KR20120051907A

KR20120051907A - 유도만능줄기세포를 ｃｄ３４ 양성 세포로 분화시키는 방법

Info

Publication number: KR20120051907A
Application number: KR1020100113264A
Authority: KR
Inventors: 한용만; 박상욱
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2010-11-15
Filing date: 2010-11-15
Publication date: 2012-05-23

Abstract

본 발명은 유도만능줄기세포(humnan induced pluripotent stem cells)에서 ＣＤ３４ 양성 세포로 분화시키는 방법에 관한 것으로서, 구체적으로 유도만능줄기세포의 에 MEK/ERK 신호전달 억제제와 BMPs를 처리하여, 중배엽 세포로 분화시킨 후, 상기 분화된 중배엽 세포에 VEGF와 bFGF를 처리하였을 때, CD34 양성세포로 분화되었으며, 상기 CD34 양성세포는 체외 및 체내에서 혈관을 형성하는 효과가 있음을 확인하였다.

Description

유도만능줄기세포를 ＣＤ３４ 양성 세포로 분화시키는 방법{Method for inducing differentiation of induced pluripotent stem cells into CD３４ positive cells}

본 발명은 MEK/ERK 신호전달 억제제 및 BMP를 포함하는 유도만능줄기세포 분화 유도용 조성물, 및 상기 조성물을 이용하여 유도만능줄기세포로부터 CD34 양성세포로의 분화를 유도하는 방법에 관한 것이다.

줄기세포(stem cell)란 조직을 구성하는 각 세포로 분화되기 전단계의 세포로서, 미분화 상태에서 무한 증식이 가능한 자가증식능과 특정 분화 자극에 의해 다양한 조직의 세포로 분화될 수 있는 잠재적 가능성인 다분화능을 가진 세포를 말한다. 즉, 배양을 계속하여도 자가증식 능력이 떨어지지 않고 유지되며, 여러 종류의 세포로 분화가 가능해야 한다.

줄기세포는 분화 가능성에 따라 크게 배아 줄기세포(embryonic stem cell; ES cell)와 성체 줄기세포(adult stem cells)로 나뉜다. 정자와 난자가 만나 수정된 후 발생과정이 일어나고 형태형성을 하게 되는데 이때 세포는 증식, 이동, 분화 과정을 겪게 된다. 배아 줄기세포는 수정란이 형성된 후 자궁내막에 착상하기 전의 매우 초기 단계인 포배기(blastocyst) 배아 중 태아로 발생할 세포괴(inner cell mass; ICM)로부터 분리해낸 줄기세포로서, 내배엽, 외배엽 및 중배엽의 3개의 배엽(embryonic germ layer)에 의해 생성되는 모든 조직의 세포로 분화될 수 있는 잠재력이 있는(pluripotent) 세포이다.

반면, 성체 줄기세포는 발생과정이 끝난 성인 또는 배아 발생 과정이 진행되어 배아의 각 장기가 형성되는 단계에 태반에서 얻어지는, 각 장기에 특이적인 줄기세포로서, 그 분화능이 일반적으로 그 조직을 구성하는 세포로만 한정되게(multipotent) 된다. 이러한 성체 줄기세포는 성인이 된 후에도 대부분의 장기에 남아 정상적으로 혹은 병리적으로 발생하는 세포의 손실을 보충하는 역할을 한다. 대표적인 성체 줄기세포로는 골수(bone marrow)에 존재하는 조혈 줄기세포(hematopoietic stem cell)와 혈구 세포 이외의 결합조직(connective tissue) 세포로 분화되는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)가 있다. 조혈 줄기세포는 적혈구, 백혈구 등 각종 혈구 세포로 분화되고, 중간엽 줄기세포는 골아세포(osteoblast), 연골아세포(chondroblast), 지방 세포(adipocyte) 및 근아세포(myoblast) 등으로 분화된다.

최근에는 인간으로부터의 배아 줄기세포 분리가 성공한 이후, 그 임상적 적용에 관심이 고조되고 있다. 줄기세포의 적용분야로서 가장 주목받고 있는 것은 세포 대체 요법(cell replacement therapy)을 위한 완벽한 세포 공급원으로서의 이용이다. 난치병으로 알려진 파킨슨씨병, 알쯔하이머와 같은 신경퇴행성 질환, 척추 손상에 의한 사지마비, 백혈병, 중풍, 소아당뇨병, 심근경색, 간경화 등의 질환은 조직을 구성하는 세포의 파괴 및 영구적 기능 장애에 의해 초래되는데, 이들 질환에 의해 파괴되어 부족한 세포를 외부로부터 공급해주는 세포 대체 요법이 효과적인 치료법으로 제시되고 있다.

MEK(mitogen-activated protein kinase kinase)는 세포질 내의 MAP 카이네이즈 신호전달계 말단에 작용하는 효소로서 세포 밖의 신호를 핵 내부로 전달하는 중요한 매개체 역할을 하며, 미엘린 기저 단백질(myelin basic protein)의 트레오닌(Thr) 잔기를 시험관 내에서 인산화(phosphorylation)시킨다. ERK는 고등생물에 존재하는 대표적인 MAP 카이네이즈로서 외부 신호에 의해 트레오닌(Thr)과 티로신(Tyr) 잔기를 인산화시킨다. 이와 같은 트레오닌과 티로신 잔기의 인산화는 MAP 카이네이즈 활성화에 결정적인 역할을 하므로, 이들 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환될 경우에는 효소가 활성화되지 않는다는 것이 보고되었다.

배아줄기세포로부터 혈관모세포로 분화 유도하는 기술로는 배아줄기세포를 VEGF, bFGF, IGF(insulin-like growth factor) 및 EGF(epidermal growth factor)를 포함한 배지에서 배양하여 내피세포(endothelial cell)로 분화 유도하는 방법(국제공개특허 WO 03/040319), 배아줄기세포를 SCF(stem cell factor), FLT-3 리간드, IL-3, IL-6 및 G-CSF(granulocyte colony stimulating factor)로부터 선택된 조혈성장인자(hematopoietic growth factor)를 포함한 환경에서 배양하여 조혈세포주(Hematopoietic lineage)를 생산하는 방법(미국공개특허 US2003/0153082), 인간 배아체를 인간 태반기질세포와 복합배양하여 인간 배아체를 조혈모세포로 분화 유도하는 방법(국내특허출원 제10-2006-0009934호) 및 인간 배아체를 인간 골수기질세포와 복합배양하여 인간 배아체를 조혈모세포로 분화 유도하는 방법(국내특허출원 제10-2004-0097538호) 등이 있다. 그러나, 현재까지 배아줄기세포의 신호전달체계 조절을 통하여 혈관모세포로 분화 유도하려는 시도에 관해서는 전혀 알려진 바가 없다.

유도만능줄기세포는 성체세포의 재프로그램을 통해 만들어지며 외견상으로는 배아줄기세포 와 구분되지 않는다. 이 두 가지 형태의 세포는 만능세포로서 신체에서 어떤 조직으로도 발전될 수 있으나, 차이점을 가지고 있다. 상기 두 종류의 줄기세포의 능력을 비교하는 연구를 통해서 유도만능줄기세포는 배아줄기세포보다 그 ‘다능성’이나 ‘줄기성 (stemness)’에서 차이가 있다는 것이 밝혀졌다(Hu, BY. et al. Proceedings of the National Academy of Sciences 107 (9): 4335-4340). 또한, 유도만능줄기세포와 배아줄기세포의 유전자 발현에 있어서의 차이점이 존재한다는 연구 결과가 발표된 바 있다(Chin, MH. et al. Cell Stem Cell. 2009).

본 발명에서 사용한 배아줄기세포는 착상 전 배아의 내부세포괴(inner cell mass)에서 추출하여, 체외에서 배양한 세포를 말하고, 유도만능줄기세포는 성인의 체세포에, OCT4(octamer-binding transcription factor 4), SOX2(SRY (sex determining region Y)-box 2), c-MYC, KLF4(Krueppel-like factor 4) 등 4가지 전사인자들을 도입하여 과발현시켰을 때, 배아줄기세포와 유사한 기능을 갖는 세포로 역분화된 세포를 말한다. 즉, 배아줄기세포와 유사하게, 분화전능성(pluripotency)과 자가재생산(self-renewal)의 기능을 갖게 된다.

이에, 본 발명자는 유도만능줄기세포포의 신호전달체계를 조절하여 보다 효율적으로 유도만능줄기세포를 CD34 양성세포로 분화 유도할 수 있는 방법을 찾고자 예의 노력한 결과, 유도만능줄기세포에 MEK/ERK신호전달억제제 및 BMP를 처리하면 높은 효율로 중배엽 세포로 분화 유도시킬 수 있음을 발견하였고, 나아가 상기 방법으로 분화된 중배엽 세포에 VEGF 및 bFGF를 처리하면 CD34 양성세포로 분화시킬 수 있으며, 상기 CD34 양성 세포에 VEGF 및 bFGF를 처리하였을 때, 혈관내피세포로 분화되며, 상기 혈관내피세포는 시험관 내(in vitro)에서 혈관 세포 특이적 마커를 발현하며, 후족부 허혈성 마우스 모델에서 혈관을 생성시키는 효과가 있음을 발견함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 유도만능줄기세포(human induced pluripotent stem cell) 분화 유도용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 유도만능줄기세포를 CD34 양성 세포로 분화하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 MEK/ERK(mitogen-activated protein kinase kinase/extracellular regulated kinase) 신호전달 억제제 및 BMP(bone morphogenetic protein)를 포함하는 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell) 분화 유도용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 유도만능줄기세포로부터 CD34 양성세포로 분화 유도 방법을 제공한다:

1) 유도만능줄기세포를 MEK/ERK 신호전달 억제제 및 BMP의 존재 하에 배양하여 중배엽 세포롤 분화시키는 단계; 및

2) 단계 1)의 중배엽 세포를 VEGF 및 bFGF 존재하에 배양하는 단계를 포함하는 단계를 포함하는, 유도만능줄기세포로부터 CD34 양성세포로 분화 유도 방법.

아울러, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 유도만능줄기세포를 혈관내피세포로 분화 유도하는 방법을 제공한다:

2) 단계 1)의 중배엽 세포를 VEGF 및 bFGF 존재하에 배양하는 단계를 포함하는 단계를 포함하는, 유도만능줄기세포로부터 혈관내피세포로 분화 유도 방법.

본 발명에 따른 MEK/ERK 신호전달 억제제 및 BMP를 포함하는 유도만능줄기세포(human iduced pluripotent stem cell, hiPSC) 분화 유도용 조성물을 이용하여 본 발명자들에 의해서 제조된 유도만능줄기세포를 배양하였을 때, 중배엽 특이적으로 분화가 유도되었으며, 중배엽으로 유도된 세포는 CD34 양성세포로의 분화가 이루어졌으며, 상기 CD34 양성 세포는 혈관내피세포로 분화되어 혈관내피세포 특이적인 유전자 마커를 발현시키고, 허혈성 마우스 모델의 후족부에 hiPSC로부터 유래분화된 CD34 양성세포를 주입하였을 때, 실제 혈관을 생성하는 혈관세포로의 분화가 유도되므로, 본 발명에 따른 분화 유도용 조성물을 유도만능줄기세포의 CD34 양성 세포로의 분화에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 유도만능줄기세포(hiPSC, Human pluripotent stem cell)로부터 CD34 양성세포 및 혈관내피세포(Endothelial cells)로 분화유도하는 순차적 방법을 나타낸 그림이다.
도 2는 MEK/ERK 신호전달 억제제와 BMPs를 처리하여 중배엽 세포로의 분화방법을 나타낸 그래프이다:
도 2의 A는 중배엽 특이적 표시 유전자인 T(BRACHYURY)와 WNT3가 MEK/ERK 신호전달 억제제(PD98059)와 BMP를 함께 처리하였을 때, 이들을 각각 처리하였을 때에 비하여 현저히 높게 발현되는 것을 확인한 그래프이다;
control: 조건 배지(conditioned medium)에서 5일간 배양한 유도만능줄기세포;
PD: 비조건 배지(unconditioned medium)에서 MEK/ERK 신호전달 억제제인 PD98059를 20 ~ 50μM를 첨가하여 5일간 배양한 유도만능줄기세포;
B4: 비조건 배지(unconditioned medium)에서 BMP-4를 10 ~ 20 ng/㎖을 첨가하여 5일간 배양한 유도만능줄기세포;
PDB4: 비조건 배지(unconditioned medium)에 20 ~ 50μM의 PD98059와 10 ~ 20 ng/㎖의 BMP-4를 함께 첨가하여 5일간 배양한 유도만능줄기세포;
도 2의 B는 내배엽 특이적 표시 유전자인 FOXQ1과 FOXA2의 발현을 확인한 그래프이다;
control: 조건 배지(conditioned medium)에서 5일간 배양한 유도만능줄기세포;
PD: 비조건 배지(unconditioned medium)에서 MEK/ERK 신호전달 억제제인 PD98059를 20 ~ 50μM를 첨가하여 5일간 배양한 유도만능줄기세포;
B4: 비조건 배지(unconditioned medium)에서 BMP-4를 10 ~ 20 ng/㎖을 첨가하여 5일간 배양한 유도만능줄기세포;
PDB4: 비조건 배지(unconditioned medium)에 20 ~ 50μM의 PD98059와 10 ~ 20 ng/㎖의 BMP-4를 함께 첨가하여 5일간 배양한 유도만능줄기세포;
도 2의 C는 외배엽 특이적 표시 유전자인 SOX1과 PAX6의 발현을 확인한 그래프이다;
control: 조건 배지(conditioned medium)에서 5일간 배양한 유도만능줄기세포;
PD: 비조건 배지(unconditioned medium)에서 MEK/ERK 신호전달 억제제인 PD98059를 20 ~ 50μM를 첨가하여 5일간 배양한 유도만능줄기세포;
B4: 비조건 배지(unconditioned medium)에서 BMP-4를 10 ~ 20 ng/㎖을 첨가하여 5일간 배양한 유도만능줄기세포; 및
PDB4: 비조건 배지(unconditioned medium)에 20 ~ 50μM의 PD98059와 10 ~ 20 ng/㎖의 BMP-4를 함께 첨가하여 5일간 배양한 유도만능줄기세포.
도 3은 유도만능줄기세포를 조건 배지(conditioned medium)에서 배양한 후 면역염색방법을 이용하여 중배엽세포로의 분화를 확인한 그림이다:
Control: 조건 배지(conditioned medium)에서 5일간 배양한 유도만능줄기세포;
PDB4: 비조건 배지(unconditioned medium)에 20 ~ 50μM의 PD98059와 10 ~ 20 ng/㎖의 BMP-4를 함께 첨가하여 5일간 배양한 유도만능줄기세포;
Tra-1-81: 배아줄기세포특이적 마커(배아성 줄기세포 표면항원, Tumor rejection antigen 1-81);
AP: 배아줄기세포특이적 마커(알칼린 포스파타제, Alkaline phosphatase);
SSEA-4: 배아줄기세포특이적 마커(stage-specific embryonic antigen-3); 및
T: 중배엽세포특이적 마커(BRACHYURY).
도 4는 유도만능줄기세포로부터 분화유도된 중배엽세포의 혈관내피세포로의 분화유도를 나타낸 그래프이다:
도 5는 유도만능줄기세포 유래의 CD34양성세포의 혈관 내피세포로의 분화를 FACS를 이용하여 확인한 그래프이다:
CD31-PE: CD31항체에 피코에리트린(Phycoerythrin, PE)이 붙어있는 항체; 및
CD105-APC: CD105항체에 알로피코시아닌(Allophycocyanin, APC)가 붙어있는 항체.
도 6은 유도만능줄기세포 유래의 CD34양성세포의 혈관 내피세포로의 분화를 면역 염색방법을 이용하여 확인한 그래프이다:
CD31: 혈관내피세포 특이적 마커;
vWF: 혈관내피세포 특이적 마커인 폰 빌브란트 인자(Von Willebrand factor);
KDR: 혈관내피세포 특이적 마커인 브이이지에프 수용체2 키나아제(VEGFR2 kinase, KDR);
VE-cadherin: 혈관 내피 카데린(Vascular Endothelial Cadherin); 및
DAPI: 4‘,6-디아미디노-2-페닐인돌(4',6-diamidino-2-phenyli).
도 7은 유도만능줄기세포 유래의 혈관내피세포의 기능성 검증을 나타낸 그림이다:
Vascular tube-like structure: 혈관 튜브 유사 구조형성을 확인한 그림; 및
AcLDL: 아세틸화된 저밀도 지질단백질(acetylated low density lipoprotein).
도 8은 후족부 허혈성 모델 마우스(hindlimb ischemia model mice)를 제조한 방법을 나타낸 그림이다.
도 9는 유도만능줄기세포 유래의 CD34양성세포의 치료효과를 확인한 그림이다
근적외선 영상 시스템(near infrared fluorescence imaging system)을 이용하여 CD34 양성 세포를 주입한 마우스에서의 혈류량을 측정한 결과를 나타낸 그림이다;
도 9의 A는 후족부 허혈성 모델 마우스에 유도만능줄기 세포 유래의 CD34 양성 세포를 주입하였을 때, 괴사가 일어나는지를 외관상 관찰한 그림이다;
POD 0: 후족부 허혈성 모델 제작 0일(POD: post operation day);
POD 3: 후족부 허혈성 모델 제작 후 3일;
POD 7: 후족부 허혈성 모델 제작 후 7일;
도 9의 B는 후족부 허혈성 모델 마우스에 유도만능줄기 세포 유래의 CD34 양성세포를 주입하였을 때의 마우스의 혈류량 변화를 확인한 그림이다;
POD 0: 후족부 허혈성 모델 제작 0일(POD: post operation day);
POD 3: 후족부 허혈성 모델 제작 후 3일; 및
POD 7: 후족부 허혈성 모델 제작 후 7일.

이하, 본 발명에서 사용한 용어를 설명한다.

본 발명에서 용어,　“유도만능줄기세포(human induced pluripotent stem cells, hiPSC)”는 동물의 체세포에 OCT4, SOX2, c-MYC, 그리고, KLF4의 4개 유전자를 도입하여, 전분화 능력(pluripotency)을 유지하면서 무한히 증식(self-renewal)할 수 있는 잠재력이 있는 세포를 의미한다.

본 발명에서 용어, “분화(differentiation)”란 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 세포의 구조나 기능이 특수화되는 현상을 의미한다.

본 발명에서 용어, "MEK/ERK 신호전달억제제"는 MEK/ERK(mitogen-activated protein kinase kinase/extracellular regulated kinase) 신호전달과정을 중 ERK1/2의 상위 단계(upstream) 분자인 MEK1/2를 표적으로 하는 물질들(예를 들어, PD98059, U0126)을 의미한다.

본 발명에서, 용어, "BMP(bone morphogenetic proteins)" 란 골형성 성장인자로서, 골형성을 촉진하는 물질로 알려져 있으나 본 발명에서는 배아줄기세포의 분화를 조절하는 물질로 사용된다. 본 발명의 BMP는 바람직하게는 BMP-2, BMP-4, 또는 BMP-7을 의미한다.

본 발명에서 용어, "유도만능줄기세포배양액"은 DMEM/F12(Invitrogen, USA)에 20% 넉아웃 혈청 리블레이스먼트(knockout serum replacement)(Invitrogen, USA), 0.1 mM 비필수 아미노산(Non-essential amino acid, NEAA)(Invitrogen, USA), 0.1 mM 베타-메르캅토에탄올(beta-mercaptoethanol), 8 ng/㎖ 제조합 인간 기본 FGF(Invitrogen, USA), 1×페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin, P/S)(Invitrogen, USA)를 첨가하고, 0.22 mm 필터로 필터한 배양액을 의미한다.

본 발명에서 용어, "조건 배지(conditioned medium)"를 제조하기 위하여 영양세포(feeder cell) STO(ATCC, USA)를 사용하였고, 이는 DMEM(Invitorgen, USA) 배지에 소 태아 혈청(fetal bovine serum)(Hyclone, USA)을 10%가 되도록 첨가하고, 0.1 mM의 NEAA, 1×P/S, 0.5 mM 베타-메르카포에탄올(beta-mercaptoethanol)을 첨가하여 배양한 후, 마이토신 C(mitomycin C)(Sigma, USA)를 10 ㎎/㎖의 농도로 2시간 30분 동안 처리하여 불활성화하여 사용하였다.

본 발명에서 용어, "조건 배지(conditioned medium)"은 영양세포인 MEF(mouse embryonic fibroblast)나 STO를 bFGF가 첨가된 유도만능줄기세포 배지에서 배양하여 생성된 배양액을 의미한다.

본 발명에서 용어, "비조건 배지(unconditioned medium)"은 bFGF가 첨가되지 않은 유도만능줄기세포 배양액을 의미한다.

본 발명에서 용어, "영양세포 비포함 배양(feeder-free culture)"란, 유도만능줄기세포 배양시, MEF나 STO와 같은 영양세포(feeder)를 사용하지 않고, 마트리겔(Matrigel)위에서, 조건 배지(conditioned medium)이나, 비조건 배지(unconditioned medium)로 유도만능줄기세포 를 배양하는 것을 의미한다.

본 발명에서 용어, "내피성장배지(endothelial growth medium, EGM)"는 클로네틱스(clonetics) 社에서 생산되는 EGM-2MV 배지를 사용하였다.

본 발명에서, CD34 양성 세포를 분리하기 위해 사용한 방법은 MACS(magnetic cell sorting)로써, 밀테니(Miltenyi)社에서 제공하는 CD34 마이크로비드 키트(microbead kit)를 사용하였다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

상기 분화 유도용 조성물에 있어서, 유도만능줄기세포는 동물의 체세포에 OCT4, SOX3, c-MYC 및 KLF4의 4개의 유전자를 도입한 세포인 것을 특징하며, 상기 세포는 전분화 능력을 유지하면서 무한히 증식할 수 있는 세포인 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 분화 유도용 조성물에 포함되는 BMP는 BMP2, BMP4 또는 BMP7인 것이 바람직하며, MEK/ERK 신호전달 억제제는 PD98059 또는 U0126인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 분화 유도용 조성물에 포함되는 MEK/ERK 신호전달 억제제의 농도는 20 내지 50 μM인 것이 바람직하며, BMP의 농도가 10 내지 20 ng/㎖인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 분화 유도용 조성물에 추가적으로 VEGF(vascular endothelial cell growth factor) 및 bFGF(basic fibroblast growth factor)이 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 발명자들은 동물의 체세포에 OCT4, SOX2, c-MYC, 그리고, KLF4의 4개 유전자를 도입하여, 전분화 능력(pluripotency)을 유지하면서 무한히 증식(self-renewal)할 수 있는 잠재력이 있는 유도만능줄기세포(human induced pluripotent stem cells, hiPSC)를 이용하여, 이를 CD 양성세포로 분화시키기 위한 최적화된 배지 및 배양조건을 확립하고자 하였다(도 1 참조). 본 발명에 따른 유도만능줄기세포를 된 MEK/ERK 신호전달 억제제 및 BMP가 포함된 조성물을 이용하여 배양하였을 때, 중배엽 세포로 분화되며, 상기 분화된 중배엽 세포를 VEGF 및 bFGF를 첨가하여 배양하였을 때, 혈관내피세포로 분화되는 것을 확인하였다.

또한, 본 발명의 구체적인 실시예를 통하여, 본 발명에 따른 최적화된 배지 및 배양조건으로 유도만능줄기세포가 중배엽 세포 특이적으로 분화되는 것을 중배엽 세포 마커의 발현 증가를 통해서 확인하였으며, 이때 내배엽 또는 외배엽 세포 마커의 발현을 통하여 세포분화가 중배엽 특이적으로 이루어지고 있다는 것을 확인할 수 있었다(도 2 및 도 3 참조).

또한, 본 발명의 구체적인 실시예를 통하여 상기 유도만능줄기세포로부터 유도분화된 중배엽 세포에서 CD34 양성 세포의 비중이 증가되고 있음을 유세포분석을 통하여 확인하였으며(도 4, 도 5 참조), 이렇게 CD34 양성세포로 분화되고 있는 세포를 VEGF 및 bFGF를 첨가하여 배양하였을 때, 상기 세포가 혈관내피세포로 분화되고 있음을 확인할 수 있었다(도 6, 도 7 참조). 구체적으로, 혈관내피세포의의 혈관 튜브 유사 구조가 형성되며, 혈관내피세포 특이적 마커의 발현이 관찰되었다. 또한, 혈관내피세포의 특성인, 저밀도지질단백질을 흡수하는 성질이 관찰됨으로써, 유도만능줄기세포로부터 본 발명에 따른 최적화된 배지 및 배양조건하에서 중배엽 세포, CD 양성세포 및 혈관내피세포로의 순차적인 분화가 진행되고 있음을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서 본 발명자들은 상기 분화유도된 C34양성세포가 실제 in vivo 실험에서 혈관을 생성할 수 있는지 확인하고자, CD34 양성세포를 후족부 허혈성 마우스 모델에 투여하였으며, 그 결과 허혈성 모델의 제거된 대퇴동맥 부위에서 혈류량이 증가하며, 본 발명에 따른 유도만능줄기세포 유래의 C34 양성세포를 주입한 후족부 허혈성 마우스 모델에서 괴사가 나타나지 않는 것을 확인하였다(도 9 참조).

즉, 본 발명에 따른 유도만능줄기세포를 MEK/ERK 신호전달억제제 및 BMP가 함유된 최적화된 배지를 이용하여 배양하였을 때, 중배엽 세포, CD34 양성세포로의 분화가 진행되며, 상기 CD34 양성세포는 시험관 내(in vitro) 및 체내(in vivo) 실험을 통하여 실제로 기능을 하는 혈관내피세포로 분화됨을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명에 따른 최적화된 배지 및 배양조건을 이용하여, 유도만능줄기세포로부터 혈관내피세포를 분화시키는데 유용하게 이용할 수 있다.

상기 유도만능줄기세포를 CD34 양성세포로 분화 유도하는 방법에 있어서, 유도만능줄기세포는 동물의 체세포에 OCT4, SOX3, c-MYC 및 KLF4의 4개의 유전자를 도입한 세포인 것을 특징하며, 상기 세포는 전분화 능력을 유지하면서 무한히 증식할 수 있는 세포인 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 유도만능줄기세포를 CD34 양성세포로 분화 유도하는 방법에 있어서, MEK/ERK 신호전달 억제제는 PD98059 또는 U0126인 것이 바람직하며, BMP는 BMP2, BMP4 또는 BMP7인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, MEK/ERK 신호전달 억제제의 농도가 20 내지 50 μM인 것이 바람직하며, BMP의 농도가 10 내지 20 ng/㎖인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 유도만능줄기세포를 CD34 양성 세포로 분화 유도하는 방법에 있어서, 단계 1)의 MEK/ERK 신호전달 억제제 및 BMP의 존재 하에서 3일 내지 5일간 배양하는 것이 바람직하며, 단계 2)의 중배엽 세포를 VEGF 및 bFGF 존재하에서 3일 내지 15일간 배양하는 것이 바람직하며, 3일 내지 10일간 배양하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예를 통하여, 본 발명에 따른 MEK/ERK(mitogen-activated protein kinase kinase/extracellular regulated kinase) 신호전달 억제제 및 BMP(bone morphogenetic protein)를 포함하는 조성물 및 배양조건을 이용하여 유도만능줄기세포를 배양하였을 때, 중배엽 세포, CD34 양성세포로 분화되며, 상기 CD34 세포는 혈관내피세포로 분화되며, 이를 후족부 허혈성 마우스 모델에 주입하였을 때, 허혈모델의 제거된 대퇴동맥이 회복되어 혈류량이 증가되는 것을 확인함으로써, 유도만능줄기세포의 혈관내피세포로의 분화를 효과적으로 유도할 수 있다는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명에 따른 최적화된 배지 및 배양조건을 이용하여 유도만능줄기세포를 분화시켜 생성된 CD34 양성세포를 이용하여, 허혈성 질환 예방 및 치료에 유용하게 이용할 수 있다.

상기 유도만능줄기세포를 혈관내피세포로 분화 유도하는 방법에 있어서, 유도만능줄기세포는 동물의 체세포에 OCT4, SOX3, c-MYC 및 KLF4의 4개의 유전자를 도입한 세포인 것을 특징하며, 상기 세포는 전분화 능력을 유지하면서 무한히 증식할 수 있는 세포인 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 유도만능줄기세포를 혈관내피세포로 분화 유도하는 방법에 있어서, MEK/ERK 신호전달 억제제는 PD98059 또는 U0126인 것이 바람직하며, BMP는 BMP2, BMP4 또는 BMP7인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, MEK/ERK 신호전달 억제제의 농도가 20 내지 50 μM인 것이 바람직하며, BMP의 농도가 10 내지 20 ng/㎖인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 유도만능줄기세포를 혈관내피세포로 분화 유도하는 방법에 있어서, 단계 1)의 MEK/ERK 신호전달 억제제 및 BMP의 존재 하에서 3일 내지 15일간 배양하는 것이 바람직하며, 3일 내지 10일간 배양하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 유도만능줄기세포의 제조

인간 체세포(CRL-2094, ATCC, USA)로부터 유도만능줄기세포를 수립하기 위해, 먼저 애드진(addgene)에서 판매하는 역분화 유도전사인자인 pMXs-Oct4, pMXs-Sox2, pMXs-Klf4, pMXs-cMyc를 구매한 후, 이들을 포함하는 레트로바이러스를 생산하였다. 이를 위해, 레트로바이러스 생산에 필수적인 Gag/pol 유전자 들어있는 HEK293세포를 100 mm 배양 접시에 2×10⁶세포를 심었다. 다음날, 상기 4가지 인자를 lipofectamine 2000(Invitrogen, USA)을 이용하여 HEK293 세포에 도입(transduction) 시켰다. 이틀 후, 상기 4가지 인자들이 포함된 바이러스를 HEK293 세포를 키운 배양액으로부터 수거하였다. 수거된 바이러스농축액은 전날 인간 체세포 5×10⁵수의 세포를 심은60 mm 디쉬(dish)에 폴리브렌(polybrene) 30 ㎕와 함께 넣었다. 이 후 이틀간 더 배양하고, 전날 미토마이신-C(mitomycin-C) 처리된 영양세포 STO에 1×10⁴세포를 첨가하였다. 이 때, 배양액은 DMEM/F12 배지에 20% 혈청 리블레이스먼트(Invitrogen)와 10 ng/㎖의 bFGF가 함유된 배양액을 이용하였다. 매일 상기 배양액으로 배양액을 갈아주면, 2주 후부터 유도만능줄기세포가 생성되었다. 생산된 유도만능줄기세포는 인간배아줄기세포와 매우 유사한 모양을 가지며, 배아줄기세포의 2가지 특징인 자가재생산 과 분화전능성을 지니게 된다.

< 실시예 2> 유도만능줄기세포의 배양 및 CD34 양성 세포로의 분화 방법

본 발명에서는 hiPSCs(human pluripotent stem cells, 유도만능줄기세포) 세포를 사용하였다. 본 발명자들은 최적화된 배지를 이용하여 유도만능줄기세포를 CD34 양성 세포로 분화시키고자 하였으며, 이러한 과정은 도 1에 기재되어 있다. CD34 세포로의 분화방법은 구체적으로 STEP 1에서 STEP 5의 단계로 구분된다. 우선 STEP 1에서, 영양세포주(feeder cells)인 STO세포주 위에서 배양된 유도만능줄기세포는 feeder-free 배양을 위해, 10 ml 주사기 바늘을 이용하여, 하나의 콜로니를 직경 300 ~ 500μm로 잘라, 마트리겔(Matrigel) 위에 올려놓고, 8 ng/㎖의 bFGF(Basic Fibroblast Growth Factor; Invitrogen, USA)가 첨가된 조건 배지(conditioned medium)에서 37℃ 및 5% CO₂의 조건으로 2일간 배양하였다.

STEP 2에서, 조건 배지(conditioned medium)에서 2일간 배양한 유도만능줄기세포를 MEK1/2 억제제인 PD98059와 BMP-4를 각각 20 ~ 50μM, 10 ~ 20 ng/㎖의 농도로 비조건 배지(unconditioned medium)에 첨가하여, 5일간 배양하였다.

STEP 3에서는 비조건 배지에 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)와 염기성 섬유아세포 성장 인자(basic fibroblast growth factor, bFGF)를 각각 100 ng/㎖의 농도로 첨가하여, 9일간 배양하였다.

STEP 4에서는 CD34를 발현하는 세포를 CD34 마이크로비드(microbead)를 이용하여, CD34 양성 세포만을 분리하여 획득하였다.

그 후, STEP 5에서 획득한 CD34 양성 세포를 혈관내피세포로 분화시키기 위해, 내피 세포 성장 배지(Endothelial cell Growth Medium, EGM)(clonetics社, USA)에 각각 100 ng/㎖의 VEGF와 bFGF를 첨가하여, 약 7일간 배양하였다(도 1).

이러한 최적화된 배지 및 조건하에서 배양된 유도만능줄기세포의 분화를 확인하기 위하여 하기 실험예를 통하여 분화 여부 및 기능성을 확인하였다.

< 실시예 3> 후족부 허혈성 모델 마우스( hindlimb ischemia model mice )의 제조

후족부 허혈성 모델 마우스를 제작하기 위하여, 도 8에 나타난 바와 같이 마우스의 후족부 대퇴동맥(femoral artery)을 외과적 수술을 통해 제거하여 후족부 허혈성 모델 마우스를 제작하였으며, 상세한 모델마우스의 제작과정은(Lee et al., Vol.43, No3, 474-482, Journal of the American college of cardiology, 2004) 참고문헌의 방식을 따랐다.

구체적으로 먼저, 생후 7 ~ 8주된 15 ~ 20g의 BalB/cAnNCriBgi-nu 누드 숫놈 마우스를 구입한다(Charles River Japan Inc). 구입한 마우스의 후족부에 허혈을 유도하기 위해, 먼저, 케타민(ketamine)과 자일라진(xylazine)으로 마취시킨 후, 오른쪽 다리의 대퇴동맥(femoral artery)과 정맥을 제거하였다. 동물 보호 및 실험에 관련된 과정은 카이스트의 동물관리위원회의 승인하에 수행하였다(도 8).

< 실험예 1> 유도만능줄기세포에서 중배엽 세포로의 분화 유도 확인

<1-1> 유도만능줄기세포에서 중배엽 특이적 유전자의 발현량 확인을 통한 분화 확인

bFGF를 첨가한 조건배지에서 2일 동안 배양시킨 유도만능줄기세포의 중배엽 세포로의 분화가 유도되는 지를 확인하기 위하여, 분화된 세포를 회수하여 실시간 RT-PCR 및 면역 염색법을 수행하여 중배엽 특이적 유전자의 발현량을 분석하였다.

<1-1-1> 전체 RNA 추출 및 실시간 RT - PCR

STEP 1의 조건에 따라 배양된 유도만능줄기세포에 MEK/ERK 신호전달 억제제인 PD98059와 BMP-4를 처리에 의해서 중배엽 세포로 분화되는지 확인하기 위하여, 대조군으로 조건 배지에서 5일간 배양된 세포를 이용하였으며, MEK/ERK 신호전달 억제제인 PD98059를 20 ~ 50μM 농도로 조건배지에 첨가하여 5일 동안 배양한 세포(PD), BMP-4를 10 ~ 20 ng/㎖의 농도로 조건배지에 첨가하여 5일 동안 배양한 세포(B4), 및 20 ~ 50μM PD98059와 10 ~ 20 ng/㎖ BMP-4을 동시에 조건배지에 첨가하여 5일 동안 배양한 세포(PDB4)의 3군으로 나눈 실험군을 이용하였다.

TRIzol(Invitrogen)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 세포로부터 전체 RNA를 추출하였다. 대략 1 ~ 2 g의 전체 RNA로부터 Superscript II 역전사효소(Invitrogen)를 이용하여 cDNA를 합성하였고, 상기 cDNA는 Prime Q-Master mix(SYBR Green I; GENETBIO)를 이용한 실시간 PCR에 사용되었다. 증폭반응은 iCycler iQ5 Real-Time detection system(Bio-Rad Laboratories, USA)에서 수행되었고, 실시간 RT-PCR의 반응 조건은 95℃ 5분 후, 95℃ 30초, 60℃ 30초 및 72℃ 30초를 40회 반복 및 최종 신장 72℃ 5분이었다. 비특이적 피크가 없는 것을 확인하기 위해 녹는점 곡선 분석을 수행하였고, 모든 반응은 세 번 반복되었다. 실시간 PCR에서 사용된 유전자 특이적 프라이머는 하기 <표 1>에 기재된 바와 같다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 MEK/ERK 신호전달 억제제와 BMP-4를 동시에 처리한 세포에서만 중배엽 세포 특이적 마커인, BRACHYURY(T), WNT3의 발현이 유의하게 증가하는 것을 관찰할 수 있었다(도 2의 A). 반면, PD98059나 BMP-4를 단독으로 처리한 세포(PD, B4)에서는 중배엽 세포 특이적 마커인 BRACHYURY(T), WNT3의 발현이 증가되지 않았다. 또한, 도 2의 B에 나타난 바와 같이, 내배엽 세포 특이적 마커인 FOXQ1 이나 FOXA2의 경우는 대조군에 비하여 발현량의 변화가 3배 이내로 미미하였으며, 그 변화가 유의하지 않았다. 이와 함께, 외배엽 세포 특이적 마커인 SOX1(Sex determining region Y-box 1)과 PAX6(Paired box gene 6)의 발현 역시 대조군에 비해 유의적인 발현차이가 거의 없었다.

따라서, MEK/ERK 신호전달 억제제와 BMP-4에 의해서 유도만능줄기세포에서 내배엽(도 2의 B) 또는 외배엽(도 2의 C) 특이적 유전자가 발현되지 않은 반면, 오직 중배엽 특이적 유전자(도 2의 B)만 유도되었다.

	서열번호	서열(5'- 3')
T 정방향프라이머	서열번호 1	ATCACAAAGAGATGATGGAGGAA
T 역방향프라이머	서열번호 2	GGTGAGTTGTCAGAATAGGTTGG
WNT3 정방향프라이머	서열번호 3	CTGCCAGGAGTGTATTCGCATC
WNT3 역방향프라이머	서열번호 4	GAGAGCCTCCCCGTCCACAG
FOXQ1 정방향프라이머	서열번호 5	GCGCGGACTTTGCACTTT
FOXQ1 역방향프라이머	서열번호 6	GCACGTTTGATGGAGATTTTAAAA
FOXA2 정방향프라이머	서열번호 7	ATGAACGGCATGAACACGTA
FOXA2 역방향프라이머	서열번호 8	TGGAGTTCATGTTGGCGTAG
PAX6 정방향프라이머	서열번호 9	GTGTCCAACGGATGTGTGAG
PAX6 역방향프라이머	서열번호 10	CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC
SOX1 정방향프라이머	서열번호 11	TACAGCCCCATCTCCAACTC
SOX1 역방향프라이머	서열번호 12	GCTCCGACTTCACCAGAGAG
GAPDH 정방향프라이머	서열번호 13	CAATGACCCCTTCATTGACC
GAPDH 역방향프라이머	서열번호 14	ATGACAAGCTTCCCGTTCTC

<1-1-2> 면역 염색방법을 이용한 중배엽 특이적 유전자의 발현확인

STEP 1의 조건에 따라 배양된 유도만능줄기세포에 MEK/ERK 신호전달 억제제인 PD98059와 BMP-4를 처리에 의해서 중배엽 세포로 분화되는지 확인하기 위하여, 대조군으로 조건 배지에서 5일간 배양된 세포를 이용하였으며, MEK/ERK 신호전달 억제제인 PD98059 20 ~ 50 μM와 BMP-4 10 ~ 20 ng/㎖을 동시에 조건배지에 첨가하여 5일 동안 배양한 세포(PDB4)를 이용하였다.

상기 대조군 세포와 PDB4 세포를 PBS를 이용하여 세척한 후, 4% 포름알데히드를 이용하여 실온에서 15분 동안 고정하였다. 핵단백질의 검출을 위해, 상기 세포를 0.1% Triton X-100을 포함하는 PBS에서 30분 동안 투과시킨 후, 4% 정상 염소 혈청 또는 우태아혈청을 이용하여 실온에서 1시간 동안 비특이적 결합을 차단하였다. 이후, Tra-1-81(Chemicon, USA, 1:500), AP(R&D, USA, 1:500), SSEA-4((R&D, USA, 1:300), 및 T(R&D, USA, 1:500)에 특이적인 항체를 차단용액으로 적절히 희석한 후, 4℃에서 밤새도록 반응시켰다. 최종적으로, 상기 세포를 PBST(0.1% Tween-20 in PBS)로 수차례 세척한 후, Alexa-488- 또는 -594-결합- 2차 항체(Invitrogen)와 인큐베이션 하였다. 면역염색된 세포를 형광현미경(Olympus, Japan)으로 관찰하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, PD98059, BMP-4를 함께 처리한 세포에서 배아줄기특이적 마커인 Tra-1-81, AP(Alkaline phosphatase), 및 SSEA-4(stage-specific embryonic antigen 4)의 발현이 감소하는 것을 관찰할 수 있었으며, 중배엽세포특이적 마커인 BRACHYURY(T)는 발현이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 따라서, 유도만능줄기세포에 MEK/ERK 신호전달 억제제인 PD98059와 BMP-4를 동시에 처리하였을 때, 상기 실험예 <1-1>에서 확인한 결과와 동일하게 유도만능줄기세포가 중배엽 세포 특이적으로 분화되고 있음을 다시 한번 확인할 수 있었다(도 3).

<13-2> FACS 분석을 이용한 유도만능줄기세포에서 중배엽 세포로의 분화 확인

상기 실험예 <1-1>을 통하여 유도만능줄기세포에 PD98059, BMP-4를 함께 처리하였을 때, 중배엽 특이적으로 세포가 분화되는 것을 확인한 후, 상기 중배엽 세포의 분화 여부를 확인하고자 유세포 분석을 수행하였다.

본 발명에 따른 유도만능줄기세포의 분화방법에 있어서, PD98059, BMP-4를 함께 처리하여 중배엽으로 분화시킨 STEP2의 세포에, VEGF와 bFGF를 각각 10 ng/㎖ 처리하고 6 ~ 9일 동안 배양한 세포를 분리한 후, 상기 분리된 세포를 2% FBS를 포함하는 PBS에 현탁한 후, CD105-APC(R&D Systems, USA)에 특이적인 항체를 이용하여 4℃에서 30 내지 45분 동안 표지하였다. 1% FBS를 포함하는 PBS로 2회 세척한 후, 상기 항체 표지된 세포를 LSRII 유세포 분석기(Becton Dickson, USA)를 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 분석하였다. FlowJo 소프트웨어(Tree Star, Inc., USA)를 이용하여 수득한 데이터를 분석하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, MEK/ERK 신호전달억제제와 BMP-4의 처리한 후(STEP2), 6 ~ 9일 동안 VEGF와 bFGF를 각각 100 ng/㎖로 처리하였을 때(STEP3), 6일째(D6)되는 날 약 5%가량 CD34 양성세포가 생성되었으며, 9일 째(D9)에 약 13% 가량의 CD34 양성세포가 생성되는 것을 확인할 수 있었다(도 4).

< 실험예 2> 중배엽 세포에서 혈관내피세포로의 분화유도 확인

상기 <실험예 1>을 통하여 유도만능줄기세포에 PD98059, BMP-4를 함께 처리하였을 때, 중배엽 특이적으로 세포가 분화되는 것을 확인한 후, 상기 중배엽 세포의 다운 스트림(downstream)에 위치하는 CD34 양성세포로 분화되는 것을 상기 실험예 <1-2>의 유세포 분석을 통하여 확인하였다. 이렇게 얻어진 CD34 양성 세포에 VEGF 및 bFGF를 첨가하여 배양하였을 때, 혈관내피세포로 분화가 유도되는지 확인하고자 하기 실험을 수행하였다.

<2-1> MACS 를 이용한 분리

CD34 양성(CD34⁺) 세포를 분류하기 위해, STEP 3에서 VEGF와 bFGF를 각각 10 ng/㎖ 처리하고 6 ~ 9일 동안 배양한 세포에 TrypLETM Express(Invitrogen, USA)를 37℃에서 5 내지 10분 동안 처리하여 단일 세포 현탁액을 제조하였다. 상기 처리된 세포에 부드럽게 파이펫팅하여 세포를 떼어놓고, 40-um 세포 여과기(BD Biosciences, USA)에 통과시켰다. 이후 CD34⁺ 세포를 자성활성 세포 분류기(magnetic-activated cell sorting, MACS) MicroBead 컬럼(Miltenyi Biotech, USA)을 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 분화된 hiPSCs 유래 중배엽 전구체로부터 분리하였다.

<2-2> FACS 분석을 이용한 유도만능줄기세포의 혈관내피세포로의 분화 확인

상기 분리된 세포를 2% FBS를 포함하는 PBS에 현탁한 후, CD31-PE(BD Pharmingen, USA) 또는 CD105-APC(BD Pharmingen, USA)에 특이적인 항체를 이용하여 4℃에서 30 내지 45분 동안 표지하였다. 2% FBS를 포함하는 PBS로 2회 세척한 후, 상기 항체 표지된 세포를 LSRII 유세포 분석기(Becton Dickson, USA)를 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 분석하였다. FlowJo 소프트웨어(Tree Star, Inc., USA)를 이용하여 수득한 데이터를 분석하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 CD31(PECAM-1)과 CD105(endoglin)을 발현하는 세포의 비율이 각각 70% 이상이 나타남으로써, 유도만능줄기세포가 혈관내피세포로 분화되고 있음을 확인할 수 있었다(도 5).

<2-3> 면역염색을 이용한 유도만능줄기세포의 혈관내피세포로의 분화 확인

상기 MACS에 의해서 분리된 STEP 3의 세포를 Ca² ⁺/Mg² ⁺-free PBS(Invitrogen)에 세척한 후, 4% 포름알데히드를 이용하여 실온에서 20분 동안 고정하였다. 핵단백질의 검출을 위해, 상기 세포를 0.1% Triton X-100를 포함하는 PBS에서 30분 동안 투과시킨 후, 4% 정상 염소 혈청 또는 우태아혈청을 이용하여 실온에서 1시간 동안 차단하였다. 이후, CD31(DAKO, Denmark, 1:100), VWF(abcam, UK, 1:100), KDR(Cell Signaling Technologies, USA, 1:100), VE-CADHERIN(R&D System, USA, 1:100), 및 DAPI(Vector laboratories, USA, 1:100)에 특이적인 항체를 차단용액으로 적절히 희석한 후, 4℃에서 밤새도록 배양하였다. 최종적으로, 상기 세포를 PBST(0.1% Tween-20 in PBS)로 수차례 세척한 후, Alexa-488- 또는 -594-결합- 2차 항체(Invitrogen)와 반응시켰다. 면역염색된 세포를 형광현미경(Olympus, Japan)으로 관찰하였다.

그 결과 도 6에서 나타난 바와 같이, 물결모양의 혈관내피세포 특이적인 형태가 관찰되었으며(도 6의 Ⅰ), 또한 혈관내피세포 특이적 마커 단백질인 CD31, vWF, KDR, 및 VE-cadherin의 발현을 확인할 수 있었다. 이러한 특성분석을 통해, 유도만능줄기세포로부터 유래한 CD34 양성세포가 성숙한 혈관내피세포로 분화됨을 다시 한번 확인할 수 있었다(도 6).

< 실험예 3> 유도만능줄기세포로부터 분화된 혈관내피세포의 기능성 검증

본 발명자들은 상기 <실험예 2>를 통하여, hiPSC세포로부터 분화유도된 CD34 양성세포가 VEGF-A 및 bFGF를 첨가하여 배앙하였을 때, 혈관내피세포로 분화되는 것을 혈내피세포 특이적 마커의 발현을 관찰함으로써 확인하였다. 이에, 유도만능줄기세포로부터 분화유도된 혈관내피세포가 실제로 혈관을 생성하는 기능성을 갖추고 있는지 확인하고자 하였다.

<3-1> 마트리겔 매트릭스를 이용한 유도만능줄기세포로부터 분화된 혈관내피세포의 분화 확인

혈관내피세포는 마트리겔(Matrigel)이라고 하는 물질위에서 올려 놓았을 때, 전선(코드)와 같은 구조를 형성하는 특성이 있다. 이에, 본 발명자들은 유도만능줄기세포로부터 분화유도된 혈관내피세포에 또한 동일한 특성을 유지하고 있는지 확인하고자 하였다.

구체적으로, 1 ×10⁵의 세포를 100 ng/㎖ VEGF-A와 100 ng/㎖ bFGF가 첨가된 EGM-2 배지의 마트리겔 매트릭스(Matrigel Matrix)(BD Biosciences) 위에 올려놓고 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 도립현미경(inverted micrscope)를 이용하여 세포를 관찰하였다.

그 결과, 도 7의 Ⅰ에 나타난 바와 같이, 유도만능줄기세포로부터 분화유도된 세포는 코드모양의 혈관 튜브 유사한 구조물을 형성하는 것을 확인할 수 있었다(도 7의 Ⅰ).

<3-2> LDL 흡수 분석방법을 이용한 유도만능줄기세포로부터 분화된 혈관내피세포의 분화 확인

본 발명자들은 성숙한 혈관내피세포의 LDL(Low Density Lipoprotein)을 흡수하는 성질을 이용하여, 유도만능줄기세포로부터 분화된 혈관내피세포 또한 동일한 특성을 나타내는지 확인하고자 하였다.

CD34 양성세포로부터 분화유도된 혈관내피세포 배양액에 10 ㎍/㎖의 DAPI(1,1'-dioctadecyl-3.3.3',3'-tetramethylindocarbocyanine)가 표지된 아세틸화된 저밀도 지질단백질(acetylated low density lipoprotein, AcLDL)(Invitrogen)를 첨가하여 5시간 동안 반응시켰다. 그 후, DAPI의 형광 시그널을 형광현미경을 이용하여 감지하였다.

그 결과, 도 7의 Ⅱ에 나타난 바와 같이, AcLDL이 유도만능줄기세포로부터 분화유도된 혈관내피세포에 흡수됨을 확인하였다. 이를 통해, 유도만능줄기세포로부터 분화된 혈관내피세포가 혈관을 구성하는 기능을 갖는다는 것을 확인할 수 있었다(도 7의 Ⅱ).

< 실험예 4> 유도만능줄기세포로부터 분화된 CD34 양성세포의 치료효과 확인

<4-1> 후족부 허혈성 모델 마우스의 CD34 양성세포의 치료효과 확인

본 발명자들은 상기 <실시예 4>에서 제조한 후족부 허혈성 모델 마우스(도 8의 A)를 이용하여, 본 발명의 세포분화 방법에 의해서 유도만능줄기세포로부터 분화 유도된 CD34 양성 세포가 혈관내피세포로 실제로 분화되어 동물모델에서 혈관을 생성할 수 있는지를 확인하고자 하였다.

대퇴동맥과 정맥이 제거된 마우스에서 유도만능줄기세포로부터 유도된 CD34 양성세포의 주입(후족부 근육에 찌름)에 따른, 후족부 괴사여부를 확인하기 위해, 마우스를 2 그룹으로 나눴다. 첫 번째 실험군은, 유도만능줄기 세포 유래의 CD34+(hiPSC-CD34 양성 세포)세포를 주입한 군이고, 두 번째 실험군은 EGM-2 배지를 주입한 군이다. 여기서, 혈관내피세포로 분화하는데에 사용되는 배양액은 EGM-2(endothelial growth medium)로써, Lonza社에서 판매하는 것을 사용했다(catalog number: CC-3162).

후족부 허혈성 모델 마우스에 CD34 양성세포를 수술한 부근의 근육에 주사하고 일주일 후, 일주일 동안 후족부의 괴사여부를 관찰한 결과, 도 9의 A에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 유도만능줄기 세포 유래의 CD34 양성 세포를 주입한 마우스의 후족부에서 괴사가 관찰되지 않았다(도 9의 A).

<4-2> 후족부 허혈성 모델 마우스의 혈관 생성 검증

대퇴동맥과 정맥이 제거된 마우스에서 유도만능줄기세포로부터 유도된 CD34 양성세포의 주입(후족부 근육에 찌름)에 따른, 후족부의 혈관 생성여부를 확인하기 위해, 마우스의 후족부의 혈류량을 측정함으로써, 이를 간접적으로 확인하고자 하였다.

후족부 허혈성 모델 마우스에 우리가 유도한 CD34 양성세포를 주입한 후, 혈류의 양을 측정하기 위해, 케타민(ketamine)과 자일라진(xylazine)으로 마취한 마우스에 400 uM의 인도시안그린(Indocyangreen, ICG)(Sigma, USA)를 꼬리정맥에 0.1 ㎖ 주입하였다. ICG 주입 후, 근적외선 영상 시스템(near infrared fluorescence imaging system)(Vieworks Corp., Sungnam, Korea)를 이용하여 CD34양성세포를 주입한 마우스에서의 혈류량을 측정하였다. 특정부위에 혈류량이 많을수록 붉게 표시되고, 혈류량이 적을수록 노란색이나, 푸른색으로 나타난다(Kang Y et al., PLoS ONE. 2009;4(1):e4275.).

그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 그 결과, CD34세포 주입직후인 POD(post operation day) 0에서의 후족부의 혈류량은 적게 나타났지만, 주입후 3일(POD3), 주입후 7일(POD7)째에 찍은 시간에서 관찰된바와 같이, 시간이 경과할 수록 혈류량이 증가함을 보여주고 있다(도 9의 B, perfusion map). 이를 통해, 유도만능줄기세포 유래의 CD34 양성세포가 후족부 허혈성 질환(hidlimb ischemia)을 치료하는데에 효과가 있음을 확인하였다(도 9의 B).

<110> Korea Advanced Institute of Science & Technology <120> Method for inducing differentiation of induced pluripotent stem cells into CD34 positive cells <130> 10p-09-55 <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T forward primer <400> 1 atcacaaaga gatgatggag gaa 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T reward primer <400> 2 ggtgagttgt cagaataggt tgg 23 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WNT3 forward primer <400> 3 ctgccaggag tgtattcgca tc 22 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WNT3 reward pirmer <400> 4 gagagcctcc ccgtccacag 20 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXQ1 forward primer <400> 5 gcgcggactt tgcacttt 18 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXQ1 reward primer <400> 6 gcacgtttga tggagatttt aaaa 24 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXA2 forward primer <400> 7 atgaacggca tgaacacgta 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXA2 reward primer <400> 8 tggagttcat gttggcgtag 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAX6 forward primer <400> 9 gtgtccaacg gatgtgtgag 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAX6 reward primer <400> 10 ctagccaggt tgcgaagaac 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX1 forward primer <400> 11 tacagcccca tctccaactc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX1 reward primer <400> 12 gctccgactt caccagagag 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 13 caatgacccc ttcattgacc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reward primer <400> 14 atgacaagct tcccgttctc 20

Claims

MEK/ERK(mitogen-activated protein kinase kinase/extracellular regulated kinase) 신호전달 억제제 및 BMP(bone morphogenetic protein)를 포함하는 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell) 분화 유도용 조성물.
제 1항에 있어서, MEK/ERK 신호전달 억제제는 PD98059 또는 U0126인 것을 특징으로 하는 유도만능줄기세포 분화 유도용 조성물.
제 1항에 있어서, BMP는 BMP2, BMP4 또는 BMP7인 것을 특징으로 하는 유도만능줄기세포 분화 유도용 조성물.
제 1항에 있어서, MEK/ERK 신호전달 억제제의 농도가 20 내지 50 μM인 것을 특징으로 하는 유도만능줄기세포 분화 유도용 조성물.
제 1항에 있어서, BMP의 농도가 10 내지 20 ng/㎖인 것을 특징으로 하는 유도만능줄기세포 분화 유도용 조성물.
제 1항에 있어서, VEGF(vascular endothelial cell growth factor) 및 bFGF(basic fibroblast growth factor)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 유도만능줄기세포 분화 유도용 조성물.
1) 유도만능줄기세포를 MEK/ERK 신호전달 억제제 및 BMP의 존재 하에 배양하여 중배엽 세포롤 분화시키는 단계; 및
2) 단계 1)의 중배엽 세포를 VEGF 및 bFGF 존재하에 배양하는 단계를 포함하는 단계를 포함하는, 유도만능줄기세포로부터 CD34 양성세포로 분화 유도 방법.
제 7항에 있어서, MEK/ERK 신호전달 억제제는 PD98059 또는 U0126인 것을 특징으로 하는 방법.
제 7항에 있어서, BMP는 BMP2, BMP4 또는 BMP7인 것을 특징으로 하는 방법.
제 7항에 있어서, MEK/ERK 신호전달 억제제의 농도가 20 내지 50 μM인 것을 특징으로 하는 방법.
제 7항에 있어서, BMP의 농도가 10 내지 20 ng/㎖인 것을 특징으로 하는 방법.
제 7항에 있어서, 단계 1)에서 3일 내지 5일간 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7항에 있어서, 단계 2)에서 3일 내지 15일간 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
1) 유도만능줄기세포를 MEK/ERK 신호전달 억제제 및 BMP의 존재 하에 배양하여 중배엽 세포롤 분화시키는 단계; 및
2) 단계 1)의 중배엽 세포를 VEGF 및 bFGF 존재하에 배양하는 단계를 포함하는 단계를 포함하는, 유도만능줄기세포로부터 혈관내피세포로 분화 유도 방법.
제 14항에 있어서, MEK/ERK 신호전달 억제제는 PD98059 또는 U0126인 것을 특징으로 하는 방법.
제 14항에 있어서, BMP는 BMP2, BMP4 또는 BMP7인 것을 특징으로 하는 방법.
제 14항에 있어서, MEK/ERK 신호전달 억제제의 농도가 20 내지 50 μM인 것을 특징으로 하는 방법.
제 14항에 있어서, BMP의 농도가 10 내지 20 ng/㎖인 것을 특징으로 하는 방법.
제 14항에 있어서, 단계 1)에서 3일 내지 5일간 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 14항에 있어서, 단계 2)에서 3일 내지 15일간 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.