CN102329769A

CN102329769A - 一种获得造血干细胞的方法

Info

Publication number: CN102329769A
Application number: CN201110300957A
Authority: CN
Inventors: 黄河; 徐玉林; 刘丽珍
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2011-09-28
Filing date: 2011-09-28
Publication date: 2012-01-25
Anticipated expiration: 2031-09-28
Also published as: CN102329769B

Abstract

本发明提供一种获得造血干细胞的方法，是利用成分确定的中胚层诱导因子联合造血细胞因子或血管内皮生长因子等诱导来源于人骨髓单个核细胞重编程的诱导性多能干细胞分化为具有造血细胞和内皮细胞功能的造血干细胞，建立了高效获得造血干细胞的方法。本发明方法为获得高效、成分确定、具有造血细胞和内皮细胞功能的造血干细胞提供技术保障，为获得临床可用的造血干细胞提供了理论基础和技术平台，并积极促进诱导性多能干细胞及其诱导的造血干细胞在药物筛选、疾病机理研究、临床应用、生物组织工程等领域的研究与开发。

Description

一种获得造血干细胞的方法

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种高效获得造血干细胞的方法。

背景技术

造血干细胞是发现最早，研究最为深入的一种成体干细胞，存在于造血组织中，具有自我更新能力，是所有造血细胞和免疫细胞的起源。造血干细胞已用于治疗多种疾病：血液系统恶性肿瘤，如慢性粒细胞白血病慢性期、急性髓细胞白血病等；血液系统非恶性肿瘤，如再生障碍性贫血、地中海贫血等；其它实体瘤，如神经母细胞瘤、小细胞肺癌等；免疫系统疾病，如重症联合免疫缺陷症、严重自身免疫性疾病等。造血干细胞移植成为应用最为广泛的一种组织干细胞，是近半个世纪临床医学中具有巨大创新的新技术，也是再生医学的成功典范。目前全球已经有超过10万人接受了各种类型的造血干细胞移植术。

造血干细胞移植需要高质量的、主要组织相容性复合体或者白细胞抗原配型相合的造血干细胞。在自体造血干细胞移植中，由于移植的细胞中往往残留少数的肿瘤干细胞，容易导致肿瘤的复发。异基因造血干细胞移植是目前主要的细胞移植手段，但由于供受者间免疫遗传学和遗传多态性差异，即使主要组织相容性复合体完全相合，异基因造血干细胞移植后，由于免疫排斥，往往导致急性移植物抗宿主、血管内皮损伤相关综合症、植入失败等一系列致命的移植并发症，异基因移植中移植相关死亡率高达40%，严重制约了造血干细胞移植的广泛开展。另外，虽然已经建立了脐血库，但适合做移植的细胞远远不能满足病人的需要，而且骨髓或脐血细胞中含有的造血干细胞数量非常少，满足不了成人对造血干细胞移植细胞数量的要求。大部分病人因为没有合适的可移植细胞来源，错过了最佳治疗期，面对死亡，只能等待。另外，那些特殊血型的人对移植细胞又有特殊的要求。造血干细胞来源匮乏的问题日益突出。

利用胚胎干细胞诱导分化获得造血干细胞，是解决造血干细胞移植中细胞来源匮乏的一个重要方法。胚胎干细胞是一类高度未分化细胞，在适当条件下可以分化出成体动物组织和器官的所有细胞，在疾病治疗、再生医学、疾病机理和治疗研究等诸多领域极具应用价值。但人胚胎干细胞的研究一直面临着伦理法律以及免疫排斥等壁垒。诱导性多能干细胞是由体细胞重编程而来，具有类胚胎干细胞的生物学特征，是干细胞研究史上的重大突破。来源于患者“个体特异的”诱导性多能干细胞，与个体具有相同的免疫遗传学信息，消除了潜在的移植免疫排异反应，为个性化治疗带来希望。诱导性多能干细胞替代胚胎干细胞在医学领域、组织工程、药物发现与评价等方面显示出广阔的应用前景。

获得适合临床治疗的造血干细胞是诱导性多能干细胞应用的主要方向之一。

自从第一株人类胚胎干细胞建立以来，人们对胚胎干细胞向造血干细胞的分化已经做了大量相关研究。目前人们将胚胎干细胞分化为造血干细胞常用方法有：拟胚体法、基质细胞共培养法。利用拟胚体法实现胚胎干细胞分化为造血细胞的体系，模拟了体内胚胎造血细胞的发育过程。小鼠胚胎干细胞在无分化抑制剂LIF的作用下，悬浮培养可以聚集形成拟胚体，4天后，拟胚体形成含有红细胞和巨噬细胞组成的血岛。在条件适合的甲基纤维素半固体培养基中，胚胎干细胞可以分化成各种具有功能的造血细胞，包括红系，粒单系，巨噬系，巨核系以及淋巴细胞。但效率非常低，只有1%左右。另外，由于必须添加动物血清，从而存在未知的、成分不明确的外源物质的污染。研究表明，造血细胞的维持、发生、迁移离不开造血微环境的调控，人们根据微环境的特点，分离骨髓基质细胞和胎肝细胞作为饲养层，利用饲养层分泌细胞因子来刺激胚胎干细胞向造血细胞分化。目前被广泛应用的基质细胞主要有小鼠基质细胞系OP9、C166、S17、MS5等，来源于小鼠胎肝的AFT024及小鼠胚胎AGM 区的AGM-S3等。虽然OP9等饲养层细胞能有效辅助胚胎干细胞体外分化为造血干细胞，效率可达20%左右，但因为存在鼠源物质，获得的造血干细胞离临床应用还有相当大的差距。研究表明造血生长因子集落刺激因子和血管内皮细胞生长因子可以诱导胚胎干细胞向造血细胞分化，获得红系、粒系-巨噬系、红系-粒系-巨噬-巨核系混合集落。Kennedy 等将小鼠胚胎干细胞自发分化成拟胚体接种于含干细胞刺激因子、促红细胞生成素和血管内皮细胞生长因子的甲基纤维素培养基中培养，可获得爆发式形成细胞。骨形态建成蛋白4 可以促进胚胎干细胞向中胚层的分化，有效提高ESC分化为造血细胞的效率。2003年，Chadwick等采用人生长因子包括干细胞生长因子、FMS样酪氨酸激酶3配体、白介素-3、粒细胞集落刺激因子以及骨形态建成蛋白4作用于拟胚体，诱导人胚胎干细胞分化为造血干细胞。Tian 等报道在拟胚体形成过程中加入细胞因子骨形态建成蛋白4、血管内皮生长因子、干细胞生长因子, 人促血小板生成素、FMS样酪氨酸激酶3配体提高胚胎干细胞向造血细胞分化效率。其它研究也表明造血因子能够提高拟胚体向造血细胞的分化效率。

基于对胚胎干细胞向造血细胞分化的认识，自从诱导性多能干细胞问世以来，人们对诱导性多能干细胞相关研究相继展开。2009年，Choi等采用OP9细胞作为基质细胞，将人iPS细胞诱导分化为CD34+造血干细胞，经磁珠筛选的CD34+细胞在含有造血生长因子的半固体培养基中培养，可形成特征性的造血集落。Hanna等将镰状细胞贫血小鼠的成纤维细胞诱导重编程，获得小鼠诱导性多能干细胞，而后通过同源重组技术，纠正β珠蛋白的等位基因突变。经过修正的诱导性多能干细胞定向分化至造血干细胞，再移植回小鼠体内。12周后，小鼠恢复正常造血，贫血症状改善。上述研究成果为诱导性多能干细胞临床应用于血液系统疾病提供了有力的实验依据，但是因为使用了OP9等鼠源细胞做滋养层，存在鼠源等不明物质。其它诱导诱导性多能干细胞向造血干细胞分化的方法中，也存在效率较低或不能向造血细胞分化等等缺点。建立一种高效的、成分确定的、具有向造血细胞和内皮细胞分化潜能的造血干细胞的方法，不仅可以扩大造血干细胞的来源，为获得病人特异的、临床上可移植的造血细胞提供技术平台，为解决目前细胞移植中细胞来源短缺，移植后发生免疫排斥反应等提供新思路，新方法和新技术，而且为研究造血和相关疾病机理，药物筛选，疾病治疗等提供理想的细胞模型。

发明内容

本发明的目的是提供一种获得造血干细胞的方法，通过以下技术方案实现：

1. 细胞制备

取骨髓，密度梯度离心结合贴壁筛选法，获得单个核细胞，选择生长状态良好的单个核细胞，用于诱导性多能干细胞（诱导性多能干细胞）的制备。

获取胎鼠成纤维细胞（购自上海斯丹赛生物技术有限公司），选择生长状态良好的胎鼠成纤维细胞，丝裂霉素C处理，作为诱导诱导性多能干细胞的饲养层。

2. 诱导性多能干细胞制备

利用含有四种转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的病毒（质粒购自addgene，网址 http://www.addgene.org）转染单个核细胞，经过一段时间的培养，挑选形态上较为类似胚胎干细胞的克隆，进行扩大培养，传至10代左右，进行诱导性多能干细胞生物学特征鉴定。对于符合诱导性多能干细胞生物学特征的克隆，继续向造血干细胞进行分化；

病毒包装：按照脂质体2000转染试剂盒（购自Invitrogen）说明书进行，孵育24-72小时。收集病毒和病毒滴度测定。选择生长良好的单个核细胞，将含有四种转录因子的病毒按照1：5比例加入培养系统中，进行病毒转染。病毒转染24小时后，将病毒转染过的目的细胞转到处理好的胎鼠成纤维细胞中，第二天将培养基更换为胚胎干细胞培养基。培养基每天进行更换。经过3周左右时间的培养，出现各种克隆。挑选形态上类似胚胎干细胞的克隆进行扩大培养并进行诱导性多能干细胞生物学特征检测。对于符合诱导性多能干细胞生物学特征的克隆，被确定为诱导性多能干细胞，继续向造血干细胞进行分化。

3. 将来源于骨髓单个核细胞的诱导性多能干细胞高效分化为造血干细胞

该技术方案中用到的各种诱导因子简称如下：骨形态建成蛋白4（BMP-4，购自R&D Systems）、促分裂原活化蛋白激酶激酶（MAPKK）抑制剂 PD98059 （购自R&D Systems）、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，购自Invitrogen)，干细胞生长因子（SCF，购自R&D Systems），FMS样酪氨酸激酶3配体（Flt3L，购自R&D Systems）、血管内皮生长因子（VEGF，购自StemCell）、白介素-3（IL-3，购自StemCell）、白介素-6（IL-6，购自StemCell）、血小板生成素（TPO，购自StemCell）、促红素（EPO，购自StemCell）、粒细胞集落刺激因子（G-CSF，购自StemCell）、粒—巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，购自StemCell)、血管内皮生长因子A （VEGF-A，购自StemCell）。

根据上述诱导因子功能的不同，分成四组，分阶段高效诱导诱导性多能干细胞为造血干细胞，并将获得的造血干细胞向造血细胞和内皮细胞方向分化。

第一组诱导因子包括中胚层诱导因子BMP-4、PD98059和部分早期造血因子SCF、Flt3L、 VEGF，第二组细胞因子为造血因子和促进造血干细胞增值的细胞因子SCF、Flt3L、 VEGF、IL-3、IL-6，第三组细胞因子为刺激造血干细胞在半固体培养基中形成不同细胞集落和不同造血细胞的因子包括SCF、VEGF、IL-3、IL-6 、TPO、 EPO 、G-CSF、GM-CSF等，第四组为刺激造血干细胞向内皮细胞分化的VEGF-A等。

将诱导性多能干细胞撤去滋养层以及bFGF，用第一组诱导因子BMP-4、PD98059、SCF、Flt3L、 VEGF进行诱导处理，利用没有使用诱导因子处理的来源于人成纤维细胞的诱导性多能干细胞的自然分化为对照组。RT-PCR和ImageJ方法检测中胚层转录因子Brachyury、GATA-2的表达情况，细胞免疫化学检测Oct4、GATA-2的表达情况，以确定第一组诱导因子对诱导性多能干细胞形成的拟胚体中中胚层细胞比例的影响。

将第一组诱导因子处理后收集的拟胚体分散成单细胞悬液，种植在低粘附的培养皿中（购自Corning Costar），培养基为含有SCF、Flt3L、VEGF、bFGF、IL-3、IL-6、L-谷氨酰胺、b-巯基乙醇、非必须氨基酸（NEAA，购自Invitrogen）的造血干细胞培养基StemPro-34（购自stemcell），利用没有使用诱导因子处理的来源于人成纤维细胞的诱导性多能干细胞的自然分化为对照组。处理7-9天，流式细胞仪检测CD34阳性细胞的表达比例，RT-PCR检测造血转录因子TAL-1和 GATA-2的表达情况，以确定诱导因子对诱导性多能干细胞形成造血干细胞比例的影响。

4. 甲基纤维素半固体培养法检测造血干细胞生成造血集落（CFU）的潜能

将获得的造血干细胞分散成单个细胞,种植于含有SCF、VEGF、IL-3、IL-6 、TPO、 EPO 、G-CSF、GM-CS等因子的甲基纤维素半固体培养基伊思柯夫改良培养液(Iscove's Modified Dubecco's Medium，IMDM，购自StemCell）中，培养皿需低粘附（购自Corning Costar），继续培养2周左右。观察各种造血集落（colony-forming unit，CFU）的形成情况，包括红系集落,粒系集落,巨核系集落,红系/粒系/巨核系/巨噬系集落等。

5. Wright-Giemsa 染色分析各造血细胞形成

将获得的各种造血集落进行细胞涂片，Wright-Giemsa染色鉴定造血细胞形态，确定各种造血细胞的形成情况，如造血祖细胞，红系祖细胞，粒系祖细胞，巨噬系祖细胞等。

6. 造血干细胞分化形成内皮细胞的潜能

将获得的造血干细胞种植在内皮细胞生长培养基2中(EGM-2)（购自BD）。免疫荧光细胞化学检测细胞能否表达内皮细胞特有的标记蛋白CD31 和 VE-CADHERIN。

同时，将获得的造血干细胞种植在人工基底膜胶Matrigel （购自BD）处理的培养皿中，用含有血管内皮生长因子A （VEGF-A）的 EGM-2中，观察血管样结构的形成。

本发明方法的特点是利用成分确定的中胚层诱导因子联合造血细胞因子或血管内皮生长因子等诱导来源于人骨髓单个核细胞重编程的诱导性多能干细胞分化为具有造血细胞和内皮细胞功能的造血干细胞，建立了高效获得造血干细胞的方法。该方法为获得高效、成分确定、具有造血细胞和内皮细胞功能的造血干细胞提供技术保障，为获得临床可用的造血干细胞提供了理论基础和技术平台，并积极促进诱导性多能干细胞及其诱导的造血干细胞在药物筛选、疾病机理研究、临床应用、生物组织工程等领域的研究与开发。

附图说明

图1是人骨髓单个核细胞重编程为诱导性多能干细胞。获得的诱导性多能干细胞具有胚胎干细胞典型的生物学特征，如：表达胚胎干细胞特有蛋白，表达胚胎干细胞特异性基因和具有体外、体内分化潜能等。图中，hMNSCs表示人骨髓单个核细胞；ESCs表示胚胎干细胞；hMNSC-iPSCs表示来源于人骨髓单个核细胞重编程获得的诱导性多能干细胞。

图2是利用中胚层诱导因子、造血相关因子等将来源于人骨髓单个核细胞的诱导性多能干细胞高效分化成造血干细胞的方案，同时以没有用细胞因子处理的诱导性多能干细胞的自然分化为对照组。

图3是 RT-PCR和荧光强度分析细胞因子处理的诱导性多能干细胞形成的拟胚体中含有较高比例的中胚层细胞。A: RT-PCR检测细胞因子处理组获得的拟胚体中，中胚层转录因子Brachyury和造血转录因子GATA-2的表达情况。结果显示BMP4, PD98059，Flt3L等诱导因子处理的细胞中，中胚层细胞所占比例明显高于同期的对照组。B：Image J 检测BMP4, PD98059，Flt3L等诱导因子处理的细胞和对照组的细胞中Brachyury和GATA-2的荧光强度，得到与A相同的结果。

图4是免疫荧光细胞化学检测细胞因子处理的诱导性多能干细胞形成的拟胚体中，转录因子GATA2表达相对较高，而多潜能基因Oct4的表达相对一致。

图5是流式细胞仪检测诱导性多能干细胞向造血干细胞分化时，造血干细胞表面抗原CD34表达情况。A: 同型对照。B ：实验组中表达CD34+细胞的比例可达20%。C：对照组中，CD34+细胞比例约为2%。D：流式细胞仪检测分选CD34+细胞的纯度。

图6是细胞因子诱导诱导性多能干细胞分化形成的造血干细胞在含有造血生长因子的甲基纤维素半固体培养基中，形成造血集落的种类和数量。

图7是细胞因子诱导诱导性多能干细胞分化形成的造血干细胞在含有造血生长因子的甲基纤维素半固体培养基中，培养3周左右，产生各种造血集落。A: 瀑式红系集落。B:红系集落。C:粒系集落。 D: 粒系/红系/巨噬系/巨核系集落。E: 红系/巨噬系集落。F: 粒系/巨噬系集落。标尺: 100μm。

图8是将红系集落中的细胞制备细胞涂片，瑞士-吉姆萨染液染色，得到原始红细胞，标尺: 50μm。

图9是将粒系集落中的细胞制备细胞涂片，瑞士-吉姆萨染液染色，得到原始粒细胞，标尺: 50μm。

图10是将粒系/红系/巨噬系/巨核系集落中的细胞制备细胞涂片，瑞士-吉姆萨染液染色，得到各种造血细胞，包括原始红细胞、原始粒细胞、原始巨噬细胞、原始巨核细胞，标尺: 50μm。

图11是细胞因子诱导诱导性多能干细胞向造血细胞分化的整个过程中造血转录因子TAL-1、GATA-2和多能基因Oct4的动态变化情况，其中A：RT-PCR检测诱导性多能干细胞向造血细胞分化的不同阶段,多能基因Oct4和造血转录因子TAL-1、GATA2的表达情况，Oct4表达随诱导时间逐渐降低，而造血细胞转录因子基因TAL-1 和 GATA-2逐渐升高，后来逐渐下降，B：Image J 检测细胞因子处理组和对照组中Brachyury和GATA-2的荧光强度，得到与A相同的结果。

图12流式细胞仪检测诱导性多能干细胞向造血细胞分化第14天时，多能基因Oct4和Sox2的表达情况。

图13是细胞因子诱导诱导性多能干细胞向造血细胞分化过程中CD34、CD45的时序表达情况。

图14是造血干细胞向内皮细胞分化潜能的检测。细胞表达CD31、VE-CAHEREN内皮细胞特有的标记基因，并在VEGF-A和matrigel的作用下形成血管样组织结构。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。

实施例1 诱导性多能干细胞制备

诱导性多能干细胞按常规方法制备。简述如下：

(1) 细胞制备

①滋养层胎鼠成纤维细胞制备(购自上海斯丹赛生物技术有限公司)：按常规方法进行复苏、培养、传代和丝裂霉素C处理。

②骨髓单个核细胞的制备：取骨髓4ml，用淋巴分离液密度梯度离心，获得单个核细胞。细胞培养液为改良Eagle培养基(Dulbecco's modification of Eagle's medium Dulbecco，DMEM，购自Invitrogen) ，含10%胎牛血清（fetal bovine serum， FBS，购自GIBCO)，100 U/ml 青霉素（ampicillin，购自GIBCO），100 U/ml 链霉素（streptomycin，购自GIBCO)。选择生长状态良好的第二至第四代单个核细胞，用于病毒转染。

③293T包装细胞制备（购自中科院上海细胞库）：按常规方法进行复苏、培养和传代。

2.诱导性多能干细胞制备：含有四种转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的质粒按照脂质体2000转染试剂盒所述方法进行293T细胞转染。收集病毒，进行病毒滴度测定。将获得的病毒按照1个细胞对应5个病毒的比例，转染骨髓单个核细胞。病毒转染一周后，将细胞转移至胎鼠成纤维细胞处理的培养皿中，培养基换成胚胎干细胞的培养基，包括DMEM/F12, 20% 血清替代物（KnockOut Serum Replacement，KSR，购自Invitrogen）, 2mM L－谷氨酰胺的衍生物GlutaMAX （购自Invitrogen）, 0.1mM β－巯基乙醇（β-mercaptoethanol，购自Invitrogen）, 1%非必需氨基酸(nonessential amino acids, NEAA，购自Invitrogen), 50 U/mL penicillin, 50 mg/mLstreptomycin和4ng/mL bFGF（购自Invitrogen），37°C, 5% CO2的培养箱中培养。转染3周左右，产生胚胎干细胞样克隆，参见图1A；对这些克隆进行常规的诱导性多能干细胞生物学特征鉴定。碱性磷酸酶AP活性检测，发现部分胚胎干细胞样克隆表达较强的AP，参见图1B；免疫荧光检测胚胎干细胞相关蛋白的表达，结果参见图1C：ESC样克隆表达Oct4核蛋白；图1D：ESC样克隆表达Nanog核蛋白；图1E：ESC样克隆表达SSEA3膜蛋白；图1F：ESC样克隆表达Tra-1-81膜蛋白。DAPI荧光染色显示相应细胞核的位置，以确定上述各蛋白在细胞中的表达位置。图1中标尺：100μm。

RT-PCR 检测胚胎干细胞多能相关基因表达, 引物参见表1。

RNA抽提按照TRIZOL试剂盒说明书（购自Invitrogen）进行，反转录RNA获得cDNA按照Superscript III First Strand Synthesis SuperMix试剂盒（购自Invitrogen）说明书进行。

RT-PCR检测Oct4，Sox2等基因的表达情况，GAPDH为阳性对照。

PCR反应体系:

Taq DNA polymerase 0.5U

dNTP 0.2mM X4

MgCl2 1.5mM

primer 0.2μM

RT product 2 μl

双蒸水H₂O加到20μl体系。

PCR反应程序: 94oC 4min；

51o C (Nanog, Rex-1), 35个循环；53o C (GAPDH), 35个循环； 55o C (Oct4), 35个循环； 68o C(Sox2), 30个循环；35 s, 72℃ 1min；

72℃ 10 min。

人骨髓单个核细胞（hMNSCs）和胚胎干细胞（H1）的cDNA分别作阴性和阳性对照。结果参见图1G：ESC样克隆表达胚胎干细胞特异性基因，表达水平与胚胎干细胞（H1）没有显著差异，而人骨髓单个核细胞中不表达多能相关基因。分化潜能研究按照常规方法进行。结果参见图1H-L，说明制备的克隆具有多向分化潜能（图1是骨髓单个核细胞（hMNSCs）重编程为诱导性多能干细胞。获得的诱导性多能干细胞具有胚胎干细胞典型的生物学特征，如：表达胚胎干细胞特有蛋白，表达胚胎干细胞特异性基因和具有体外、体内分化潜能等）。图中的hMNSCs为人骨髓单个核细胞，ESCs为胚胎干细胞，hMNSC-iPSCs为来源于人骨髓单个核细胞重编程获得的诱导性多能干细胞。

实施例2 建立高效获得造血干细胞的方法

为高效获得造血干细胞，我们筛选出中胚层诱导因子BMP4，PD98059和造血相关因子SCF, Flt3L等，根据这些因子的功能不同，分成四组，具体方案参见图2：利用中胚层诱导因子、造血相关因子等将来源于人骨髓单个核细胞的诱导性多能干细胞分化成造血干细胞的方案，同时以没有用细胞因子处理的来源于人骨髓单个核细胞的诱导性多能干细胞的自然分化为对照组。

（1）拟胚体制备

①来源于人骨髓单个核细胞的诱导性多能干细胞扩增培养后，按正常传代步骤消化下来，自然沉淀，将细胞吹打至小团块（比正常传代大小再小一些），撤去饲养层和bFGF，种植在低粘附的培养皿中，悬浮培养，培养基为KnockOut DMEM （购自Invitrogen）, 2mM GlutaMAX,1% NEAA, 0.1mM β-mercaptoethanol, 50 U/mL penicillin, 50 mg/mL streptomycin, 20 ng/mL BMP4 , 50μM PD98059，300 ng/mL SCF, 300 ng/mL Flt3L和 100 ng/mL VEGF ，用于拟胚体制备。

②设立没有细胞因子处理的自然分化的诱导性多能干细胞作对照组。

③经过5天的培养，形成拟胚体，主要为小的细胞团块。

（2）收集部分拟胚体，检测中胚层转录因子Brachyury 和造血转录因子GATA-2的表达情况。

①Primer Premier 5.0设计中胚层转录因子Brachyury 和造血转录因子GATA-2及阳性对照GAPDH的引物，见表2。

②TRIzol试剂盒抽提细胞因子处理组和没有细胞因子处理组诱导0天和诱导5天的细胞RNA，具体操作程序按照产品说明书进行。

③利用Superscript III First Strand Synthesis SuperMix试剂盒将RNA反转录成cDNA，具体操作程序按照产品说明书进行。

表2：人骨髓单个核细胞来源的诱导性多能干细胞向拟胚体分化时中胚层转录因子Brachyury 和造血转录因子GATA-2引物的设计

Figure 2011103009574100002DEST_PATH_IMAGE002

④RT-PCR检测Brachyury，GATA-2基因在拟胚体中的表达情况，GAPDH为内参。

PCR反应体系:

Taq DNA polymerase 0.5U

dNTP 0.2mM X4

MgCl₂ 1.5mM

each primer 0.2μM

RT product 2 μl

双蒸水H₂O加到20μl体系。

PCR反应程序: 94oC 4min；

94℃ 15s，53o C（GAPDH, Brachyury）, 58o C （GATA-2）35 s, 72℃ 1min，35循环；

72℃ 10 min。

⑤ImageJ软件用于分析Brachyury 和 GATA-2荧光强度，以确定细胞因子处理对诱导性多能干细胞向造血干细胞分化时中胚层形成的影响。

结果参见图3所示：RT-PCR检测结果表明细胞因子处理的诱导性多能干细胞中含有较高比例的中胚层和造血转录因子Brachyury 和GATA-2，如图3A所示；Image J分析Brachyury 和GATA-2的相对表达量，检测结果与RT-PCR检测结果一致，参见图3B （图3是RT-PCR和荧光强度分析细胞因子处理的诱导性多能干细胞形成的拟胚体中含有较高比例的中胚层细胞。A: RT-PCR检测细胞因子处理组获得的拟胚体中，中胚层转录因子Brachyury和造血转录因子GATA-2的表达情况。结果显示BMP4, PD98059，Flt3L等因子处理的细胞中，中胚层细胞所占比例明显高于同期的对照组。B：Image J 检测BMP4, PD98059，Flt3L等因子处理的细胞和对照组的细胞中Brachyury和GATA-2的荧光强度，得到与A相同的结果）。

（3）免疫荧光细胞化学检测拟胚体中GATA-2和Oct4的表达情况，免疫荧光细胞化学按照常规方法进行。结果参见图4。图4中A表明细胞因子诱导诱导性多能干细胞形成的拟胚体法s中含有相对较高比例的GATA-2，而对照组中GATA-2的比例相对较低。而Oct4的表达在细胞因子诱导组和对照组中没有显著差异，图4B（图4是免疫荧光细胞化学检测细胞因子处理的诱导性多能干细胞形成的拟胚体中，相对于对照组来说，转录因子GATA2表达较高，而多潜能基因Oct4的表达相对一致）。

（4）将拟胚体分散成单细胞悬液，种植在低粘附的培养皿中，培养基为含有100 ng/mL SCF, 100 ng/mL Flt3L, 50 ng/mL VEGF, 5 ng/mL bFGF, 20 ng/mL IL-3，20 ng/mL IL-6，2 mM L-glutamine, 0.1 mM β-mercaptoethanol, 1% NEAA的StemPro-34，继续培养7-9天，以诱导造血干细胞的生成。

（5）流式细胞仪检测造血干细胞CD34的表达情况。具体方法如下：

①收集第二组相关因子处理7-9天的细胞，制备单细胞悬液，密度为10⁶-10⁷细胞/ml。

②用不含Ca2+ 和 Mg2+的PBS（加入1% FBS，以防细胞粘连）洗涤2-3次，1000rpm，5分钟，过85μm 的尼龙网筛以去除存在的细胞团块。

③取80μl PBS重悬细胞，加入20μl CD34-PE（购自BD），室温避光孵育30min,同型IgG1-PE作为对照；用不含Ca2+ 和 Mg2+的PBS（加入1% FBS）洗涤3次，500μl PBS（加入1% FBS）重悬细胞，BD FACScalibur instrument (Becton Dickinson)检测细胞中造血干细胞表面抗原表达情况。

④获得的数据用FlowJo Version 7.2.5的软件进行分析，分析三批相关样本。

⑤富集造血干细胞

用磁性细胞分选法（magnet-activated cell sorting，MACS，购自Milteneyi Biotech) 富集造血干细胞，具体步骤按照说明书进行。结果参见图5：利用中胚层诱导因子联合造血相关因子能有效促进来源于人骨髓单个核细胞的诱导性多能干细胞分化为造血干细胞（图5是流式细胞仪检测诱导性多能干细胞向造血干细胞分化时，造血干细胞表面抗原CD34表达情况。A: 同型对照。B ：实验组中表达CD34+细胞的比例可达20%。C：对照组中，CD34+细胞比例不到2%。D：流式细胞仪检测分选出的C造血干细胞的纯度）。

实施例3 获得的造血干细胞具有向造血细胞分化的潜能

（1）甲基纤维素半固体培养法检测诱导性多能干细胞分化的造血干细胞生成造血集落（CFU）的潜能

①上述方法获得的造血干细胞用 0.25%胰酶/乙二胺四乙酸（trypsin/ EDTA，购自Invitrogen）分散成单个细胞, 过 20-gauge的注射器, 按照 5000 个细胞 /ml 种植于含有9% 甲基纤维素，0.1mM 2-mercaptoethanol, 2mM GlutaMAX, 50 ng/mL SCF, 50 ng/mL VEGF, 3 U/mL TPO, 3 U/mL EPO, 20 ng/mL IL-3, 20 ng/mL IL-6, 20 ng/mL G-CSF ，20 ng/mL GM-CSF 的IMDM低粘附的培养皿中，继续培养 12-14天，以促进各造血集落的形成。

②观察集落形成情况。在诱导性多能干细胞开始向造血细胞分化后24-26天，有明显的集落形成。根据集落的形状，细胞体积大小，可见的细胞密度程度，判断、检测和比较各个造血细胞集落形成情况，并计数。结果参见图6和图7。图6是细胞因子诱导诱导性多能干细胞分化形成的造血干细胞在含有造血生长因子的甲基纤维素半固体培养基中，形成造血集落的种类和数量。图7是细胞因子诱导诱导性多能干细胞分化形成的造血干细胞在含有造血生长因子的甲基纤维素半固体培养基中，培养3周左右，产生各种造血集落。A: 瀑式红系集落。B:红系集落。C:粒系建立。 D: 粒系/红系/巨噬系/巨核系集落。E: 红系/巨噬系集落。F: 粒系/巨噬系集落。标尺: 100μm。

（2）瑞士-吉姆萨（Wright-Giemsa）染色分析各造血细胞的形成情况。

集落中各造血细胞形态用Wright-Giemsa染色鉴定。

①用Pasteur 移液管将CFU中的细胞吸至玻片上，用涂片机进行涂片。

②4%多聚甲醛固定，风干。

③Wright-Giemsa染色。

④显微镜下观察各个造血细胞的形态，以确定各种造血细胞的形成情况。

结果参见图8、图9、图10，集落中含有多种类型的血细胞，如红细胞、粒细胞、巨噬细胞、巨核细胞等（图8：原始红细胞；图9：原始粒细胞；图10：原始红细胞、粒细胞、巨噬细胞、巨核细胞。标尺: 50μm）。

（3）细胞因子诱导诱导性多能干细胞向造血细胞分化的整个过程中造血转录因子TAL-1、GATA-2和多能基因Oct4的动态变化情况。

①Primer Premier 5.0设计多能基因Oct4，造血转录因子GATA-2、TAL-1及阳性对照GAPDH的引物，见表3。

②TRIzol试剂盒抽提细胞因子处理0天、处理5天、处理14天和处理21天的细胞RNA。

④RT-PCR检测Oct4， GATA-2，TAL-1基因在诱导性多能干细胞向造血细胞分化过程中的表达情况，GAPDH为内参。

PCR反应体系:

Taq DNA polymerase 0.5U

dNTP 0.2mM X4

MgCl₂ 1.5mM

each primer 0.2μM

RT product 2 μl

双蒸水H₂O加到20μl体系。

PCR反应程序: 94oC 4min；

94℃ 15s，53o C（GAPDH, TAL-1）, 55o C（Oct4）, 58o C （GATA-2）35 s, 72℃ 1min，35循环；

72℃ 10 min。

⑤ImageJ软件用于分析上述RT-PCR反应条带中各个基因的荧光强度，分析上述各个基因的相对表达值。

结果参见图11：细胞因子诱导诱导性多能干细胞向造血细胞分化的整个过程中造血转录因子TAL-1、GATA-2和多能基因Oct4呈现动态变化（图11 A：RT-PCR检测诱导性多能干细胞向造血细胞分化的不同阶段,多能基因Oct4和造血转录因子TAL-1、GATA2的表达情况，Oct4表达随诱导时间逐渐降低，而造血细胞转录因子基因TAL-1 和 GATA-2逐渐升高，B：Image J 检测细胞因子处理的细胞和对照组的细胞中Brachyury和GATA-2的荧光强度，得到与A相同的结果）。

（4）流式细胞仪检测诱导性多能干细胞向造血细胞分化第14天时，多能基因Oct4和Sox2的表达情况。

①收集细胞因子分步处理14天的细胞，制备单细胞悬液，密度为10⁶-10⁷细胞/ml。

②用不含Ca2+ 和 Mg2+的PBS（加入1% FBS，以防细胞粘连）洗涤2-3次，1000rpm，5分钟，过85-μm 的尼龙网筛以去除存在的细胞团块。

③取80μl PBS重悬细胞，分别加入20μl Oct4-FITC（购自BD），Sox2-FITC（购自BD）抗体，室温避光孵育30min。

④用不含Ca2+ 和 Mg2+的PBS（加入1% FBS）洗涤3次，500μl PBS（加入1% FBS）重悬细胞，BD FACScalibur instrument (Becton Dickinson)检测细胞中造血干细胞表面抗原表达情况。

⑤获得的数据用FlowJo Version 7.2.5的软件进行分析，分析三批相关样本。

结果参见图12，表明诱导性多能干细胞在细胞因子的作用下向造血细胞分化第14天时，已经基本不表达多能基因Oct4和Sox2（图12流式细胞仪检测诱导性多能干细胞向造血细胞分化第14天时，多能基因Oct4和Sox2的表达情况）。

（5）流式细胞仪检测诱导性多能干细胞向造血细胞分化过程中CD34、CD45的时序表达情况。

①收集细胞因子分步处理0天、5天、14天、21天的细胞，制备单细胞悬液，密度为10⁶-10⁷细胞/ml。

③取80μl PBS重悬细胞，分别加入20μl CD34-PE（购自BD）， CD45-FITC（购自BD）抗体，室温避光孵育30min。

④用不含Ca2+ 和 Mg2+的PBS（加入1% FBS）洗涤3次，500μl PBS（加入1% FBS）重悬细胞，BD FACScalibur instrument (Becton Dickinson)检测细胞中CD34， CD45抗原的表达情况。

结果参见图13，CD34、CD45的时序表达表明诱导性多能干细胞在细胞因子的作用下向造血细胞分化是一个动态的变化过程（图13是流式细胞仪检测细胞因子诱导诱导性多能干细胞向造血细胞分化过程中CD34、CD45的时序表达情况）。

实施例4 获得的造血干细胞具有向内皮细胞分化的潜能

诱导性多能干细胞分化的造血干细胞分化形成内皮细胞的潜能

将被诱导的细胞种植在纤维粘连蛋白处理的培养皿中，用内皮细胞生长的培养基2（EGM-2）（购自BD）培养。免疫荧光化学检测细胞表达CD31(购自Santa Cruz)、VE-CAHEREN(购自Santa Cruz)内皮细胞特有的标记蛋白表达情况。免疫荧光化学按常规步骤进行。结果参见图14A和14B，细胞表达CD31、VE-CAHEREN内皮细胞特有的标记蛋白。

将被诱导的细胞种植在人工基质胶matrigel（购自BD）处理的培养皿中，EGM-2中加入VEGF-A，诱导3天，产生血管样组织结构，结果参见图14C（图12是造血干细胞向内皮细胞分化潜能的检测。细胞表达CD31、VE-CAHEREN内皮细胞特有的标记蛋白，并在VEGF-A和matrigel的作用下形成血管样组织结构）。

<110> 浙江大学

<120> 一种获得造血干细胞的方法

<160>16

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 转录因子Brachyury基因的DNA序列的上游引物

<400> 1

TGAGCCTCGA ATCCACAT 18

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>转录因子Brachyury基因的DNA序列的下游引物

<400> 2

GGGCACCTCC AAACTGA 17

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 转录因子GATA-2基因的DNA序列的上游引物

<400> 3

GGCGTCAAGT ACCAGGTGT 19

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>转录因子GATA-2基因的DNA序列的下游引物

<400>4

GGTCGGTTCT GCCCATTC 18

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 转录因子TAL-1基因的DNA序列的上游引物

<400>5

TTGTGCGGCG TATCTTC 17

<210>6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>转录因子TAL-1基因的DNA序列的下游引物

<400>6

CAGGGTCCTT GCCAGTC 17

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 转录因子Oct4基因的DNA序列的上游引物

<400>7

TTCAGCCAAA CGACCATC 18

<210>8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>转录因子Oct4基因的DNA序列的下游引物

<400>8

GGAAAGGGAC CGAGGAGTA 19

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>转录因子Sox2基因的DNA序列的上游引物

<400> 9

AAACAGCCCG GACCGCGTCA A 21

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>转录因子Sox2基因的DNA序列的下游引物

<400> 10

TCGCAGCCGC TTAGCCTCGT 20

<210> 11

<211>17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 转录因子Nanog基因的 DNA序列的上游引物

<400> 11

CCTATGCCTG TGATTTG 17

<210> 12

<211>17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 转录因子Nanog基因的 DNA序列的下游引物

<400> 12

AGAAGTGGGT TGTTTGC 17

<210> 13

<211>17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 转录因子Rex1基因的 DNA序列的上游引物

<400> 13

GGCAAAGACAAGACACC 17

<210> 14

<211>16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 转录因子Rex1基因的 DNA序列的下游引物

<400> 14

GCAAATTCTGCGAGCT 16

<210> 15

<211>17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 转录因子GAPDH基因的 DNA序列的上游引物

<400> 15

AAGGTCGGAG TCAACGG 17

<210> 16

<211>19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 转录因子GAPDH基因的 DNA序列的下游引物

<400> 16

GGAAGATGGT GATGGGATT 19

Claims

1.一种获得造血干细胞的方法，通过以下技术方案实现：

（1）细胞制备：取骨髓，密度梯度离心结合贴壁筛选法，获得单个核细胞，选择生长状态良好的单个核细胞，用于诱导性多能干细胞的制备；

获取胎鼠成纤维细胞，选择生长状态良好的胎鼠成纤维细胞，丝裂霉素C处理，作为制备诱导性多能干细胞的饲养层；

（2）诱导性多能干细胞制备

利用含有四种转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的病毒转染生长状态良好的单个核细胞；病毒包装利用脂质体2000转染试剂盒转染293T 细胞进行，孵育24-72小时，收集病毒和病毒滴度测定，选择生长良好的单个核细胞，将含有四种转录因子的病毒按照1：5比例加入培养系统中，进行病毒转染，病毒转染24小时后，将病毒转染过的目的细胞转到处理好的鼠胚胎成纤维细胞中，第二天将培养基更换为胚胎干细胞的培养基，待克隆形成，挑选形态上类似胚胎干细胞的克隆进行扩大培养并进行诱导性多能干细胞生物学特征检测，对于符合诱导性多能干细胞生物学特征的克隆，被确定为诱导性多能干细胞，继续向造血干细胞进行分化；

（3）分化获得造血干细胞

根据诱导因子功能的不同，分成四组，分阶段高效诱导诱导性多能干细胞为造血干细胞，并检测获得的造血干细胞向造血细胞和内皮细胞方向分化的潜能；

第一组诱导因子有中胚层诱导因子BMP-4、PD98059和部分早期造血因子SCF、Flt3L、 VEGF，第二组细胞因子为造血因子和促进造血干细胞增值的细胞因子SCF、Flt3L、 VEGF、IL-3、IL-6，第三组细胞因子为刺激造血干细胞在半固体培养基中形成不同细胞集落和不同造血细胞的因子，有SCF、VEGF、IL-3、IL-6 、TPO、 EPO 、G-CSF、GM-CSF，第四组为刺激造血干细胞向内皮细胞分化的VEGF-A；

第一组细胞因子BMP4、PD98059、SCF、Flt3L、VEGF处理后收集的拟胚体中，含有高比例的中胚层转录因子Brachyury 和GATA-2；

将第一组细胞因子处理后收集的拟胚体分散成单细胞悬液，种植在低粘附的培养皿中，培养基为含有SCF、Flt3L、VEGF、bFGF、IL-3、IL-6、L-谷氨酰胺、b-巯基乙醇、非必须氨基酸的造血干细胞培养基StemPro-34，处理7-9天后获得高达19.58±4.37%的造血干细胞。

2.根据权利要求1所述的一种获得造血能干细胞的方法，其特征在于，利用成分确定的诱导因子的方法将来源于骨髓单个核细胞重编程的诱导性多能干细胞高效分化成造血干细胞。

3.根据权利要求1所述的一种获得造血能干细胞的方法，其特征在于，获得的造血干细胞在SCF、VEGF、IL-3、IL-6 、TPO、 EPO 、G-CSF、GM-CSF因子作用下，形成造血集落，为红系集落,粒系集落,巨核系集落,红系/粒系/巨核系/巨噬系集落。

4.根据权利要求1所述的一种获得造血能干细胞的方法，其特征在于，获得的造血干细胞能表达内皮细胞特有的标记蛋白CD31 和 VE-CADHERIN；获得的造血干细胞在VEGF-A和matrigel作用下，形成血管状组织结构。