CN110577967A - 诱导性多能干细胞及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了诱导性多能干细胞，所述诱导性多能干细胞来源于脐动脉内皮细胞且可以分化为生血内皮细胞。本发明的诱导性多能干细胞保留了部分脐动脉内皮细胞的表观遗传特性，能够分化为血液系统和内皮系统的共祖细胞—生血内皮细胞。由此为造血干细胞移植以及进一步诱导分化获得充足数量的红细胞或血小板乃至各种类型的血液细胞提供来源，也为心血管相关疾病涉及的血管新生提供充足的、具有良好功能的内皮干/祖细胞或成熟的内皮种子细胞，具有较高的应用价值。

Description

诱导性多能干细胞及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及诱导性多能干细胞及其制备方法。更具体地，本发明涉及诱导性多能干细胞、药物、诱导性多能干细胞在制备药物中的用途、筛选制剂的方法、试剂盒、获得诱导性多能干细胞的方法、生血内皮细胞、获得生血内皮细胞的方法及造血干细胞。
背景技术
造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSC)具有高度的自我更新能力以及多向分化潜能，可以产生所有类型的血液细胞，如红细胞、白细胞、血小板和淋巴细胞等。它在生命过程中不仅能够重建整个造血系统，还具备维持长期造血的功能。近年来，HSC移植越来越多地被应用于临床治疗血液或非血液系统的恶性肿瘤，显示出广阔的前景，但是绝对数量的不足极大的限制了其应用发展。由于造血干细胞自我更新与维持的机制尚不清楚，难以实现体外扩增培养，从体外重新生成HSC成为解决临床可供移植的细胞数量不足的另一个途径。
通过外源表达几种基因可以将体细胞重编程为诱导性多能干细胞(inducedpluripotent stem cells,iPS cells)，由此可以实现小鼠、人、大鼠、猴以及犬的体细胞重编程。iPS细胞在病人特异性的细胞移植治疗、发病机理的研究以及新药筛选方面具有巨大的潜在价值。
最初iPS细胞的建立是通过莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney murine leukemiavirus，MMLV)-基础的逆转录病毒载体实现转基因的运输。逆转录病毒可以稳定感染小鼠成纤维细胞，并借助逆转录酶将它的RNA基因组介导入宿主的基因组中。因此，iPS细胞基因组内整合了大量转基因，从而实现持续表达。
iPS细胞最初从原代培养的小鼠成纤维细胞中建立，随后在多个物种、多种不同类型的组织细胞中均实现了重编程。表观遗传改变是形成iPS细胞的表现之一。尽管iPS和ES细胞都属于多潜能细胞，具有相似的基因表达谱。然而，它们在表观修饰方面有所不同，特别是那些不涉及多潜能性的基因。细胞分化是通过表观遗传修饰来限制分化潜能的过程，每一种类型的体细胞具有特定的表观遗传特征以稳定自身状态。外源表达重编程因子可以影响体细胞中的几个下游基因而改变它们的表观修饰。然而，难以想象这几个因子可以控制基因组的所有基因。实际上，全基因组分析显示iPS和ES细胞具有相似的DNA甲基化模式。不受控制的基因将仍然保留它们的表观遗传状态，这将会影响iPS细胞的分化潜能。例如，星形胶质细胞GFAP基因增强子结合位点的甲基化状态通过改变与增强子STAT3的结合活性来控制神经祖细胞的分化命运。无甲基化时它们倾向于变成星形胶质细胞，而甲基化时它们倾向于向神经分化。可见，表观遗传记忆是影响iPS分化倾向的重要因素。
目前，利用iPS细胞在体外生成HSC的方法仍有待研究。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。
为此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种诱导性多能干细胞。根据本发明的实施例，所述诱导性多能干细胞来源于脐动脉内皮细胞且可分化为生血内皮细胞。发明人以脐动脉内皮细胞作为起始细胞，经处理(如重编程)能够获得诱导性多能干细胞，该细胞能够进一步分化为生血内皮细胞。由于生血内皮细胞为造血干细胞及内皮细胞的共祖细胞，因此通过对生血内皮细胞分化可分别获得造血干细胞和内皮细胞，从而为造血干细胞移植以及进一步诱导分化获得充足数量的红细胞或血小板乃至各种类型的血液细胞提供来源。另外，经生血内皮细胞可分化得到的内皮干/祖细胞、内皮细胞或血管平滑肌细胞，也可以为心血管相关疾病涉及的血管新生(如常见的下肢缺血性疾病的治疗)提供充足的、具有良好功能的种子细胞。
根据本发明的实施例，所述诱导性多能干细胞还可以具有下列附加技术特征：
根据本发明的实施例，所述诱导性多能干细胞为非基因组整合式。
根据本发明的实施例，所述诱导性多能干细胞是通过将所述脐动脉内皮细胞重编程而获得的。
根据本发明的实施例，所述重编程包括将携带有重编程因子的仙台病毒转染至所述脐动脉内皮细胞中。
根据本发明的实施例，所述诱导性多能干细胞表达TIE2基因。
根据本发明的实施例，与所述脐动脉内皮细胞相比，下列至少之一的基因在所述诱导性多能干细胞内表达水平下调：CD31基因、CD144基因、vWF基因和TIE1基因。
根据本发明的实施例，所述生血内皮细胞可分化为下列至少之一的细胞：血系细胞、内皮干/祖细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞。
根据本发明的实施例，所述生血内皮细胞可诱导分化为造血干细胞，并可进一步分化为血系细胞，其中，由所述生血内皮细胞向所述血系细胞诱导分化所得到的细胞群中，CD43+细胞含量为35～50％，CD45+细胞含量为15～20％。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种药物。根据本发明的实施例，所述药物含有脐动脉内皮细胞或前面所述的诱导性多能干细胞。
在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述的诱导性多能干细胞在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于治疗心血管相关疾病。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种筛选药物的方法，所述药物含有TIE2激酶抑制剂或者TIE2激酶激动剂。根据本发明的实施例，所述方法包括：使候选制剂与前面所述诱导性多能干细胞接触，确定接触前后所述诱导性多能干细胞中TIE2基因的表达量，所述TIE2基因表达下调，是所述候选制剂作为含有TIE2激酶抑制剂的制剂的指示；所述TIE2基因表达上调，是所述候选制剂作为含有TIE2激酶激动剂的制剂的指示。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种获得前面所述诱导性多能干细胞的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：对所述脐动脉内皮细胞进行重编程，以便获得所述诱导性多能干细胞。
根据本发明的实施例，获得所述脐动脉内皮细胞的步骤包括：将填充有Ⅳ型胶原酶溶液的脐带动脉血管进行孵育，收集所得到的消化液中的脐动脉内皮细胞。
根据本发明的实施例，所述Ⅳ型胶原酶溶液浓度为0.5～3mg/mL，所述孵育时间为10～20分钟。
根据本发明的实施例，所述步骤包括：除去脐带的脐动脉血管内残血，并向所得到的血管内填充1mg/mL的Ⅳ型胶原酶溶液；封住所述血管两端，在CO2气氛中37℃孵育15分钟，收集血管内的消化液；将所述消化液进行离心，弃上清，用EGM-2培养基重悬细胞，并将所得到的细胞悬液按照1～5×105个细胞/孔接入孔板，在CO2气氛中37℃孵育，隔天更换培养基，当细胞生长至80～90％细胞汇合时，PBS洗涤细胞一次，用0.25％Trypin-EDTA在37℃消化3～5min，用EGM-2培养基终止消化后，将细胞从所述培养基上吹打下来，收集细胞于15ml离心管中，室温下以1000rpm的转速离心5min，弃上清，以便得到所述脐动脉内皮细胞。
根据本发明的实施例，所述重编程包括将携带有重编程因子的仙台病毒转染至所述脐动脉内皮细胞中。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种生血内皮细胞。根据本发明的实施例，所述生血内皮细胞是由前面所述诱导性多能干细胞分化得到的。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种造血干细胞。根据本发明的实施例，所述造血干细胞是通过前面所述生血内皮细胞分化得到的。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种获得前面所述生血内皮细胞的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将所述诱导性多能干细胞进行预培养；将所述预培养的细胞进行分化，得到中胚层细胞；将所述中胚层细胞进行分化，得到所述生血内皮细胞。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒含有前面所述的诱导性多能干细胞。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例的原代培养的脐动脉内皮细胞的光镜图；
图2显示了根据本发明一个实施例的流式细胞术检测脐动脉内皮细胞的表面标志分析示意图；
图3显示了根据本发明一个实施例的脐动脉内皮细胞中vWF表达的免疫荧光图；
图4显示了根据本发明一个实施例的脐动脉内皮细胞管腔的光镜图；
图5显示了根据本发明一个实施例的重编程的过程中的克隆形成的光镜图，其中A：起始细胞形态，B：iPS克隆的出现，C：iPS克隆在无饲养层环境下的培养细胞；
图6显示了根据本发明一个实施例的流式检测iPS-A中多能性标志SSEA-4和Tra-1-60表达的分析示意图；
图7显示了根据本发明一个实施例的qPCR分析iPS-A中内源性多能性基因和内皮特异性基因表达的分析示意图；
图8显示了根据本发明一个实施例的核型分析示意图；
图9显示了根据本发明一个实施例的iPS-A的体外分化潜能的鉴定分析示意图；以及
图10A显示了根据本发明一个实施例的iPS-A与胚胎干细胞向造血系细胞分化的细胞形态示意图；
图10B显示了根据本发明一个实施例的流式检测标志CD43和CD45表达的分析示意图；
图10C显示了根据本发明一个实施例的造血相关基因表达分析示意图；以及
图10D显示了根据本发明一个实施例的iPS-A向生血内皮分化后内皮相关基因表达分析示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
本发明提出了诱导性多能干细胞、药物、诱导性多能干细胞在制备药物中的用途、筛选制剂的方法、试剂盒、获得诱导性多能干细胞的方法、生血内皮细胞、获得生血内皮细胞的方法及造血干细胞，下面将分别对其进行详细描述。
诱导性多能干细胞
在本发明的一个方面，本发明提出了一种诱导性多能干细胞。根据本发明的实施例，所述诱导性多能干细胞来源于脐动脉内皮细胞且可分化为生血内皮细胞。
研究发现，在尿囊和绒毛膜融合而成胎盘之后，造血干细胞就出现在大的动脉中，其中之一就是脐动脉，而随后有研究进一步证实内皮细胞和造血干细胞具有共同的祖先细胞—生血内皮。
有鉴于此，发明人以脐动脉内皮细胞作为起始细胞，经处理(如重编程)能够获得诱导性多能干细胞，其具有高度的自我复制能力和多向分化潜能，可以提供充足的细胞来源。与现有的胚胎干细胞或诱导性多能干细胞相比，该细胞起源于脐带动脉内皮细胞，由于起始细胞的表观遗传特性有可能会在重编程为诱导性多能干细胞后仍得到部分保留，因此有可能会有助于诱导性多能干细胞向生血内皮乃至造血谱系和内皮谱系的细胞类型进一步分化，可以作为生血内皮细胞、造血干细胞以及内皮祖细胞的新型源头细胞，为造血干细胞移植以及进一步诱导分化获得充足数量的红细胞或血小板乃至各种类型的血液细胞提供来源。另外，经生血内皮细胞分化得到的内皮干/祖细胞、内皮细胞或血管平滑肌细胞也可以为心血管相关疾病涉及的血管新生(如常见的下肢缺血性疾病的治疗)提供充足的、具有良好功能的种子细胞。
根据本发明的实施例，诱导性多能干细胞为非基因组整合式。利用携带有目标基因的逆转录病毒转染靶细胞从而将目标基因介导入靶细胞的基因组中。研究发现，无论是在ES细胞还是在诱导性多能干细胞中，逆转录病毒启动子区会发生DNA甲基化而失活，因此，在重编程过程中逆转录病毒所承载的目标基因的表达逐渐被抑制，当变成真正的诱导性多能干细胞时则完全被沉默。人们认为正是这一自动沉默机制实现了有效的体细胞重编程。然而，外源序列仍然保留在iPS细胞的基因组中，原结构的改变可能会诱发一些反常。特别是重编程因子中的原癌基因c-Myc，它的再度激活有可能导致转基因源性的肿瘤形成。为制备安全的iPS细胞，发明人采用非基因组整合的方法进行重编程，从而获得非基因组整合式诱导性多能干细胞。
根据本发明的实施例，诱导性多能干细胞是通过将脐动脉内皮细胞重编程而获得的。发明人发现，以脐动脉内皮细胞作为起始细胞，经处理(如重编程)能够获得诱导性多能干细胞，且该诱导性多能干细胞部分保留了起始细胞的表观遗传特性，因此会有助于诱导性多能干细胞向生血内皮乃至造血谱系和内皮谱系的细胞类型进一步分化。
根据本发明的实施例，重编程包括将携带有重编程因子的仙台病毒转染至脐动脉内皮细胞中。根据本发明的具体实施例，重编程因子选自Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc。通过将携带有重编程因子的逆转录病毒转染至宿主细胞(脐动脉内皮细胞)中，重编程因子能够诱导众多靶基因过表达，这些靶基因中很多可能参与诱导性多能干细胞的产生。进一步地，发明人发现，相比于其他逆转录病毒，仙台病毒作为单负链RNA病毒，生活周期完全在胞质中进行，不会整合到基因组上，所以安全性高。而且二代仙台病毒含有温敏性的突变，可以通过改变培养温度而清除转染后残余在包浆中的载体，确保了应用的安全性。根据本发明的具体实施例，二代仙台病毒购自Invitrogen公司。
本发明所使用的术语“重编程”是指成体细胞通过改变其分化状态，形成包括干细胞在内的不同类型的细胞。
根据本发明的实施例，诱导性多能干细胞表达TIE2基因。TIE2基因编码促血管新生蛋白因子TIE2，主要在生血内皮细胞和血管内皮细胞表达。由于该诱导性多能干细胞来源于脐动脉内皮细胞，保留有脐动脉内皮细胞的TIE2基因表达。然而，其他来源的诱导性多能干细胞和ES细胞中TIE2基因不表达。
根据本发明的实施例，与脐动脉内皮细胞相比，下列至少之一的基因在诱导性多能干细胞内表达水平下调：CD31基因、CD144基因、vWF基因和TIE1基因。
根据本发明的实施例，生血内皮细胞可分化为下列至少之一的细胞：血系细胞、内皮干/祖细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞。研究发现，内皮细胞和造血干细胞具有相同的祖先细胞—生血内皮，由于生血内皮细胞是由脐动脉内皮细胞来源的诱导性多能干细胞分化而来，诱导性多能干细胞部分保留了脐动脉内皮细胞的表观遗传特性，因此更倾向于向内皮和造血的共祖细胞——生血内皮细胞分化，随后加以诱导可以分别分化为内皮谱系细胞或造血干细胞及造血干细胞下游各类型的血系细胞。根据本发明的具体实施例，由生血内皮细胞向血系细胞诱导分化所得到的细胞群中，CD43+(发育过程中最早出现的血液系统细胞标志)细胞含量为35～50％，CD45+(除脱核的成熟红细胞外所有血液系统细胞均表达的标志)细胞含量为15～20％。由此，脐动脉内皮细胞来源的诱导性多能干细胞经过一系列分化而得到的血系细胞得率较高。
需要说明的是，本发明所使用的术语“血系细胞”亦可称作血液细胞，应作广义理解，即凡是存在于血液中的细胞均可视作血系细胞，包括但不限于红细胞、白细胞、血小板和淋巴细胞等。
药物
在本发明的另一方面，本发明提出了一种药物。根据本发明的实施例，药物含有脐动脉内皮细胞或前面所述的诱导性多能干细胞。由于本发明的诱导性多能干细胞来源于脐动脉内皮细胞，部分保留有脐动脉内皮细胞的表观遗传特性，因此会有助于诱导性多能干细胞向生血内皮乃至造血谱系的细胞类型进一步分化，可以作为生血内皮细胞、造血干细胞以及内皮祖细胞的新型源头细胞，为造血干细胞移植以及进一步诱导分化获得充足数量的红细胞或血小板乃至各种类型的血细胞提供来源，另外，经生血内皮细胞分化得到的内皮干/祖细胞、内皮细胞或血管平滑肌细胞也可以为心血管相关疾病涉及的血管新生(如常见的下肢缺血性疾病的治疗)提供充足的、具有良好功能的种子细胞。
本发明的药物可与常规治疗方法和/或疗法相结合使用，或者可与常规治疗方法和/或疗法分开使用。例如可根据本领域中任何常规方法与用于移植和其它目的的其他干细胞、药物一起施用，或以与其混合物的形式施用。当本发明的药物在采用与其它药物的联合疗法中给药时，它们可序贯地或同时地给予个体。或者，本发明的药物可包含本发明的脐动脉内皮细胞或诱导性多能干细胞、药学上可接受的载体或药学上可接受的赋形剂以及本领域已知的其它治疗药或预防药的组合。
药学上可接受的载体或药学上可接受的赋形剂包括：润滑剂、湿润剂、增甜剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、镇痛控制剂、增溶剂、稳定剂和防腐剂。药学上可接受的载体和赋形剂的详细内容可在此处引入作为参考的Remington’s Pharmaceutical Sciences(19thed.，1995)中找到。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对诱导性多能干细胞所描述的特征和优点，同样适用于该药物，在此不再赘述。
用途
在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述的诱导性多能干细胞在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，药物用于治疗心血管相关疾病。由于本发明的诱导性多能干细胞来源于脐动脉内皮细胞，部分保留有脐动脉内皮细胞的表观遗传特性，因此会有助于诱导性多能干细胞向生血内皮乃至造血谱系的细胞类型进一步分化，可以作为生血内皮细胞、造血干细胞以及内皮祖细胞的新型源头细胞，为造血干细胞移植以及进一步诱导分化获得充足数量的红细胞或血小板乃至各种类型血细胞提供来源，也为心血管相关疾病涉及的血管新生提供充足的、具有良好功能的种子细胞。
本发明所使用的术语“治疗”用于指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病(例如预防心血管相关疾病)或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本文所述药物给予有需要的个体。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对诱导性多能干细胞所描述的特征和优点，同样适用于该用途，在此不再赘述。
筛选制剂的方法
在本发明的又一方面，本发明提出了一种筛选制剂的方法，制剂含有TIE2激酶抑制剂或者TIE2激酶激动剂。根据本发明的实施例，该方法包括：使候选制剂与前面所述诱导性多能干细胞接触，确定接触前后诱导性多能干细胞中TIE2基因的表达量，TIE2基因表达下调，是候选制剂作为含有TIE2激酶抑制剂的制剂的指示；TIE2基因表达上调，是候选制剂作为含有TIE2激酶激动剂的制剂的指示。
目前，主要采用普通的表达TIE2的细胞如内皮细胞以研究促血管新生蛋白因子(TIE2)激酶信号通路，以获得TIE2激酶抑制剂和激动剂。但是，目前表达TIE2的细胞如内皮细胞存在如下问题：分离获取繁琐；增殖能力有限，几代之后便会发生功能及特性丧失和凋亡的现象，需要经常性的反复制备；每一制备批次都会有不同，而且核型未必正常。有鉴于此，发明人发现，经脐动脉内皮细胞重编程而获得的诱导性多能干细胞保留了脐动脉内皮细胞中TIE2基因的表达，因此，可以通过研究候选制剂对TIE2激酶(由TIE2基因编码)表达通路的作用，以获得TIE2激酶的激动剂(激活通路，TIE2基因表达上调)或者抑制剂(抑制通路，TIE2基因表达下调)。
并且，相对于其他表达TIE2的细胞，诱导性多能干细胞具有高度自我更新能力和扩增能力，可以无限传代、冻存、复苏，且维持染色体核型稳定正常。并且，其可来源于自体本身，从而实现一对一的疾病治疗或药物筛选，不易出现排斥现象。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对诱导性多能干细胞所描述的特征和优点，同样适用于该筛选制剂的方法，在此不再赘述。
获得诱导性多能干细胞的方法
在本发明的又一方面，本发明提出了一种获得前面所述诱导性多能干细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：对脐动脉内皮细胞进行重编程，以便获得诱导性多能干细胞。发明人发现，以脐动脉内皮细胞作为起始细胞，经处理(如重编程)能够获得诱导性多能干细胞，且该诱导性多能干细胞部分保留了起始细胞的表观遗传特性，因此会有助于诱导性多能干细胞向生血内皮乃至造血谱系或内皮谱系的细胞类型进一步分化。
根据本发明的实施例，获得脐动脉内皮细胞的步骤包括：将填充有Ⅳ型胶原酶溶液的脐带动脉血管进行孵育，收集所得到的消化液中的脐动脉内皮细胞。发明人发现，Ⅳ型胶原酶作用温和，能够在消化细胞的过程中减少对细胞的伤害，细胞得率较高。
根据本发明的实施例，Ⅳ型胶原酶溶液浓度为0.5～3mg/mL，孵育时间为10～20分钟。发明人经过大量实验得到上述较优酶解反应条件，在此条件下内皮细胞既可以从血管壁脱落下来，同时其邻近下一层的血管平滑肌细胞仍然留在血管壁未脱落，确保了分离获取细胞具有高纯度。
根据本发明的实施例，该步骤包括：除去脐带的脐动脉血管内残血，并向所得到的血管内填充1mg/mL的Ⅳ型胶原酶溶液；封住血管两端，在CO2气氛中37℃孵育15分钟，收集血管内的消化液；将消化液进行离心，弃上清，用EGM-2培养基重悬细胞，并将所得到的细胞悬液按照1～5×105个细胞/孔接入孔板，在CO2气氛中37℃孵育，隔天更换培养基，当细胞生长至80～90％细胞汇合时，PBS洗涤细胞一次，用0.25％Trypin-EDTA在37℃消化3～5min，用EGM-2培养基终止消化后，将细胞从培养基上吹打下来，收集细胞于15ml离心管中，室温下以1000rpm的转速离心5min，弃上清，以便得到脐动脉内皮细胞。由此，所得到的脐动脉内皮细胞得率较高，活性较好。
根据本发明的实施例，重编程包括将携带有重编程因子的仙台病毒转染至脐动脉内皮细胞。根据本发明的具体实施例，重编程因子选自Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc。通过将携带有重编程因子的逆转录病毒转染至宿主细胞(脐动脉内皮细胞)中，重编程因子能够诱导众多靶基因过表达，这些靶基因中很多可能参与诱导性多能干细胞的产生。进一步地，发明人发现，相比于其他逆转录病毒，仙台病毒作为单负链RNA病毒，生活周期完全在胞质中进行，不会整合到基因组上，所以安全性高。而且二代仙台病毒载体含有温敏性的突变，可以通过改变培养温度而清除转染后残余在包浆中的载体，确保了应用的安全性。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对诱导性多能干细胞所描述的特征和优点，同样适用于该获得诱导性多能干细胞的方法，在此不再赘述。
生血内皮细胞
在本发明的又一方面，本发明提出了一种生血内皮细胞。根据本发明的实施例，生血内皮细胞是由前面所述诱导性多能干细胞分化得到的。由于本发明的诱导性多能干细胞来源于人脐带动脉内皮细胞，部分保留有人脐带动脉内皮细胞的表观遗传特性，使得iPS细胞倾向于向生血内皮细胞分化。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对诱导性多能干细胞所描述的特征和优点，同样适用于该生血内皮细胞，在此不再赘述。
获得生血内皮细胞的方法
在本发明的又一方面，本发明提出了一种获得前面所述生血内皮细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将诱导性多能干细胞进行预培养；将预培养的细胞进行分化，得到中胚层细胞；将中胚层细胞进行分化，得到所述生血内皮细胞。由此，利用本发明的方法所得到的生血内皮细胞得率较高，活性较好。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对生血内皮细胞所描述的特征和优点，同样适用于该获得生血内皮细胞的方法，在此不再赘述。
造血干细胞
在本发明的又一方面，本发明提出了一种造血干细胞。根据本发明的实施例，造血干细胞是通过前面所述生血内皮细胞分化得到的。研究发现，内皮细胞和造血干细胞具有相同的祖先细胞—生血内皮，由于生血内皮细胞是由脐动脉内皮细胞来源的诱导性多能干细胞分化而来，诱导性多能干细胞部分保留有脐动脉内皮细胞的表观遗传特性，因此倾向于向生血内皮细胞分化，再经由特定的诱导，后续可以进一步分化为内皮谱系细胞或造血干细胞及下游各类型血细胞。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对生血内皮细胞所描述的特征和优点，同样适用于该造血干细胞，在此不再赘述。
试剂盒
在本发明的又一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，试剂盒含有前面所述的诱导性多能干细胞。由此，利用本发明的试剂盒能够进一步获得生血内皮细胞、造血干细胞和内皮细胞，从而为造血干细胞移植以及进一步诱导分化获得充足数量的红细胞或血小板乃至各种类型的血液细胞提供来源。另外，经生血内皮细胞可分化得到的内皮干/祖细胞、内皮细胞或血管平滑肌细胞，也可以为心血管相关疾病涉及的血管新生(如常见的下肢缺血性疾病的治疗)提供充足的、具有良好功能的种子细胞。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对诱导性多能干细胞所描述的特征和优点，同样适用于该试剂盒，在此不再赘述。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
1、原代分离培养的人脐动脉内皮细胞(HuAECs)
将脐带置于装有PBS的无菌托盘中，用皮肤镊钝性分离出两根脐动脉。用弯镊提起脐动脉一端，用1ml注射器针头挑开血管口轻轻插入，用止血钳固定针头。注射器吸取PBS后连接针头，反复灌注冲洗动脉血管内残血至从血管内冲出的PBS澄清，用注射器吸取1mg/ml的Ⅳ型胶原酶注入动脉血管中。当血管另一端有溶液流出时，用止血钳夹闭出口端，继续注入Ⅳ型胶原酶直至血管充盈，移除注射器，将脐动脉连同止血钳、针头一起放入无菌饭盒中，盖上盖子，将饭盒置于CO2孵育箱37℃孵育15min。在超净工作台内取出脐动脉，用止血钳提起脐动脉，将未夹带针头的一端置于50ml离心管上方，打开血管封闭端止血钳。使用注射器吸取PBS后连接针头，冲出血管内消化液入50ml离心管，之后吸取PBS反复灌注血管以便将细胞充分冲出；将收集好的细胞悬液于台式水平离心机中1000rpm离心5min，弃上清，用EGM-2培养基重悬细胞，计数1×105个细胞/孔接种入含有EGM-2培养基的6孔板中，置于CO2孵育箱37℃培养，隔天换液，当细胞生长至80-90％细胞汇合时，PBS洗涤细胞一次，用0.25％Trypin-EDTA在37℃消化3-5min，用EGM-2培养基终止消化后，用移液枪将细胞从培养板上轻轻吹打下来，收集细胞于15ml离心管中，室温1000rpm离心5min，弃上清，按照1:3-1:5的比例传代。
原代分离培养的HuAECs为贴壁生长型细胞，呈铺路石样单层生长，少数呈梭形(图1)。
采用流式细胞术检测细胞的表面标志，结果表明，原代培养的HuAECs高表达CD144和CD31，低表达或者不表达CD117、CD133和CD45，KDR的表达率分别为89.6％、67.7％和69％(图2)。
vWF也称Ⅷ因子相关抗原，是一种由血管内皮细胞合成并分泌的大分子蛋白多聚体，在体内参与血液凝固和血栓的形成，因此常被作为特征因子来鉴定体外培养的内皮细胞。免疫荧光结果表明，原代分离培养的HuAECs vWF均表达阳性(图3)。
管腔形成实验是检测内皮细胞体外生成血管能力的一种可靠实验方法。结果表明，原代分离培养的HuAECs能在体外形成管腔结构(图4)。
2、重编程HuAECs为iPS
(1)常规复苏原代分离培养的HuAECs，离心后用无抗生素EGM-2培养基重悬细胞并计数1～2×104个细胞/孔接种入24孔板中，原则上代数越早的细胞重编程效率越高，因此实验中用作重编程的起始细胞均在2代以内；
(2)调养细胞两天后，当细胞密度达到30～60％时，用重编程试剂盒进行转染；
(3)取适量无抗生素EGM-2培养基转移至细胞培养板中，置于5％CO2，37℃孵育箱进行预平衡；
(4)用0.25％胰酶消化一孔贴壁培养的HuAECs，用血球计数板计数细胞总数；
(5)根据细胞计数结果，用以下公式计算每孔细胞所需要的病毒体积：
病毒体积(μL)＝MOI(CIU/每个细胞)×细胞个数/[病毒滴度(CIU/mL)×10-3(mL/μL)]，其中每种病毒推荐使用的MOI分别为KOS MOI＝5，hc-Myc MOI＝5，hKlf4 MOI＝3，病毒为仙台病毒；
(7)从-80℃取出装有病毒的EP管，快速将病毒管浸入37℃水浴锅中5～10s苏醒病毒，然后在室温复苏病毒，等到管中病毒毒液完全融化后，立即将病毒管插在冰上待用；
(8)用移液枪转移700μl在37℃孵育箱预平衡好的无抗生素EGM-2培养基到无菌1.5ml EP管中，根据第(6)步中的计算结果将三种病毒加入培养基中，轻轻吹打保证溶液充分混匀；
(9)取出在24孔板中贴壁培养的HuAECs，弃去培养上清，用不含钙镁离子的DPBS洗涤1次后加入在上一步中准备好的病毒溶液，为防止在培养基中的病毒失活，该步骤耗时不能超过5min；
(10)将转染中的细胞置于5％CO2，37℃孵育箱进行培养；
(11)转染24h后，用新鲜无抗生素EGM-2培养基替换病毒上清；
(12)连续培养细胞7天，在此期间隔天换液，一旦出现克隆则改为每天换液；
(13)原孔培养至转染后第七天，可以对病毒转染的HuAECs进行细胞传代；
(14)在6孔板中加入1ml geltrex，在37℃事先包被1h；
(15)取出HuAECs，用DPBS洗涤1次后，用TrypLETMSelect enzyme消化细胞，收集细胞于15ml离心管；
(16)室温1000rpm离心5min；
(17)弃上清，用无抗生素EGM-2培养基重悬细胞后，将细胞接种入预先包被好的6孔板中进行无饲养层培养；
(18)24h以后，弃去培养上清，将培养基替换成Essential 8培养基，之后开始每天换液；
(19)从转染后第8天开始，每天在光学显微镜下观察细胞形态，转染后3周左右，可以观察到iPS样小的克隆开始出现；
(20)转染后3-4周，iPS克隆开始平铺生长，可以手动挑出未分化的iPS克隆转移至新包被好的6孔板或12孔板中继续培养，以备进一步的细胞扩增、冻存以及检测。
病毒转染后第12天左右可以观察到iPS克隆样细胞在细胞间隙内萌发，之后iPS呈集落样开始平铺生长，克隆出现后7-15天内可以挑取集落进行单克隆培养，传代纯化后获得的iPS在形态上与ES非常相似，细胞呈单克隆集落样生长，集落致密且表面光滑平整、边界清晰，单个细胞体积较小，核质比高，扩增迅速，倍增时间短，能够维持长期传代(图5)。
3、iPS克隆的挑取
(1)将光学显微镜移入超净工作台，开启紫外灯灭菌30min；
(2)先在包被好geltrex的细胞培养板中加入Essential 8培养基在5％CO2，37℃孵育箱中进行预平衡；
(3)弃去培养上清，DPBS洗涤1次后，加入新鲜的Essential 8培养基；
(4)将iPS克隆生长的6孔板取出，置于超净工作台内光学显微镜下观察，挑选生长状态良好的、未分化的克隆；
(5)打开6孔板盖，用移液枪插取10μl枪头；
(6)在显微镜下边观察边操作，先用枪尖剥离克隆周围正常形态的内皮细胞，然后将克隆分割成小块后再从6孔板上剥离下来；
(7)换枪头，在显微镜下将克隆团控吸入枪头内，将细胞悬液直接加入预先平衡好的培养基中，将细胞培养板置于5％CO2，37℃孵育箱中培养。
4、HuAECs来源iPS(iPS-A)的培养
iPS-A在预先包被好geltrex的细胞培养板上用Essential 8完全培养基进行贴壁培养，iPS贴壁后需要每天换液。iPS呈集落样生长，集落形态与ES克隆非常相似，集落形态都呈扁平状。iPS增殖迅速，为防止iPS克隆生长过大后发生分化，连续培养4-7天就需要为iPS进行传代培养。
5、iPS-A的传代培养
(1)挑取的iPS单克隆连续培养4-7天后，可以进行传代培养；
(2)弃去培养上清，DPBS洗涤细胞2次，加入适量DPBS室温孵育5-7min；
(3)在显微镜下观察到iPS克隆已经自然分裂成小块时，用细胞刮将其从孔壁上刮下，用移液枪转移细胞悬液到离心管中，注意不要将克隆团块吹打成单细胞，否则将降低克隆传代后的存活率；
(4)室温1000rpm离心5min；
(5)弃上清，用Essential 8培养基重悬细胞后，将iPS克隆转移至预先包被好geltrex的细胞培养板，在5％CO2，37℃孵育箱中培养，根据iPS克隆的生长密度，传代比例应该在1:3～1:5之间。
6、鉴定
(1)流式检测iPS-A中多能性标志SSEA-4和Tra-1-60的表达
流式细胞术结果显示，iPS-A高表达多能性基因标志SSEA-4和Tra-1-60，与ES相似(图6)。
(2)qPCR分析iPS-A中内源性多能性基因和内皮特异性基因的表达
qRT-PCR检测结果显示，iPS-A的内源性多能性基因(Oct4、Sox2、Klf4和Nanog)均表达上调(图7的A)，而内皮细胞特性基因则表达下调(图7的B)。
(3)核型分析
20个中期分裂相细胞进行核型分析，结果均为正常女性核型(图8)。
(4)iPS-A的体外分化
iPS-A传代接种入低吸附性孔板中形成EBs，悬浮培养7天后，再进行贴壁诱导7d。收取悬浮培养7天的EBs和贴壁诱导分化7天后的EBs细胞进行qRT-PCR鉴定，结果表明分化后的细胞高表达三个胚层的基因，表明具有分化为三胚层细胞的能力(图9)。
7、多能干细胞向造血系诱导分化体系的建立
将iPSC-A和ES(H9细胞系)分别接种至预先matrigel 4℃过夜包被好的6孔细胞培养板中，16-24h后弃去Essential 8培养基，替换为中胚层诱导培养基，连续培养2天后，替换为生血内皮诱导培养基，再培养2天后，替换为造血干/祖细胞诱导培养基，培养2天后，收集细胞进行CD34免疫磁珠分选，收集CD34+细胞接种到造血分化诱导培养基中以便进一步向血系细胞分化，可以在光学显微镜下观察到折光性良好的悬浮生长的细胞(图10A)，它们有的成簇悬浮在培养基中，有的紧挨着呈长梭形或者多边形的内皮样细胞生长。收集在此诱导阶段连续培养5-7天的细胞标记血细胞特异性标志CD43和CD45进行流式分析，结果表明体外诱导iPSC-A向血系细胞分化产生的细胞有42.6％的CD43和17.5％的CD45阳性率，明显优于ES组12.3％的CD43和1.3％的CD45阳性率(图10B)，表明HuAECs来源的iPS细胞更倾向于向生血内皮，进而向血液系细胞分化，可以作为生血内皮细胞、造血干细胞甚至内皮祖细胞的新型源头细胞。
在iPS-A向生血内皮分化后，与造血相关的部分重要基因如Notch配体DLL4、HOXB4和Runx1表达开始上调，与内皮相关的基因如KDR(VEGF受体2)表达也同时上调，证明此诱导分化已进入具有造血和内皮双向分化潜能的生血内皮细胞阶段(图10C)。此外，iPS-A向生血内皮分化后，原本在重编程为诱导性多能干细胞过程中下调表达的内皮相关基因除TIE2外全部显著上调表达(图10D)，再度验证了此源自人脐动脉内皮细胞的诱导性多能干细胞是特异性的TIE2高表达细胞株。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种诱导性多能干细胞，其特征在于，所述诱导性多能干细胞来源于脐动脉内皮细胞且可分化为生血内皮细胞。
2.根据权利要求1所述的诱导性多能干细胞，其特征在于，所述诱导性多能干细胞为非基因组整合式；
任选地，所述诱导性多能干细胞是通过将所述脐动脉内皮细胞重编程而获得的；
任选地，所述重编程包括将携带有重编程因子的仙台病毒转染至所述脐动脉内皮细胞中；
任选地，所述诱导性多能干细胞表达TIE2基因；
任选地，与所述脐动脉内皮细胞相比，下列至少之一的基因在所述诱导性多能干细胞内表达水平下调：CD31基因、CD144基因、vWF基因和TIE1基因；
任选地，所述生血内皮细胞可分化为下列至少之一的细胞：血系细胞、内皮干/祖细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞；
任选地，所述生血内皮细胞可诱导分化为造血干细胞，并可进一步分化为血系细胞，其中，由所述生血内皮细胞向所述血系细胞诱导分化所得到的细胞群中，CD43+细胞含量为35～50％，CD45+细胞含量为15～20％。
3.一种药物，其特征在于，含有脐动脉内皮细胞或权利要求1或2所述的诱导性多能干细胞。
4.权利要求1或2所述的诱导性多能干细胞在制备药物中的用途，其特征在于，所述药物用于治疗心血管相关疾病。
5.一种筛选制剂的方法，所述制剂含有TIE2激酶抑制剂或者TIE2激酶激动剂，其特征在于，包括：
使候选制剂与权利要求1或2所述诱导性多能干细胞接触，确定接触前后所述诱导性多能干细胞中TIE2基因的表达量，
所述TIE2基因表达下调，是所述候选制剂作为含有TIE2激酶抑制剂的制剂的指示；
所述TIE2基因表达上调，是所述候选制剂作为含有TIE2激酶激动剂的制剂的指示。
6.一种试剂盒，其特征在于，含有权利要求1或2所述的诱导性多能干细胞。
7.一种获得权利要求1或2所述诱导性多能干细胞的方法，其特征在于，包括：
对所述脐动脉内皮细胞进行重编程，以便获得所述诱导性多能干细胞；
任选地，获得所述脐动脉内皮细胞的步骤包括：
将填充有Ⅳ型胶原酶溶液的脐带动脉血管进行孵育，收集所得到的消化液中的脐动脉内皮细胞；
任选地，所述Ⅳ型胶原酶溶液浓度为0.5～3mg/mL，所述孵育时间为10～20分钟；
任选地，所述步骤包括：
除去脐带的脐动脉血管内残血，并向所得到的血管内填充1mg/mL的Ⅳ型胶原酶溶液；
封住所述血管两端，在CO2气氛中37℃孵育15分钟，收集血管内的消化液；
将所述消化液进行离心，弃上清，用EGM-2培养基重悬细胞，并将所得到的细胞悬液按照1～5×105个细胞/孔接入孔板，在CO2气氛中37℃孵育，隔天更换培养基，当细胞生长至80～90％细胞汇合时，PBS洗涤细胞一次，用0.25％Trypin-EDTA在37℃消化3～5min，用EGM-2培养基终止消化后，将细胞从所述培养基上吹打下来，收集细胞于15ml离心管中，室温下以1000rpm的转速离心5min，弃上清，以便得到所述脐动脉内皮细胞；
任选地，所述重编程包括将携带有重编程因子的仙台病毒转染至所述脐动脉内皮细胞中。
8.一种生血内皮细胞，其特征在于，是由权利要求1或2所述诱导性多能干细胞分化得到的。
9.一种获得权利要求8所述生血内皮细胞的方法，其特征在于，包括：
将所述诱导性多能干细胞进行预培养；
将所述预培养的细胞进行分化，得到中胚层细胞；
将所述中胚层细胞进行分化，得到所述生血内皮细胞。
10.一种造血干细胞，其特征在于，是通过权利要求8所述生血内皮细胞分化得到的。
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