa t 21
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 33
cagcaaggct cgttcctgtt 20
<210> 34
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 34
ggcttgatga gtggtcggt 19
<210> 35
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 35
ccgcgctcat ttctcgtca 19
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 36
acggagggaa tagtctggtc c 21
<210> 37
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 37
aacgctatac agatcctagc tcg 23
<210> 38
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 38
gtgccgtttg gtcacatgg 19
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 39
tgctggttct aatcggggac a 21
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 40
ccaggggaag aaaggttccg 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 41
acgtgcgagg gcgttaatac 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 42
ggggtaggtc atggcattga 20
<210> 43
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 43
cgtcgccttg gactggaag 19
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 44
tacgtggact cgttcctgct 20
<210> 45
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 45
cgtgagcacg gtaaacccc 19
<210> 46
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 46
cgagcggatc ttggtgttg 19
<210> 47
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 47
gtgatcggaa atgacactgg ag 22
<210> 48
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 48
catgttggtc actaacagaa gca 23
<210> 49
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 49
gcctgctcga ccctacaga 19
<210> 50
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 50
gcttgtcaac tgcggttgc 19
<210> 51
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 51
aagcggattc gtgcctatga g 21
<210> 52
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 52
agttgatgag gaggtatctg tca 23
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 53
aacatgagcg agttggtcaa g 21
<210> 54
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 54
gctcgtagat gtccgcgat 19
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 55
ggcgtcagag tgggaaatcc 20
<210> 56
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 56
ggcaggcagt tcacatctac c 21
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 57
tcaggcgtct gtagaggctt 20
<210> 58
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 58
atgcacatcc ttcgataaga ctg 23
<210> 59
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 59
tgtccgtcag aacccatgc 19
<210> 60
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 60
aaagtcgaag ttccatcgct c 21
<210> 61
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 61
tagccttgtc agataaggaa gga 23
<210> 62
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 62
acagcttcac agtcaacttt gt 22
<210> 63
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 63
acccagtggc attccagac 19
<210> 64
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 64
ggcttggggt tgtgaaagaa g 21
<210> 65
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 65
tcgaatcgct accctgctg 19
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 66
caagcctcat ggtgccatct 20
<210> 67
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 67
agaacacccc gatgacgga 19
<210> 68
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 68
ggcatcatta tgtacccgga at 22
<210> 69
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 69
ttagccagct tagttctctg tgg 23
<210> 70
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 70
agcatcagat acaagaggta ggg 23
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 71
agctacccga tctggtggtc 20
<210> 72
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 72
caaactcgat gtcctcgcta c 21
<210> 73
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 73
acttgtcgct cttgaagcta c 21
<210> 74
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 74
gatgcggaga atctttggaa ca 22
<210> 75
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 75
ctgcccatcg ctttcaaggt 20
<210> 76
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 76
gccgagtagt tttcatcatt gcc 23
<210> 77
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 77
cacgcagaac atagataccc tg 22
<210> 78
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 78
cagtgtgatg tgtagaaggt gc 22
<210> 79
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 79
cccacggagt ctggaccat 19
<210> 80
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 80
ctctgccagt ttgtccctg 19
<210> 81
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 81
ccaaagttgt gcggcgtatc 20
<210> 82
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 82
caggcggagg atctcattct t 21
<210> 83
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 83
gctctaccct gatggacgat a 21
<210> 84
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 84
tccacgccgt caatcttgat g 21
<210> 85
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 85
ggcccaataa tcagagtggc a 21
<210> 86
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列 (Unknow)
<400> 86
ccagtgtcat ttccgatcac ttt 23
Claims (5)
1.一种利用非动员外周血制备异质性造血干祖细胞的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
(1)起始细胞的来源和准备
起始培养的细胞来源使用非动员药物处理的正常外周血，将获得的血液制品，用淋巴细胞分离液或者利用红细胞裂解液去除红细胞，获得的单个核细胞用不含钙离子和镁离子的磷酸盐缓冲液进行洗涤2-3次，备用；
(2)异质性造血干祖细胞克隆的捕获和制备
将上述获得的单个核细胞用细胞培养材料水凝胶进行包裹并种植，称之为胶囊状培养体系，用10％蔗糖溶液洗涤一次，20％蔗糖重悬，种植在孔板中，用培养液进行培养，每2-3天更换培养液，出现不同形态的克隆；
(3)单细胞测序技术检测造血干祖细胞克隆的异质性
根据形态特征，挑选克隆中的单个细胞，进行单细胞测序，提取单细胞RNA，用带有Oligo的磁珠富集真核生物mRNA，以打断后的mRNA为模板合成cDNA，试剂盒纯化回收，PCR扩增建库，构建好的文库测序，检测单细胞测序转录表达情况，根据基因测序获得的reads数，分析基因表达、基因结构优化、可变剪接、新转录本预测及注释、SNP检测，并从基因表达结果中，筛选出样品间差异表达的基因；
(4)异质性造血干祖细胞克隆的表面分子表达
胶囊状培养体系中各种克隆长至每个克隆包含30-80个细胞，将体系打散，混合，用乙二胺四乙酸消化液进行消化，过70um网筛，离心，收获细胞，获得的细胞利用流式细胞仪技术检测造血干祖细胞表面分子表达的情况，包括CD34、CD43、CD45、CD90；
(5)体外分化潜能检测
对胶囊状培养体系中出现的几种不同形态克隆，根据克隆形状进行挑选，每种克隆挑选200-300个细胞，于含有生长因子的甲基纤维素半固体培养基进行克隆形成实验，检测不同克隆的多向分化潜能，包括瀑式红系集落，一般小的红系集落，粒系细胞集落，粒系-巨噬细胞集落，红系-粒系-巨噬混合细胞集落；
(6)不同克隆的生长潜能检测
对胶囊状培养体系中出现的几种细胞类型克隆，包括致密型克隆，血管状克隆，铺路石状克隆，自由分散型克隆，根据克隆形状进行挑选，将不同的克隆单独挑出，于含有造血干祖细胞生长因子的培养基中进行生长潜能研究验，检测不同克隆的自我更新潜能；
(7)胶囊状培养体系中造血干细胞转录因子表达的检测
胶囊状细胞培养体系整体细胞群体在分子水平的生物学特征研究，利用RNA测序的方式检测胶囊状培养体系中的细胞在转录组水平的变化，特别是造血干细胞相关的转录因子、信号通路和与微环境相关因子；
(8)整个胶囊状细胞培养体系整体细胞群体体内造血分化潜能的检测，各种造血集落打散后形成的细胞群体，进行移植实验，检测细胞体内长期自我更新和多向分化潜能，定期检测小鼠体内人源化细胞的植入情况，以同等条件下非胶囊状细胞培养的细胞作为对照。
2.根据权利要求1所述的一种利用非动员外周血制备异质性造血干祖细胞的方法，其特征在于，步骤(2)培养液由20-150ng/ml干细胞生长因子SCF、20-150ng/ml FMS样酪氨酸激酶3配体抗体、20-100ng/ml血小板生成素TPO、10-50ng/ml白介素6IL6、10-50ng/ml白介素3IL3、2-10ng/ml血管生长因子VEGF、10-20ug/ml维生素C、嘌呤霉素衍生物StemRegenin1组成。
3.根据权利要求1所述的一种利用非动员外周血制备异质性造血干祖细胞的方法，其特征在于，步骤(2)中经培养，出现不同形态的克隆包括致密型克隆，血管状克隆，铺路石状克隆，自由分散型克隆。
4.根据权利要求1所述的一种利用非动员外周血制备异质性造血干祖细胞的方法，其特征在于，步骤(3)中，基于差异表达基因，进行GO功能显著性富集分析和pathway显著性富集分析，对单细胞进行主成份的细胞聚类分析，以检测上述各种克隆的异质性。
5.根据权利要求1所述的一种利用非动员外周血制备异质性造血干祖细胞的方法，其特征在于，步骤(7)中转录因子包括CD34，Runx1，GATA2，c-MYC，HoxA9，HoxB4，GATA1，Tie2；信号通路主要有造血干细胞干性维持、代谢、分化通路基因；微环境相关因子主要为归巢、细胞粘附相关因子。
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