TW202227615A - 心肌幹/前驅細胞之製作方法及心肌纖維化抑制方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種不伴隨基因修飾而將成熟/未成熟心肌細胞高效率地重組為心肌幹/前驅細胞，及/或抑制纖維化之方法。 本發明藉由於ROCK抑制藥之存在下培養原代心肌細胞，能夠維持心肌幹/前驅細胞。進而，藉由使該等於低分子化合物之存在下所培養之心肌細胞或來自該心肌細胞之胞外體或分泌組作用於心臟纖維母細胞而抑制纖維化。

Description

心肌幹/前驅細胞之製作方法及心肌纖維化抑制方法
本發明係關於一種使用低分子化合物之心肌幹/前驅細胞之製作方法、心肌細胞之纖維化抑制方法、或長期培養方法。
幹細胞生物學之顯著進展會在運用於心肌再生醫學中時大有裨益，但當下尚未發展至此。作為最受期待之細胞源之一的人工多能幹細胞(iPS細胞)仍存在腫瘤形成之風險，於實際臨床應用中，雖已有臨床研究，但不易實現實用化(非專利文獻1～3)。另一方面，據最新研究表明，可將不同譜系之細胞直接轉化(直接重組)為心肌前驅細胞樣之細胞。然而，直接重組與iPS細胞之情形同樣地，會伴隨有Gata4、Mef2c、Tbx5等之基因轉殖所進行之基因修飾，故仍存在意料之外之風險，無法運用於再生醫學(非專利文獻4)。
最近相繼報告有心臟之纖維母細胞重組為心肌細胞之事實(非專利文獻5)。該等革新性發現為心肌幹細胞理論、甚至是心肌再生研究提供了深刻見解。即，若能再現此種重組，則藉此所得之心肌幹/前驅細胞將有望成為心肌再生醫學中之革新性細胞源。然而，業界對於不伴隨基因修飾而將各個階段之心肌細胞重組為心肌幹/前驅細胞之方法尚全然不知。
本發明人等及其他研究組曾報告過某種低分子抑制藥之組合有助於肝臟或胃等中之幹細胞之多能性之誘導及維持(專利文獻1、非專利文獻6～9)。然而，針對低分子抑制藥，當下尚無報告指出其與成熟/未成熟心肌細胞重組為心肌幹/前驅細胞之間之關係。 [先前技術文獻] [專利文獻]
專利文獻1：日本專利再表2018-079714 非專利文獻
非專利文獻1：Cell. 2014 Oct 9; 159(2): 428-39 非專利文獻2：Cell Metab. 2016 Apr 12; 23(4): 622-634 非專利文獻3：Intech Open, 2019 DOI: http://dx.doi.org/10.5772/intechopen.88878. 非專利文獻4：Stem Cells International, Volume 2018, Article ID 1435746, https://doi.org/10.1155/2018/1435746 非專利文獻5：Circulation Report. 2019, review, doi: 10.1253/circrep. CR-19-0104 非專利文獻6：Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Aug 10; 107(32): 14223-8. 非專利文獻7：Cell Stem Cell. 2017 Jan 5; 20(1): 41-55 非專利文獻8：Cell Stem Cell. 2016 Oct 6; 19(4): 449-461 非專利文獻9：eLIFE, 2019, https://doi.org/10.7554/eLife.47313.001
[發明所欲解決之問題]
本發明之目的在於提供一種不伴隨基因修飾而將成熟/未成熟心肌細胞高效率地重組為心肌幹/前驅細胞之方法。於另一態樣中，本發明之目的在於提供一種使心肌幹/前驅細胞長期維持於不分化之狀態之方法。於又一態樣中，本發明之目的在於提供一種抑制纖維母細胞之纖維化，及/或對其進行去纖維化之方法。於又一態樣中，本發明之目的在於提供一種抑制心血管系統疾病之發病及/或惡化，使心血管系統之發育及/或功能活化之方法。 [解決問題之技術手段]
本發明人等為達成上述目的而對可有助於心肌細胞之重組之低分子化合物反覆進行研究，結果發現，若於Rho激酶抑制藥之存在下培養心肌細胞，則可維持未分化標記物之表現，且可抑制成熟心肌細胞標記物、老化標記物、及/或內皮細胞標記物之表現上升。藉此，利用作為低分子化合物之Rho激酶抑制藥成功實現心肌細胞之重組。又發現，於Rho激酶抑制藥之存在下所培養之心肌細胞可維持作為幹細胞之狀態，並且可長期增殖，故Rho激酶抑制藥可維持未分化狀態。又發現，於經本發明之ROCK抑制藥處理之心肌細胞中，與心血管疾病相關之訊息傳遞路徑受到抑制，與心血管之發育及/或功能相關之訊息傳遞路徑得到活化。進而發現，該等於低分子化合物存在下所培養之心肌細胞與纖維母細胞之共培養、或來自該心肌細胞之胞外體存在下之纖維母細胞之培養可抑制纖維化。又發現，該胞外體可對已纖維化之細胞進行去纖維化。 [發明之效果]
根據本發明，不伴隨基因修飾而能夠安全且迅速地自各種心肌細胞誘導具有自體增殖能力之心肌幹/前驅細胞。又，根據本發明，能夠長期穩定地培養包含心肌幹/前驅細胞之心肌細胞。又，藉由經本發明之ROCK抑制藥處理，心肌細胞有望抑制心血管疾病之發病及/或惡化，以及使心血管系統之發育及/或功能活化。又，經本發明之ROCK抑制藥處理之心肌細胞或來自該心肌細胞之分泌組或胞外體能夠安全且迅速地抑制纖維母細胞之纖維化，及/或對其進行去纖維化。本發明之方法能夠供給自體/異體移植中之心肌細胞，除此以外，能夠利用於心肌症、心肌炎、或其他與心肌之纖維化相關之疾病之治療及預防，進而，能夠利用於該等之模型細胞之製作或治療藥之評價、心臟毒性之評價等。進而，本發明之方法不伴隨基因修飾而能夠安全且迅速地自心肌細胞誘導心肌幹/前驅細胞且/或使其維持，故可運用於心臟功能再生醫學。
1.由心肌細胞成為心肌幹/前驅細胞之製作方法、及所製作之心肌幹/前驅細胞 於一態樣中，本發明係關於一種心肌幹/前驅細胞之製作方法，該製作方法包括藉由ROCK抑制藥處理心肌細胞(以下亦稱為「本發明之心肌重組法」)。
本發明之心肌重組法中所用之「心肌細胞」可為成熟心肌細胞及未成熟心肌細胞中之任一種。例如，心肌細胞可為表現出心肌細胞標記物基因(例如，MYL2、心肌鈣蛋白1、GATA4、VCAM-1、Nkx2.5等)中之至少一種之細胞，較佳為表現出MYL2及心肌鈣蛋白1之細胞。
用於本發明之重組法之心肌細胞之來源動物較佳為哺乳動物，例如可為人類、大鼠、小鼠、豚鼠、兔、羊、馬、豬、牛、猴等，較佳為人類、大鼠、小鼠，最佳為人類。
心臟細胞可為從自哺乳動物摘除之心臟中單離之心肌細胞(原代心肌細胞)、以及永生心肌細胞(例如導入有SV40大T抗原之心肌細胞)、藉由公知之分化誘導方法(例如，J. Clin. Inv., 1999; 103: 697-705.; Circ Res. 2009; 104(4): e30-41)由胚性幹細胞(ES細胞)或iPS細胞等多能幹細胞或間葉系幹細胞中所得之心肌細胞、及藉由直接重組自纖維母細胞所誘導之心肌細胞(Circulation Report, Vol. 1(2019), No.12: pp.564-567)等，較佳為原代心肌細胞。或者，心肌細胞亦可為存在於哺乳動物體內之心臟中之心肌細胞。
於使用原代心肌細胞之情形時，例如於嚙齒類之情形時，較佳為使用自10-20週齡之成體中摘除之心臟，亦可使用8週齡以下之未成熟個體之心臟。於人類之情形時，較佳為使用藉由外科手術切除之成人之心臟組織片，亦可使用自死亡胎兒切除之心臟。或者，亦可使用將自該等摘除之心臟單離純化之心肌細胞進行冷凍所得之細胞(冷凍心肌細胞)。作為自哺乳動物之心臟或其組織片獲得心肌細胞之方法，可使用以膠原酶使心肌組織分解，藉由過濾、離心等去除非實質細胞及細胞片之方法。
於本說明書中，「心肌幹/前驅細胞」(以下亦稱為「CMSC」)意指具有與分化成心肌緊密相關之分化單能性(unipotency)及自體再生能力之細胞。本說明書中之CMSC之幹細胞標記物之表現量以高為佳。例如，本說明書中之CMSC之幹細胞標記物之表現量可高於成熟心肌細胞。於本說明書中，「幹細胞標記物」意指選自Pdx1、Nkx6.1、Gata4、Vcam1、Hes1、Sox9、Foxa2、CK19、及CD133中之一種以上之標記物，較佳為Gata4及/或Vcam1。又，本說明書中之CMSC之成熟標記物之表現量以低為佳。例如，本說明書中之CMSC之成熟標記物之表現量可低於完全分化之心肌細胞。於本說明書中，「成熟標記物」意指心肌細胞之成熟標記物，可例舉：Myl2、Myl7、Myh7、Herg、Kcnq1、Tcap、Vcam1、Sirpa等。又，本說明書中之CMSC因ROCK抑制藥之處理所造成之細胞死亡較少。本說明書中之CMSC之老化標記物之表現量以低為佳。例如，本說明書中之CMSC之老化標記物之表現量可低於成熟心肌細胞或未經ROCK抑制藥處理之心肌細胞。於本說明書中，「老化標記物」意指心肌細胞之老化標記物，可例舉：CDKN1A、CDKN2A、p53、老化相關酸性β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)等。該幹細胞標記物、成熟標記物、老化標記物、內皮細胞標記物之量可為mRNA量或蛋白質量。
於本說明書中，ROCK抑制藥係指已知具有抑制Rho結合激酶之功能之作用之物質，例如可例舉：N-[3-[2-(4-胺基-1,2,5-㗁二唑-3-基)-1-乙基咪唑并[5,4-d]吡啶-6-基]氧基苯基]-4-(2-𠰌啉-4-基-乙氧基)苯甲醯胺(GSK269962A)、法舒地爾(Fasudil)鹽酸鹽、反式-4-[(1R)-1-胺基乙基]-N-4-吡啶基環己烷甲醯胺(Y-27632)、4-甲基-5-[[(2S)-2-甲基-1,4-二氮雜環庚烷-1-基]磺醯基]異喹啉(H-1152)等，較佳為Y-27632。該等ROCK抑制藥可使用一種化合物，亦可組合使用兩種以上之化合物。ROCK抑制藥可為游離體，可為鹽酸鹽、硫酸鹽等鹽之形態，可為溶劑合物或水合物。
又，於本發明之重組法中，可將ROCK抑制藥以外之低分子訊息傳遞路徑抑制藥與ROCK抑制藥組合使用。作為此種抑制藥，例如可例舉GSK3抑制藥、MEK抑制藥等，但並不限定於該等。
於活體外(in vitro)實施本發明之重組法之情形時，可藉由於上述抑制藥之存在下培養心肌細胞而實施。具體而言，向培養基中添加有效濃度之該等抑制藥而進行培養。此處，作為培養基，可為可用於心肌細胞之培養之培養基，作為市售之培養基，例如可例舉CMC培養基等。又，亦可使用實施例所記載之向肌細胞基礎培養基(Myocyte basal medium)中添加Supplement Pack Myocyte Cell GM(包含5% FBS(fetal bovine serum，胎牛血清)、5 μg/mL胰島素、2 ng/mL FGF-b及0.5 ng/mL EGF(epithelium growth factor，表皮生長因子))及1%抗生素×抗有絲分裂素所得之培養基。ROCK抑制藥於培養基中之添加濃度例如可自0.01-500 μM、0.1-100 μM、1-50 μM之範圍中適當選擇，更佳為10 μM。
用於培養之培養容器例如可例舉：培養皿、陪替氏培養皿、組織培養用培養皿、多量培養皿、微量培養盤、微孔培養盤、多量培養盤、多孔培養盤、腔室載玻片、皮氏培養皿、試管、托盤、培養袋等。培養容器可使用用以進行細胞之懸浮培養之培養容器。或者，於黏著位置用之情形時，可使用內表面塗佈有細胞支持用基質以提昇與細胞之黏著性者。作為此種細胞支持用基質，例如可例舉：膠原蛋白、缺端膠原、明膠、Matrigel、聚-L-離胺酸、層黏連蛋白、纖維黏連蛋白等。
心肌細胞可以10 2-10 6細胞/cm 2，較佳為10 3-10 5細胞/cm 2之細胞密度於培養容器上進行接種。心肌細胞之培養可於CO 2培養箱(較佳為約5%之CO 2濃度)之氛圍下，於30-40℃(較佳為約37℃)下進行。作為培養時間，例如可例舉1-4週，較佳為1-3週。又，可每1-3天更換新鮮之培養基(可包含上述抑制劑)。向CMSC之誘導可藉由培養心肌細胞中之上述幹細胞標記物之表現進行確認。又，所得之CMSC可視需要藉由利用上述幹細胞標記物之方法(例如FACS(Fluorescence-activated cell sorting，螢光激發細胞分選術)等)進行單離。
於繼代之情形時，於培養細胞達到80%融合之階段對細胞進行胰蛋白酶處理而使其解離，於新培養容器上以10 3-10 5細胞/cm 2之密度進行接種。較佳為更換為含有ROCK抑制藥之培養基。於4～6繼代左右時可獲得穩定之CMSC。於10繼代以上後，可藉由常法進行選殖化。作為確認CMSC是否於繼代後仍得以維持之方法之一例，可將低密度(例如10 2-10 3細胞/cm 2)之細胞接種於上述之培養容器，隨時間觀察或計測細胞之形態或數量，亦可確認CMSC標記物之表現。
藉由於活體內(in vivo)進行心肌細胞之利用ROCK抑制藥之處理，可對存在於生物體內之心臟之心肌細胞直接重組。於此情形時，藉由利用ROCK抑制藥處理哺乳動物之心臟中之心肌細胞而進行。ROCK抑制藥可對心臟或心臟內之目標部位進行局部投予，亦可全身投予。
又，本發明係關於一種藉由於ROCK抑制藥之存在下培養心肌細胞而獲得之CMSC。該CMSC可用作以下所記載之纖維母細胞之纖維化抑制劑，亦可經由增殖及再分化而作為移植用心肌細胞進行製備。例如CMSC可藉由公知之分化誘導法(例如J. Clin. Inv., 1999; 103: 697-705.；Circ Res. 2009; 104(4): e30-41)再分化成心肌細胞。CMSC或由CMSC分化而成之心肌細胞例如可利用於試驗樣品之心臟毒性之評價、移植用心肌之製備、所釋放之分泌組之來源、及心肌細胞之纖維化之抑制劑等。
試驗樣品之心臟毒性之評價方法包括於試驗樣品之存在下培養CMSC或再分化之心肌細胞。CMSC或心肌細胞之試驗樣品之處理通常藉由向培養CMSC或心肌細胞之培養基或培養液中添加試驗樣品而進行，但並不限定於該方法。例如，於試驗樣品為蛋白質等之情形時，可藉由將表現該蛋白質之DNA載體導入至該細胞而進行處理。試驗樣品之心臟毒性之評價方法進而可包括：測定或觀察經試驗樣品處理之CMSC之損傷；及確認到CMSC之損傷之情形時，判定該試驗樣品是否具有心肌毒性。
例如，評價試驗樣品之心肌毒性之方法可包括：藉由ROCK抑制藥處理心肌細胞而獲得CMSC；藉由試驗樣品處理所得之CMSC；測定或觀察經試驗樣品處理之CMSC之損傷；及於確認到CMSC之損傷之情形時，判定該試驗樣品是否具有心肌毒性。或者，評價試驗樣品之心肌毒性之方法亦可包括：藉由ROCK抑制藥處理心肌細胞而獲得CMSC、使所得之CMSC再分化為心肌細胞；藉由試驗樣品處理再分化之心肌細胞；測定或觀察經試驗樣品處理之心肌細胞之損傷；及於確認到心肌細胞之損傷之情形時，判定該試驗樣品是否具有心肌毒性。損傷之程度例如可以CMSC或心肌細胞之生存率、形態、或者細胞凋亡或壞死標記物作為指標。具體而言，例如於藉由向CMSC或心肌細胞之培養液中添加試驗樣品，而CMSC或心肌細胞之生存率降低之情形時，判定該試驗樣品具有心臟毒性，於生存率無顯著變化之情形時，判定該試驗樣品不具有心臟毒性。
又，本發明之CMSC可利用於移植用心肌之製備。移植用心肌之製備方法可包括：培養CMSC並使其增殖、使增殖之CMSC再分化為心肌細胞、及將再分化之心肌細胞用於移植用心肌之製備。因此，於一態樣中，本發明係關於一種含有本發明之CMSC或由本發明之CMSC所誘導之心肌細胞之移植用心肌。又，上述移植用心肌可用作心肌損傷之治療劑或預防劑。心肌損傷係指心肌出現某些異常，心臟之動作產生異常之狀態，包括急性心血管疾病及慢性心血管疾病。作為慢性心血管疾病，例如可例舉：心肌症(擴張型心肌症等)、心肌炎、心肌梗塞、心肥大、高血壓等。CMSC可懸浮於適當之等張緩衝液(例如PBS(Phosphate Buffered Saline，磷酸鹽緩衝液))而使用。CMSC懸浮液之使用方法因心臟疾病之種類、心肌損傷之嚴重程度等而不同，例如於成人之情形時，可藉由將10 8-10 11個細胞直接投予至心肌內或利用導管自心房內向心肌直接投予等，而進行移植。又，關於移植用心肌，可使由本發明之CMSC分化而成之心肌細胞與血管內皮細胞、血管壁細胞混合培養而製成心肌片。該心肌片藉由貼附於哺乳動物之心臟之治療部位而進行移植。
2.心肌細胞之培養方法、CMSC之維持培養方法 於另一態樣中，本發明係關於一種心肌細胞之培養方法，其包括於ROCK抑制藥之存在下培養心肌細胞。又，於另一態樣中，本發明係關於一種CMSC之維持培養方法，其包括於ROCK抑制藥之存在下培養CMSC。
心肌細胞及CMSC之培養可藉由依據上述培養方法進行繼代培養而進行。尤其是，本發明之培養方法可一面維持CMSC之幹細胞性/前驅細胞性一面進行長期培養。於本說明書中，CMSC之維持或幹細胞性/前驅細胞性之維持意指成熟標記物之量較低，且/或幹細胞標記物之量較高。例如，經過較長期之培養時間後，上述心肌細胞或CMSC所表現之成熟標記物之量可低於ROCK抑制藥之非存在下所培養之心肌細胞所表現之成熟標記物之量。又，經過較長期之培養時間後，上述心肌細胞或CMSC所表現之幹細胞標記物之量可高於ROCK抑制藥之非存在下所培養之心肌細胞所表現之幹細胞標記物之量。於本說明書中，「長期」意指與未經ROCK抑制藥處理之心肌細胞相比，心肌細胞或所誘導之CMSC實現增殖之培養時間較長，可意指20天以上、1月以上、40天以上、或2個月以上。
3.用以自心肌細胞誘導CMSC之藥劑、心肌細胞之長期培養劑、或CMSC之維持用藥劑 於一態樣中，本發明係一種含有ROCK抑制藥作為有效成分之用以自心肌細胞誘導CMSC之藥劑、心肌細胞之長期培養劑、或CMSC之維持用藥劑。該包含ROCK抑制藥之藥劑可單獨包含ROCK抑制藥作為有效成分，亦可包含其他藥劑。
於另一態樣中，本發明係關於一種用以製造如下藥劑之ROCK抑制藥之用途，該藥劑係用以自心肌細胞誘導CMSC者。本發明進而係關於一種由心肌細胞誘導CMSC之方法，其包括：對有需求之患者投予有效量之ROCK抑制藥。本發明還關於一種ROCK抑制藥，其用於由心肌細胞誘導CMSC之方法。
4.分泌組及胞外體 於一態樣中，本發明係一種來自於ROCK抑制藥之存在下所培養之心肌細胞之胞外體或分泌組。於本說明書中，「分泌組」係指細胞培養上清液中所分泌之有用成分之總稱，例如包含各種細胞激素、趨化因子等蛋白質成分；或ECM(Extracellular Matrix，細胞外基質)等細胞外基質或細胞外囊泡等微粒子。又，於本說明書中，「胞外體」係指自各種細胞釋放之直徑約20～200 nm(較佳為50～150 nm)之於內噬作用過程中所形成之來自內體膜之囊泡，主要由脂質、蛋白質、核酸(小分子RNA、信使RNA、DNA)構成。
於另一態樣中，本發明係關於一種分泌組或胞外體之製備方法，其包括：於ROCK抑制藥之存在下培養心肌細胞、及自所培養之心肌細胞回收分泌組或胞外體。
本發明之分泌組可作為於ROCK抑制藥之存在下培養心肌細胞或CMSC之培養液(例如培養上清液)而獲得。心肌細胞及CMSC之培養可依據上述記載而進行。
本發明之胞外體可自上述分泌組中回收。自培養液或分泌組中回收胞外體之方法可使用任意公知之方法或市售之套組而進行。例如可例舉：超離心分離法(例如Thery C., Curr. Protoc. Cell Biol. (2006) Chapter 3: Unit 3.22.)、聚合物沈澱法、免疫沈澱法、FACS法、超過濾法、凝膠過濾法、HPLC(High Performance Liquid Chromatography，高效液相層析)法、及利用抗體或凝集素吸附於珠粒等載體之方法。又，亦可使用市售之胞外體單離用套組回收胞外體。
於上述回收方法中，超離心分離法係最常用於胞外體之單離之標準方法。超離心分離法中之離心力例如為50,000 ×g以上，可為100,000 ×g以上，或可為1,500,000 ×g以上，又，可為300,000 ×g以下，可為250,000 ×g以下，或可為200,000 ×g以下。離心時間並無限定，例如可設為30分鐘～120分鐘、60分鐘～90分鐘、或70分鐘～80分鐘。又，離心分離前可視需要藉由過濾器過濾及/或更低離心力下之離心分離，去除或減少夾雜物。
胞外體之存在可藉由奈米粒子追蹤系統(例如，如Nano Sight之機器)進行計測。又，於胞外體之粒子表面存在例如作為四跨膜蛋白之CD9、CD63、CD81等分子，該等分子可成為胞外體之標記物。亦可藉由以免疫學測定法等(例如西方墨點法等)確認該等蛋白質及/或基因之表現，而確認胞外體之存在。
5.纖維化抑制方法、纖維化抑制劑、去纖維化方法、及去纖維化劑 經ROCK抑制藥處理之心肌細胞或CMSC所釋放之分泌組或胞外體可抑制心肌細胞之纖維化，且可對纖維化之心肌細胞進行去纖維化。因此，於另一態樣中，本發明係關於一種ROCK抑制藥、於ROCK抑制藥之存在下所培養之心肌細胞、或者利用經ROCK抑制藥處理之心肌細胞所釋放之分泌組或胞外體而進行之纖維化抑制方法及去纖維化方法。於本方法中，可藉由投予ROCK抑制藥，使ROCK抑制藥直接作用於生物體內之心肌細胞而使分泌組或胞外體釋放，亦可使用經ROCK抑制藥處理之心肌細胞，或亦可將經ROCK抑制藥處理之心肌細胞所釋放之分泌組或胞外體單離及/或純化而利用。又，關於心肌細胞之纖維化、或纖維化之心肌細胞之去纖維化，例如可藉由如下操作發生：藉由經ROCK抑制藥處理之心肌細胞所釋放之分泌組或胞外體所含之小分子RNA，而與纖維化細胞之活化或纖維化相關之訊息傳遞路徑所含之基因受到抑制。作為此種訊息傳遞路徑，可例舉：TGFB1、E2F1、EGF、HRAS、AGT等，較佳為TGFB1。
於投予ROCK抑制藥而直接處理生物體內之心肌細胞之情形時，可使ROCK抑制藥作用於已位於纖維母細胞附近之心肌細胞。因此，本發明包括一種纖維母細胞之纖維化抑制方法及去纖維化方法，該方法包括：藉由ROCK抑制藥對處於可對纖維母細胞發揮旁分泌作用之位置之心肌細胞進行處理。
於利用細胞之情形時，可藉由使用預先經ROCK抑制藥處理之心肌細胞，使該心肌細胞存在於纖維母細胞之附近或者將兩細胞共培養而實施。或者，可藉由ROCK抑制藥對已位於纖維母細胞附近或與纖維母細胞共培養之心肌細胞進行處理。更具體而言，本發明係關於一種纖維母細胞之纖維化抑制方法，其包括：藉由ROCK抑制藥處理心肌細胞、及使該心肌細胞存在於對於纖維母細胞而言該心肌細胞可發揮旁分泌作用之位置。
「旁分泌作用」意指自經ROCK抑制藥處理之心肌細胞或CMSC所分泌之物質作用於該心肌細胞或CMSC周圍之細胞或組織。因此，「可發揮旁分泌作用之位置」係指可抑制自經ROCK抑制藥處理之心肌細胞或CMSC所產生之分泌組或胞外體之目標纖維母細胞中之纖維化的位置，心肌細胞或CMSC較佳為處於纖維母細胞附近或與其鄰近之位置。於預先使經ROCK抑制藥處理之心肌細胞作用於生物體內之纖維母細胞之情形時，該心肌細胞可局部移植至心臟或心臟內之目標部位。即，藉由將經本發明之ROCK抑制藥處理之心肌細胞或CMSC移植至心臟，而於心臟局部釋放分泌組，從而可藉由旁分泌作用抑制因周圍之纖維母細胞所造成之纖維化。
於將心肌細胞與纖維母細胞共培養之情形時，可於同一表面上進行培養，亦可利用腔室等，於自心肌細胞所釋放之分泌組或胞外體可作用於纖維母細胞之形態下進行培養。於培養細胞之情形時，可藉由ROCK抑制藥對與纖維母細胞共培養之心肌細胞進行處理，而抑制纖維母細胞之纖維化。
經ROCK抑制藥處理之心肌細胞或CMSC之培養上清液及自培養上清液分離純化之胞外體抑制心肌細胞之纖維化。因此，又，本發明之纖維化抑制方法亦可使用經ROCK抑制藥處理之心肌細胞或CMSC所釋放之分泌組或胞外體而進行。因此，本發明係關於一種纖維母細胞之纖維化抑制方法，其包括：藉由自於ROCK抑制藥之存在下所培養之心肌細胞提取出之分泌組或胞外體處理纖維母細胞。例如，本發明之方法可為一種纖維母細胞之纖維化抑制方法，其包括：於ROCK抑制藥之存在下培養心肌細胞、自所培養之心肌細胞回收分泌組或胞外體、及藉由所回收之分泌組或胞外體處理纖維母細胞。
於本說明書中，纖維母細胞之纖維化抑制方法可設為伴隨心肌細胞之纖維化之疾病之預防方法或治療方法，纖維母細胞之纖維化抑制劑可設為伴隨心肌細胞之纖維化之疾病之預防劑或治療劑。伴隨心肌細胞之纖維化之疾病包括：因心肌細胞之纖維化而發病之疾病及因心肌細胞之纖維化而惡化之疾病，例如可例舉：心肌損傷、心肌纖維化、心肌梗塞、心衰竭、心肥大、高血壓等。
6.心血管系統疾病之發病及/或惡化之抑制方法、以及抑制劑 來自經ROCK抑制藥處理之心肌細胞之胞外體所內含之小分子RNA以與心血管疾病相關之基因作為靶，具體而言，以與作為心血管疾病之心臟壞死及細胞死亡、心肥大、心衰竭、心臟麻痹相關之基因作為靶。因此，可藉由利用ROCK抑制藥處理心肌細胞，抑制心血管疾病之發病及/或惡化。又，可藉由利用ROCK抑制藥處理心肌細胞，使與心血管系統之發育及/或功能相關之訊息傳遞路徑活化。藉此，例如可促進內皮細胞之細胞運動、脈管形成、血管新生、及脈管結構發育。因此，於另一態樣中，本發明係關於一種心血管系統疾病之發病及/或惡化之抑制劑、心血管系統疾病之治療劑、內皮細胞之細胞運動促進劑、脈管形成促進劑、血管新生促進劑、及脈管結構發育促進劑，其等包括藉由ROCK抑制藥、ROCK抑制藥、於ROCK抑制藥之存在下所培養之心肌細胞、經ROCK抑制藥處理之心肌細胞所釋放之分泌組或胞外體對心肌細胞進行處理。於本方法中，可藉由投予ROCK抑制藥，直接使ROCK抑制藥作用於生物體內之心肌細胞，而釋放分泌組或胞外體，亦可使用經ROCK抑制藥處理之心肌細胞，或可使經ROCK抑制藥處理之心肌細胞所釋放之分泌組或胞外體單離及/或純化而進行利用。又，本方法可包括：藉由來自經ROCK抑制藥處理之心肌細胞之胞外體所內含之小分子RNA抑制與該心血管疾病相關之訊息傳遞路徑，且/或使與心血管系統之發育及/或功能相關之訊息傳遞路徑活化。作為心血管疾病，除上述急性心血管疾病及慢性心血管疾病(例如心肌症(擴張型心肌症等)、心肌炎、心肌梗塞、心肥大、高血壓等)以外，亦可為心室功能衰竭、左心室功能衰竭、左心障礙、心功能衰竭、家族性心血管疾病、腦血管功能衰竭、左心室異常、心室異常、末梢血管疾病、動脈粥狀硬化症、動脈硬化症、血管阻塞、血管阻塞症、動脈阻塞、鬱血性心衰竭、及心衰竭。
於另一態樣中，本發明係關於一種心血管系統疾病之發病及/或惡化之抑制方法或治療方法，其包括將ROCK抑制藥、經ROCK抑制藥處理之心肌細胞、或經ROCK抑制藥處理之心肌細胞所釋放之分泌組或胞外體之有效量投予給有需求之患者。又，本發明係關於一種用以製造心血管系統疾病之發病及/或惡化之抑制劑或治療劑之ROCK抑制藥、經ROCK抑制藥處理之心肌細胞、或經ROCK抑制藥處理之心肌細胞所釋放之分泌組或胞外體之用途。或者，本發明係關於一種用以抑制或治療心血管系統疾病之發病及/或惡化之ROCK抑制藥、經ROCK抑制藥處理之心肌細胞、或經ROCK抑制藥處理之心肌細胞所釋放之分泌組或胞外體。
7.投予方法、製劑 分泌組及胞外體可藉由上述方法由經ROCK抑制藥處理之心肌細胞獲得。於利用分泌組或胞外體之處理於活體外進行之情形時，可藉由於分泌組或胞外體之存在下培養心肌細胞或纖維母細胞而進行。於活體內進行之情形時，分泌組或胞外體可對心臟或心臟內之目標部位局部投予，亦可全身投予。
上述藥劑可單獨包含ROCK抑制藥、經ROCK抑制藥處理之心肌細胞、或經ROCK抑制藥處理之心肌細胞所釋放之分泌組或胞外體作為有效成分，亦可視需要包含其他成分。例如，於想要將該藥劑投予至動物之情形時，其他成分係指藥學許可之添加物，例如可為殺菌水、生理鹽水、緩衝劑、賦形劑、結合劑、崩解劑、乳化劑、界面活性劑、穩定劑、潤滑劑、稀釋劑、流動性促進劑、矯味劑、著色劑及香料等。例如，於想要將本發明之藥劑投予至動物而使用之情形時，可以經口投予形態、或注射劑、點滴劑等非經口投予形態投予該等藥劑。又，該等藥劑可製成錠劑、散劑、顆粒劑、糖漿劑等而進行經口投予，或製成注射劑、點滴劑而進行非經口投予。投予量為可實現目的之有效量即可，可根據症狀、年齡、性別、體重、投予形態等而決定。
本發明之方法除如此解釋不匹配之情形以外，均可以活體內、離體(ex vivo)、或活體外進行。
以下，使用實施例更詳細地對本發明進行說明，但其並不限定本發明之範圍。再者，本案說明書通篇所引用之文獻整體作為參照併入本案說明書中。 [實施例]
(培養基之製備) 心肌細胞培養基(CMM)以如下方式調整：向肌細胞基礎培養基中添加Supplement Pack Myocyte Cell GM(包含5% FBS、5 μg/mL胰島素、2 ng/mL FGF-b、0.5 ng/mL EGF)(PromoCell，Cat#C-39270)及1%抗生素×抗有絲分裂素。
PC-100-021之培養用培養基以如下方式調整：向血管平滑肌細胞生長培養基(Vascular Smooth Muscle Cell growth medium)中添加血管平滑肌細胞生長套組(Vascular Smooth Muscle Cell growth Kit)(包含5% FBS、5% L-麩醯胺酸、50 μg/mL抗壞血酸、5 ng/mL EGF、5 μg/mL胰島素、5 ng/mL FGF-b)(ATCC，Cat#PCS-100-042)及1%抗生素×抗有絲分裂素。
完全培養基使用先進之DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium，達爾伯克改良伊格爾培養基)(Gibco, cat. No. 12491)。
(實施例1)心肌細胞之培養 (1)原代培養 將原代人類心肌細胞(HCM、PromoCell)及作為對照組之原代人類冠狀動脈平滑肌細胞(PC-100-021、ATCC)分別接種至含有適於心肌細胞之培養之心肌細胞培養基(CMM)及PC-100-021之培養用培養基之培養皿上，於培養箱內(37℃、5% CO 2/95%空氣)進行平面培養。
(2)繼代培養 藉由TrypLE Express(Thermo Fisher)對上述原代培養之人類心肌細胞進行處理而回收，將其以9×10 3細胞/cm 2接種至塗佈有膠原蛋白I之培養容器(2 μg/cm 2、150 mm培養皿)中，於血管平滑肌細胞生長培養基或肌細胞基礎培養基中進行培養。使用CELLBANKER(註冊商標)1(Takara Bio)，將所培養之細胞製備成冷凍儲料。
(實施例2)心肌細胞培養中之TGFβ受體抑制藥及ROCK抑制藥之作用 (1)於受驗低分子化合物存在下之培養 於包含3 mL血管平滑肌細胞生長培養基或肌細胞基礎培養基之35 mm培養盤(IWAKI)上，以0.5×10 2細胞/cm 2接種繼代培養之人類心肌細胞，該血管平滑肌細胞生長培養基或肌細胞基礎培養基含有低分子化合物即作為TGFβ受體抑制藥之3-(6-甲基-2-吡啶基)-正苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-硫代碳醯胺(A-83-01:A)(最終濃度1 μM)、作為ROCK抑制藥之(1R,4r)-4-((R)-1-胺基乙基)-N-(吡啶-4-基)環己烷甲醯胺(Y-27632:Y)(最終濃度10 μM)、或含有A-83-01及Y-27632兩種化合物，或者不含該兩種化合物。於第3天更換為含有各低分子化合物之血管平滑肌細胞生長培養基或肌細胞基礎培養基。隨後，每3天同樣地進行培養基更換。
(2)於低細胞密度下之低速攝影 培養基更換後，使用BZ9000合用(All in one)螢光顯微鏡(基恩士)進行低速攝影。又，於攝影時間(110天)內追蹤各細胞，計測來自各細胞之最終之細胞數量。
圖1A示出經A-83-01或Y-27632處理之心肌細胞之細胞形態之變化。藉由以A-83-01或Y-27632進行處理，顯示出心肌幹/前驅細胞樣之形態。於HCM中，以A-83-01處理、Y-27632處理誘導長期培養(圖1B)。於PC-100-021中，以A-83-01處理誘導長期培養(圖1C)。
(3)定量性RT-PCR(Reverse transcription-Polymerase chain reaction，反轉錄聚合酶鏈反應) 使用miRNeasy Mini Kit(QIAGEN)，自於受驗低分子化合物存在下培養1個月後及2個月後之各心肌細胞中單離出全部之RNA。反轉錄反應係使用大容量cDNA反轉錄套組Life technologies，根據製造人員之準則而實施。將所得之cDNA作為模板，使用TaqMan Probe(Thermo Fisher)進行PCR。靶基因之表現量藉由作為內在性對照組之β-肌動蛋白實現標準化。
於圖2中示出於A-83-01(A)或Y-27632(Y)存在下培養HCM細胞及PC-100-021細胞後之心肌前驅細胞標記物(GATA4、VCAM-1)之mRNA、及作為心肌細胞之成熟標記物之MYL2之mRNA之表現量。HCM細胞及PC-100-021細胞於藥劑未處理組(N.T.)中一併繼續培養，藉此不斷分化，而前驅細胞標記物(GATA4、VCAM-1)之表現減少，並且成熟標記物(MYL2)之表現上升。該前驅細胞標記物(GATA4、VCAM-1)之減少及成熟標記物(MYL2)之上升藉由利用Y-27632處理HCM細胞及PC-100-021細胞而受到抑制。另一方面，顯示出利用A-83-01之處理促進了前驅細胞標記物(GATA4、VCAM-1)之減少及成熟標記物(MYL2)之上升。
於圖3A中示出於A-83-01(A)或Y-27632(Y)存在下培養HCM細胞及PC-100-021細胞後之心肌前驅細胞標記物(GATA4、VCAM-1)之mRNA、作為心肌細胞之成熟標記物之MYL2之mRNA、及老化標記物(CDKN1A、CDKN2A)之mRNA之表現量。HCM細胞及PC-100-021細胞於藥劑未處理組(N.T.)中一併繼續培養，藉此不斷分化，而前驅細胞標記物(GATA4、VCAM-1)之表現減少，並且成熟標記物(MYL2)之表現上升。該前驅細胞標記物(GATA4、VCAM-1)之減少及成熟標記物(MYL2)之上升藉由利用Y-27632處理HCM細胞及PC-100-021細胞而受到抑制。另一方面，顯示出利用A-83-01之處理促進了成熟標記物(MYL2)之上升。進而，老化標記物(CDKN1A、CDKN2A)於經A-83-01(A)或Y-27632(Y)處理之HCM細胞及PC-100-021細胞中幾乎未表現。因此，顯示出A-83-01(A)或Y-27632(Y)之處理所造成之細胞死亡較少。又，根據圖3B，於經A-83-01(A)或Y-27632(Y)處理之HCM細胞及PC-100-021細胞中，內皮細胞標記物(CD31)未表現，而肌細胞標記物有所表現，確認到該等細胞僅包含肌細胞，於原代培養中，內皮細胞未混入。
(實施例3)與經ROCK抑制藥處理之心肌細胞之訊息傳遞路徑相關之特性 於藉由Y-27632(Y)處理心肌細胞之情形時，推定較未處理之心肌細胞有所變化之訊息傳遞路徑。於該推定中，根據製造商之操作說明書使用Ingenuity(註冊商標) Pathway Analysis(IPA)(QIAGEN公司)。
經作為ROCK抑制藥之Y-27632(Y)處理之心肌細胞中，與未處理之心肌細胞相比，與循環系統疾病相關之路徑受到抑制。具體而言，推定與如下疾病相關之訊息傳遞路徑受到抑制：心室功能衰竭、左心室功能衰竭、左心障礙、心功能衰竭、家族性心血管疾病、腦血管功能衰竭、左心室異常、心室異常、末梢血管疾病、動脈粥狀硬化症、動脈硬化症、血管阻塞、血管阻塞症、動脈阻塞、鬱血性心衰竭、及心衰竭(圖4A)。因此，提示了與心血管疾病相關之訊息傳遞路徑於經ROCK抑制藥處理之心肌細胞中減少。又，於藉由Y-27632(Y)處理心肌細胞之情形時，推定與心臟收縮、血壓及心肌收縮相關之訊息傳遞路徑受到抑制，與內皮細胞之細胞運動、脈管形成、血管新生、及脈管結構發育相關之訊息傳遞路徑活化(圖4B)。因此，提示了於經ROCK抑制藥處理之心肌細胞中，與心血管系統之發育及功能相關之訊息傳遞路徑活化。 又，由此種訊息系統之變化提示，經ROCK抑制藥處理之心肌細胞顯示再生特性，不易發生惡性轉形。
(實施例4)來自心肌幹/前驅細胞之胞外體之純化及解析 藉由完全培養基培養細胞，直至心肌幹/前驅細胞融合70%為止。完全培養基使用上述物質。隨後，將完全培養基更換為先進之DMEM(Gibco)，進而培養48小時。隨後，回收培養液，進行離心分離(2,000 ×g、10分鐘、4℃)及利用0.22 μm過濾器之過濾後，廢棄細胞顆粒，回收上清液。藉由超離心分離連續地自該上清液單離胞外體。隨後，對胞外體實施超離心分離(35,000 ×g、70分鐘、4℃)，溶解於PBS中進行保存。
圖5表示藉由奈米粒子捕獲系統(Nanosight LM-10)測定如下胞外體(EV)所得之粒子數(A)，該胞外體(EV)係藉由超離心法自經A-83-01及Y-27632處理之心肌細胞之培養上清液中純化之分泌組之一種。進而表明，利用西方點墨法進行鑑定之胞外體所含之CD9分子、CD63分子及CD81之分子之存在。據此表明，實際上實現了胞外體之回收。
(實施例5)與經TGFβ受體抑制藥及ROCK抑制藥處理之心肌細胞共培養之TGFβ刺激纖維母細胞中之標記物表現 藉由TGFβ使人類心臟纖維母細胞活化24小時。使活化之纖維母細胞與經A-83-01或Y-27632處理之心肌細胞共培養48小時以上。提取總RNA及蛋白質以進行纖維化症活化標記物分析。
圖6係表示作為與經A-83-01及Y-27632處理之心肌細胞共培養之TGFβ刺激纖維母細胞中之纖維化相關基因的ACTA2之mRNA量(A、C)、及作為纖維化標記物之αSMA之蛋白質量(B、D)之圖表。ACTA2及αSMA之表現量可作為細胞之纖維化之指標。ACTA2及αSMA表現量伴隨著經TGFβ處理所造成之人類心臟纖維母細胞之纖維化而上升，但藉由與心肌細胞共培養而其量有所降低，故可知纖維母細胞之活化受到抑制。因此，顯示出自經TGFβ受體抑制藥及ROCK抑制藥處理之心肌細胞中純化之分泌組使纖維母細胞之活化受到抑制之效果。
圖7係表示作為與經A-83-01及Y-27632處理之心肌細胞共培養之TGFβ刺激纖維母細胞中之纖維化相關基因的ACTA2之mRNA量(A、C)、及作為纖維化標記物之αSMA之蛋白質量(B、D)之圖表。圖表藉由平均值±標準偏差表示。ACTA2及αSMA之表現量可作為細胞之纖維化之指標。ACTA2及αSMA表現量伴隨著經TGFβ處理所造成之人類心臟纖維母細胞之纖維化而上升，但藉由與心肌細胞共培養而其量有所降低，故可知纖維母細胞之活化受到抑制。因此，顯示出自經TGFβ受體抑制藥及ROCK抑制藥處理之心肌細胞中純化之分泌組使纖維母細胞之活化受到抑制之效果。
(實施例6)來自經TGFβ受體抑制藥及ROCK抑制藥處理之心肌細胞之胞外體存在下所培養之TGFβ刺激纖維母細胞中之標記物表現 藉由TGFβ使人類心臟纖維母細胞活化24小時。繼而，添加來自經Y-27632處理之心肌細胞之胞外體(EV)，進而培養纖維母細胞48小時。提取總RNA及蛋白質以進行纖維化症活化標記物分析。
圖8係表示自經A-83-01及Y-27632處理之心肌細胞中純化之胞外體組入至藉由TGFβ處理而活化之纖維母細胞中所得之纖維母細胞所表現之ACTA2之mRNA量(A、C)、及αSMA之蛋白質量(B、D)之圖表。ACTA2及αSMA表現量伴隨著經TGFβ處理所造成之人類心臟纖維母細胞之纖維化而上升，但藉由胞外體之添加而其量顯著降低，故可知纖維母細胞之活化受到抑制。因此，顯示出自經A-83-01及Y-27632處理之心肌細胞中純化之胞外體使纖維母細胞之活化受到抑制之效果。
圖9係表示自經A-83-01及Y-27632處理之心肌細胞中純化之胞外體組入至藉由TGFβ處理而活化之纖維母細胞終所得之纖維母細胞所表現之ACTA2之mRNA量(A、C)、及αSMA之蛋白質量(B、D)之圖表。圖表藉由平均值±標準偏差表示。ACTA2及αSMA表現量伴隨著經TGFβ處理所造成之人類心臟纖維母細胞之纖維化而上升，但藉由胞外體之添加而其量顯著降低，故可知纖維母細胞之活化受到抑制。因此，顯示出自經A-83-01及Y-27632處理之心肌細胞中純化之胞外體使纖維母細胞之活化受到抑制之效果。
(實施例7)免疫染色 與實施例5或實施例6同樣地，使藉由TGFβ活化24小時之纖維母細胞與經A-83-01或Y-27632處理之HCM細胞共培養，或於來自該HCM細胞之胞外體(EV)存在下培養48小時。繼而，以PBS將細胞洗淨2次後，歷時10分鐘添加4%多聚甲醛而實施固定。藉由利用PBS溶解之0.1% Triton X對細胞膜實施透過處理。關於阻斷，藉由阻斷劑-1(Blocking One，Nacalai Tesque)實行30分鐘，於室溫下歷時1小時培養細胞及一級抗體(抗αSMA、抗纖維黏連蛋白、抗膠原蛋白I)。進而培養與Alexa Fluor 594結合之二級抗體1小時。藉由DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole，4',6-二脒基-2-苯基吲哚)(Vectashield)對細胞核染色。
將經A-83-01或Y-27632處理之HCM與藉由TGFβ處理而活化之纖維母細胞共培養之情形時之免疫染色之結果示於圖10中。可知αSMA、纖維黏連蛋白、膠原蛋白I之表現藉由與經ROCK抑制藥處理之HCM進行共培養而得到顯著抑制，確認到心臟纖維母細胞之纖維化之抑制效果。
將來自經A-83-01或Y-27632處理之HCM之胞外體添加至藉由TGFβ處理而活化之纖維母細胞中進行培養之情形時之免疫染色結果示於圖11中。可知αSMA、纖維黏連蛋白、膠原蛋白I之表現藉由來自經ROCK抑制藥處理之HCM之胞外體而得到顯著抑制，確認到心臟纖維母細胞之纖維化之抑制效果。
將來自經A-83-01或Y-27632處理之HCM之胞外體添加至藉由TGFβ處理而活化之纖維母細胞中進行培養之情形時之代表性之免疫染色結果示於圖12中。以白色箭頭表示αSMA陽性細胞。又，圖表藉由平均值±標準偏差表示。可知藉由TGFβ處理，誘導出αSMA之表現，αSMA陽性細胞增加，進而，藉由添加來自經Y-27632處理之HCM之胞外體，TGFβ所造成之表現受到抑制，αSMA陽性細胞減少。同樣地，關於纖維黏連蛋白、膠原蛋白I之表現，亦可知藉由來自經Y-27632處理之HCM之胞外體而受到顯著抑制，確認到心臟纖維母細胞之纖維化之抑制效果。
(實施例8)來自經ROCK抑制藥處理之心肌細胞之胞外體存在下所培養之纖維母細胞中之訊息傳遞路徑之變化 於對活化之纖維母細胞、及來自經Y-27632(Y)處理之心肌細胞之胞外體進行處理所得之纖維母細胞中，推定較未處理之心肌細胞產生變化之訊息傳遞路徑。該推定中係根據製造商之操作說明書使用IPA。
於活化之纖維母細胞中，推定相關訊息傳遞路徑按照如下順序受到促進：肝纖維化/肝星狀細胞之活化、神經細胞中之CREB(Cyclic Adenosine monophosphate-response element binding protein，環單磷酸腺苷反應元件結合蛋白)信令、軸突誘導信令、心肥大信令(增加)、利用Stathmin1之乳癌控制、動脈粥狀硬化信令、肝纖維化訊息傳遞路徑、STAT3路徑、巨噬細胞、纖維母細胞、內皮之作用、及骨關節炎路徑(圖13A)。另一方面，於對來自經Y-27632(Y)處理之心肌細胞之胞外體進行處理所得之纖維母細胞中，推定相關訊息傳遞路徑按照如下順序受到促進：神經細胞中之CREB信令、精子運動、利用Stathmin1之乳癌控制、心肥大信令、STAT3路徑、雌激素受體信令、巨噬細胞、纖維母細胞、內皮之作用、IL-15生成、肝纖維化/肝星狀細胞之活化、PTEN(Phosphatase and tensin homolog，磷酸酯酶與張力蛋白同源物)信令(圖13B)。
(實施例9)來自經ROCK抑制藥處理之心肌細胞之胞外體存在下所培養之纖維母細胞中之活化訊息傳遞因子之變化 對於實施例8所推定之訊息傳遞路徑，為了推定更具體之訊息傳遞因子，於活化之纖維母細胞中，推定與未處理之心肌細胞相比受到抑制或促進之訊息傳遞路徑；以及針對活化之纖維母細胞，對來自經ROCK抑制藥處理之HCM細胞之胞外體進行處理之情形時，推定與未處理之心肌細胞相比受到抑制或促進之訊息傳遞路徑。該推定中係根據製造商之操作說明書使用IPA。
於活化之纖維母細胞中，推定相關訊息傳遞路徑按照如下順序受到抑制：NFκB(複合體)、HGF、Vegf、IL17A、IL1B、CSF2、CHUK、EGF、Tlr、TLR4，推定相關訊息傳遞路徑按照如下順序受到促進：TGFB1、Tgf beta、TGFB3、NUPR1、NORAD、TAZ、MRTFA、TGFBR1、TGFB2、DRD2(圖14A、B)。
另一方面，於針對活化之纖維母細胞，對來自經ROCK抑制藥處理之HCM細胞之胞外體進行處理之情形時，推定相關訊息傳遞路徑按照如下順序受到抑制：ESR1、TCF7L2、IRGM、MRTFB、HGF、CD24、MRTFA、MAPK1、Vegf、NKX2-3、RC3H1、Irgm1、IL1RN、ACKR2、IL4、TRIM24、Tgf beta、SMAD4、ESR2、PTGER4，推定相關訊息傳遞路徑按照如下順序受到促進：IFNL1、IRF7、IFNA2、MIR17HG、GRIN3A、Hbb-b1、Ifnar、IFNB1、IRF3、STAT1、STING1、SEL1L、RNY3、IRF1、干擾素α、PML、MAVS、IFNAR1、IFNG、KLF3(圖14C、D)。因此，可知活化之纖維母細胞中之活化之訊息傳遞路徑藉由胞外體之處理而受到抑制。因此，提示具體之纖維母細胞之訊息傳遞路徑藉由來自經ROCK抑制藥處理之心肌細胞之胞外體之處理而恢復。
(實施例10)小分子RNA之功能解析 針對來自經ROCK抑制藥處理之HCM細胞之胞外體，選擇內含之小分子RNA最高度表現之胞外體群(參照圖15A)，鑑定該小分子RNA之靶基因。具體而言，將經ROCK抑制藥處理之HCM細胞之培養液更換為無血清之培養液，培養72小時後，回收500 ml之該培養上清液液。以10,000 ×g使該培養上清液液離心30分鐘，而去除細胞之破碎物等後，利用貝克曼庫爾特公司製造之超離心機(Optima-XE-90)於100,000 ×g、4℃下進行超離心70分鐘後，使顆粒溶解於PBS(-)中，進而與於100,000 ×g、4℃下進行超離心70分鐘後，溶解於適量之PBS(-)中。使用微量RNA簡易套組(QIAGEN)，自該胞外體組份中回收小分子RNA，藉由下一代核酸定序儀對該8 ng實施RNA解析(DNA chip研究所)。
其結果，表明所選之小分子RNA靶向之513種之基因中之18.5%與心臟之壞死及細胞死亡、心肥大、心衰竭等心血管疾病相關(參照圖15B)。又，表明所選之小分子RNA之靶基因與TGFB1訊息傳遞路徑密切相關(參照圖15C)。 [相關申請案之相互參照]
本國際申請案基於2020年10月14日向日本特許廳提出申請的日本專利申請案第2020-173581號的優先權，日本專利申請案第2020-173581號之全部內容作為參照引用至本國際申請案中。
圖1表示經TGFβ受體抑制藥或ROCK抑制藥處理之心肌細胞之細胞形態之變化及增殖。A係表示藉由於TGFβ受體抑制藥(A)之單獨處理、ROCK抑制藥(Y)之單獨處理下長期培養，而心肌細胞成為心肌幹/前驅細胞之形態之照片。B係表示於單獨投予TGFβ受體抑制藥(A)、單獨投予ROCK抑制藥(Y)之條件下之HCM(Human Cardiac Myocytes，人類心肌細胞)細胞之增殖之圖表。C係表示於單獨投予TGFβ受體抑制藥(A)、單獨投予ROCK抑制藥(Y)之條件下之原代人類冠狀動脈平滑肌細胞PC-100-021細胞之增殖之圖表。 圖2(A)～(C)係表示經TGFβ受體抑制藥(A)或ROCK抑制藥(Y)處理之心肌細胞中之心肌前驅細胞標記物(GATA4、VCAM-1)、及作為心肌細胞之成熟標記物之MYL2的mRNA表現之圖表。縱軸表示將培養前之細胞之表現量設為1時之各mRNA之表現量(相對mRNA量)，橫軸之文字表示成為對象之mRNA，數值表示培養時間(月)。於各mRNA之各月中，左側之條形圖表示藥劑處理組之資料，右側之條形圖表示藥劑未處理組(對照組)之資料。 圖3之A係表示經TGFβ受體抑制藥(A)或ROCK抑制藥(Y)處理之心肌細胞中之心肌前驅細胞標記物(GATA4、VCAM-1)、心肌細胞之成熟標記物(MYL2)、及老化標記物(CDKN1A、CDKN2A)的mRNA表現之圖表。於各圖表中，縱軸表示將培養前之細胞之表現量設為1時之各mRNA之表現量(相對mRNA表現量)，橫軸之數值表示培養時間(天)。B係藉由西方點墨法對經TGFβ受體抑制藥(A)或ROCK抑制藥(Y)處理之原代人類心肌細胞(HCM)或原代人類冠狀動脈平滑肌細胞(PC-100-021)中之內皮細胞標記物(CD31)、肌細胞標記物(肌鈣蛋白T)、及肌動蛋白之表現進行確認所得之結果之照片。NT表示藥劑未處理之對照組，HUVEC(Human Umbilical Vein Endothelial Cell，人類臍靜脈內皮細胞)表示使用人類臍帶靜脈內皮細胞(作為內皮細胞標記物之CD31陽性)之結果。 圖4係表示推測訊息傳遞路徑變化之結果之圖表，該推測基於使用Ingenuity(註冊商標)Pathway Analysis(IPA)，將經ROCK抑制藥處理之心肌細胞之總RNA與未處理之心肌細胞之總RNA進行比較。A係表示與心血管疾病相關之訊息傳遞路徑中之變化之推測結果。B係表示與心血管系統之發育及功能相關之訊息傳遞路徑中之變化之推測結果。圖表中之活化z分值參考Bioinformatics. (2014); 30(4): 523-530。#Molecules表示分子數。 圖5之A係表示藉由超離心法自經TGFβ受體抑制藥或ROCK抑制藥處理之心肌細胞之培養上清液中純化之細胞外囊泡之粒子數之圖表。B係表示藉由西方點墨法對利用超離心法自經TGFβ受體抑制藥及ROCK抑制藥處理之心肌細胞之培養上清液中純化之細胞外囊泡內之CD9分子、CD63分子及CD81之分子進行鑑定所得之結果之照片。 圖6係將經TGFβ受體抑制藥或ROCK抑制藥處理之心肌細胞與藉由TGFβ處理而活化之纖維母細胞共培養之實驗之模式圖、及表示其結果之圖。A及C係表示與HCM細胞(A)或PC-100-021細胞(C)共培養之纖維母細胞之ACTA2 mRNA量之圖表。縱軸表示將未經TGFβ處理之纖維母細胞中之ACTA2 mRNA之表現量設為1時之各纖維母細胞之ACTA2 mRNA之表現量(相對mRNA量)。橫軸表示有無TGFβ處理及經處理之藥劑(左起依序為TGF-β(-)：無TGFβ處理、無藥劑處理、無共培養；-：經TGFβ處理、藥劑未處理、無共培養；N.T：經TGFβ處理、藥劑未處理、與心肌細胞共培養；Y：經TGFβ處理、經ROCK抑制藥處理、與心肌細胞共培養；A：經TGFβ處理、經TGFβ受體抑制藥處理、與心肌細胞共培養)(以下，圖7～圖9之圖表之橫軸同樣)。B及D係表示藉由西方墨點法對與HCM細胞(B)或PC-100-021細胞(D)共培養之纖維母細胞之αSMA蛋白質之表現量進行確認所得之結果之照片及圖表。照片自左起依序表示TGF-β(-)：無TGFβ處理、無藥劑處理、無共培養；-：經TGFβ處理、藥劑未處理、無共培養；N.T：經TGFβ處理、藥劑未處理、與心肌細胞共培養；Y：經TGFβ處理、經ROCK抑制藥處理、與心肌細胞共培養；A：經TGFβ處理、經TGFβ受體抑制藥處理、與心肌細胞共培養(以下，圖7～圖9之照片同樣)。圖表表示將未經TGFβ處理之纖維母細胞中之αSMA蛋白質之表現量設為1時之各纖維母細胞之αSMA蛋白質之表現量(相對蛋白質量)。 圖7係將經TGFβ受體抑制藥或ROCK抑制藥處理之心肌細胞與藉由TGFβ處理而活化之纖維母細胞共培養之實驗之模式圖、及表示其結果之圖。A及C係表示與HCM細胞(A)或PC-100-021細胞(C)共培養之纖維母細胞之ACTA2 mRNA量之圖表。縱軸表示將經TGFβ處理、藥劑未處理、未與心肌細胞共培養之纖維母細胞中之ACTA2 mRNA之表現量設為1時之各纖維母細胞之ACTA2 mRNA之表現量(相對mRNA量)。B及D係表示藉由西方墨點法對與HCM細胞(B)或PC-100-021細胞(D)共培養之纖維母細胞之αSMA蛋白質之表現量進行確認所得之結果之照片及圖表。圖表示出將經TGFβ處理、藥劑未處理、未與心肌細胞共培養之纖維母細胞中之αSMA蛋白質之表現量設為1時之各纖維母細胞之αSMA蛋白質之表現量(相對蛋白質量)。 圖8係來自經TGFβ受體抑制藥或ROCK抑制藥處理之心肌細胞之胞外體與藉由TGFβ處理而活化之纖維母細胞共培養之實驗之模式圖、以及表示其結果之圖。A及C係表示於來自HCM細胞(A)或PC-100-021細胞(C)之胞外體之存在下所培養之纖維母細胞之ACTA2 mRNA量之圖表。縱軸表示將未經TGFβ處理之纖維母細胞中之ACTA2 mRNA之表現量設為1時之各纖維母細胞之ACTA2 mRNA之表現量(Relative mRNA level)。B及D係表示藉由西方墨點法對與來自HCM細胞(B)或PC-100-021細胞(D)之胞外體培養之纖維母細胞之αSMA蛋白質之表現量進行確認所得之結果之照片及圖表。圖表示出將未經TGFβ處理之纖維母細胞中之αSMA蛋白質之表現量設為1時之各纖維母細胞之αSMA蛋白質之表現量(相對蛋白質量)。 圖9係將來自經TGFβ受體抑制藥或ROCK抑制藥處理之心肌細胞之胞外體與藉由TGFβ處理而活化之纖維母細胞共培養之實驗之模式圖、及表示其結果之圖。A及C係表示於來自HCM細胞(A)或PC-100-021細胞(C)之胞外體之存在下所培養之纖維母細胞之ACTA2 mRNA量之圖表。縱軸表示將經TGFβ處理、藥劑未處理、且未添加胞外體之纖維母細胞中之ACTA2 mRNA之表現量設為1時之各纖維母細胞中之ACTA2 mRNA之表現量(相對mRNA量)。B及D係表示藉由西方墨點法對與來自HCM細胞(B)或PC-100-021細胞(D)之胞外體培養之纖維母細胞之αSMA蛋白質之表現量進行確認所得之結果之照片及圖表。圖表示出將經TGFβ處理、藥劑未處理、且未添加胞外體之纖維母細胞中之αSMA蛋白質之表現量設為1時之各纖維母細胞之αSMA蛋白質之表現量(相對蛋白質量)。 圖10係將來自經TGFβ受體抑制藥或ROCK抑制藥處理之HCM細胞與藉由TGFβ處理而活化之纖維母細胞共培養，且使用抗αSMA、抗纖維黏連蛋白、抗膠原蛋白I抗體作為一級抗體之情形時之免疫染色之圖(A)及圖表(B)。圖自上段起依序表示未經TGFβ處理且無共培養(TGFβ(-))、經TGFβ處理且共培養(TGFβ(+))、經TGFβ處理且與經ROCK抑制藥處理之心肌細胞共培養(TGFβ(+)＋Y)、及經TGFβ處理且與經TGFβ受體抑制藥處理之心肌細胞共培養(TGFβ(+)＋A)。圖表示出將經TGFβ處理且無共培養之纖維母細胞(TGFB)中之αSMA蛋白質、纖維黏連蛋白、膠原蛋白I之表現量設為1時，未經TGFβ處理且無共培養(-)、經TGFβ處理且與經ROCK抑制藥處理之心肌細胞共培養(Y)、或經TGFβ處理且與經TGFβ受體抑制藥處理之心肌細胞共培養(A)之纖維母細胞中之αSMA蛋白質、纖維黏連蛋白、膠原蛋白I之表現量。 圖11係將來自經TGFβ受體抑制藥或ROCK抑制藥處理之HCM細胞之胞外體添加至藉由TGFβ處理而活化之纖維母細胞進行培養，且使用抗αSMA、抗纖維黏連蛋白、抗膠原蛋白I抗體作為一級抗體之情形時之免疫染色之圖(A)及圖表(B)。圖自上段起依序表示：未經TGFβ處理且未添加胞外體(TGFβ(-))、經TGFβ處理且未添加胞外體(TGFβ(+))、經TGFβ處理且添加來自經ROCK抑制藥處理之心肌細胞之胞外體(TGFβ(+)＋Y)、及經TGFβ處理且添加來自經TGFβ受體抑制藥處理之心肌細胞之胞外體(TGFβ(+)＋A)。圖表示出將經TGFβ處理之纖維母細胞(未添加胞外體)(TGFB)中之αSMA蛋白質、纖維黏連蛋白、膠原蛋白I之表現量設為1時未經TGFβ處理且無共培養(-)、經TGFβ處理且添加來自經ROCK抑制藥處理之心肌細胞之胞外體(Y)、或經TGFβ處理且添加來自經TGFβ受體抑制藥處理之心肌細胞之胞外體(A)之纖維母細胞之αSMA蛋白質、纖維黏連蛋白、膠原蛋白I之表現量。 圖12係將來自經TGFβ受體抑制藥或ROCK抑制藥處理之HCM細胞之胞外體添加至藉由TGFβ處理而活化之纖維母細胞進行培養，且將抗αSMA、抗纖維黏連蛋白、抗膠原蛋白I抗體用作一級抗體之情形時之免疫染色之圖(A)及圖表(B)。圖自上段起依序表示未經TGFβ處理且未添加胞外體(TGFβ(-))、經TGFβ處理且未添加胞外體(TGFβ(+))、經TGFβ處理且添加來自經ROCK抑制藥處理之心肌細胞之胞外體(TGFβ(+)＋Y)、及經TGFβ處理且添加來自經TGFβ受體抑制藥處理之心肌細胞之胞外體(TGFβ(+)＋A)。圖中之箭頭表示αSMA陽性細胞。圖表示出將經TGFβ處理之纖維母細胞(未添加胞外體)中之αSMA蛋白質、纖維黏連蛋白、膠原蛋白I之表現量設為1時未經TGFβ處理且無共培養、經TGFβ處理且添加來自經ROCK抑制藥處理之心肌細胞之胞外體、或經TGFβ處理且添加來自經TGFβ受體抑制藥處理之心肌細胞之胞外體的纖維母細胞之αSMA蛋白質、纖維黏連蛋白、膠原蛋白I之表現量。圖表自左起依序分別表示未經TGFβ處理且無共培養、經TGFβ處理且未添加胞外體、經TGFβ處理且添加來自經ROCK抑制藥處理之心肌細胞之胞外體、經TGFβ處理且添加來自經TGFβ受體抑制藥處理之心肌細胞之胞外體的纖維母細胞之結果。 圖13係表示使用IPA對纖維化細胞由既有之訊息傳遞路徑所發生之變化進行分析所得之結果之圖表。(A)係表示對纖維母細胞進行活化處理之情形時，產生變化之訊息傳遞路徑之前10種之圖表；及(B)係表示於利用藉由對心肌細胞實施ROCK抑制藥處理所得之胞外體處理已活化之纖維母細胞之情形時，產生變化之訊息傳遞路徑之前10種之圖表。 圖14係表示於經活化處理之纖維母細胞中，使用IPA對(A)受到抑制之前10種之訊息傳遞路徑、及(B)已活化之前10種之訊息傳遞路徑進行分析所得之結果之圖表。又，表示於利用藉由對心肌細胞實施ROCK抑制藥處理所得之胞外體處理已活化之纖維母細胞之情形時，使用IPA對(C)受到抑制之前20種之訊息傳遞路徑、及(D)已活化之前20種之訊息傳遞路徑進行分析所得之結果之圖表。 圖15之(A)係於實施例10中對所選之小分子RNA高度表現之胞外體進行分析之圖表。橫軸表示表現量。(B)係表示所選之胞外體所含之小分子RNA靶向之513種之基因中，18.5%與心血管疾病相關之圖。(C)係表示所選之小分子RNA靶向之基因參與之前5種之訊息傳遞路徑之圖。

Claims (35)

  1. 一種心肌幹/前驅細胞之製作方法，其包括藉由ROCK抑制藥處理心肌細胞。
  2. 一種心肌細胞之培養方法，其包括於ROCK抑制藥之存在下培養心肌細胞。
  3. 如請求項2之培養方法，其中培養時間為1個月以上及/或經過培養時間後上述心肌細胞所表現之選自心肌細胞之成熟標記物、老化標記物、及內皮細胞標記物中之一種以上之標記物之量低於ROCK抑制藥之非存在下所培養之心肌細胞所表現之心肌細胞之該標記物之量。
  4. 如請求項3之培養方法，其中成熟標記物為MYL2，並且/或者老化標記物為CDKN1A及/或CDKN2A，並且/或者內皮細胞標記物為CD31。
  5. 如請求項3之培養方法，其中經過培養時間後上述心肌細胞所表現之心肌前驅細胞標記物之量高於ROCK抑制藥之非存在下所培養之心肌細胞所表現之心肌細胞之該標記物之量。
  6. 如請求項4之培養方法，其中經過培養時間後上述心肌細胞所表現之心肌前驅細胞標記物之量高於ROCK抑制藥之非存在下所培養之心肌細胞所表現之心肌細胞之該標記物之量。
  7. 一種心肌幹/前驅細胞之維持培養方法，其包括於ROCK抑制藥之存在下培養心肌幹/前驅細胞。
  8. 一種分泌組或胞外體之製備方法，其包括自藉由如請求項2至6之方法所培養之心肌細胞回收分泌組或胞外體。
  9. 一種纖維母細胞之纖維化抑制方法，其包括使經ROCK抑制藥處理之心肌細胞與纖維母細胞局部存在該心肌細胞可發揮旁分泌效果之位置。
  10. 一種纖維母細胞之纖維化抑制方法，其包括藉由ROCK抑制藥處理存在於可對纖維母細胞發揮旁分泌作用之位置之心肌細胞。
  11. 一種纖維母細胞之纖維化抑制方法，其包括藉由自於ROCK抑制藥之存在下所培養之心肌細胞提取出之分泌組或胞外體處理纖維母細胞。
  12. 如請求項9之纖維母細胞之纖維化抑制方法，其包括： 於ROCK抑制藥之存在下培養心肌細胞； 自所培養之心肌細胞回收分泌組或胞外體；及 藉由所回收之分泌組或胞外體處理纖維母細胞。
  13. 如請求項1之方法，其中上述ROCK抑制藥為(1R,4r)-4-((R)-1-胺基乙基)-N-(吡啶-4-基)環己烷甲醯胺。
  14. 如請求項2至6中任一項之方法，其中上述ROCK抑制藥為(1R,4r)-4-((R)-1-胺基乙基)-N-(吡啶-4-基)環己烷甲醯胺。
  15. 如請求項7之方法，其中上述ROCK抑制藥為(1R,4r)-4-((R)-1-胺基乙基)-N-(吡啶-4-基)環己烷甲醯胺。
  16. 如請求項8之方法，其中上述ROCK抑制藥為(1R,4r)-4-((R)-1-胺基乙基)-N-(吡啶-4-基)環己烷甲醯胺。
  17. 如請求項9至12中任一項之方法，其中上述ROCK抑制藥為(1R,4r)-4-((R)-1-胺基乙基)-N-(吡啶-4-基)環己烷甲醯胺。
  18. 如請求項13之方法，其中上述心肌細胞為人類心肌細胞。
  19. 如請求項14之方法，其中上述心肌細胞為人類心肌細胞。
  20. 如請求項15之方法，其中上述心肌細胞為人類心肌細胞。
  21. 如請求項16之方法，其中上述心肌細胞為人類心肌細胞。
  22. 如請求項17之方法，其中上述心肌細胞為人類心肌細胞。
  23. 一種心肌幹/前驅細胞之誘導劑或心肌幹/前驅細胞之維持培養劑，其含有ROCK抑制藥作為有效成分。
  24. 一種心肌幹/前驅細胞，其係藉由於ROCK抑制藥之存在下培養心肌細胞而獲得。
  25. 一種胞外體或分泌組，其係來自於ROCK抑制藥之存在下所培養之心肌細胞。
  26. 如請求項25之胞外體或分泌組，其含有以與心血管疾病相關之基因作為靶之小分子RNA。
  27. 如請求項26之胞外體或分泌組，其中上述與心血管疾病相關之基因係與TGFB1訊息傳遞路徑相關之基因。
  28. 一種纖維化抑制劑或去纖維化劑，其含有ROCK抑制藥、於ROCK抑制藥之存在下所培養之心肌細胞、或如請求項25至27中任一項之胞外體或分泌組作為有效成分。
  29. 如請求項23之心肌幹/前驅細胞之誘導劑或心肌幹/前驅細胞之維持培養劑，其中上述ROCK抑制藥為(1R,4r)-4-((R)-1-胺基乙基)-N-(吡啶-4-基)環己烷甲醯胺。
  30. 如請求項24之心肌幹/前驅細胞，其中上述ROCK抑制藥為(1R,4r)-4-((R)-1-胺基乙基)-N-(吡啶-4-基)環己烷甲醯胺。
  31. 如請求項25至27中任一項之胞外體或分泌組，其中上述ROCK抑制藥為(1R,4r)-4-((R)-1-胺基乙基)-N-(吡啶-4-基)環己烷甲醯胺。
  32. 如請求項28纖維化抑制劑或去纖維化劑，其中上述ROCK抑制藥為(1R,4r)-4-((R)-1-胺基乙基)-N-(吡啶-4-基)環己烷甲醯胺。
  33. 一種心血管疾病之發病及/或惡化之抑制劑、或治療劑，其含有用以作用於心肌細胞之ROCK抑制藥作為有效成分。
  34. 如請求項33之抑制劑或治療劑，其中上述心血管疾病為選自由心室功能衰竭、左心室功能衰竭、左心障礙、心功能衰竭、家族性心血管疾病、腦血管功能衰竭、左心室異常、心室異常、末梢血管疾病、動脈粥狀硬化症、動脈硬化症、血管阻塞、血管阻塞症、動脈阻塞、鬱血性心衰竭、及心衰竭所組成之群中之至少一種疾病。
  35. 一種內皮細胞之細胞運動、脈管形成、血管新生、及脈管結構形成之促進劑，其含有用以作用於心肌細胞之ROCK抑制藥作為有效成分。
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