JP7045363B2 - インビボで血管形成能を有する中胚葉細胞および/または血管内皮コロニー形成細胞様細胞を作製する方法 - Google Patents
インビボで血管形成能を有する中胚葉細胞および/または血管内皮コロニー形成細胞様細胞を作製する方法 Download PDFInfo
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Description
本出願は、2016年8月10日に出願された米国仮特許出願第62/372,907号に基づく利益を主張するものであり、この出願は本明細書の一部を構成するものとして参照によりその全体が援用される。
多能性幹細胞(PSC)を提供する工程;
i)アクチビンA、BMP-4、VEGFおよびFGF-2を含む中胚葉分化培地中で前記多能性幹細胞を約24時間培養すること、および
ii)その後、約72時間にわたって約24~48時間ごとに、工程i)の培地を、BMP-4、VEGFおよびFGF-2を含む中胚葉分化培地に置換すること
を含む、前記多能性幹細胞を中胚葉へと分化誘導する工程;ならびに
iii)中胚葉細胞をソーティングしてKDR+NCAM+APLNR+細胞を選択すること
を含む、前記分化誘導された細胞から前記中胚葉細胞を単離する工程
を含む。
本明細書に記載の細胞集団中の少なくとも1個の細胞を試験薬剤に曝露させること;ならびに
細胞増殖および細胞生存率のうちの1つ以上に対する前記試験薬剤の効果を観察すること
を含む方法を提供する。
本明細書において使用される特定の用語の定義を以下に示す。別段の記載がない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はいずれも、概して、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。
一態様において、本明細書で提供される前記方法は、少なくとも3つの工程、すなわち、
A.多能性幹細胞(PSC)を提供する工程;
B.i)アクチビンA、BMP-4、VEGFおよびFGF-2を含む中胚葉分化培地中で前記多能性幹細胞を約24時間培養すること、およびii)その後、約72時間にわたって約24~48時間ごとに、工程i)の培地を、BMP-4、VEGFおよびFGF-2を含む中胚葉分化培地に置換することを含む、前記多能性幹細胞を中胚葉へと分化誘導する工程;ならびに
C.i)中胚葉細胞をソーティングしてKDR+NCAM+APLNR+細胞を選択することを含む、前記分化誘導された細胞から前記中胚葉細胞を単離する工程
を含む。
D.前記中胚葉細胞をソーティングしてSSEA5-KDR+NCAM+APLNR+細胞を選択する工程;
E.中胚葉へ分化誘導中の前記細胞をFc-NRP-1の共存下で培養する工程;
F.中胚葉へ分化誘導中の前記細胞を、1種以上のmiRNA阻害剤、1種以上のmiRNAミミックまたはその組み合わせの共存下で培養する工程;
G.単離された前記中胚葉細胞を内皮系細胞へと分化誘導する工程;および
H.分化誘導された内皮系細胞からECFC様細胞を単離する工程
のうちの1つ以上の工程をさらに含む。
一態様において、インビトロにおいて、単離された中胚葉細胞集団および/またはECFC様細胞集団を多能性細胞から作製する方法を提供する。本開示の方法での使用に適した多能性細胞は、様々な供給源から得ることができる。たとえば、好適な多能性細胞の一種として、胚盤胞の内部細胞塊に由来する胚性幹(ES)細胞が挙げられる。マウス、アカゲザル、コモンマーモセット、ヒトなどの様々な種類のES細胞を得る方法がよく知られている。本発明の方法において使用されるES細胞の供給源は、たとえば、1種以上の樹立ES細胞株であってもよい。様々なES細胞株が知られており、これらの培養条件および増殖条件は既に確立されている。本明細書に開示される方法において、実質的にあらゆる種類のES細胞またはES細胞株を使用することができるものとする。一実施形態において、前記多能性細胞は、体細胞の再プログラム化によって得られる人工多能性幹(iPS)細胞である。人工多能性幹細胞は様々な公知の方法によって得られている。本明細書に開示される方法において、実質的にあらゆる種類のiPS細胞またはiPS細胞株を使用することができるものとする。別の実施形態において、前記多能性細胞は、紡錘体を除去した卵母細胞にドナー細胞の核を移入することによって行われる体細胞核移植によって得られた胚性幹細胞である。核移植によって幹細胞を作製する様々な方法が知られている。本明細書に開示される方法において、体細胞核移植によって得られる実質的にあらゆる種類のES細胞またはES細胞株を使用することができるものとする。
本明細書に開示された方法の一態様において、インビトロにおいて多能性細胞を中胚葉へと分化誘導する。この工程を「中胚葉へと分化誘導する」工程とも呼ぶ。多能性細胞を中胚葉系細胞へと分化誘導する様々な方法(培養条件を含む)が当技術分野で公知である。本明細書で提供されるプロトコルでは、化学的組成の明らかな培地中で多能性細胞を分化誘導することが好ましい。たとえば、Stemline II無血清造血細胞増殖培地を、中胚葉分化誘導用の基礎培地として使用することができる。また、本明細書で提供されるプロトコルでは、様々な成長因子を使用して多能性細胞の中胚葉系細胞への分化を促進している。たとえば、化学的組成の明らかな分化培地に、アクチビンA、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)、塩基性線維芽細胞増殖因子(FGF-2)および骨形成タンパク質4(BMP-4)を添加し、多能性細胞を中胚葉系細胞へと分化誘導する。
一態様において、中胚葉へ分化誘導された細胞集団からKDR+NCAM+APLNR+細胞を選択して単離する。1種以上の特定の分子マーカーを有する細胞を選択する方法は当技術分野で公知である。たとえば、蛍光活性化セルソーティングや磁気活性化セルソーティングなどのフローサイトメトリー技術を使用して、様々な転写産物の発現に基づき細胞を選択してもよい。
一実施形態において、本明細書で述べているように、中胚葉へ分化誘導中の分化4日目の細胞集団からSSEA5-KDR+NCAM+APLNR+細胞を選択する。好ましい一実施形態において、中胚葉へ分化誘導中の細胞集団からSSEA5-KDR+細胞を選択し、次いで選択したSSEA5-KDR+細胞からNCAM+APLNR+細胞を選択することによって、SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+細胞集団を得る。
本発明者らは、中胚葉へ分化誘導中の細胞においてKDRのシグナル伝達を刺激することによって、中胚葉の形成が増加する可能性があると考えた。本明細書で提供されるプロトコルの一実施形態において、アクチビンA含有培地中で24時間分化誘導後、この中胚葉分化培地を、有効量のFc-NRP-1、BMP-4、VEGFおよびFGF-2を含む中胚葉分化培地に置換した。「有効量」とは、多能性細胞の中胚葉系細胞への分化を促進するのに効果的な量を意味する。さらに、有効量のFc-NRP-1、BMP-4、VEGFおよびFGF-2を含む中胚葉分化培地との培地置換を、たとえば約3日間にわたって(すなわちD4まで)1~2日ごとに行ってもよい。本発明者らは、本発明の中胚葉誘導プロトコルにFc-NRP-1を加えることによって、中胚葉の形成が向上することを見出した。少なくとも、NRP-1(Fc-NRP-1はNRP-1の代替として作用する)およびVEGF165(Fc-NRP1または内因性のNRP-1に結合するリガンド)は中胚葉へ分化誘導中の細胞において発現されないことから、この結果は驚くべきものである。VEGF165およびNRP-1は、KDRのシグナル伝達を活性化する分子であることが知られている。しかし、本発明者らの研究では、これらの分子はいずれも、中胚葉への分化誘導中の4日目の細胞において内因性に発現されないことが示された。本発明者らは、KDRのシグナル伝達を活性化することができる可溶性分子(培地添加物として使用することが可能であった)を特定し、これを利用して中胚葉の形成を増強させた。この可溶性分子を使用することによって、ECFC中胚葉細胞の産生を有利に増強することができる。
本明細書で提供されるプロトコルの一実施形態において、中胚葉へ分化誘導中の細胞を、1種以上のmiRNA阻害剤、1種以上のmiRNAミミックまたはその組み合わせに曝露させる。本発明者らは、SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+細胞においてダウンレギュレートされる一連のmiRNA群(miR-221-3p、miR-1271-5p、miR-559、miR-543、miR-361-3p、miR-30d-5p、miR-124-3pおよびmiR-185-5p)と、SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+細胞においてアップレギュレートされる一連のmiRNA群(miR-330-5p、miR-145-5p、miR-214-3pおよびmiR-497-5p)を特定した。本発明者らは、SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+細胞においてアップレギュレートされる特定のmiRNAを模倣する1種以上の薬剤を、中胚葉へ分化誘導中の細胞にトランスフェクトすると、PSCから発生するSSEA5-KDR+NCAM+APLNR+細胞の頻度が増加することを見出した。また、本発明者らは、SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+細胞においてダウンレギュレートされることが特定された特定のmiRNAを抑制する1種以上の薬剤を、中胚葉へ分化誘導中の細胞にトランスフェクトすると、PSCから発生するSSEA5-KDR+NCAM+APLNR+細胞の頻度が増加することを見出した。さらに、本発明者らは、miRNA特異的ミミックとmiRNA特異的阻害剤の組み合わせを、中胚葉へ分化誘導中の細胞にトランスフェクトすると、PSCから発生するSSEA5-KDR+NCAM+APLNR+細胞の頻度が増加することを見出した。
本明細書に開示された方法の一態様において、前記単離された中胚葉細胞を内皮へと分化誘導する。中胚葉細胞を内皮系細胞へと分化誘導する様々な方法(培養条件を含む)は当技術分野で公知である。本明細書で提供されるECFC様細胞プロトコルでは、化学的組成の明らかな培地中で内皮細胞へと分化誘導することが好ましい。たとえば、Stemline II無血清造血細胞増殖培地を内皮分化誘導用の基礎培地として使用することができる。また、本明細書で提供されるECFC様細胞プロトコルでは、様々な成長因子を使用して、多能性細胞の内皮系細胞(ECFC様細胞を含む)への分化を促進する。たとえば、化学的組成の明らかな分化培地にVEGF、FGF-2およびBMP-4を添加し、単離された中胚葉細胞を内皮系細胞(ECFC様細胞を含む)へと分化誘導する。
本明細書に開示された方法の一実施形態において、内皮へ分化誘導中の細胞集団からCD31+NRP-1+細胞を選択して単離する。たとえば、一実施形態において、本明細書で述べているように、内皮へ分化誘導中の分化10日目、11日目または12日目の細胞集団からCD31+NRP-1+細胞を選択する。好ましい一実施形態において、内皮へ分化誘導中の分化12日目の細胞集団からCD31+NRP-1+細胞を選択する。本発明者らは、内皮へ分化誘導中の12日目の細胞集団に含まれるNRP-1+細胞の割合(%)が、分化誘導のその他の日の細胞集団と比べて高いことを見出した。
単離された中胚葉細胞集団
一実施形態において、単離されたヒトKDR+NCAM+APLNR+中胚葉細胞集団を提供する。一実施形態において、本明細書で提供される精製されたヒトKDR+NCAM+APLNR+中胚葉細胞集団は、インビトロにおいてhPSCから中胚葉細胞を作製する本発明の方法を使用して作製される。前記集団中に含まれる単離されたKDR+NCAM+APLNR+中胚葉細胞は、ECFC産生能と、インビボでの血管形成能を有する。一実施形態において、前記集団中に含まれるKDR+NCAM+APLNR+中胚葉細胞は、PSCと比較して1つ以上の側板/胚体外中胚葉マーカー(たとえばBMP4、WNT5A、NKX2-5および/またはHAND1)の発現が増加していることをさらなる特徴とする。一実施形態において、前記集団中に含まれるKDR+NCAM+APLNR+中胚葉細胞は、PSCと比較して、中軸中胚葉マーカー(たとえばCHIRDおよび/またはSHH)、沿軸中胚葉マーカー(たとえばPAX1、MEOX1およびTCF15)および/または中間中胚葉マーカー(たとえばGOSR1、PAX2およびPAX8)の1つ以上の発現の増加が見られないことをさらなる特徴とする。
一実施形態において、単離されたヒトNRP-1+/CD31+ECFC様細胞集団を提供する。一実施形態において、本明細書で提供される精製されたヒトNRP-1+/CD31+ECFC様細胞集団は、インビトロにおいてhPSCからECFC様細胞を作製する本発明の方法を使用して作製される。
公知の中胚葉細胞株や過去に報告されているその他の公知の単離された中胚葉細胞とは異なり、後述するように、本明細書に開示された方法を使用して作製された中胚葉細胞はインビトロで作製することができ、インビボでの血管組織の形成に使用して様々に臨床応用することができる。
本明細書の一態様において、細胞移植、細胞補充および/または細胞置換もしくは組織置換に適した方法、細胞および組成物を提供する。この方法は、本明細書で提供される方法によって誘導された中胚葉細胞および/またはECFC様細胞の治療有効量を、前記治療を必要とする対象に提供することを含んでいてもよく、中胚葉細胞および/またはECFC様細胞を提供することによって該対象の治療が行われる。「治療有効量」とは、上皮の修復を必要とする対象の治療に効果的な量を意味する。好ましい一実施形態において、前記上皮の修復は血管上皮の修復である。本明細書で提供される細胞および/または組成物は、中胚葉細胞および/またはECFC様細胞が目的の組織部位に移植または遊走することが可能となり、かつ、たとえば血管などの機能欠損部位を再構築または再生することが可能となるような方法で対象に投与してもよい。
本明細書に開示された中胚葉細胞および/またはECFC様細胞は、中胚葉細胞および/またはECFC様細胞の特性およびこれらの細胞から発生する任意の組織の特性に影響を与える因子(溶媒、低分子薬物、ペプチド、オリゴヌクレオチドなど)や環境条件(培養条件、培養操作など)のスクリーニングに使用することができる。一実施形態において、本開示の中胚葉細胞および/またはECFC様細胞を使用して、たとえば医薬化合物などの試験薬剤をスクリーニングし、内皮の健常性および/または修復に対する試験薬剤の効果を評価することができる。たとえば、スクリーニングは、化合物が内皮細胞に薬理効果をもたらすように設計されていることを理由に行ってもよく、その他の部位に効果をもたらすように設計された化合物が内皮細胞に意図しない副作用を起こす可能性があることを理由に行ってもよい。様々な実施形態において、本明細書に開示された中胚葉細胞および/またはECFC様細胞は、少なくとも、培養された多能性細胞とインビトロで識別できることから、試験薬剤のスクリーニングに特に有用である。これに対して、臍帯血(CB)ECFCは患者の血液から得られる初代細胞であり、以前から公知の単離された中胚葉細胞はインビボにおいて血管形成能を持たない。試験薬剤化合物をスクリーニングするための様々な方法が当技術分野で公知であり、本明細書に開示された中胚葉細胞および/またはECFC様細胞を使用してこのようなスクリーニング方法を実施することができる。
i)本明細書に開示された中胚葉細胞および/またはECFC様細胞に試験薬剤を単独で、またはさらに別の薬剤を併用して組み合わせること;
ii)非処理細胞またはコントロール薬剤で処理した細胞と比較することによって、前記試験薬剤に起因すると認められる前記中胚葉細胞および/またはECFC様細胞の形態学的変化、分子表現型の変化および/または機能活性の変化を測定すること;ならびに
iii)前記試験薬剤の効果を観察された変化と関連付けること
が含まれていてもよい。
一実施形態において、本明細書に開示された方法および細胞を使用するためのキットを提供する。一実施形態において、キットは、1つ以上の密封バイアル中に、本明細書に記載の分化培地および/または増殖培地を含んでいてもよい。一実施形態において、前記キットは、多能性細胞、中胚葉細胞および/またはECFC様細胞などの、本明細書に開示された1種以上の細胞を含んでいてもよい。一実施形態において、前記キットは、1種以上のmiRNAミミック、1種以上のmiRNA阻害剤またはその組み合わせを含んでいてもよい。一実施形態において、前記キットは、Fc-NRP-1を含んでいてもよい。一実施形態において、前記キットは、多能性細胞から中胚葉細胞を作製することに関する説明書を含んでいてもよい。一実施形態において、前記キットは、多能性細胞からECFC様細胞を作製することに関する説明書を含んでいてもよい。一実施形態において、前記キットは、適切な容器および包装材料中に、本発明に使用するための様々な試薬を含んでいてもよい。一実施形態において、前記キットは、適切な容器および包装材料中に、本発明に使用するための1種以上のコントロールを含んでいてもよい。
hPSCの培養:
ヒト胚性幹細胞(hES)細胞株H9(Thomson et al., 1998 Science; 282:1145-1147)および線維芽細胞由来ヒトiPS細胞株(DF19-9-11T)(Yu et al. 2009 Science 324:797-801)は、WiCell Research institute(ウィスコンシン州マディソン)から購入した。hESおよびhiPSCは、マトリゲルでコーティングした10cm2の組織培養ディッシュに入れたmTeSR1完全培地(Stem Cell Technologies)中において5%CO2下、37℃で維持した。細胞播種後、2日目、3日目および4日目に培地を交換した。5日目に細胞を継代した。培地を吸引除去し、ディスパーゼ(2mg/mL、Gibco)含有培地4~5mLをプレートに加え、3~5分間またはプレートの縁のコロニーが剥がれてくるまで37℃でインキュベートした。ディスパーゼ含有培地をプレートから吸引除去し、DMEM-F12(Gibco)で細胞を穏やかに3回洗浄して、残存酵素を除去した。次いで新鮮培地を加え、5mLの使い捨てピペットを使用して、泡を立てないように注意しながら強く洗浄し、かつ掻き取ることによってプレートからコロニーを回収した。回収したコロニーを300×gで5分間遠心分離した。上清を吸引除去し、ペレットをmTeSR1完全培地に再懸濁した。継代前に、10cm2の組織培養ディッシュを30分間かけてマトリゲルでコーティングした。組織培養ディッシュに結合しなかったマトリゲルを除去し、mTeSR1完全培地7mLをディッシュに加えた。mTeSR1培地中に均一に分散させたコロニーを各プレートに加えた。培地が渦を巻かないように注意しながら、ディッシュを数回左右に揺らして細胞をディッシュ内に均一に分散させた。増殖の質および形態学的特徴を評価するとともに、過去の報告(Broxmeyer et al., 2011 Blood; 117:4773-4777)に従ってテラトーマ形成アッセイを実施することによって培養を確認した。
mTeSR1培地中で2日間培養後(-D2)、FGF-2、VEGF165およびBMP4(各10ng/mL)の存在下でアクチビンA(10ng/mL)を添加して24時間培養することによってhPSCを中胚葉系細胞に分化誘導した。翌日(D1)、アクチビンA含有培地を除去し、FGF-2(Stemgent)、VEGF165(R&D)およびBMP4(R&D)を含むStemline II完全培地(シグマ)8mLに置換した。3日目に、培地を新鮮なStemline II分化培地8mLに置換した。4日目に、細胞を回収し、フローサイトメトリーでソーティングして、KNA+中胚葉細胞またはSSEA5-KNA+中胚葉細胞を得た。
4日目にソーティングを行って得られた中胚葉細胞(KDR+NCAM+APLNR+またはSSEA5-KDR+NCAM+APLNR+)を、FGF-2(Stemgent)、VEGF165(R&D)およびBMP4(R&D)を含むStemline II完全培地(シグマ)8mLでさらに培養し、6日目、8日目、10日目および12日目に培地を交換した。10日目以降は培地をStemline II分化培地10mLに交換した。
分化誘導後12日目に、TrypLEを使用して接着細胞を回収し、EGM-2培地に懸濁して単一細胞懸濁液とした。細胞をカウントし、抗体染色を行うために細胞懸濁液の一部を前処理した。抗体の非特異的結合を阻止するため、FcRブロッキング試薬(ミルテニーバイオテク)を加えた。抗ヒトCD31抗体(CD31-FITC、BD Pharmingen社から入手したクローンWM59)、抗ヒトCD144抗体(CD144-PE、eBioscience社から入手したクローン16B1)および抗ヒトNRP-1抗体(NRP-1-APC、ミルテニーバイオテク社から入手したクローンAD5-176)を、使用前に滴定により決定した濃度で使用した。ヨウ化プロピジウム(PI、シグマ)を細胞懸濁液に加え、死細胞を染色した。LSR II(ベクトン・ディッキンソン)を使用してフローサイトメトリーによる細胞表面抗原の検出を行い、FACSAria(ベクトン・ディッキンソン)を使用して細胞のソーティングを行った。蛍光補正(コンペンセーション)は、臍帯血由来ECFCを使用した単一陽性コントロールを使用して設定した。標的細胞集団のゲーティングは、各蛍光色のfluorescent minus one(FMO)コントロールに基づいて行った。
CD31+、CD144+またはKDR+およびNRP-1+に基づきソーティングした細胞を300×gで5分間遠心分離し、EGM-2培地とStemline II分化用完全培地を50%:50%の割合で混合した培地中に再懸濁した。ソーティングにより得られたこの細胞集団からECFCを作製するため、ラット尾由来I型コラーゲンをコーティングした12ウェルプレートに1ウェルあたり2500個の密度で播種した。2日後に培地を吸引除去し、EGM-2培地と分化培地を3:1の比率で混合した培地を培養に加えた。7日目に、強固に接着している細胞としてECFCコロニーが発生し、敷石状の形態を示した。場合に応じて、クローニングシリンダーを使用して不均一な細胞集団からECFCコロニーを単離した。過去の報告(Yoder et al., 2007; Ingram et al., 2005)に従って、内皮細胞小塊のクローニングを行い、増殖性の高い純粋な内皮細胞集団を単離した。過去の報告(Yoder et al., 2007; Ingram et al., 2005)に従って、コンフルエントに達したECFCを1cm2あたり10,000個の播種密度で播種して継代し、内皮細胞増殖用完全培地(コラーゲンコーティングプレートおよびcEGM-2培地)中でECFCを維持し、1日おきに培地を交換した。
ECFCを4%(w/v)パラホルムアルデヒドで30分間固定し、0.1%(v/v)TritonX-100含有PBSで細胞膜透過処理を5分間行った。10%(v/v)ヤギ血清で30分間ブロッキング後、抗CD31抗体(Santa Cruz)、抗CD144抗体(eBioscience)、抗NRP-1抗体(Santa Cruz)および抗α-SMA抗体(Chemicon)を一次抗体として加え、4℃で一晩インキュベートした。PBSで細胞を洗浄後、Alexa-488またはAlexa-565(Molecular Probe)で標識した二次抗体を加えてインキュベートし、2g/ml DAPI(シグマ アルドリッチ)で対比染色した後、共焦点顕微鏡で可視化した。共焦点画像は、オリンパス社製uplanSApo対物レンズ(60×W/1.2NA/eus)を備えたオリンパス社製FV1000 mpE共焦点顕微鏡を使用して撮影した。画像はいずれも室温においてそれぞれ厚さ10μmのZスタック画像として取得し、FV10-ASW 3.0 Viewerを使用して分析した。
動物実験はいずれも、実験動物の管理と使用に関する指針に従って実施し、インディアナ大学医学部の動物実験委員会(IACUC)によって承認されたものであった(IACUCプロトコル#10850)。いずれの動物実験においても、6~12週齢の雄性および雌性のNOD/SCIDマウス(T細胞およびB細胞が欠損しており、補体系に異常を示すマウス)を使用した。このNOD-SCIDマウスは、インディアナ大学のLaboratory Animal Resource Center(LARC)において特定病原体不在条件で飼育した。過去の研究では、統計学的に有意な結果を得るために最低限必要な動物の数を決定するために、この動物モデルが使用された(Yoderら、2007)。過去の研究では、移植した10個のマトリックス(1匹のマウスにつき2個のマトリックスを移植)のうち、8個のマトリックスが宿主の血管と接合したこと、統計学的有意差を得るには、機能性血管を備えた8個のマトリックス(4匹のマウス)が各群に必要であることが示されている(Yoderら、2007)。各実験群に試料およびマウスを割り当てる際、無作為化は行わなかった。さらに、実験中およびアウトカムの評価において、各群への割り当ての際に盲検化は行わなかった。
過去の報告(Critserら、2010)に従って、ブタ皮膚I型コラーゲンを使用して、細胞が播種された三次元(3D)コラーゲンマトリックスを作製した。簡潔に説明すると、氷冷ブタ皮膚コラーゲン溶液と10%v/vヒト血小板溶解物の0.01N HCl溶液とを混合してI型コラーゲンゲル混合物を調製し、リン酸緩衝生理食塩水と0.1N NaOHで中和してpHを中性(7.4)とした。中和したゲル混合物(約1.5mg/mL)を氷冷し、5%CO2下37℃で加温して重合反応を誘導した。最終濃度がコラーゲン1mLあたり400万個となるように、KNA+中胚葉細胞またはSSEA-KNA+中胚葉細胞またはSSEA-KNA+由来NRP-1+CD31+ECFCをコラーゲン混合物に加えた。細胞懸濁液を含むコラーゲン混合物(250μL)を48ウェル組織培養ディッシュに加え、CO2インキュベーター内において37℃で30分間インキュベートすることによって重合させ、ゲルを形成させた。次いで、得られたゲルを500μLの培地に載せ、5%CO2下37℃で30分間培養した。エクスビボでの3D培養を1時間行った後、過去の報告(Yoder、2007#71)に従って、細胞が播種されたゲルを6~12週齢のNOD/SCIDマウスの脇腹(宿主の血管に隣接した前腹壁を鈍的に切開した皮下ポケット)に移植した。コラーゲンゲルを移植するためのこの外科手術は、麻酔下で一定量の酸素を供給しながら行った。切開を縫合し、マウスの回復を観察した。移植後の様々な時点(経過日数)において、承認されたIACUCプロトコルに従って人道的に屠殺したマウスから移植片を切除し、ゲルを回収した。過去の報告に従い、H&E染色ならびに抗ヒトCD31(およびNRP-1)染色を使用して、共焦点蛍光イメージングおよび免疫組織化学分析を行うことによりゲルを観察し、マウス赤血球で満たされ、かつヒト内皮細胞で覆われた血管の有無を確認した。Spot-KEデジタルカメラ(Diagnostic Instruments)を取り付けたライカDM 4000B顕微鏡(ライカマイクロシステムズ)を使用して、各外植片のhCD31+血管のイメージングを行った。少なくとも1個のマウス赤血球を含んでいた血管のみを機能性血管としてカウントした。オリンパス社製FV-1000 MPE倒立共焦点/2Pシステムを使用してNRP-1+CD31+血管を観察した。
逆転写酵素(RT)反応はGeneAmp PCR 9700サーマルサイクラー(アプライドバイオシステムズ)を使用して行った。mRNAのRT反応はTranscriptor Universal cDNA Master(ロシュ)を使用して行った。目的とする特定のmiRNAは、特異的なmiRNAプライマーを使用してcDNAを作製した。テンプレートやプライマーを使用せずに行ったRT反応をコントロールとして使用した。遺伝子発現量およびmiRNA発現量はABI 7300 RT-PCRシステム(アプライドバイオシステムズ)を使用して定量した。mRNAの定量PCRはFastStart Universal SYBR green master (Rox)(ロシュ)を使用して行った。リアルタイムPCRによる比較定量法は、miRNAまたはmRNAに特異的なプライマーを使用して、あるいはこれらを使用せずに三連で行った。mRNAの定量では、95℃で10分間の反応後、95℃15秒、60℃1分間を40サイクルで反応を行った。miRNAの定量では、95℃15秒、60℃1分間を40サイクルで反応を行った。相対発現量は比較Ct法(Leeら、2013)を使用して算出した。
KNA+またはSSEA5-KNA+の中胚葉細胞に由来するECFCの単一細胞アッセイを行い、クローン増殖能を評価した。簡潔に説明すると、内皮細胞をTrypLE Express(インビトロジェン)で処理して単一細胞懸濁液を得た。細胞数をカウントし、段階希釈を行って、96ウェル培養プレートの各ウェルに1ウェルあたり0.68個の細胞が含まれるように濃度を調整した。細胞を播種した翌日にウェルを観察し、1ウェルに1個の細胞が入っていることを確認した。4日目、8日目および12日目に培地を交換した。培養の14日目に、Sytox試薬(インビトロジェン)で細胞を染色し、蛍光顕微鏡観察して各ウェルの細胞数を計測した。10倍のCP-ACHROMAT(0.12NA)対物レンズを備えたツァイス社製Axiovert 25 CFL倒立顕微鏡を使用して10倍で蛍光顕微鏡観察し、2個以上の細胞を含むウェルを増殖陽性として特定した。過去の報告(Yoder et al., 2007; Ingram et al., 2005)に従って、ウェル中に2~50個の内皮細胞を含んでいたものを内皮細胞小塊(ECC)として分類し、ウェル中に51~500個の内皮細胞を含んでいたものを低増殖能ECFC(LPP)として分類し、ウェル中に501~2000個または2001個以上の内皮細胞を含んでいたものを高増殖能ECFC(HPP)として分類した。
溶解バッファー(20mM Tris-HCl pH 7.5、150mM NaCl、10%グリセリン、1%TritonX-100、2mM EDTA、1mM Na3VO4、1μg/mlアプロチニンおよび1μg/mlロイペプチン)中に細胞を再懸濁して細胞溶解物を調製し、氷上で20分間インキュベートした。12,000×gで15分間遠心分離して不溶性成分を除去した。タンパク質濃度はタンパク質測定キット(バイオ・ラッド)で測定した。4~20%トリス-グリシンミニゲル上でタンパク質を電気泳動により分離し、イモビロン-FL PVDF膜(ミリポア)に転写した。ブロッキングバッファーを使用して室温で1時間インキュベートして非特異的結合を阻止し、Odysseyブロッキングバッファー中の抗リン酸化PYK2一次抗体(1:1,000;Cell Signaling)および抗リン酸化p130Cas一次抗体(1:1,000;Cell Signaling)を加えて4℃で一晩インキュベートした。0.1%Tween20含有PBSでブロットを洗浄し、抗ウサギ抗体(1:10,000;LI-COR)を加えて室温で1時間インキュベートした。Odyssey Infrared Imager(LI-COR)を使用して免疫反応バンドを検出した。
mTeSR1培地中でhiPSC細胞塊を2日間培養後(-D2)、FGF-2、VEGF165およびBMP4(各10ng/mL)の存在下でアクチビンA(10ng/mL)を添加して24時間培養することによってhiPSCを中胚葉系細胞に分化誘導した。翌日(D1)、アクチビンA含有培地を除去し、FGF-2(Stemgent)、VEGF165(R&D)、BMP4(R&D)および500ng/mL Fc-NRP-1(R&D)を含むStemline II完全培地(シグマ)8mLに置換した。3日目に、FGF-2(Stemgent)、VEGF165(R&D)、BMP4(R&D)および500ng/mL Fc-NRP-1(R&D)を含む新鮮なStemline II分化培地8mlに置換した。4日目に、細胞を回収し、フローサイトメトリーでソーティングして、SSEA5-KNA+中胚葉細胞を得た。
Trizol試薬(インビトロジェン)を使用して試料からトータルRNAを単離し、過去の報告(Ginsberg et al., 2012, Cell 151:559-575)に従ってRNAの質を調査した。miRNAマイクロアレイは、miRNome miRNA PCRアレイプレート、miScript II Reverse Transcription reaction kitおよびmiScript SYBR Green PCR Kit(いずれもキアゲン社から入手)を使用して実施し、miRBase(リリース16)に基づいてアノテーションされたヒトmiRNAゲノム(miRNome)において最も豊富に発現しており、最も特徴が解析されている1008個のmiRNA配列の発現プロファイルを調査した。RNA-seq解析では、過去の報告(Ginsbergら、2012)に従って、高品質トータルRNA1μgを使用してRNA配列ライブラリを作製し、イルミナ社製HiSeq2000シーケンサーを使用してシーケンシングを行った。TopHatをデフォルトパラメータで使用して、得られたリード配列をヒトゲノム(hg18)にマッピングし、CuffLinksを使用してRefSeq(2010年6月)に登録されている転写産物の転写量(FPKM)を定量した。
mTeSR1培地中でhiPSCの単一細胞懸濁液を1日培養後(D1)、6ウェルプレート(GE Dharmacon)の各ウェルにhiPSCを100,000個/ウェルの密度で播種し、1ウェルあたり2.5μgのmiRNAミミックまたはmiRNA阻害剤とFGF-2、VEGF165およびBMP4(各10ng/mL)の存在下でアクチビンA(10ng/mL)を添加して24時間培養することによってhiPSCを中胚葉系細胞に分化誘導した。翌日(D1)、アクチビンAとmiRNAミミックまたはmiRNA阻害剤とを含む培地を除去し、FGF-2(Stemgent)、VEGF165(R&D)およびBMP4(R&D)を含むStemline II完全培地(シグマ)2mLに置換した。2日目に、FGF-2(Stemgent)、VEGF165(R&D)およびBMP4(R&D)ならびにmiRNAミミックまたはmiRNA阻害剤2.5μgを含む新鮮なStemline II分化培地2mlに置換した。3日目に、FGF-2(Stemgent)、VEGF165(R&D)およびBMP4(R&D)を含む新鮮なStemline II分化培地2mlに置換した。4日目に、細胞を回収し、フローサイトメトリーでソーティングして、SSEA5-KNA+中胚葉細胞を得た。
実験はすべて三連で3回以上行い、データは平均値±SDで示して統計比較を行った。信頼区間を95%とした検定力分析を使用して、統計学的に有意な結果を得るために必要な標本数を算出した。使用した標本数は正規分布を示した。差の有意性は、スチューデントの両側t検定、または一元配置分散分析後にポストホックテストとしてTukey法を実施した多重比較検定により評価した。
4日目(D4)のKDR+中胚葉細胞(KNA+中胚葉)に含まれるNCAMおよびAPLNRを共発現する細胞から、ECFCの能力を持ったNRP-1+CD31+内皮細胞が生じた。図1A~1Gを参照されたい。
Claims (12)
- 単離されたヒトKDR+NCAM+APLNR+中胚葉細胞集団をヒト多能性幹細胞から作製する方法であって、
(a)多能性幹細胞(PSC)を提供する工程;
(b)i)アクチビンA、BMP-4、VEGFおよびFGF-2を含む中胚葉分化培地中で前記多能性幹細胞を24時間培養すること、および
ii)その後、72時間にわたって24~48時間ごとに、工程i)の培地を、BMP-4、VEGFおよびFGF-2を含む中胚葉分化培地に置換すること
を含む、前記多能性幹細胞を中胚葉へと分化誘導する工程;ならびに
(c)iii)中胚葉細胞をソーティングしてKDR+NCAM+APLNR+細胞を選択すること
を含む、前記分化誘導された細胞から前記中胚葉細胞を単離する工程
を含み、
前記工程(b)において、前記多能性幹細胞をmiR-221-3p阻害剤、miR-1271-5p阻害剤およびmiR-559阻害剤からなる群から選択される1種以上のmiRNA阻害剤と接触させること、ならびに/またはmiR-330-5pミミック、miR-145-5pミミックおよびmiR-214-3pミミックからなる群から選択される1種以上のmiRNAミミックと接触させることを含む方法。 - 前記ソーティングが、SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+細胞を選択することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記中胚葉への分化誘導が、前記工程(b)において、中胚葉へ分化誘導中の前記細胞をFc-NRP-1と接触させることをさらに含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記Fc-NRP-1を工程(b)ii)の中胚葉分化培地に添加する、請求項3に記載の方法。
- 前記中胚葉への分化誘導が、前記工程(b)において、前記多能性幹細胞をmiR-221-3p阻害剤、miR-1271-5p阻害剤およびmiR-559阻害剤からなる群から選択される1種以上のmiRNA阻害剤と接触させることを含み、該1種以上のmiRNA阻害剤によって、PSCと比較してSSEA5-KDR+NCAM+APLNR+中胚葉細胞において低発現しているmiRNAが抑制される、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記中胚葉への分化誘導が、前記工程(b)において、前記多能性幹細胞をmiR-330-5pミミック、miR-145-5pミミックおよびmiR-214-3pミミックからなる群から選択される1種以上のmiRNAミミックと接触させることを含み、該1種以上のmiRNAミミックが、PSCと比較してSSEA5-KDR+NCAM+APLNR+中胚葉細胞において高発現しているmiRNAを模倣する、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記中胚葉への分化誘導が、前記工程(b)において、前記多能性幹細胞をmiR-214ミミックと接触させることを含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記単離されたヒトKDR + NCAM + APLNR + 中胚葉細胞集団が、哺乳動物に移植された場合に血管形成能を示す、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1~8のいずれか一項に記載の方法で単離されたヒトKDR + NCAM + APLNR + 中胚葉細胞集団を作製し、前記中胚葉細胞集団を内皮へと分化誘導する工程をさらに含み、該工程が、
(a)前記単離された中胚葉細胞を、BMP-4、VEGFおよびFGF-2を含む内皮分化培地中で6~8日間培養すること、ならびに
(b)内皮へ分化誘導された前記細胞から、敷石状の形態を示すCD31+NRP-1+血管内皮コロニー形成細胞様(ECFC様)細胞を単離すること
を含む、ECFC様細胞の作製方法。 - 前記単離されたECFC様細胞が、CD144+、KDR+およびα-SMA-のうちの1つ以上の発現をさらなる特徴とする、請求項9に記載の方法。
- 前記内皮への分化誘導工程を、共培養細胞、胚様体の形成および外因性TGF-βの抑制のうちの1つ以上が存在しない条件で行う、請求項9または10に記載の方法。
- 前記単離されたECFC様細胞が、共移植細胞の非存在下で哺乳動物に移植された場合に血管形成能を示す、請求項9~11のいずれか一項に記載の方法。
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