WO2022080455A1 - 心筋幹／前駆細胞の作製方法及び心筋線維化抑制方法 - Google Patents

心筋幹／前駆細胞の作製方法及び心筋線維化抑制方法 Download PDF

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麻生 村中
孝広 落谷
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    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing myocardial stem / progenitor cells using a low molecular weight compound, a method for suppressing cardiomyocyte fibrosis, or a method for long-term culture.
  • Non-Patent Document 5 discloses the fact that fibroblasts of the heart are reprogrammed into cardiomyocytes.
  • These innovative discoveries provide great insight not only into myocardial stem cell theory, but also in myocardial regeneration research. That is, if such reprogramming can be reproduced, the myocardial stem / progenitor cells thus obtained are expected to become an innovative cell source in myocardial regenerative medicine.
  • no method is known for reprogramming cardiomyocytes at various stages into myocardial stem / progenitor cells without genetic modification.
  • Patent Document 1 Non-Patent).
  • Documents 6-9 Non-Patent.
  • small molecule inhibitors with reprogramming from mature / immature cardiomyocytes to myocardial stem / progenitor cells.
  • An object of the present invention is to provide a method for efficiently reprogramming mature / immature cardiomyocytes into myocardial stem / progenitor cells without genetic modification.
  • it is an object of the present invention to provide a method of suppressing the onset and / or exacerbation of cardiovascular disease and activating the development and / or function of the cardiovascular system.
  • the present inventors have found that culturing cardiomyocytes in the presence of a Rho-kinase inhibitor is an undifferentiated marker. It was found that the expression of mature cardiomyocyte marker, aging marker, and / or endothelial cell marker can be suppressed. As a result, we succeeded in reprogramming cardiomyocytes with a Rho-kinase inhibitor, which is a small molecule compound.
  • the Rho-kinase inhibitor brings about the maintenance of an undifferentiated state. I found it.
  • the signal transduction pathway related to cardiovascular disease is suppressed, and the signal transduction pathway related to cardiovascular development and / or function is activated. I found it.
  • co-culture of cardiomyocytes and fibroblasts cultured in the presence of these low molecular weight compounds and culture of fibroblasts in the presence of exosomes derived from the cardiomyocytes can suppress fibrosis. I found it. We also found that the exosome is capable of defibroticizing fibrotic cells.
  • myocardial stem / progenitor cells having self-proliferative ability can be safely and rapidly induced from various cardiomyocytes without genetic modification.
  • cardiomyocytes including myocardial stem / progenitor cells can be stably cultured for a long period of time.
  • cardiomyocytes can be expected to suppress the onset and / or exacerbation of cardiovascular disease, and to activate the development and / or function of the cardiovascular system.
  • cardiomyocytes treated with the ROCK inhibitor of the present invention or secretomes or exosomes derived from the cardiomyocytes can safely and rapidly suppress fibroblast fibrosis and / or defibrosis.
  • the methods of the present invention enable the supply of cardiomyocytes in autologous / allogeneic transplantation and can be used for the treatment and prevention of cardiomyopathy, myocarditis and other diseases associated with myocardial fibrosis, and further, these. It can be used for making model cells, evaluating therapeutic agents, and evaluating cardiotoxicity. Furthermore, since the method of the present invention can safely and rapidly induce and / or maintain myocardial stem / progenitor cells from cardiomyocytes without genetic modification, it can be applied to cardiac function regenerative medicine. It is possible.
  • the vertical axis represents the expression level of each mRNA (Relative mRNA level) when the expression level of cells before culture is 1, the horizontal axis represents the target mRNA, and the numerical value represents the culture period (month). .. For each month of each mRNA, the bar graph on the left shows data for the drug-treated group and the bar graph on the right shows data for the drug-untreated group (control).
  • A Cardiomyocyte precursor cell markers (GATA4, VCAM-1), cardiomyocyte maturation markers (MYL2), and aging markers (CDKN1A,) in cardiomyocytes treated with TGF ⁇ receptor inhibitor (A) or ROCK inhibitor (Y).
  • GATA4, VCAM-1 cardiomyocyte maturation markers
  • CDKN1A aging markers
  • A TGF ⁇ receptor inhibitor
  • Y ROCK inhibitor
  • Endothelial cell markers (CD31) in primary human cardiomyocytes (HCM) or primary human coronary smooth muscle cells (PC-100-021) treated with a TGF ⁇ receptor inhibitor (A) or ROCK inhibitor (Y), It is a photograph of the result of confirming the expression of a muscle cell marker (Troponin T) and Actin by a western blot.
  • NT indicates a drug-naive control
  • HUVEC indicates results using human umbilical vein endothelial cells (CD31 positive, an endothelial cell marker).
  • the results of estimating signal transduction pathway changes by comparing the total RNA of cardiomyocytes treated with a ROCK inhibitor with the total RNA of untreated cardiomyocytes using Industry® Pathway Analysis (IPA).
  • IPA Industry® Pathway Analysis
  • A Shows the estimated results of changes in signal transduction pathways associated with cardiovascular disease.
  • B Shows the estimation results of changes in signal transduction pathways related to the development and function of the cardiovascular system.
  • #Molecules indicates the number of molecules.
  • a and C It is a graph showing the ACTA2 mRNA level of fibroblasts co-cultured with HCM cells (A) or PC-100-021 cells (C).
  • the vertical axis represents the expression level of ACTA2 mRNA in each fibroblast when the expression level of ACTA2 mRNA in fibroblasts not treated with TGF ⁇ is 1. (Relative mRNA level).
  • the horizontal axis indicates the presence or absence of TGF ⁇ treatment and the treated drug (from left to right: TGF- ⁇ (-): no TGF ⁇ treatment, no drug treatment, no co-culture;-: TGF ⁇ -treated, drug-untreated, no co-culture; NT: TGF ⁇ -treated, drug-untreated, co-cultured with myocardial cells; Y: TGF ⁇ -treated, ROCK inhibitor-treated, co-cultured with myocardial cells; A: TGF ⁇ -treated, TGF ⁇ receptor inhibitor-treated, co-cultured with myocardial cells ) (Hereinafter, the same applies to the horizontal axis of the graphs of FIGS.
  • B and D Photographs and graphs of the results of confirming the expression level of ⁇ SMA protein in fibroblasts co-cultured with HCM cells (B) or PC-100-021 cells (D) by Western blotting are shown.
  • TGF- ⁇ no TGF ⁇ treatment, no drug treatment, no co-culture
  • - TGF ⁇ -treated, no drug treatment, no co-culture
  • T TGF ⁇ -treated, drug-untreated, co-cultured with cardiomyocytes
  • Y TGF ⁇ -treated, ROCK inhibitor-treated, co-cultured with cardiomyocytes
  • A TGF ⁇ -treated, TGF ⁇ receptor inhibitor-treated, co-cultured with cardiomyocytes.
  • the graph shows the expression level of ⁇ SMA protein in each fibroblast when the expression level of ⁇ SMA protein in fibroblasts not treated with TGF ⁇ is 1.
  • Relative protein level It is a schematic diagram of the experiment which co-cultured the cardiomyocyte treated with the TGF ⁇ receptor inhibitor or the ROCK inhibitor, and the fibroblast activated by the TGF ⁇ treatment, and the figure which shows the result.
  • a and C It is a graph showing the ACTA2 mRNA level of fibroblasts co-cultured with HCM cells (A) or PC-100-021 cells (C).
  • the vertical axis represents the expression level of ACTA2 mRNA in each fibroblast when the expression level of ACTA2 mRNA in fibroblasts treated with TGF ⁇ , untreated with a drug, and without co-culture with cardiomyocytes is 1. ).
  • B and D Photographs and graphs of the results of confirming the expression level of ⁇ SMA protein in fibroblasts co-cultured with HCM cells (B) or PC-100-021 cells (D) by Western blotting are shown.
  • the graph shows the expression level of ⁇ SMA protein in each fibroblast when the expression level of ⁇ SMA protein in fibroblasts treated with TGF ⁇ , untreated with a drug, and without cardiomyocyte co-culture is set to 1 (Relative protein level).
  • a and C It is a graph showing the ACTA2 mRNA level of fibroblasts cultured in the presence of exosomes derived from HCM cells (A) or PC-100-021 cells (C). The vertical axis represents the expression level of ACTA2 mRNA in each fibroblast when the expression level of ACTA2 mRNA in fibroblasts not treated with TGF ⁇ is 1. (Relative mRNA level).
  • B and D Photographs and graphs of the results of confirming the expression level of ⁇ SMA protein in fibroblasts cultured with exosomes derived from HCM cells (B) or PC-100-021 cells (D) by Western blotting are shown.
  • the graph shows the expression level of ⁇ SMA protein in each fibroblast when the expression level of ⁇ SMA protein in fibroblasts not treated with TGF ⁇ is 1. (Relative protein level).
  • a and C It is a graph showing the ACTA2 mRNA level of fibroblasts cultured in the presence of exosomes derived from HCM cells (A) or PC-100-021 cells (C).
  • the vertical axis represents the expression level of ACTA2 mRNA in each fibroblast when the expression level of ACTA2 mRNA in fibroblasts treated with TGF ⁇ , drug-untreated, and exosome-free is 1. (Relative mRNA level).
  • B and D Photographs and graphs of the results of confirming the expression level of ⁇ SMA protein in fibroblasts cultured with exosomes derived from HCM cells (B) or PC-100-021 cells (D) by Western blotting are shown.
  • the graph shows the expression level of ⁇ SMA protein in each fibroblast when the expression level of ⁇ SMA protein in fibroblasts treated with TGF ⁇ , drug-untreated, and exosome-free is set to 1 (Relative protein level). Immunity when HCM cell-derived products treated with a TGF ⁇ receptor inhibitor or ROCK inhibitor are co-cultured with fibroblasts activated by TGF ⁇ treatment and anti- ⁇ SMA, anti-fibronectin, and anti-collagen I antibody are used as primary antibodies. It is the figure (A) and the graph (B) of the staining.
  • the figure shows, in order from the top, TGF ⁇ -treated and no co-culture (TGF ⁇ (-)), TGF ⁇ -treated and co-cultured (TGF ⁇ (+)), TGF ⁇ -treated and ROCK inhibitor-treated myocardial cell co-culture (TGF ⁇ (+) + Y). ), And TGF ⁇ -treated and TGF ⁇ receptor inhibitor-treated myocardial cell co-culture (TGF ⁇ (+) + A).
  • the graph shows TGF ⁇ -untreated and no co-culture (-), TGF ⁇ -treated and ROCK inhibition when the expression levels of ⁇ SMA protein, fibronectin, and collagen I in fibroblasts (TGFB) treated with TGF ⁇ and without co-culture were set to 1.
  • the figure shows, in order from the top, TGF ⁇ -treated and no exosome added (TGF ⁇ (-)), TGF ⁇ -treated and exosome-free (TGF ⁇ (+)), TGF ⁇ -treated and ROCK inhibitor-treated myocardial cell-derived exosome addition (TGF ⁇ ). (+) + Y), and TGF ⁇ -treated and TGF ⁇ receptor inhibitor-treated myocardial cell-derived exosome addition (TGF ⁇ (+) + A).
  • the graph shows TGF ⁇ -treated and no co-culture (-), TGF ⁇ -treated and ROCK when the expression levels of ⁇ SMA protein, fibronectin and collagen I in TGF ⁇ -treated fibroblasts (without exosomes) (TGFB) were set to 1.
  • the figure shows, in order from the top, TGF ⁇ -treated and no exosome added (TGF ⁇ (-)), TGF ⁇ -treated and exosome-free (TGF ⁇ (+)), TGF ⁇ -treated and ROCK inhibitor-treated myocardial cell-derived exosome addition (TGF ⁇ ). (+) + Y), and TGF ⁇ -treated and TGF ⁇ receptor inhibitor-treated myocardial cell-derived exosome addition (TGF ⁇ (+) + A). Arrows in the figure indicate ⁇ SMA-positive cells.
  • the graph is derived from TGF ⁇ -treated and no co-cultured, TGF ⁇ -treated and ROCK inhibitor-treated myocardial cells when the expression levels of ⁇ SMA protein, fibronectin, and collagen I in TGF ⁇ -treated fibroblasts (without exosomes added) were 1.
  • Exosome-added or TGF ⁇ -treated and TGF ⁇ receptor inhibitor-treated exosome-added fibroblasts derived from myocardial cells expresses ⁇ SMA protein, fibronectin, and collagen I.
  • the graphs are, in order from the left, TGF ⁇ -treated and no co-culture, TGF ⁇ -treated and exosome-free, TGF ⁇ -treated and ROCK inhibitor-treated cardiomyocyte-derived exosome-added, TGF ⁇ -treated and TGF ⁇ receptor inhibitor-treated cardiomyocytes.
  • the results in fibroblasts supplemented with exosomes are shown.
  • (B) It is a figure which shows that 18.5% of the 513 kinds of genes targeted by the microRNA contained in the selected exosome are related to cardiovascular disease.
  • (C) It is a figure which shows the signal transduction pathway of the top 5 species which a gene targeted by a selected microRNA is involved.
  • the present invention comprises treating the myocardial cell with a ROCK inhibitor.
  • a ROCK inhibitor for producing a myocardial stem / progenitor cell from a myocardial cell and a method for producing a myocardial stem / progenitor cell
  • the present invention comprises treating the myocardial cell with a ROCK inhibitor.
  • the method hereinafter, also referred to as "myocardial reprogramming method of the present invention”.
  • the "cardiomyocyte” used in the myocardial reprogramming method of the present invention may be either a mature cardiomyocyte or an immature cardiomyocyte.
  • a cardiomyocyte is a cell expressing at least one cardiomyocyte marker gene (for example, MYL2, cardiac troponin 1, GATA4, VCAM-1, Nkx2.5, etc.), preferably MYL2 and cardiac troponin 1. You may.
  • the animal from which the myocardial cells used in the reprogramming method of the present invention is derived is preferably a mammal, and may be, for example, human, rat, mouse, guinea pig, rabbit, sheep, horse, pig, cow, monkey or the like. Humans, rats and mice are preferred, and humans are most preferred.
  • Cardiomyocytes include cardiomyocytes isolated from the heart extracted from mammals (primary cardiomyocytes), immortalized cardiomyocytes (for example, cardiomyocytes introduced with SV40 large T antigen), and embryonic stem cells (ES cells). ) Or from pluripotent stem cells such as iPS cells and mesenchymal stem cells, known methods for inducing differentiation (eg, J. Clin. Inv., 1999; 103: 697-705 .; Circ Res. 2009; 104 (4)). : E30-41) and cardiomyocytes derived from fibroblasts by direct reprogramming (Circulation Report, Vol. 1 (2019), No. 12: pp. 564-567) and the like. However, it is preferably a primary cardiomyocyte. Alternatively, the cardiomyocytes may be cardiomyocytes present in the heart of the mammalian body.
  • a heart extracted from an adult 10-20 weeks old in the case of rodents, it is preferable to use a heart extracted from an adult 10-20 weeks old, but a heart of an immature individual 8 weeks old or younger may be used.
  • a heart excised from a dead fetus in the case of humans, it is preferable to use an adult heart tissue excised by surgery, but a heart excised from a dead fetus may be used.
  • cells frozen cardiomyocytes obtained by freezing cardiomyocytes isolated and purified from these excised hearts.
  • a method for obtaining cardiomyocytes from a mammalian heart or a piece of tissue thereof a method of digesting cardiomyocytes with collagenase and removing non-parenchymal cells and cell pieces by filtration, centrifugation or the like can be used.
  • CMSC myocardial stem / progenitor cell
  • CMSC myocardial stem / progenitor cell
  • stem cell marker means one or more markers selected from Pdx1, Nkx6.1, Gata4, Vcam1, Hes1, Sox9, Foxa2, CK19, and CD133, preferably Gata4 and /. Or Vcam1.
  • CMSC in the present specification has a low expression level of a maturation marker.
  • the expression levels of CMSC maturation markers herein may be lower compared to fully differentiated cardiomyocytes.
  • the term "maturation marker” means a maturation marker for cardiomyocytes, and examples thereof include Myl2, Myl7, Myh7, Herg, Kcnq1, Tcap, Vcam1, and Sirpa.
  • CMSC in the present specification has less cell death due to treatment with a ROCK inhibitor.
  • CMSCs herein have low expression levels of aging markers.
  • the expression level of the CMSC aging marker in the present specification may be lower than that of mature cardiomyocytes or cardiomyocytes untreated with a ROCK inhibitor.
  • the term "aging marker” means a marker for aging of cardiomyocytes, and examples thereof include CDKN1A, CDKN2A, p53, and aging-related acidic ⁇ -galactosidase (SA- ⁇ -Gal).
  • the level of the stem cell marker, maturation marker, aging marker, endothelial cell marker may be mRNA level or protein level.
  • the ROCK inhibitor is a substance known to have an action of inhibiting the function of Rho-binding kinase, and is, for example, N- [3- [2- (4-amino-1,2, 5-oxadiazole-3-yl) -1-ethylimidazole [5,4-d] pyridin-6-yl] oxyphenyl] -4- (2-morpholine-4-ylethoxy) benzamide (GSK269962A), fasdyl hydrochloride Salt, trans-4-[(1R) -1-aminoethyl] -N-4-pyridinylcyclohexanecarboxamide (Y-27632), 4-methyl-5-[[(2S) -2-methyl-1, 4-Diazepan-1-yl] sulfonyl] isoquinoline (H-1152) and the like can be mentioned, preferably Y-27632.
  • ROCK inhibitors may use one kind of compound or may use two or more kinds of compounds in combination.
  • the ROCK inhibitor may be free, in the form of salts such as hydrochlorides, sulfates, etc., and may be solvates or hydrates.
  • a small molecule signal transduction pathway inhibitor other than the ROCK inhibitor may be used in combination with the ROCK inhibitor.
  • examples of such inhibitors include, but are not limited to, GSK3 inhibitors, MEK inhibitors and the like.
  • the reprogramming method of the present invention When the reprogramming method of the present invention is performed in vitro, it can be performed by culturing cardiomyocytes in the presence of the inhibitor. Specifically, these inhibitors are added to the medium at an effective concentration and cultured.
  • the medium may be any medium that can be used for culturing cardiomyocytes, and examples of commercially available media include CMC medium and the like.
  • the Myocyte basic medium described in the examples Supplement Pack Myocyte Cell GM (including 5% FBS, 5 ⁇ g / mL Insulin, 2 ng / mL FGF-b, 0.5 ng / mL EGF) and 1% Antibiotic. You may use the medium which added and.
  • the concentration of the ROCK inhibitor added to the medium can be appropriately selected from the range of, for example, 0.01-500 ⁇ M, 0.1-100 ⁇ M, and 1-50 ⁇ M, and is more preferably 10 ⁇ M.
  • Culture containers used for culturing include, for example, dishes, petri dishes, tissue culture dishes, multi-dish, microplates, microwell plates, multi-plates, multi-well plates, chamber slides, petri dishes, tubes, trays, culture bags, etc. Can be mentioned.
  • a culture vessel a culture vessel for carrying out suspension culture of cells can be used.
  • an inner surface coated with a cell-supporting substrate can be used for the purpose of improving adhesion to cells.
  • cell-supporting substrates include collagen, atelocollagen, gelatin, matrigel, poly-L-lysine, laminin, fibronectin and the like.
  • Cardiomyocytes can be seeded on culture vessels at a cell density of 10 2-10 6 cells / cm 2 , preferably 10 3-10 5 cells / cm 2 . Cardiomyocytes can be cultured in an atmosphere of a CO 2 incubator (preferably about 5% CO 2 concentration) at 30-40 ° C (preferably about 37 ° C). The culture period may be, for example, 1-4 weeks, preferably 1-3 weeks. It may also be replaced with fresh medium (which may contain the inhibitor) every 1-3 days. Induction to CMSC can be confirmed by the expression of the stem cell marker in cultured cardiomyocytes. Further, the obtained CMSC may be isolated by a method using the stem cell marker (for example, FACS), if necessary.
  • the stem cell marker for example, FACS
  • the cells are trypsinized and dissected and seeded on a new culture vessel at a density of 10 3-10 5 cells / cm 2 .
  • a medium containing a ROCK inhibitor Preferably, it is replaced with a medium containing a ROCK inhibitor.
  • a stable CMSC can be obtained in about 4 to 6 passages. After 10 passages or more, it may be cloned by a conventional method.
  • low-density for example, 10 2-10 3 cells / cm 2
  • cells are seeded in the above culture vessel and passaged over time. It may be carried out by observing or measuring the morphology or number of cells, or the expression of the CMSC marker may be confirmed.
  • direct reprogramming can be performed on cardiomyocytes existing in the heart in the living body. This is done by treating cardiomyocytes in the mammalian heart with a ROCK inhibitor.
  • the ROCK inhibitor may be administered locally to the heart or a site of interest within the heart, or may be administered systemically.
  • the present invention also relates to CMSC obtained by culturing cardiomyocytes in the presence of a ROCK inhibitor.
  • the CMSC can be used as a fibroblast inhibitor described below, or can be prepared as a cardiomyocyte for transplantation through proliferation and redifferentiation.
  • CMSC is redifferentiated into cardiomyocytes by a known differentiation induction method (eg, J. Clin. Inv., 1999; 103: 697-705 .; Circ Res. 2009; 104 (4): e30-41). be able to.
  • Cardiomyocytes differentiated from CMSC or CMSC can be used, for example, for evaluation of cardiotoxicity of a test substance, preparation of myocardium for transplantation, a source of secretome to be released, an agent for suppressing the fibrosis of cardiomyocytes, and the like.
  • a method for assessing the cardiotoxicity of a test substance comprises culturing CMSC or redifferentiated cardiomyocytes in the presence of the test substance.
  • Treatment of CMSC or cardiomyocytes with a test substance is usually performed by adding the test substance to a medium or culture medium for culturing CMSC or cardiomyocytes, but is not limited to this method.
  • the test substance is a protein or the like, it may be treated by introducing a DNA vector expressing the protein into the cell.
  • the method for evaluating the cardiotoxicity of the test substance is to further measure or observe the disorder of CMSC treated with the test substance, and to determine that the test substance has myocardial toxicity when the disorder of CMSC is confirmed. It may be included.
  • methods for assessing myocardial toxicity of a test substance include treating cardiomyocytes with a ROCK inhibitor to obtain CMSC, treating the obtained CMSC with the test substance, and measuring the damage of the CMSC treated with the test substance. Alternatively, it may include observing and determining that the test substance has cardiomyocyte toxicity if CMSC damage is confirmed.
  • the method for evaluating the myocardial toxicity of the test substance is to treat the cardiomyocytes with a ROCK inhibitor to obtain CMSC, to redifferentiate the obtained CMSC into cardiomyocytes, or to use the redifferentiated cardiomyocytes as the test substance.
  • the degree of disability may be indexed, for example, CMSC or cardiomyocyte viability, morphology, or apoptosis or necrosis markers.
  • the survival rate of CMSC or cardiomyocytes is reduced by adding the test substance to the culture solution of CMSC or cardiomyocytes, the test substance is determined to have cardiotoxicity, and the survival rate is increased. If there is no significant change, the test substance is determined to be non-cardiotoxic.
  • the CMSC of the present invention can be used for preparing a myocardium for transplantation.
  • Methods for preparing the myocardium for transplantation may include culturing and propagating the CMSC, redifferentiating the proliferated CMSC into cardiomyocytes, and preparing the redifferentiated myocardium for the myocardium for transplantation. good.
  • the invention relates to a myocardium for transplantation containing cardiomyocytes derived from the CMSC of the invention or the CMSC of the invention.
  • the myocardium for transplantation can be used as a therapeutic agent or a preventive agent for myocardial disorders.
  • Myocardial damage refers to a state in which some abnormality occurs in the myocardium and the function of the heart becomes abnormal, and includes acute cardiovascular disease and chronic cardiovascular disease.
  • chronic cardiovascular diseases include cardiomyopathy (dilated cardiomyopathy and the like), myocarditis, myocardial infarction, cardiac hypertrophy, hypertension and the like.
  • CMSC can be used by suspending it in a suitable isotonic buffer (for example, PBS).
  • PBS isotonic buffer
  • the CMSC suspension varies depending on the type of heart disease, the severity of myocardial damage, etc., but in the case of adults, for example, 10 8-10 11 cells are directly administered into the myocardium, or a catheter is used from the atrium. It can be transplanted by directly administering it to the myocardium.
  • the myocardium for transplantation may be obtained as a myocardial sheet by mixing and culturing cardiomyocytes differentiated from the CMSC of the present invention with vascular endothelial cells and vascular parietal cells.
  • the myocardial sheet is implanted by affixing it to a treated area of the mammalian heart.
  • the present invention relates to a cardiomyocyte culturing method comprising culturing cardiomyocytes in the presence of a ROCK inhibitor.
  • the present invention relates to a method for maintaining and culturing CMSC, which comprises culturing CMSC in the presence of a ROCK inhibitor.
  • Cardiomyocytes and CMSC can be cultured by subculture according to the above culture method.
  • the culturing method of the present invention can be cultivated for a long period of time while maintaining the stem cell / progenitor cell property of CMSC.
  • maintenance of CMSC or maintenance of stem cell / progenitor cells may mean low levels of maturation markers and / or high levels of stem cell markers.
  • the level of the maturation marker expressed by the cardiomyocytes or CMSC after a long period of culture may be lower than the level of the maturation marker expressed by cardiomyocytes cultured in the absence of a ROCK inhibitor.
  • the level of the stem cell marker expressed by the cardiomyocyte or CMSC after the lapse of a long-term culture period may be higher than the level of the stem cell marker expressed by the cardiomyocyte cultured in the absence of the ROCK inhibitor.
  • long term means that the culture period in which cardiomyocytes or induced CMSCs proliferate is longer than that of cardiomyocytes not treated with a ROCK inhibitor, and 20 days or more. It may mean January or more, 40 days or more, or February or more.
  • a drug for inducing CMSC from cardiomyocytes, a long-term culture agent for cardiomyocytes, or a drug for maintaining CMSC induces CMSC from cardiomyocytes containing a ROCK inhibitor as an active ingredient.
  • a drug for this purpose, a long-term culture agent for cardiomyocytes, or a drug for maintaining CMSC may contain the ROCK inhibitor alone as an active ingredient, or may contain other drugs.
  • the invention in another aspect, relates to the use of a ROCK inhibitor to produce a drug for inducing CMSC from cardiomyocytes.
  • the invention further relates to a method of inducing CMSC from cardiomyocytes, comprising administering to a patient in need thereof an effective amount of a ROCK inhibitor.
  • the present invention also relates to ROCK inhibitors for use in methods of inducing CMSC from cardiomyocytes.
  • the invention is a cardiomyocyte-derived exosome or selectome cultured in the presence of a ROCK inhibitor.
  • secretome is a general term for useful components secreted in cell culture supernatants, such as various cytokines, protein components such as chemokines, extracellular matrix such as ECM, and extracellular matrix. Contains fine particles such as vesicles.
  • the "exosome” is a vesicle derived from an endosome membrane formed in an endocytosis process having a diameter of about 20 to 200 nm (preferably 50 to 150 nm) released from various cells. , Mainly composed of lipids, proteins, and nucleic acids (micro RNA, messenger RNA, DNA).
  • the present invention relates to a method for preparing a secretome or an exosome, which comprises culturing cardiomyocytes in the presence of a ROCK inhibitor and recovering the secretome or exosome from the cultured cardiomyocytes.
  • the secretome of the present invention can be obtained as a culture medium (for example, a culture supernatant) in which cardiomyocytes or CMSC are cultured in the presence of a ROCK inhibitor.
  • Cardiomyocytes and CMSC can be cultured according to the above description.
  • the exosome of the present invention can be recovered from the secretome.
  • the method for recovering exosomes from the culture medium or secretome can be carried out by using any known method or a commercially available kit. For example, ultracentrifugation method (for example, Terry C., Curr. Protect. Cell Biol. (2006) Chapter 3: Unit 3.22.), Polymer precipitation method, immunoprecipitation method, FACS method, ultrafiltration method, gel. Examples thereof include a filtration method, an HPLC method, and a method of adsorbing to a carrier such as beads using an antibody or lectin.
  • exosomes may be recovered using a commercially available exosome isolation kit.
  • the ultracentrifugation method is the most commonly used standard method for isolating exosomes.
  • the centrifugal force in the ultracentrifugal method may be, for example, 50,000 ⁇ g or more, 100,000 ⁇ g or more, or 1,500,000 ⁇ g or more, and 300,000 ⁇ g or less, 250,000 ⁇ g. It may be g or less, or 200,000 ⁇ g or less.
  • the centrifugation time is not limited, but can be, for example, 30 minutes to 120 minutes, 60 minutes to 90 minutes, or 70 minutes to 80 minutes.
  • impurities may be removed or reduced by filtering and / or centrifuging at a lower centrifugal force, if necessary, before centrifugation.
  • exosomes can be measured with a nanoparticle tracking system (eg, a device such as NanoSight). Further, on the surface of the exosome particles, for example, molecules such as CD9, CD63, and CD81, which are tetraspanins, are present, and these molecules can be markers for exosomes. The presence of exosomes can also be confirmed by confirming the expression of these proteins and / or genes by an immunological measurement method or the like (for example, Western blotting or the like).
  • Fibrosis-suppressing method fibrosis-suppressing agent, defibrosis method, and defibrosis agent
  • the secretome or exosome released by cardiomyocytes or CMSC treated with a ROCK inhibitor suppresses fibrosis of cardiomyocytes and causes fibers.
  • the defibrotic cardiomyocytes can be defibrotic.
  • the present invention utilizes a selectome or exosome released by a ROCK inhibitor, cardiomyocytes cultured in the presence of a ROCK inhibitor, or cardiomyocytes treated with a ROCK inhibitor to suppress fibrosis. The method and the defibrosis method.
  • the ROCK inhibitor may be directly acted on the cardiomyocytes in the living body to release secretome or exosome by administering the ROCK inhibitor, or the cardiomyocytes treated with the ROCK inhibitor may be used.
  • the selectome or exosome released by cardiomyocytes treated with a ROCK inhibitor may be isolated and / or purified and utilized.
  • fibrosis of cardiomyocytes or defibrosis of fibrotic cardiomyocytes is performed by activation of fibrotic cells by, for example, microRNA contained in selectome or exosome released by cardiomyocytes treated with a ROCK inhibitor. It may be brought about by suppression of genes involved in the signaling pathways involved in fibrosis. Examples of such a signal transduction pathway include TGFB1, E2F1, EGF, HRAS, AGT and the like, and TGFB1 is preferable.
  • the present invention provides a method for suppressing fibrosis and a method for defibrosis of fibroblasts, which comprises treating cardiomyocytes present at positions capable of exerting a paracrine action on fibroblasts with a ROCK inhibitor.
  • cardiomyocytes previously treated with a ROCK inhibitor may be localized in the vicinity of fibroblasts, or both cells may be co-cultured.
  • cardiomyocytes already located in the vicinity of fibroblasts or co-cultured with fibroblasts may be treated with a ROCK inhibitor.
  • the present invention comprises treating cardiomyocytes with a ROCK inhibitor and localizing the cardiomyocytes to fibroblasts at positions where the cardiomyocytes can exert paracrine action. , Concerning a method for suppressing fibroblast fibrosis.
  • the "position capable of exerting the paracrine action” is a position where fibroblasts in the target fibroblasts can be suppressed by the cardiomyocytes treated with the ROCK inhibitor or the selectomes or exosomes produced from CMSC.
  • cardiomyocytes or CMSCs are located near or adjacent to fibroblasts.
  • cardiomyocytes and fibroblasts When co-culturing cardiomyocytes and fibroblasts, they may be cultured on the same surface, or they may be cultured in a form in which selectomes or exosomes released from cardiomyocytes can act on fibroblasts using a chamber or the like. You may. In the case of cultured cells, cardiomyocytes co-cultured with fibroblasts may be treated with a ROCK inhibitor to suppress fibroblast fibrosis.
  • the methods of the invention are to culture cardiomyocytes in the presence of a ROCK inhibitor, to recover secretome or exosomes from the cultured cardiomyocytes, and to treat fibroblasts with the recovered secretome or exosomes. It may be a method for suppressing fibroblast fibrosis, which comprises the above.
  • the method for suppressing fibroblast fibrosis may be a method for preventing or treating a disease associated with cardiomyocyte fibrosis, and a fibroblast inhibitor for fibrosis is a disease associated with cardiomyocyte fibrosis. It may be used as a prophylactic or therapeutic agent.
  • Diseases associated with cardiomyocyte fibrosis include diseases that develop due to cardiomyocyte fibrosis and diseases that are exacerbated by cardiomyocyte fibrosis, such as myocardial damage, myocardial fibrosis, myocardial infarction, cardiac failure, and cardiac. Examples include hypertrophy and hypertension.
  • a method for suppressing the onset and / or exacerbation of cardiovascular disease, and microRNA contained in exosomes derived from myocardial cells treated with an inhibitor ROCK inhibitor are genes related to cardiovascular disease, specifically, cardiovascular disease. Diseases target genes associated with cardiac necrosis and cell death, cardiac enlargement, heart failure, and cardiac palsy. Therefore, by treating cardiomyocytes with a ROCK inhibitor, the onset and / or exacerbation of cardiovascular disease can be suppressed.
  • treatment of cardiomyocytes with ROCK inhibitors can activate signaling pathways for cardiovascular development and / or function. This can promote, for example, endothelial cell motility, angiogenesis, angiogenesis, and development of vasculature.
  • the invention provides myocardial cells with ROCK inhibitors, ROCK inhibitors, myocardial cells cultured in the presence of ROCK inhibitors, selectomes or exosomes released by myocardial cells treated with ROCK inhibitors.
  • Inhibitors of onset and / or exacerbation of cardiovascular disease including treatment, therapeutic agents for cardiovascular disease, endothelial cell motility promoters, angiogenesis promoters, angiogenesis promoters, and vessels.
  • the ROCK inhibitor may be directly acted on the cardiomyocytes in the living body to release secretome or exosome by administering the ROCK inhibitor, or the cardiomyocytes treated with the ROCK inhibitor may be used.
  • the selectome or exosome released by cardiomyocytes treated with a ROCK inhibitor may be isolated and / or purified and utilized.
  • this method suppresses signal transduction pathways related to the cardiovascular disease by means of microRNA contained in exosomes derived from cardiomyocytes treated with a ROCK inhibitor, and / or signals related to the development and / or function of the cardiovascular system. It may include activating the transmission pathway.
  • Cardiovascular diseases include the above-mentioned acute cardiovascular diseases and chronic cardiovascular diseases (for example, cardiovascular disease (dilated cardiovascular disease, etc.), myocarditis, myocardial infarction, heart hypertrophy, hypertension, etc.), as well as ventricular dysfunction.
  • the invention requires an effective amount of secretome or exosome released by a ROCK inhibitor, cardiomyocytes treated with a ROCK inhibitor, or cardiomyocytes treated with a ROCK inhibitor. It relates to a method for suppressing or treating the onset and / or exacerbation of cardiovascular disease, including administration to a patient.
  • the present invention comprises cardiomyocytes treated with a ROCK inhibitor, a ROCK inhibitor, or cardiomyocytes treated with a ROCK inhibitor for producing an inhibitor or therapeutic agent for the onset and / or exacerbation of cardiovascular disease. Concerning the use of secretomes or exosomes to release.
  • the present invention is a ROCK inhibitor, a cardiomyocyte treated with a ROCK inhibitor, or a cardiomyocyte treated with a ROCK inhibitor for suppressing or treating the onset and / or exacerbation of cardiovascular disease. Released by secretomes or exosomes.
  • Selectome and exosome can be obtained from cardiomyocytes treated with a ROCK inhibitor by the above-mentioned method. Treatment with selectomes or exosomes can be performed by culturing cardiomyocytes or fibroblasts in the presence of selectomes or exosomes when performed in vitro. When performed in vivo, the selectome or exosome may be administered locally to the heart or a target site in the heart, or may be administered systemically.
  • the above-mentioned agent may contain, as an active ingredient, a secretome or an exosome released by a ROCK inhibitor, a cardiomyocyte treated with a ROCK inhibitor, or a cardiomyocyte treated with a ROCK inhibitor, or if necessary. And may contain other components.
  • the other ingredients may be pharmaceutically acceptable additives such as sterile water, saline, buffers, excipients, binders, disintegrants. , Emulsifiers, surfactants, stabilizers, lubricants, diluents, fluidity promoters, flavoring agents, colorants, fragrances and the like.
  • the drug of the present invention when used for the purpose of administration to an animal, the drug can be administered in an oral administration form or a parenteral administration form such as an injection or an infusion.
  • these agents may be orally administered as tablets, powders, granules, syrups and the like, or may be administered parenterally as injections and infusions.
  • the dose may be any amount as long as it is effective for achieving the purpose, and can be determined according to symptoms, age, gender, body weight, administration form and the like.
  • the method of the present invention can be carried out in vivo, ex vivo, or in vitro in all cases except when the interpretation is inconsistent.
  • Cardiomyocyte medium was prepared as follows: Myocyte basic medium contains Supplement Pack Myocyte Cell GM (5% FBS, 5 ⁇ g / mL Insulin, 2 ng / mL FGF-b, 0.5 ng / mL EGF). (Promocell, Cat # C-39270) and 1% Antibiotic x Antibiotic were added.
  • the culture medium for PC-100-021 was adjusted as follows: Vascalar Smooth Cell growth medium to Vascalar Smooth Muscle Cell growth Kit (5% FBS, 5% L-Glutamine, 50 ⁇ g / Gluthamine, 50 ⁇ g / mL EGF, 5 ⁇ g / mL Insulin, 5 ng / mL containing FGF-b) (ATCC, Cat # PCS-100-042) and 1% Antibiotic x Antibiotic were added.
  • Example 1 Culture of cardiomyocytes (1) Primary culture Primary human cardiomyocytes (HCM, promocell) and primary human coronary smooth muscle cells (PC-100-021, ATCC) as controls are used for culturing cardiomyocytes, respectively. The cells were seeded on a culture dish containing a suitable cardiomyocyte medium (CMM) and a culture medium for PC-100-021, and cultivated in a plane in an incubator (37 ° C., 5% CO 2 /95% air).
  • CCM cardiomyocyte medium
  • Example 2 Action of TGF ⁇ receptor inhibitor and ROCK inhibitor in myocardial cell culture (1) Culture in the presence of test small molecule compound 3- (6-methyl), which is a TGF ⁇ receptor inhibitor which is a small molecule compound.
  • test small molecule compound 3- (6-methyl), which is a TGF ⁇ receptor inhibitor which is a small molecule compound.
  • -2-Pyridinyl) -n-phenyl-4- (4-quinolinyl) -1H-pyrazole-1-carbothioamide A-83-01: A) (final concentration 1 ⁇ M), ROCK inhibitor (1R, 4r) ) -4- ((R) -1-Aminoethyl) -N- (pyridine-4-yl) cyclohexanecarboxamide (Y-27632: Y) (final concentration 10 ⁇ M), or A-83-01 and Y-27632.
  • Time-lapse photography at low cell density After changing the medium, time-lapse photography was performed using a BZ9000 all-in-one fluorescence microscope (KEYENCE). In addition, individual cells were followed throughout the imaging period (110 days) and the final number of cells derived from each cell was counted.
  • KEYENCE all-in-one fluorescence microscope
  • FIG. 1A shows changes in cell morphology of cardiomyocytes treated with A-83-01 or Y-27632.
  • Treatment with A-83-01 or Y-27632 showed myocardial stem / progenitor cell-like morphology.
  • HCM long-term culture was induced by A-83-01 treatment and Y-27632 treatment (FIG. 1B).
  • FIG. 2 shows the mRNA of cardiomyocyte marker (GATA4, VCAM-1) after culturing HCM cells and PC-100-021 cells in the presence of A-83-01 (A) or Y-27632 (Y).
  • GATA4, VCAM-1 a maturation marker of cardiomyocytes.
  • MYL2 a maturation marker of cardiomyocytes.
  • FIG. 3A mRNA of myocardial progenitor cell marker (GATA4, VCAM-1) after culturing HCM cells and PC-100-021 cells in the presence of A-83-01 (A) or Y-27632 (Y).
  • MYL2 mRNA which is a maturation marker of myocardial cells
  • CDKN1A, CDKN2A mRNA of aging markers
  • NT drug-untreated group
  • differentiation progresses by continuing the culture, and the expression of progenitor cell markers (GATA4, VCAM-1) decreases.
  • the expression of the maturation marker (MYL2) was increased.
  • the endothelial cell marker (CD31) was not expressed in the HCM cells and PC-100-021 cells treated with A-83-01 (A) or Y-27632 (Y), and the muscle cells were not expressed. The markers were expressed, confirming that these cells contained only muscle cells and were free of endothelial cells in the primary culture.
  • Example 3 Characteristics of signal transduction pathway of cardiomyocytes treated with ROCK inhibitor When cardiomyocytes are treated with Y-27632 (Y), a signal transduction pathway that changes as compared with untreated cardiomyocytes is estimated. bottom. For this estimation, Industry® Pathway Analysis (IPA) (QIAGEN) was used according to the manufacturer's instruction manual.
  • IPA Industry® Pathway Analysis
  • cardiomyocytes treated with the ROCK inhibitor Y-27632 (Y) pathways associated with cardiovascular disease were inhibited as compared to untreated cardiomyocytes. Specifically, ventricular dysfunction, left ventricular dysfunction, left heart disorder, cardiac dysfunction, familial cardiovascular disease, cerebrovascular dysfunction, left ventricular abnormality, ventricular abnormality, peripheral vascular disease, atherosclerosis, It was presumed that arteriosclerosis, vascular obstruction, vascular obstruction, arterial obstruction, congestive heart failure, and signaling pathways associated with heart failure were suppressed (FIG. 4A). Thus, it was suggested that signaling pathways associated with cardiovascular disease were reduced in cardiomyocytes treated with ROCK inhibitors.
  • Y-27632 Y-27632
  • signaling pathways associated with myocardial contraction, blood pressure, and myocardial contraction are suppressed, and endothelial cell motility, angiogenesis, angiogenesis, and pulse. It was speculated that signaling pathways associated with the development of vascular structure were activated (Fig. 4B). Therefore, it was suggested that signal transduction pathways related to cardiovascular development and function are activated in cardiomyocytes treated with ROCK inhibitors. In addition, such changes in the signal system suggest that cardiomyocytes treated with a ROCK inhibitor exhibit regenerative properties and are less susceptible to malignant transformation.
  • Example 4 Purification and analysis of exosomes from myocardial stem / progenitor cells
  • Cells were cultured in complete medium until the myocardial stem / progenitor cells reached 70% confluence. As the complete medium, the above-mentioned one was used. Then, the complete medium was replaced with Advanced DMEM (Gibco), and the cells were cultured for another 48 hours. Then, the culture broth was collected, and after centrifugation (2,000 ⁇ g, 10 minutes, 4 ° C.) and filtration with a 0.22 ⁇ m filter, the cell pellet was discarded and the supernatant was collected. Exosomes were continuously isolated from the supernatant by ultracentrifugation. Then, the exosomes were ultracentrifuged (35,000 ⁇ g, 70 minutes, 4 ° C.), dissolved in PBS and stored.
  • FIG. 5 shows a nanoparticle capture system (Nanosight LM-), which is a type of secretome purified by ultracentrifugation from the culture supernatant of cardiomyocytes treated with A-83-01 and Y-27632. The number of particles (A) measured in 10) is shown. Furthermore, the presence of CD9 molecule, CD63 molecule and CD81 molecule contained in the exosome identified by Western blotting is shown. From this, it was shown that exosomes could actually be recovered.
  • Nanoparticle capture system Nanosight LM-
  • Example 5 Marker expression in TGF ⁇ -stimulated fibroblasts co-cultured with cardiomyocytes treated with a TGF ⁇ receptor inhibitor and a ROCK inhibitor Human cardiac fibroblasts were activated with TGF ⁇ for 24 hours. Activated fibroblasts were co-cultured with cardiomyocytes treated with A-83-01 or Y-27632 for 48 hours or longer. Total RNA and protein were extracted for fibrosis activation marker analysis.
  • FIG. 6 shows the mRNA levels (A, C) of ACTA2, which is a fiber-related gene in TGF ⁇ -stimulated fibroblasts co-cultured with cardiomyocytes treated with A-83-01 and Y-27632, and fibrosis markers. It is a graph which shows the protein level (B, D) of ⁇ SMA.
  • the expression levels of ACTA2 and ⁇ SMA can be used as an index of cell fibrosis.
  • the ACTA2 and ⁇ SMA expression levels increased with the fibrosis of human cardiac fibroblasts by TGF ⁇ treatment, but the levels decreased by co-culture with cardiomyocytes, so that the activation of fibroblasts was suppressed. I understand. Therefore, it was shown that the secretome purified from cardiomyocytes treated with the TGF ⁇ receptor inhibitor and the ROCK inhibitor suppresses the activation of fibroblasts.
  • FIG. 7 shows the mRNA levels (A, C) of ACTA2, which is a fiber-related gene in TGF ⁇ -stimulated fibroblasts co-cultured with cardiomyocytes treated with A-83-01 and Y-27632, and fibrosis markers. It is a graph which shows the protein level (B, D) of ⁇ SMA. The graph shows the mean ⁇ standard deviation.
  • the expression levels of ACTA2 and ⁇ SMA can be used as an index of cell fibrosis.
  • the ACTA2 and ⁇ SMA expression levels increased with the fibrosis of human cardiac fibroblasts by TGF ⁇ treatment, but the levels decreased by co-culture with cardiomyocytes, so that the activation of fibroblasts was suppressed. I understand. Therefore, it was shown that the secretome purified from cardiomyocytes treated with the TGF ⁇ receptor inhibitor and the ROCK inhibitor suppresses the activation of fibroblasts.
  • Example 6 Marker expression in TGF ⁇ -stimulated fibroblasts cultured in the presence of cardiomyocyte-derived exosomes treated with a TGF ⁇ receptor inhibitor and ROCK inhibitor Human cardiac fibroblasts were activated with TGF ⁇ for 24 hours. .. Next, cardiomyocyte-derived exosomes (EV) treated with Y-27632 were added, and fibroblasts were cultured for an additional 48 hours. Total RNA and protein were extracted for fibrosis activation marker analysis.
  • EV cardiomyocyte-derived exosomes
  • FIG. 8 shows the mRNA level of ACTA2 expressed by fibroblasts in which exosomes purified from cardiomyocytes treated with A-83-01 and Y-27632 were incorporated into fibroblasts activated by TGF ⁇ treatment (A). , C), and ⁇ SMA protein levels (B, D).
  • the expression levels of ACTA2 and ⁇ SMA increased with the fibrosis of human cardiac fibroblasts by TGF ⁇ treatment, but the levels were significantly decreased by the addition of exosomes, so that the activation of fibroblasts was suppressed. I understood. Therefore, the effect of suppressing the activation of fibroblasts by exosomes purified from cardiomyocytes treated with A-83-01 and Y-27632 was shown.
  • FIG. 9 shows the mRNA level of ACTA2 expressed by fibroblasts in which exosomes purified from cardiomyocytes treated with A-83-01 and Y-27632 were incorporated into fibroblasts activated by TGF ⁇ treatment (A). , C), and ⁇ SMA protein levels (B, D).
  • the graph shows the mean ⁇ standard deviation.
  • the expression levels of ACTA2 and ⁇ SMA increased with the fibrosis of human cardiac fibroblasts by TGF ⁇ treatment, but the levels were significantly decreased by the addition of exosomes, so that the activation of fibroblasts was suppressed. I understood. Therefore, the effect of suppressing the activation of fibroblasts by exosomes purified from cardiomyocytes treated with A-83-01 and Y-27632 was shown.
  • Example 7 Immunostaining Similar to Example 5 or Example 6, fibroblasts activated with TGF ⁇ for 24 hours were co-cultured with HCM cells treated with A-83-01 or Y-27632. Alternatively, the cells were cultured for 48 hours in the presence of exosomes (EV) derived from the HCM cells. The cells were then washed twice with PBS and then fixed with 4% paraformaldehyde for 10 minutes. Cell membranes were permeabilized with 0.1% Triton X lysed with PBS. Blocking was performed on Blocking One (Nacalai Tesque) for 30 minutes and cells were incubated with primary antibody (anti- ⁇ SMA, anti-fibronectin, anti-collagen I) for 1 hour at room temperature. Secondary antibody bound to AlexaFluor 594 was incubated for an additional hour. The nuclei were stained with DAPI (Vectashield).
  • FIG. 10 shows the results of immunostaining when co-cultured HCM treated with A-83-01 or Y-27632 and fibroblasts activated by TGF ⁇ treatment. It was found that the expression of ⁇ SMA, fibronectin, and collagen I was remarkably suppressed by co-culture with HCM treated with a ROCK inhibitor, and the inhibitory effect on the fibrosis of cardiac fibroblasts was confirmed.
  • FIG. 11 shows the immunostaining results when HCM-derived exosomes treated with A-83-01 or Y-27632 were added to fibroblasts activated by TGF ⁇ treatment and cultured. It was found that the expression of ⁇ SMA, fibronectin, and collagen I was remarkably suppressed by HCM-derived exosomes treated with a ROCK inhibitor, and the inhibitory effect on the fibrosis of cardiac fibroblasts was confirmed.
  • FIG. 12 shows typical immunostaining results when HCM-derived exosomes treated with A-83-01 or Y-27632 were added to fibroblasts activated by TGF ⁇ treatment and cultured. ⁇ SMA-positive cells are indicated by white arrows. The graph is shown by mean ⁇ standard deviation.
  • TGF ⁇ treatment induces ⁇ SMA expression and increases ⁇ SMA-positive cells, but further addition of Y-27632-treated HCM-derived exosomes suppresses TGF ⁇ expression and reduces ⁇ SMA-positive cells. It turned out.
  • fibronectin and collagen I was also remarkably suppressed by the exosomes derived from HCM treated with Y-27632, and the inhibitory effect on the fibrosis of cardiac fibroblasts was confirmed.
  • Example 8 Changes in signal transduction pathway in fibroblasts cultured in the presence of cardiomyocyte-derived exosomes treated with a ROCK inhibitor Treatment with activated fibroblasts and Y-27632 (Y).
  • fibroblasts treated with cardiomyocyte-derived exosomes we estimated a signal transduction pathway that changes compared to untreated cardiomyocytes. IPA was used for the estimation according to the manufacturer's instruction manual.
  • fibrosis signaling pathway In activated fibroblasts, hepatic fibroblast / hepatic presentation cell activation, CREB signaling in neurons, axon induction signaling, cardiac hypertrophy signaling (increased), breast cancer control by Stathmin1, atherosclerosis signaling, liver It was presumed that the fibrosis signaling pathway, the STAT3 pathway, macrophages, fibroblasts, the role of the endothelium, and the atherosclerosis pathway were promoted in that order (FIG. 13A).
  • fibroblasts treated with Y-27632 (Y) -treated myocardial-derived exosomes CREB signaling in neurons, sperm motility, breast cancer control by Stathmin1, cardiac hypertrophy signaling, STAT3 pathway, estrogen.
  • Receptor signaling, macrophages, fibroblasts, endothelial role, IL-15 production, hepatic fibrosis / hepatic presentation cell activation, and PTEN signaling were presumed to promote related signaling pathways. (FIG. 13B).
  • Example 9 Changes in activated signal transduction factors in fibroblasts cultured in the presence of cardiomyocyte-derived exosomes treated with a ROCK inhibitor A more specific signal for the signal transduction pathway estimated in Example 8 ROCK inhibition in activated fibroblasts to suppress or promote signaling pathways and activated fibroblasts compared to untreated cardiomyocytes to estimate transduction factors
  • signal transduction pathways that were suppressed or promoted were estimated as compared to untreated cardiomyocytes.
  • IPA was used for the estimation according to the manufacturer's instruction manual.
  • the associated signaling pathways are suppressed in the order of NF ⁇ B (complex), HGF, Vegf, IL17A, IL1B, CSF2, CHUK, EGF, Thrr, TLR4, TGFB1, Tgf beta, TGFB3. , NUPR1, NORAD, TAZ, MRTFA, TGFBR1, TGFB2, DRD2 in that order, it was estimated that the related signaling pathways were promoted (FIGS. 14A, B).
  • activated fibroblasts are treated with exosomes derived from HCM cells treated with a ROCK inhibitor, ESR1, TCF7L2, IRGM, MRTFB, HGF, CD24, MRTFA, MAPK1, and Vegf. , NKX2-3, RC3H1 , Ifnar, IFNB1, IRF3, STAT1, STING1, SEL1L, RNY3, IRF1, Interferon alpha, PML, MAVS, IFNAR1, IFNG, KLF3 in that order. D). Therefore, it was found that the activated signal transduction pathway in activated fibroblasts is suppressed by exosome treatment. Therefore, it was suggested that the specific fibroblast signal transduction pathway is restored by treatment of cardiomyocyte-derived exosomes treated with a ROCK inhibitor.
  • Example 10 Functional analysis of microRNA For exosomes derived from HCM cells treated with a ROCK inhibitor, a group of exosomes in which the contained microRNA is most highly expressed was selected (see FIG. 15A), and the target of the microRNA was selected. The gene was identified. Specifically, the culture medium of HCM cells treated with the ROCK inhibitor was replaced with a serum-free culture medium, and after culturing for 72 hours, 500 ml of the culture supernatant was collected. The culture supernatant was centrifuged at 10,000 xg for 30 minutes to remove crushed cells, and then 100,000 xg at 4 ° C. using an ultracentrifuge (Optima-XE-90) manufactured by Beckman Coulter.
  • Optima-XE-90 ultracentrifuge
  • microRNA was recovered using a microRNAeasy kit (QIAGEN), and 8 ng of the microRNA was analyzed by a next-generation sequencer (DNAchip laboratory).

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Abstract

【課題】遺伝子改変を伴わずに、成熟・幼若心筋細胞を心筋幹／前駆細胞に効率よくリプログラムし、及び／又は線維化を抑制する方法を提供する。 【解決手段】ＲＯＣＫ阻害薬の存在下で初代心筋細胞を培養することにより、心筋幹／前駆細胞を維持することができる。更に、これらの低分子化合物の存在下で培養した心筋細胞又は該心筋細胞由来のエクソソーム又はセレクトームを心臓線維芽細胞に作用させることにより線維化を抑制する。

Description

心筋幹／前駆細胞の作製方法及び心筋線維化抑制方法 関連出願の相互参照
　本国際出願は、２０２０年１０月１４日に日本国特許庁に出願された日本国特許出願第２０２０－１７３５８１号に基づく優先権を主張するものであり、日本国特許出願第２０２０－１７３５８１号の全内容を本国際出願に参照により援用する。
　本発明は、低分子化合物を用いた心筋幹／前駆細胞の作製方法、心筋細胞の線維化抑制方法、又は長期間培養方法に関する。
　幹細胞生物学の目覚ましい進歩は、心筋再生医療におけるその応用に対する重要な位置を占めるが、いまだその実現には至っていない。最も期待される細胞ソースの１つである人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は腫瘍形成リスクが依然として存在し、実臨床への応用については、臨床研究は存在するものの、実用化は困難視されている（非特許文献１～３）。一方、最近の研究により、異なる系譜の細胞を心筋前駆細胞様の細胞に直接転換（ダイレクトリプログラミング）し得ることが示された。しかし、ダイレクトリプログラミングは、ｉＰＳ細胞の場合と同様、Ｇａｔａ４，Ｍｅｆ２ｃ，Ｔｂｘ５などの遺伝子導入による遺伝子改変を伴うため、予期せぬリスクが依然として存在し、再生医療に応用できていない（非特許文献４）。
　最近、心臓の線維芽細胞が心筋細胞へとリプログラミングする事実が相次いで報告された（非特許文献５）。これらの革新的な発見は、心筋幹細胞理論だけでなく、心筋再生研究にも大いなる洞察を与えるものである。即ち、このようなリプログラミングを再現することができれば、そうして得られる心筋幹／前駆細胞は、心筋再生医療における革新的な細胞ソースとなるものと期待される。しかしながら、遺伝子改変を伴わずに、様々なステージの心筋細胞を心筋幹／前駆細胞にリプログラムする方法は全く知られていない。
　本発明者らや他のグループは以前、ある種の低分子阻害薬の組み合わせが、肝臓や胃等において幹細胞の多能性の誘導及び維持に寄与することを報告した（特許文献１、非特許文献６～９）。しかし、これまで低分子阻害薬について、成熟・幼若心筋細胞から心筋幹／前駆細胞へのリプログラミングとの関係は報告されていなかった。
再表２０１８－０７９７１４
Ｃｅｌｌ．　２０１４　Ｏｃｔ　９；１５９（２）：４２８－３９ Ｃｅｌｌ　Ｍｅｔａｂ．　２０１６　Ａｐｒ　１２；　２３（４）：　６２２－６３４ ＩｎｔｅｃｈＯｐｅｎ，　２０１９ＤＯＩ：　ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．５７７２／ｉｎｔｅｃｈｏｐｅｎ．８８８７８． Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，　Ｖｏｌｕｍｅ　２０１８，　Ａｒｔｉｃｌｅ　ＩＤ　１４３５７４６，　ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１５５／２０１８／１４３５７４６ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　Ｒｅｐｏｒｔ．　２０１９，　ｒｅｖｉｅｗ，　ｄｏｉ：１０．１２５３／ｃｉｒｃｒｅｐ．ＣＲ－１９－０１０４ Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ．　２０１０　Ａｕｇ　１０；１０７（３２）：１４２２３－８． Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ．　２０１７　Ｊａｎ　５；２０（１）：４１－５５ Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ．　２０１６　Ｏｃｔ　６；１９（４）：４４９－４６１ ｅＬＩＦＥ，　２０１９，　ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．４７３１３．００１
　本発明の目的は、遺伝子改変を伴わずに、成熟・幼若心筋細胞を心筋幹／前駆細胞に効率よくリプログラムする方法を提供することである。別の態様において、本発明は心筋幹／前駆細胞を分化しない状態で長期間維持させる方法を提供することを目的とする。更に別の態様において、本発明は、線維芽細胞の線維化を抑制し、及び／又は脱繊維化させる方法を提供することを目的とする。更に別の態様において、本発明は、心血管系疾患の発症及び／又は増悪を抑制し、心血管系の発達及び／又は機能を活性化させる方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記の目的を達成すべく、心筋細胞のリプログラミングに寄与し得る低分子化合物について検討を重ねた結果、Ｒｈｏキナーゼ阻害薬の存在下で心筋細胞を培養すると、未分化マーカーの発現が維持され、成熟心筋細胞マーカー、老化マーカー、及び／又は内皮細胞マーカーの発現上昇を抑制できることを見出した。これにより、低分子化合物であるＲｈｏキナーゼ阻害薬による心筋細胞のリプログラミングに成功した。また、Ｒｈｏキナーゼ阻害薬の存在下培養された心筋細胞は、幹細胞としての状態を維持しながら長期間に渡って増殖可能であることから、Ｒｈｏキナーゼ阻害薬が未分化状態の維持をもたらすことを見出した。また、本発明のＲＯＣＫ阻害薬で処理した心筋細胞においては、心血管疾患に関連するシグナル伝達経路が抑制され、心血管の発達及び／又は機能に関連するシグナル伝達経路が活性化されることを見出した。更に、これらの低分子化合物存在下で培養した心筋細胞と線維芽細胞との共培養や、当該心筋細胞由来のエクソソーム存在下での線維芽細胞の培養が、線維化を抑制可能であることを見出した。また、当該エクソソームは線維化した細胞を脱繊維化可能であることを見出した。
　本発明によれば、遺伝子改変を伴わずに、様々な心筋細胞から、自己増殖能を有する心筋幹／前駆細胞を、安全かつ迅速に誘導することができる。また、本発明によれば、心筋幹／前駆細胞を含む心筋細胞を、長期間安定に培養することを可能とする。また、本発明のＲＯＣＫ阻害薬で処理することで、心筋細胞は、心血管疾患の発症及び／又は増悪の抑制、並びに心血管系の発達及び／又は機能の活性化が期待できる。また、本発明のＲＯＣＫ阻害薬で処理した心筋細胞又は当該心筋細胞由来のセクレトーム又はエクソソームは、線維芽細胞の線維化を安全かつ迅速に抑制し、及び／又は脱繊維化させることができる。本発明の方法は、自家／他家移植における心筋細胞の供給を可能とする他、心筋症、心筋炎、その他の心筋の線維化に関連する疾患の治療及び予防に利用でき、更に、これらのモデル細胞の作製や治療薬の評価、心毒性の評価などに利用することができる。さらに、本発明の方法は、遺伝子改変を伴わずに、心筋細胞から、安全かつ迅速に心筋幹／前駆細胞を誘導し、かつ／又は維持することができるため、心臓機能再生医療への応用が可能である。
ＴＧＦβ受容体阻害薬又はＲＯＣＫ阻害薬で処理した心筋細胞の細胞形態の変化及び増殖を示す。Ａ：ＴＧＦβ受容体阻害薬（Ａ）単独の処理、ＲＯＣＫ阻害薬（Ｙ）単独の処理下での長期間培養により、心筋細胞が心筋幹／前駆細胞の形態となることを示す写真である。Ｂ：ＴＧＦβ受容体阻害薬（Ａ）単独投与、ＲＯＣＫ阻害薬（Ｙ）単独投与条件下におけるＨＣＭ細胞の増殖を示すグラフである。Ｃ：ＴＧＦβ受容体阻害薬（Ａ）単独投与、ＲＯＣＫ阻害薬（Ｙ）単独投与条件下における初代ヒト冠動脈平滑筋細胞ＰＣ－１００－０２１細胞の増殖を示すグラフである。 ＴＧＦβ受容体阻害薬（Ａ）又はＲＯＣＫ阻害薬（Ｙ）で処理した心筋細胞における心筋前駆細胞マーカー（ＧＡＴＡ４，ＶＣＡＭ－１）及び心筋細胞の成熟マーカーであるＭＹＬ２のｍＲＮＡ発現を示すグラフである。縦軸は培養前の細胞の発現量を１とした時の各ｍＲＮＡの発現量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｍＲＮＡ　ｌｅｖｅｌ）を表し、横軸の文字は対象となるｍＲＮＡを表し、数値は培養期間（月）を表す。各ｍＲＮＡの各月において、左側の棒グラフは薬剤処理群のデータを示し、右側の棒グラフが薬剤未処理群（コントロール）のデータを示す。 Ａ：ＴＧＦβ受容体阻害薬（Ａ）又はＲＯＣＫ阻害薬（Ｙ）で処理した心筋細胞における心筋前駆細胞マーカー（ＧＡＴＡ４，ＶＣＡＭ－１）、心筋細胞の成熟マーカー（ＭＹＬ２）、及び老化マーカー（ＣＤＫＮ１Ａ，ＣＤＫＮ２Ａ）のｍＲＮＡ発現を示すグラフである。各グラフにおいて、縦軸は培養前の細胞の発現量を１とした時の各ｍＲＮＡの発現量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｍＲＮＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を表し、横軸の数値は培養期間（日）を表す。Ｂ：ＴＧＦβ受容体阻害薬（Ａ）又はＲＯＣＫ阻害薬（Ｙ）で処理した初代ヒト心筋細胞（ＨＣＭ）又は初代ヒト冠動脈平滑筋細胞（ＰＣ－１００－０２１）における、内皮細胞マーカー（ＣＤ３１）、筋細胞マーカー（Ｔｒｏｐｏｎｉｎ　Ｔ）、及びＡｃｔｉｎの発現をウエスタンブロットで確認した結果の写真である。ＮＴは薬剤未処理のコントロールを示し、ＨＵＶＥＣは、ヒト臍帯静脈内皮細胞（内皮細胞マーカーであるＣＤ３１陽性）を用いた結果を示す。 Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ（登録商標）　Ｐａｔｈｗａｙ　Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）を用いて、ＲＯＣＫ阻害薬で処理した心筋細胞のＴｏｔａｌ　ＲＮＡを、未処理の心筋細胞のＴｏｔａｌ　ＲＮＡと比較することにより、シグナル伝達経路変化を推測した結果を示すグラフである。Ａ：心血管疾患に関連するシグナル伝達経路における変化の推測結果を示す。Ｂ：心血管系の発達及び機能に関連するシグナル伝達経路における変化の推測結果を示す。グラフ中のＡｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｚ－ｓｃｏｒｅについては、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．（２０１４）；３０（４）：５２３－５３０．参照。♯Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓは、分子数を示す。 Ａ：ＴＧＦβ受容体阻害薬又はＲＯＣＫ阻害薬で処理した心筋細胞の培養上清中から超遠心法で精製された細胞外小胞の粒子数を示すグラフである。Ｂ：ＴＧＦβ受容体阻害薬及びＲＯＣＫ阻害薬で処理した心筋細胞の培養上清中から超遠心法で精製された細胞外小胞内のＣＤ９分子、ＣＤ６３分子及びＣＤ８１の分子をウエスタンブロット法により同定した結果を表す写真である。 ＴＧＦβ受容体阻害薬又はＲＯＣＫ阻害薬で処理した心筋細胞と、ＴＧＦβ処理によって活性化した線維芽細胞とを共培養した実験の模式図、及びその結果を表す図である。Ａ及びＣ：ＨＣＭ細胞（Ａ）又はＰＣ－１００－０２１細胞（Ｃ）と共培養した繊維芽細胞のＡＣＴＡ２　ｍＲＮＡレベルを表すグラフである。縦軸は、ＴＧＦβ処理していない線維芽細胞におけるＡＣＴＡ２　ｍＲＮＡの発現量を１とした時の各線維芽細胞のＡＣＴＡ２　ｍＲＮＡの発現量を表す（Ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｍＲＮＡ　ｌｅｖｅｌ）。横軸は、ＴＧＦβ処理の有無、及び処理した薬剤（左から順に、ＴＧＦ－β（－）：ＴＧＦβ処理なし、薬剤処理なし、共培養なし；－：ＴＧＦβ処理、薬剤未処理、共培養なし；Ｎ．Ｔ：ＴＧＦβ処理、薬剤未処理、心筋細胞と共培養；Ｙ：ＴＧＦβ処理、ＲＯＣＫ阻害薬処理、心筋細胞と共培養；Ａ：ＴＧＦβ処理、ＴＧＦβ受容体阻害薬処理、心筋細胞と共培養）を表す（以下、図７～図９までのグラフの横軸において同様）。Ｂ及びＤ：ＨＣＭ細胞（Ｂ）又はＰＣ－１００－０２１細胞（Ｄ）と共培養した繊維芽細胞のαＳＭＡタンパク質の発現レベルをウェスタンブロッティングで確認した結果の写真とグラフを表す。写真は、左から順に、ＴＧＦ－β（－）：ＴＧＦβ処理なし、薬剤処理なし、共培養なし；－：ＴＧＦβ処理、薬剤未処理、共培養なし；Ｎ．Ｔ：ＴＧＦβ処理、薬剤未処理、心筋細胞と共培養；Ｙ：ＴＧＦβ処理、ＲＯＣＫ阻害薬処理、心筋細胞と共培養；Ａ：ＴＧＦβ処理、ＴＧＦβ受容体阻害薬処理、心筋細胞と共培養、を表す（以下、図７～図９までの写真において同様）。グラフは、ＴＧＦβ処理していない線維芽細胞におけるαＳＭＡタンパク質の発現量を１とした時の各線維芽細胞のαＳＭＡタンパク質の発現量を表す（Ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｌｅｖｅｌ）。 ＴＧＦβ受容体阻害薬又はＲＯＣＫ阻害薬で処理した心筋細胞と、ＴＧＦβ処理によって活性化した線維芽細胞とを共培養した実験の模式図、及びその結果を表す図である。Ａ及びＣ：ＨＣＭ細胞（Ａ）又はＰＣ－１００－０２１細胞（Ｃ）と共培養した繊維芽細胞のＡＣＴＡ２　ｍＲＮＡレベルを表すグラフである。縦軸は、ＴＧＦβ処理、薬剤未処理、心筋細胞との共培養なしの線維芽細胞におけるＡＣＴＡ２　ｍＲＮＡの発現量を１とした時の各線維芽細胞のＡＣＴＡ２　ｍＲＮＡの発現量を表す（Ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｍＲＮＡ　ｌｅｖｅｌ）。Ｂ及びＤ：ＨＣＭ細胞（Ｂ）又はＰＣ－１００－０２１細胞（Ｄ）と共培養した繊維芽細胞のαＳＭＡタンパク質の発現レベルをウェスタンブロッティングで確認した結果の写真とグラフを表す。グラフは、ＴＧＦβ処理、薬剤未処理、心筋細胞共培養なしの線維芽細胞におけるαＳＭＡタンパク質の発現量を１とした時の各線維芽細胞のαＳＭＡタンパク質の発現量を表す（Ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｌｅｖｅｌ）。 ＴＧＦβ受容体阻害薬又はＲＯＣＫ阻害薬により処理された心筋細胞由来のエクソソームと、ＴＧＦβ処理によって活性化した線維芽細胞とを共培養した実験の模式図、及びその結果を表す図である。Ａ及びＣ：ＨＣＭ細胞（Ａ）又はＰＣ－１００－０２１細胞（Ｃ）由来のエクソソームの存在下で培養した繊維芽細胞のＡＣＴＡ２　ｍＲＮＡレベルを表すグラフである。縦軸は、ＴＧＦβ処理していない線維芽細胞におけるＡＣＴＡ２　ｍＲＮＡの発現量を１とした時の各線維芽細胞のＡＣＴＡ２　ｍＲＮＡの発現量を表す（Ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｍＲＮＡ　ｌｅｖｅｌ）。Ｂ及びＤ：ＨＣＭ細胞（Ｂ）又はＰＣ－１００－０２１細胞（Ｄ）由来のエクソソームと培養した繊維芽細胞のαＳＭＡタンパク質の発現レベルをウェスタンブロッティングで確認した結果の写真とグラフを表す。グラフは、ＴＧＦβ処理していない線維芽細胞におけるαＳＭＡタンパク質の発現量を１とした時の各線維芽細胞のαＳＭＡタンパク質の発現量を表す（Ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｌｅｖｅｌ）。 ＴＧＦβ受容体阻害薬又はＲＯＣＫ阻害薬により処理された心筋細胞由来のエクソソームと、ＴＧＦβ処理によって活性化した線維芽細胞とを共培養した実験の模式図、及びその結果を表す図である。Ａ及びＣ：ＨＣＭ細胞（Ａ）又はＰＣ－１００－０２１細胞（Ｃ）由来のエクソソームの存在下で培養した繊維芽細胞のＡＣＴＡ２　ｍＲＮＡレベルを表すグラフである。縦軸は、ＴＧＦβ処理、薬剤未処理、かつエクソソーム未添加の線維芽細胞におけるＡＣＴＡ２　ｍＲＮＡの発現量を１とした時の各線維芽細胞のＡＣＴＡ２　ｍＲＮＡの発現量を表す（Ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｍＲＮＡ　ｌｅｖｅｌ）。Ｂ及びＤ：ＨＣＭ細胞（Ｂ）又はＰＣ－１００－０２１細胞（Ｄ）由来のエクソソームと培養した繊維芽細胞のαＳＭＡタンパク質の発現レベルをウェスタンブロッティングで確認した結果の写真とグラフを表す。グラフは、ＴＧＦβ処理、薬剤未処理、かつエクソソーム未添加の線維芽細胞におけるαＳＭＡタンパク質の発現量を１とした時の各線維芽細胞のαＳＭＡタンパク質の発現量を表す（Ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｌｅｖｅｌ）。 ＴＧＦβ受容体阻害薬又はＲＯＣＫ阻害薬により処理されたＨＣＭ細胞由来をＴＧＦβ処理によって活性化した線維芽細胞と共培養し、一次抗体として抗αＳＭＡ、抗フィブロネクチン、抗コラーゲンＩ抗体を用いた場合の免疫染色の図（Ａ）及びグラフ（Ｂ）である。図は、上段から順に、ＴＧＦβ未処理かつ共培養なし（ＴＧＦβ（－））、ＴＧＦβ処理かつ共培養（ＴＧＦβ（＋））、ＴＧＦβ処理かつＲＯＣＫ阻害薬処理心筋細胞共培養（ＴＧＦβ（＋）＋Ｙ）、及びＴＧＦβ処理かつＴＧＦβ受容体阻害薬処理心筋細胞共培養（ＴＧＦβ（＋）＋Ａ）を表す。グラフは、ＴＧＦβ処理かつ共培養なしの線維芽細胞（ＴＧＦＢ）におけるαＳＭＡタンパク質、フィブロネクチン、コラーゲンＩの発現量を１とした時の、ＴＧＦβ未処理かつ共培養なし（－）、ＴＧＦβ処理かつＲＯＣＫ阻害薬処理心筋細胞共培養（Ｙ）、又は、ＴＧＦβ処理かつＴＧＦβ受容体阻害薬処理心筋細胞共培養（Ａ）の線維芽細胞におけるαＳＭＡタンパク質、フィブロネクチン、コラーゲンＩの発現量を表す。 ＴＧＦβ受容体阻害薬又はＲＯＣＫ阻害薬により処理されたＨＣＭ細胞由来のエクソソームをＴＧＦβ処理によって活性化した線維芽細胞に添加して培養し、一次抗体として抗αＳＭＡ、抗フィブロネクチン、抗コラーゲンＩ抗体を用いた場合の免疫染色の図（Ａ）及びグラフ（Ｂ）である。図は、上段から順に、ＴＧＦβ未処理かつエクソソームの添加なし（ＴＧＦβ（－））、ＴＧＦβ処理かつエクソソーム未添加（ＴＧＦβ（＋））、ＴＧＦβ処理かつＲＯＣＫ阻害薬処理心筋細胞由来のエクソソーム添加（ＴＧＦβ（＋）＋Ｙ）、及びＴＧＦβ処理かつＴＧＦβ受容体阻害薬処理心筋細胞由来のエクソソーム添加（ＴＧＦβ（＋）＋Ａ）を表す。グラフは、ＴＧＦβ処理した線維芽細胞（エクソソーム未添加）（ＴＧＦＢ）におけるαＳＭＡタンパク質、フィブロネクチン、コラーゲンＩの発現量を１とした時の、ＴＧＦβ未処理かつ共培養なし（－）、ＴＧＦβ処理かつＲＯＣＫ阻害薬処理心筋細胞由来のエクソソーム添加（Ｙ）、又はＴＧＦβ処理かつＴＧＦβ受容体阻害薬処理心筋細胞由来のエクソソーム添加（Ａ）の線維芽細胞のαＳＭＡタンパク質、フィブロネクチン、コラーゲンＩの発現量を表す。 ＴＧＦβ受容体阻害薬又はＲＯＣＫ阻害薬により処理されたＨＣＭ細胞由来のエクソソームをＴＧＦβ処理によって活性化した線維芽細胞に添加して培養し、一次抗体として抗αＳＭＡ、抗フィブロネクチン、抗コラーゲンＩ抗体を用いた場合の免疫染色の図（Ａ）及びグラフ（Ｂ）である。図は、上段から順に、ＴＧＦβ未処理かつエクソソームの添加なし（ＴＧＦβ（－））、ＴＧＦβ処理かつエクソソーム未添加（ＴＧＦβ（＋））、ＴＧＦβ処理かつＲＯＣＫ阻害薬処理心筋細胞由来のエクソソーム添加（ＴＧＦβ（＋）＋Ｙ）、及びＴＧＦβ処理かつＴＧＦβ受容体阻害薬処理心筋細胞由来のエクソソーム添加（ＴＧＦβ（＋）＋Ａ）を表す。図中の矢印は、αＳＭＡ陽性細胞を示す。グラフは、ＴＧＦβ処理した線維芽細胞（エクソソーム未添加）におけるαＳＭＡタンパク質、フィブロネクチン、コラーゲンＩの発現量を１とした時の、ＴＧＦβ未処理かつ共培養なし、ＴＧＦβ処理かつＲＯＣＫ阻害薬処理心筋細胞由来のエクソソーム添加、又はＴＧＦβ処理かつＴＧＦβ受容体阻害薬処理心筋細胞由来のエクソソーム添加の線維芽細胞のαＳＭＡタンパク質、フィブロネクチン、コラーゲンＩの発現量を表す。グラフは、それぞれ左から順に、ＴＧＦβ未処理かつ共培養なし、ＴＧＦβ処理かつエクソソーム未添加、ＴＧＦβ処理かつＲＯＣＫ阻害薬処理心筋細胞由来のエクソソーム添加、ＴＧＦβ処理かつＴＧＦβ受容体阻害薬処理心筋細胞由来のエクソソーム添加の線維芽細胞における結果を示す。 線維化細胞の既存のシグナル伝達経路からの変化をＩＰＡを用いて分析した結果を示すグラフである。（Ａ）線維芽細胞を活性化処理した場合、及び、（Ｂ）心筋細胞をＲＯＣＫ阻害薬処理することにより得られたエクソソームにより、活性化された線維芽細胞を処理した場合、に変化したシグナル伝達経路の上位１０種を示すグラフである。 活性化処理された線維芽細胞において、（Ａ）抑制される上位１０種のシグナル伝達経路、及び、（Ｂ）活性化される上位１０種のシグナル伝達経路、をＩＰＡを用いて分析した結果を示すグラフである。また、心筋細胞をＲＯＣＫ阻害薬処理することにより得られたエクソソームにより、活性化された線維芽細胞を処理した場合の、（Ｃ）抑制される上位２０種のシグナル伝達経路、及び、（Ｄ）活性化される上位２０種のシグナル伝達経路、をＩＰＡを用いて分析した結果を示すグラフである。 （Ａ）実施例１０において、選択されたｍｉｃｒｏＲＮＡが高発現するエクソソームを分析したグラフである。横軸は発現レベルを示す。（Ｂ）選択されたエクソソームが含有するｍｉｃｒｏＲＮＡが標的とする５１３種類の遺伝子のうち、１８．５％が心血管疾患に関連するものであることを示す図である。（Ｃ）選択されたｍｉｃｒｏＲＮＡが標的とする遺伝子が関与する上位５種のシグナル伝達経路を示す図である。
　１．心筋細胞からの心筋幹／前駆細胞の作製方法、及び作成された心筋幹／前駆細胞
　一態様において、本発明は、心筋細胞をＲＯＣＫ阻害薬で処理することを含む、心筋幹／前駆細胞の作製方法に関する（以下、「本発明の心筋リプログラミング法」ともいう）。
　本発明の心筋リプログラミング法において使用される「心筋細胞」は、成熟心筋細胞及び幼若心筋細胞のいずれであってもよい。例えば、心筋細胞は、心筋細胞マーカー遺伝子（例えば、ＭＹＬ２、ｃａｒｄｉａｃ　ｔｒｏｐｏｎｉｎ　１、ＧＡＴＡ４、ＶＣＡＭ－１，　Ｎｋｘ２．５等）を少なくとも１種、好ましくはＭＹＬ２及びｃａｒｄｉａｃ　ｔｒｏｐｏｎｉｎ　１を発現している細胞であってもよい。
　本発明のリプログラミング法に用いる心筋細胞が由来する動物は、好ましくは哺乳動物であり、例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウシ、サル等であってよく、好ましくはヒト、ラット、マウスであり、最も好ましくはヒトである。
　心臓細胞は、哺乳動物から摘出した心臓から単離された心筋細胞（初代心筋細胞）の他、不死化心筋細胞（例えば、ＳＶ４０ラージＴ抗原を導入された心筋細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）又はｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞や間葉系幹細胞から、公知の分化誘導方法（例えば、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖ．，１９９９；１０３：６９７－７０５．；Ｃｉｒｃ　Ｒｅｓ．２００９；１０４（４）：ｅ３０－４１）により得られた心筋細胞、及び、繊維芽細胞からダイレクトリプロクラミングにより誘導された心筋細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　Ｒｅｐｏｒｔ，Ｖｏｌ．１（２０１９），Ｎｏ．１２：ｐｐ．５６４－５６７）などであってよいが、好ましくは初代心筋細胞である。あるいは、心筋細胞は、哺乳動物の体内の心臓に存在する心筋細胞であってもよい。
　初代心筋細胞を使用する場合、例えば、げっ歯類の場合、１０－２０週齢の成体から摘出した心臓を用いることが好ましいが、８週齢以下の幼若個体の心臓を用いてもよい。ヒトの場合、外科手術により切除した成人の心臓組織片を用いることが好ましいが、死亡胎児から切除した心臓を用いてもよい。あるいは、これらの摘出した心臓から単離精製された心筋細胞を凍結した細胞（凍結心筋細胞）を用いることも可能である。哺乳動物の心臓又はその組織片から心筋細胞を得る方法としては、心筋組織をコラゲナーゼで消化させ、濾過、遠心等によって非実質細胞及び細胞片を除去する方法が使用できる。
　本明細書において「心筋幹／前駆細胞」（以下、「ＣＭＳＣ」ともいう）とは、心筋への分化が運命づけられた分化単能性（ｕｎｉｐｏｔｅｎｃｙ）と自己再生能を有する細胞を意味する。好ましくは、本明細書におけるＣＭＳＣは、幹細胞マーカーの発現レベルが高い。例えば、本明細書におけるＣＭＳＣの幹細胞マーカーの発現レベルは、成熟心筋細胞と比較して高くてもよい。本明細書において「幹細胞マーカー」とは、Ｐｄｘ１、Ｎｋｘ６．１、Ｇａｔａ４、Ｖｃａｍ１、Ｈｅｓ１、Ｓｏｘ９、Ｆｏｘａ２、ＣＫ１９、及びＣＤ１３３から選択される１つ以上のマーカーを意味し、好ましくは、Ｇａｔａ４及び／又はＶｃａｍ１である。また、好ましくは、本明細書におけるＣＭＳＣは、成熟マーカーの発現レベルが低い。例えば、本明細書におけるＣＭＳＣの成熟マーカーの発現レベルは、完全に分化した心筋細胞と比較して低くてもよい。本明細書において「成熟マーカー」とは、心筋細胞の成熟マーカーを意味し、Ｍｙｌ２、Ｍｙｌ７、Ｍｙｈ７、Ｈｅｒｇ、Ｋｃｎｑ１、Ｔｃａｐ、Ｖｃａｍ１、Ｓｉｒｐａなどを挙げることができる。また、本明細書におけるＣＭＳＣは、ＲＯＣＫ阻害薬の処理による細胞死が少ない。好ましくは、本明細書におけるＣＭＳＣは、老化マーカーの発現レベルが低い。例えば、本明細書におけるＣＭＳＣの老化マーカーの発現レベルは、成熟心筋細胞又ＲＯＣＫ阻害薬未処理の心筋細胞と比較して低くてもよい。本明細書において「老化マーカー」とは、心筋細胞の老化マーカーを意味し、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ｐ５３、老化関連酸性β－ガラクトシダーゼ（ＳＡ－β－Ｇａｌ）などを挙げることができる。該幹細胞マーカー、成熟マーカー、老化マーカー、内皮細胞マーカーのレベルは、ｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベルであってよい。
　本明細書においてＲＯＣＫ阻害薬とは、Ｒｈｏ結合キナーゼの機能を阻害する作用を有することが知られている物質であり、例えば、Ｎ－［３－［２－（４－アミノ－１，２，５－オキサジアゾール－３－イル）－１－エチルイミダゾ［５，４－ｄ］ピリジン－６－イル］オキシフェニル］－４－（２－モルホリン－４－イルエトキシ）ベンズアミド（ＧＳＫ２６９９６２Ａ）、ファスジル塩酸塩、トランス－４－［（１Ｒ）－１－アミノエチル］－Ｎ－４－ピリジニルシクロヘキサンカルボキサミド（Ｙ－２７６３２）、４－メチル－５－［［（２Ｓ）－２－メチル－１，４－ジアゼパン－１－イル］スルホニル］イソキノリン（Ｈ－１１５２）などが挙げられ、好ましくはＹ－２７６３２である。これらのＲＯＣＫ阻害薬は、１種の化合物を用いてもよいし、２種以上の化合物を組み合わせて用いてもよい。ＲＯＣＫ阻害薬は、フリー体であっても、塩酸塩、硫酸塩等の塩の形であっても、溶媒和物又は水和物であってもよい。
　また、本発明のリプログラミング法においては、ＲＯＣＫ阻害薬以外の低分子シグナル伝達経路阻害薬を、ＲＯＣＫ阻害薬と組み合わせて用いてもよい。そのような阻害薬としては、例えばＧＳＫ３阻害薬、ＭＥＫ阻害薬等が挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明のリプログラミング法を、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで行う場合、前記阻害薬の存在下で心筋細胞を培養することにより行うことができる。具体的には、培地中に有効な濃度でこれらの阻害薬を添加して培養を行う。ここで、培地としては、心筋細胞の培養に使用することができる培地であればよく、市販の培地としては、例えば、ＣＭＣ培地等が挙げられる。また、実施例に記載された、Ｍｙｏｃｙｔｅ　ｂａｓａｌ　ｍｅｄｉｕｍにＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　Ｐａｃｋ　Ｍｙｏｃｙｔｅ　Ｃｅｌｌ　ＧＭ（５％ＦＢＳ、５μｇ／ｍＬ　Ｉｎｓｕｌｉｎ、２ｎｇ／ｍＬ　ＦＧＦ－ｂ、０．５ｎｇ／ｍＬ　ＥＧＦを含む）と１％Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　ｘ　Ａｎｔｉｍｉｔｏｔｉｃとを添加した培地を使用してもよい。ＲＯＣＫ阻害薬の培地への添加濃度は、例えば、０．０１－５００μＭ、０．１－１００μＭ、１－５０μＭの範囲から適宜選択され得、より好ましくは１０μＭである。
　培養に用いられる培養容器は、例えば、デッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用デッシュ、マルチデッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バックなどが挙げられる。培養容器は、細胞の浮遊培養を行うための培養容器を用いることができる。あるいは、接着場用の場合は、内表面が、細胞との接着性を向上させる目的で細胞支持用基質によりコーティングされたものを用いることができる。そのような細胞支持用基質としては、例えば、コラーゲン、アテロコラーゲン、ゼラチン、マトリゲル、ポリ－Ｌ－リジン、ラミニン、フィブロネクチンなどが挙げられる。
　心筋細胞は、１０２－１０６細胞／ｃｍ２、好ましくは１０３－１０５細胞／ｃｍ２の細胞密度で培養容器上に播種することができる。心筋細胞の培養は、ＣＯ２インキュベーター（好ましくは約５％のＣＯ２濃度）の雰囲気下において、３０－４０℃（好ましくは約３７℃）で行うことができる。培養期間としては、例えば１－４週間、好ましくは１－３週間が挙げられる。また、１－３日ごとに新鮮な培地（前記阻害剤を含んでいてもよい）に交換してもよい。ＣＭＳＣへの誘導は、培養心筋細胞における前記幹細胞マーカーの発現により確認することができる。また、得られたＣＭＳＣは、必要に応じて、前記幹細胞マーカーを利用した方法（例えば、ＦＡＣＳなど）により単離してもよい。
　継代する場合、培養細胞が８０％コンフルエントに達した段階で、細胞をトリプシン処理して解離させ、新たな培養容器上に、１０３－１０５細胞／ｃｍ２の密度で播種する。好ましくは、ＲＯＣＫ阻害薬を含有する培地と交換する。４～６継代程度で安定なＣＭＳＣを得ることができる。１０継代以上した後に、常法によりクローン化してもよい。ＣＭＳＣが継代後も維持されていることを確認する方法としては、一例として、低密度（例えば、１０２－１０３細胞／ｃｍ２）の細胞を上記の培養容器に播種し、継時的に細胞の形態又は数を観察又は計測することにより行ってもよいし、ＣＭＳＣマーカーの発現を確認してもよい。
　心筋細胞のＲＯＣＫ阻害薬による処理をｉｎ　ｖｉｖｏで行うことにより、生体内の心臓に存在する心筋細胞に対してダイレクトリプログラミングを行うことができる。この場合、哺乳動物の心臓における心筋細胞をＲＯＣＫ阻害薬で処理することにより行う。ＲＯＣＫ阻害薬は、心臓又は心臓内の目的とする部位に局所的に投与してもよいし、全身投与してもよい。
　また、本発明は、心筋細胞をＲＯＣＫ阻害薬の存在下で培養することにより得られたＣＭＳＣに関する。該ＣＭＳＣは、以下に記載する線維芽細胞の線維化抑制剤として使用することもできるし、増殖及び再分化を経て移植用心筋細胞として調製することもできる。例えばＣＭＳＣは、公知の分化誘導法（例えば、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖ．，１９９９；１０３：６９７－７０５．；Ｃｉｒｃ　Ｒｅｓ．２００９；１０４（４）：ｅ３０－４１）により心筋細胞へと再分化させることができる。ＣＭＳＣ又はＣＭＳＣから分化した心筋細胞は、例えば、被験物質の心毒性の評価、移植用心筋の調製、放出するセクレトームの由来源、及び心筋細胞の繊維化の抑制剤などに利用できる。
　被験物質の心毒性の評価方法は、被験物質の存在下で、ＣＭＳＣ又は再分化させた心筋細胞を培養することを含む。ＣＭＳＣ又は心筋細胞の被験物質による処理は、通常、ＣＭＳＣ又は心筋細胞を培養する培地や培養液に被験物質を添加することによって行うが、この方法に限定されない。例えば、被験物質がタンパク質等の場合には、該タンパク質を発現するＤＮＡベクターを、該細胞へ導入することにより、処理してもよい。被験物質の心毒性の評価方法は、更に、被験物質で処理したＣＭＳＣの障害を測定又は観察すること、及びＣＭＳＣの障害が確認された場合に当該被験物質は心筋毒性を有すると判定することを含んでいてもよい。
　例えば、被験物質の心筋毒性を評価する方法は、心筋細胞をＲＯＣＫ阻害薬で処理してＣＭＳＣを得ること、得られたＣＭＳＣに被験物質で処理すること、被験物質で処理したＣＭＳＣの障害を測定又は観察すること、及びＣＭＳＣの障害が確認された場合に当該被験物質は心筋毒性を有すると判定することを含んでいてもよい。あるいは、被験物質の心筋毒性を評価する方法は、心筋細胞をＲＯＣＫ阻害薬で処理してＣＭＳＣを得ること、得られたＣＭＳＣを心筋細胞へと再分化させること、再分化した心筋細胞を被験物質で処理すること、被験物質で処理した心筋細胞の障害を測定又は観察すること、及び、心筋細胞の障害が確認された場合に当該被験物質は心筋毒性を有すると判定することを含んでいてもよい。障害の程度は、例えばＣＭＳＣ又は心筋細胞の生存率、形態、あるいはアポトーシスやネクローシスマーカーを指標としてもよい。具体的には、例えば、ＣＭＳＣ又は心筋細胞の培養液に被験物質を添加することにより、ＣＭＳＣ又は心筋細胞の生存率が低下する場合、該被験物質は心毒性を有すると判定され、生存率に有意な変化がない場合、該被験物質は心毒性を有しないと判定される。
　また、本発明のＣＭＳＣは、移植用心筋の調製に利用することができる。移植用心筋の調製方法は、ＣＭＳＣを培養し、増殖させること、増殖させたＣＭＳＣを心筋細胞に再分化させること、及び再分化させた心筋細胞を移植用心筋の調製することを含んでいてもよい。よって、一態様において、本発明は、本発明のＣＭＳＣ又は本発明のＣＭＳＣから誘導された心筋細胞を含有する移植用心筋に関する。また、前記移植用心筋は、心筋障害の治療剤又は予防剤として使用することができる。心筋障害とは、心筋に何らかの異常が生じて、心臓の働きに異常が生じた状態をいい、急性心血管疾患及び慢性心血管疾患を含む。慢性心血管疾患としては、例えば、心筋症（拡張型心筋症等）、心筋炎、心筋梗塞、心肥大、高血圧症等が挙げられる。ＣＭＳＣは適当な等張緩衝液（例えば、ＰＢＳ）に懸濁して使用することができる。ＣＭＳＣ懸濁液は、心臓疾患の種類、心筋障害の重篤度等によっても異なるが、例えば成人の場合、１０８－１０１１個の細胞を心筋内に直接投与したり、カテーテルで心房内から心筋に直接投与したりする等により移植することができる。また、移植用心筋は、本発明のＣＭＳＣから分化した心筋細胞を血管内皮細胞、血管壁細胞と混合培養して心筋シートとしてもよい。該心筋シートは哺乳動物の心臓の治療箇所に貼付することにより移植される。
　２．心筋細胞の培養方法、ＣＭＳＣの維持培養方法
　別の態様において、本発明はＲＯＣＫ阻害薬の存在下で心筋細胞を培養することを含む、心筋細胞の培養方法に関する。また別の態様において、本発明はＲＯＣＫ阻害薬の存在下でＣＭＳＣを培養させることを含む、ＣＭＳＣの維持培養方法に関する。
　心筋細胞及びＣＭＳＣの培養は、上記培養方法に準じて継代培養することにより行うことができる。特に、本発明の培養方法は、ＣＭＳＣの幹細胞性／前駆細胞性を維持しながら長期間培養することが可能である。本明細書において、ＣＭＳＣの維持又は幹細胞性／前駆細胞性の維持とは、成熟マーカーのレベルが低く、かつ／又は幹細胞マーカーのレベルが高いことを意味していてもよい。例えば、長期間培養期間経過後において前記心筋細胞又はＣＭＳＣが発現する成熟マーカーのレベルは、ＲＯＣＫ阻害薬の非存在下で培養した心筋細胞が発現する成熟マーカーのレベルより低くてもよい。また、長期間培養期間経過後において前記前記心筋細胞又はＣＭＳＣが発現する幹細胞マーカーのレベルは、ＲＯＣＫ阻害薬の非存在下で培養した心筋細胞が発現する幹細胞マーカーのレベルより高くてもよい。本明細書において、「長期間」とは、ＲＯＣＫ阻害薬で処理していない心筋細胞と比較して、心筋細胞又は誘導されたＣＭＳＣが増殖する培養期間が長いことを意味し、２０日以上、１月以上、４０日以上、又は２月以上を意味してもよい。
　３．心筋細胞からＣＭＳＣを誘導するための薬剤、心筋細胞の長期間培養剤、又はＣＭＳＣの維持用薬剤
　一態様において、本発明は、ＲＯＣＫ阻害薬を有効成分として含有する、心筋細胞からＣＭＳＣを誘導するための薬剤、心筋細胞の長期間培養剤、又はＣＭＳＣの維持用薬剤である。該ＲＯＣＫ阻害薬を含む薬剤は、有効成分としてＲＯＣＫ阻害薬を単独で含んでいてもよいし、他の薬剤を含んでいてもよい。
　別の態様において、本発明は、心筋細胞からＣＭＳＣを誘導するための薬剤を製造のためのＲＯＣＫ阻害薬の使用に関する。本発明はさらに、それを必要とする患者に有効量のＲＯＣＫ阻害薬を投与することを含む、心筋細胞からＣＭＳＣを誘導する方法に関する。本発明はまた、心筋細胞からＣＭＳＣを誘導する方法に使用するためのＲＯＣＫ阻害薬に関する。
　４．セクレトーム及びエクソソーム
　一態様において本発明は、ＲＯＣＫ阻害薬の存在下で培養された心筋細胞由来のエクソソーム若しくはセレクトームである。本明細書において、「セクレトーム」とは、細胞培養上清中に分泌された有用成分の総称であり、例えば、様々なサイトカイン、ケモカインなどのタンパク質成分や、ＥＣＭなどの細胞外基質や細胞外小胞などの微粒子を含む。また、本明細書において、「エクソソーム」とは、様々な細胞から放出される直径約２０～２００ｎｍ（好ましくは、５０～１５０ｎｍ）のエンドサイトーシス過程で形成されるエンドソーム膜由来の小胞であり、主には脂質、タンパク質、核酸（ｍｉｃｒｏ　ＲＮＡ，ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ　ＲＮＡ，ＤＮＡ）で構成される。
　別の態様において、本発明は、ＲＯＣＫ阻害薬の存在下で心筋細胞を培養すること、及び、培養された心筋細胞からセクレトーム又はエクソソームを回収することを含む、セクレトーム又はエクソソームの調製方法に関する。
　本発明のセクレトームは、ＲＯＣＫ阻害薬の存在下で心筋細胞又はＣＭＳＣを培養した培養液（例えば培養上清）として得ることができる。心筋細胞及びＣＭＳＣの培養は、上述の記載に準じて行うことができる。
　本発明のエクソソームは、前記セクレトームから回収することができる。培養液又はセクレトーム中からエクソソームを回収する方法は、任意の公知の方法又は市販のキットを用いて行うことができる。例えば、超遠心分離法（例えば、Ｔｈｅｒｙ　Ｃ．，　Ｃｕｒｒ．　Ｐｒｏｔｏｃ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．（２００６）　Ｃｈａｐｔｅｒ　３：Ｕｎｉｔ　３．２２．）、ポリマー沈殿法、免疫沈降法、ＦＡＣＳ法、限外濾過法、ゲル濾過法、ＨＰＬＣ法、及び抗体やレクチンを利用してビーズ等の担体に吸着させる方法が挙げられる。また、市販のエクソソーム単離用キット用いて、エクソソームを回収してもよい。
　上記回収方法のうち、超遠心分離法は、エクソソームの単離に最も一般的に利用されている標準的な方法である。超遠心分離法における遠心力は、例えば５０，０００×ｇ以上、１００，０００×ｇ以上、又は１，５００，０００×ｇ以上であってよく、また３００，０００×ｇ以下、２５０，０００×ｇ以下、又は２００，０００×ｇ以下であってよい。遠心時間は、限定しないが、例えば、３０分～１２０分、６０分～９０分、又は７０分～８０分間とすることができる。また、遠心分離前に、必要に応じて、フィルター濾過及び／又はより低い遠心力での遠心分離を行うことにより、夾雑物を除去又は低減してもよい。
　エクソソームの存在はナノパーティクルトラッキングシステム（例えば、ＮａｎｏＳｉｇｈｔのような機器）で計測可能である。また、エクソソームの粒子の表面には、例えば、テトラスパニンであるＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１などの分子が存在しており、これらの分子は、エクソソームのマーカーとなり得る。これらのタンパク質及び／又は遺伝子の発現を免疫学的測定法等（例えば、ウェスタンブロット等）で確認することにより、エクソソームの存在を確認することもできる。
　５．線維化抑制方法、線維化抑制剤、脱繊維化方法、及び脱繊維化剤
　ＲＯＣＫ阻害薬で処理した心筋細胞又はＣＭＳＣが放出するセクレトーム又はエクソソームは、心筋細胞の繊維化を抑制し、かつ、線維化した心筋細胞を脱繊維化することができる。よって、別の態様において、本発明は、ＲＯＣＫ阻害薬、ＲＯＣＫ阻害薬の存在下で培養された心筋細胞、あるいは、ＲＯＣＫ阻害薬で処理した心筋細胞が放出するセレクトーム又はエクソソームを利用した線維化抑制方法及び脱繊維化方法に関する。本方法においては、ＲＯＣＫ阻害薬を投与することにより直接生体内の心筋細胞にＲＯＣＫ阻害薬を作用させてセクレトーム又はエクソソームを放出させてもよく、ＲＯＣＫ阻害薬で処理した心筋細胞を用いてもよく、又は、ＲＯＣＫ阻害薬で処理した心筋細胞が放出するセレクトーム又はエクソソームを単離及び／又は精製して利用してもよい。また、心筋細胞の繊維化、または、線維化した心筋細胞の脱繊維化は、例えば、ＲＯＣＫ阻害薬で処理した心筋細胞が放出するセレクトーム又はエクソソームが含有するｍｉｃｒｏＲＮＡによる、繊維化細胞の活性化又は線維化に関わるシグナル伝達経路に含まれる遺伝子の抑制によりもたらされてもよい。このようなシグナル伝達経路としては、ＴＧＦＢ１、Ｅ２Ｆ１、ＥＧＦ、ＨＲＡＳ、ＡＧＴなどが挙げられ、好ましくは、ＴＧＦＢ１である。
　ＲＯＣＫ阻害薬を投与して直接生体内の心筋細胞を処理する場合、既に線維芽細胞の近傍に位置する心筋細胞にＲＯＣＫ阻害薬を作用させることができる。よって、本発明は、線維芽細胞に対してパラクライン作用を発揮可能な位置に存在する心筋細胞をＲＯＣＫ阻害薬で処理することを含む、線維芽細胞の線維化抑制方法及び脱繊維化方法を含む。
　細胞を利用する場合、予めＲＯＣＫ阻害薬で処理した心筋細胞を用いて、該心筋細胞を線維芽細胞の近傍に局在化させるか、又は両細胞を共培養することにより実施してもよい。あるいは、既に線維芽細胞の近傍に位置するか、又は線維芽細胞と共培養している心筋細胞にＲＯＣＫ阻害薬で処理してもよい。より具体的には、本発明は、心筋細胞をＲＯＣＫ阻害薬で処理すること、及び該心筋細胞がパラクライン作用を発揮可能な位置で該心筋細胞を線維芽細胞と局在化させることを含む、線維芽細胞の線維化抑制方法に関する。
　「パラクライン作用」とは、ＲＯＣＫ阻害薬で処理した心筋細胞又はＣＭＳＣから分泌された物質が該心筋細胞又はＣＭＳＣの周囲の細胞や組織に作用することを意味する。よって、「パラクライン作用を発揮可能な位置」とは、ＲＯＣＫ阻害薬で処理した心筋細胞又はＣＭＳＣから産生されるセレクトーム又はエクソソームが目的とする繊維芽細胞における線維化を抑制可能な位置であり、好ましくは、心筋細胞又はＣＭＳＣは、線維芽細胞の近傍又は隣接する位置に存在する。予めＲＯＣＫ阻害薬で処理した心筋細胞を生体内の線維芽細胞に作用させる場合、当該心筋細胞は、心臓又は心臓内の目的とする部位に局所的に移植することができる。すなわち、本発明のＲＯＣＫ阻害薬で処理した心筋細胞又はＣＭＳＣを、心臓に移植することにより、心臓局部でセクレトームを放出してパラクライン作用により周囲の線維芽細胞による線維化を抑制することができる。
　心筋細胞と線維芽細胞を共培養する場合、同一表面上で培養してもよいし、チャンバーなどを利用して、心筋細胞から放出されるセレクトーム又はエクソソームが線維芽細胞に作用可能な形態で培養してもよい。培養細胞の場合には、線維芽細胞と共培養している心筋細胞をＲＯＣＫ阻害薬で処理して、線維芽細胞の線維化を抑制してもよい。
　ＲＯＣＫ阻害薬で処理した心筋細胞又はＣＭＳＣの培養上清及び培養上清から分離精製したエクソソームは、心筋細胞の繊維化を抑制する。よって、また、本発明の線維化抑制方法は、ＲＯＣＫ阻害薬で処理した心筋細胞又はＣＭＳＣが放出するセクレトーム又はエクソソームを用いて行うこともできる。よって、本発明は、ＲＯＣＫ阻害薬の存在下で培養した心筋細胞から抽出されたセクレトーム又はエクソソームで、線維芽細胞を処理することを含む、線維芽細胞の線維化抑制方法に関する。例えば、本発明の方法は、ＲＯＣＫ阻害薬の存在下で心筋細胞を培養すること、培養された心筋細胞からセクレトーム又はエクソソームを回収すること、及び回収されたセクレトーム又はエクソソームで、線維芽細胞を処理することを含む、線維芽細胞の線維化抑制方法であってもよい。
　本明細書において、線維芽細胞の線維化抑制方法は、心筋細胞の繊維化を伴う疾患の予防方法又は治療方法としてもよく、線維芽細胞の線維化抑制剤は心筋細胞の繊維化を伴う疾患の予防剤又は治療剤としてもよい。心筋細胞の繊維化を伴う疾患としては、心筋細胞の繊維化により発症する疾患及び心筋細胞の繊維化により増悪化する疾患が含まれ、例えば、心筋障害、心筋繊維化、心筋梗塞、心不全、心肥大、高血圧症等が挙げられる。
　６．心血管系疾患の発症及び／又は増悪の抑制方法、並びに抑制剤
　ＲＯＣＫ阻害薬で処理した心筋細胞由来のエクソソームに内包されるｍｉｃｒｏＲＮＡは、心血管疾患に関連する遺伝子、具体的には、心血管疾患として、心臓のネクローシス及び細胞死、心拡大、心不全、心臓麻痺に関連する遺伝子をターゲットとする。よって、ＲＯＣＫ阻害薬で心筋細胞を処理することにより、心血管疾患の発症及び／又は悪化を抑制することができる。また、ＲＯＣＫ阻害薬を心筋細胞に処理することにより、心血管系の発達及び／又は機能に関するシグナル伝達経路を活性化させることができる。これにより、例えば、内皮細胞の細胞運動、脈管形成、血管新生、及び脈管構造の発達を促進させることができる。よって、別の態様において、本発明は、ＲＯＣＫ阻害薬、ＲＯＣＫ阻害薬、ＲＯＣＫ阻害薬の存在下で培養された心筋細胞、ＲＯＣＫ阻害薬で処理した心筋細胞が放出するセレクトーム又はエクソソームを心筋細胞に処理することを含む、心血管系疾患の発症及び／若しくは増悪の抑制剤、心血管系疾患の治療剤、内皮細胞の細胞運動促進剤、脈管形成促進剤、血管新生促進剤、及び脈管構造の発達促進剤に関する。本方法においては、ＲＯＣＫ阻害薬を投与することにより直接生体内の心筋細胞にＲＯＣＫ阻害薬を作用させてセクレトーム又はエクソソームを放出させてもよく、ＲＯＣＫ阻害薬で処理した心筋細胞を用いてもよく、又は、ＲＯＣＫ阻害薬で処理した心筋細胞が放出するセレクトーム又はエクソソームを単離及び／又は精製して利用してもよい。また、本方法は、ＲＯＣＫ阻害薬で処理した心筋細胞由来のエクソソームに内包されるｍｉｃｒｏＲＮＡにより、該心血管疾患に関するシグナル伝達経路を抑制し、かつ／又は心血管系の発達及び／又は機能に関するシグナル伝達経路を活性化することを含んでもよい。心血管疾患としては、上述の急性心血管疾患及び慢性心血管疾患（例えば、心筋症（拡張型心筋症等）、心筋炎、心筋梗塞、心肥大、高血圧症等）の他、心室機能不全、左心室機能不全、左心障害、心機能不全、家族性心血管疾患、脳血管機能不全、左心室異常、心室異常、末梢血管疾患、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、血管閉塞、血管閉塞症、動脈閉塞、うっ血性心不全、及び心不全であってもよい。
　別の態様において、本発明は、本発明は、ＲＯＣＫ阻害薬、ＲＯＣＫ阻害薬で処理した心筋細胞、又はＲＯＣＫ阻害薬で処理した心筋細胞が放出するセクレトーム若しくはエクソソームの有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、心血管系疾患の発症及び／若しくは増悪の抑制方法又は治療方法に関する。また、本発明は心血管系疾患の発症及び／若しくは増悪の抑制剤又は治療剤を製造するための、ＲＯＣＫ阻害薬、ＲＯＣＫ阻害薬で処理した心筋細胞、又はＲＯＣＫ阻害薬で処理した心筋細胞が放出するセクレトーム若しくはエクソソームの使用に関する。あるいは、本発明は、心血管系疾患の発症及び／若しくは増悪を抑制するための、又は治療するための、ＲＯＣＫ阻害薬、ＲＯＣＫ阻害薬で処理した心筋細胞、又はＲＯＣＫ阻害薬で処理した心筋細胞が放出するセクレトーム若しくはエクソソームに関する。
　７．投与方法・製剤
　セレクトーム及びエクソソームは上述の方法によりＲＯＣＫ阻害薬で処理した心筋細胞から得ることができる。セレクトーム又はエクソソームによる処理は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで行う場合には、セレクトーム又はエクソソームの存在下で心筋細胞又は線維芽細胞を培養することにより行うことができる。ｉｎ　ｖｉｖｏで行う場合には、セレクトーム又はエクソソームは、心臓又は心臓内の目的とする部位に局所的に投与してもよいし、全身投与してもよい。
　上述の薬剤は、有効成分として、ＲＯＣＫ阻害薬、ＲＯＣＫ阻害薬で処理した心筋細胞、又はＲＯＣＫ阻害薬で処理した心筋細胞が放出するセクレトーム若しくはエクソソームを単独で含んでいてもよいし、必要に応じて、他の成分を含有していてもよい。例えば、当該薬剤が動物への投与を目的とする場合、他の成分とは、薬学的に許容可能な添加物、例えば滅菌水、生理食塩水、緩衝剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、乳化剤、界面活性剤、安定化剤、滑沢剤、希釈剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、及び香料等であってもよい。例えば、本発明の薬剤を動物への投与を目的として使用する場合、それらの薬剤を、経口投与形態、又は注射剤、点滴剤等の非経口投与形態で投与することができる。また、それらの薬剤は、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等として経口投与してもよいし、又は、注射剤、点滴剤として非経口的に投与してもよい。投与量は、目的を達成するために有効な量であればよく、症状、年齢、性別、体重、投与形態等に応じて決定することができる。
　本発明の方法は、そのように解釈することが不整合である場合を除き全て、ｉｎ　ｖｉｖｏ、ｅｘ　ｖｉｖｏ、又はｉｎ　ｖｉｔｒｏで行うことができる。
　以下に実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、これは本発明の範囲を限定するものではない。なお、本願明細書全体を通じて引用する文献は、参照によりその全体が本願明細書に組み込まれる。
（培地の調製）
　心筋細胞培地（ＣＭＭ）は、以下のように調整した：Ｍｙｏｃｙｔｅ　ｂａｓａｌ　ｍｅｄｉｕｍにＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　Ｐａｃｋ　Ｍｙｏｃｙｔｅ　Ｃｅｌｌ　ＧＭ（５％ＦＢＳ、５μｇ／ｍＬ　Ｉｎｓｕｌｉｎ、２ｎｇ／ｍＬ　ＦＧＦ－ｂ、０．５ｎｇ／ｍＬ　ＥＧＦを含む）（プロモセル、Ｃａｔ＃Ｃ－３９２７０）と１％Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　ｘ　Ａｎｔｉｍｉｔｏｔｉｃとを添加した。
　ＰＣ－１００－０２１の培養用培地は、以下のように調整した：Ｖａｓｃｕｌａｒ　Ｓｍｏｏｔｈ　Ｍｕｓｃｌｅ　Ｃｅｌｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｍｅｄｉｕｍにＶａｓｃｕｌａｒ　Ｓｍｏｏｔｈ　Ｍｕｓｃｌｅ　Ｃｅｌｌ　ｇｒｏｗｔｈ　Ｋｉｔ（５％ＦＢＳ、５％Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、５０μｇ／ｍＬ　Ａｓｃｏｒｂｉｃ　ａｃｉｄ、５ｎｇ／ｍＬ　ＥＧＦ、５　μｇ／ｍＬ　Ｉｎｓｕｌｉｎ、５ｎｇ／ｍＬ　ＦＧＦ－ｂを含む）（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ＃ＰＣＳ－１００－０４２）と１％Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　ｘ　Ａｎｔｉｍｉｔｏｔｉｃとを添加した。
　完全培地はＡｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，ｃａｔ．Ｎｏ．１２４９１）を使用した。
（実施例１）心筋細胞の培養
　（１）初代培養
　初代ヒト心筋細胞（ＨＣＭ、プロモセル）及びコントロールとして初代ヒト冠動脈平滑筋細胞（ＰＣ－１００－０２１、ＡＴＣＣ）を、それぞれ、心筋細胞の培養に適した心筋細胞培地（ＣＭＭ）及びＰＣ－１００－０２１の培養用培地を含有する培養皿上に播種し、インキュベーター内（３７℃、５％ＣＯ２／９５％ａｉｒ）で平面培養した。
　（２）継代培養
　上述の初代培養のヒト心筋細胞を、ＴｒｙｐＬＥ　Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で処理して回収し、コラーゲンＩでコートした培養容器（２μｇ／ｃｍ２，１５０ｍｍディッシュ）に９×１０３細胞／ｃｍ２で播種してＶａｓｃｕｌａｒ　Ｓｍｏｏｔｈ　Ｍｕｓｃｌｅ　Ｃｅｌｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｍｅｄｉｕｍまたは、Ｍｙｏｃｙｔｅ　ｂａｓａｌ　ｍｅｄｉｕｍ培地中で培養した。培養した細胞をＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）１（タカラバイオ）を用いて凍結ストックを調製した。
（実施例２）心筋細胞培養におけるＴＧＦβ受容体阻害薬及びＲＯＣＫ阻害薬の作用
　（１）被験低分子化合物存在下での培養
　低分子化合物であるＴＧＦβ受容体阻害薬である３－（６－メチル－２－ピリジニル）－ｎ－フェニル－４－（４－キノリニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボチオアミド（Ａ－８３－０１：Ａ）（終濃度１μＭ）、ＲＯＣＫ阻害薬である（１Ｒ、４ｒ）－４－（（Ｒ）－１－アミノエチル）－Ｎ－（ピリジン－４－イル）シクロヘキサンカルボキサミド（Ｙ－２７６３２：Ｙ）（終濃度１０μＭ）、又はＡ－８３－０１とＹ－２７６３２の両方の化合物を含有する又は非含有の３ｍＬＶａｓｃｕｌａｒ　Ｓｍｏｏｔｈ　Ｍｕｓｃｌｅ　Ｃｅｌｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｍｅｄｉｕｍまたは、Ｍｙｏｃｙｔｅ　ｂａｓａｌ　ｍｅｄｉｕｍ培地を含む３５ｍｍプレート（ＩＷＡＫＩ）上に、継代培養したヒト心筋細胞を０．５×１０２細胞／ｃｍ２で播種した。３日目に各低分子化合物を含有するＶａｓｃｕｌａｒ　Ｓｍｏｏｔｈ　Ｍｕｓｃｌｅ　Ｃｅｌｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｍｅｄｉｕｍまたは、Ｍｙｏｃｙｔｅ　ｂａｓａｌ　ｍｅｄｉｕｍ培地と交換した。その後、３日毎に同様に培地交換を行った。
　（２）低細胞密度での低速度撮影
　培地交換後、ＢＺ９０００オールインワン蛍光顕微鏡　（キーエンス）を用いて低速度撮影を行った。また、個々の細胞を撮影期間（１１０日間）を通じて追跡し、各細胞に由来する最終の細胞数を計測した。
　図１Ａは、Ａ－８３－０１又はＹ－２７６３２で処理した心筋細胞の細胞形態の変化を示す。Ａ－８３－０１又はＹ－２７６３２で処理することにより、心筋幹／前駆細胞様の形態を示した。ＨＣＭにおいては、Ａ－８３－０１処理、Ｙ－２７６３２処理で長期間培養が誘導された（図１Ｂ）。ＰＣ－１００－０２１においては、Ａ－８３－０１処理で長期間培養が誘導された（図１Ｃ）。
　（３）定量的ＲＴ－ＰＣＲ
　被験低分子化合物存在下での培養１月後及び２月後の各心筋細胞から、ｍｉＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて全ＲＮＡを単離した。逆転写反応は、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ　ｃＤＮＡ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓを用い、製造者のガイドラインに従って実施した。得られたｃＤＮＡを鋳型として、Ｔａｑｍａｎ　Ｐｒｏｂｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いてＰＣＲを行った。標的遺伝子の発現レベルは内在性コントロールであるβ－アクチンで標準化した。
　図２に、ＨＣＭ細胞及びＰＣ－１００－０２１細胞を、Ａ－８３－０１（Ａ）又はＹ－２７６３２（Ｙ）存在下で培養した後の心筋前駆細胞マーカー（ＧＡＴＡ４，ＶＣＡＭ－１）のｍＲＮＡ、及び心筋細胞の成熟マーカーであるＭＹＬ２のｍＲＮＡの発現量を示す。ＨＣＭ細胞及びＰＣ－１００－０２１細胞共に、薬剤未処理群（Ｎ．Ｔ．）においては、培養を継続することにより分化が進み、前駆細胞マーカー（ＧＡＴＡ４，ＶＣＡＭ－１）の発現が減少するとともに、成熟マーカー（ＭＹＬ２）の発現が上昇した。この前駆細胞マーカー（ＧＡＴＡ４，ＶＣＡＭ－１）の減少と成熟マーカー（ＭＹＬ２）の上昇は、ＨＣＭ細胞及びＰＣ－１００－０２１細胞をＹ－２７６３２で処理することにより抑制された。一方で、Ａ－８３－０１による処理は前駆細胞マーカー（ＧＡＴＡ４，ＶＣＡＭ－１）の減少と成熟マーカー（ＭＹＬ２）の上昇を促進させてしまうことが示された。
　図３Ａに、ＨＣＭ細胞及びＰＣ－１００－０２１細胞を、Ａ－８３－０１（Ａ）又はＹ－２７６３２（Ｙ）存在下で培養した後の心筋前駆細胞マーカー（ＧＡＴＡ４，ＶＣＡＭ－１）のｍＲＮＡ、心筋細胞の成熟マーカーであるＭＹＬ２のｍＲＮＡ、及び老化マーカー（ＣＤＫＮ１Ａ，ＣＤＫＮ２Ａ）のｍＲＮＡの発現量を示す。ＨＣＭ細胞及びＰＣ－１００－０２１細胞共に、薬剤未処理群（Ｎ．Ｔ．）においては、培養を継続することにより分化が進み、前駆細胞マーカー（ＧＡＴＡ４，ＶＣＡＭ－１）の発現が減少するとともに、成熟マーカー（ＭＹＬ２）の発現が上昇した。この前駆細胞マーカー（ＧＡＴＡ４，ＶＣＡＭ－１）の減少と成熟マーカー（ＭＹＬ２）の上昇は、ＨＣＭ細胞及びＰＣ－１００－０２１細胞をＹ－２７６３２で処理することにより抑制された。一方で、Ａ－８３－０１による処理は成熟マーカー（ＭＹＬ２）の上昇を促進させることが示された。さらに、老化マーカー（ＣＤＫＮ１Ａ，ＣＤＫＮ２Ａ）は、Ａ－８３－０１（Ａ）又はＹ－２７６３２（Ｙ）を処理したＨＣＭ細胞及びＰＣ－１００－０２１細胞では、ほとんど発現しなかった。よって、Ａ－８３－０１（Ａ）又はＹ－２７６３２（Ｙ）の処理による細胞死は少ないことが示された。また、図３Ｂより、Ａ－８３－０１（Ａ）又はＹ－２７６３２（Ｙ）を処理したＨＣＭ細胞及びＰＣ－１００－０２１細胞では、内皮細胞マーカー（ＣＤ３１）は発現しておらず、筋細胞マーカーは発現しており、これらの細胞は、筋細胞のみを含み、初代培養において、内皮細胞が混入していなかったことが確認された。
（実施例３）ＲＯＣＫ阻害薬を処理した心筋細胞のシグナル伝達経路に関する特性
　心筋細胞をＹ－２７６３２（Ｙ）で処理した場合に、未処理の心筋細胞と比較して変化するシグナル伝達経路を推定した。該推定には、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ（登録商標）　Ｐａｔｈｗａｙ　Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）（ＱＩＡＧＥＮ社）をメーカーの取扱説明書に従って使用した。
　ＲＯＣＫ阻害薬であるＹ－２７６３２（Ｙ）で処理した心筋細胞において、未処理の心筋細胞と比較して、循環器疾患に関連する経路が阻害されていた。具体的には、心室機能不全、左心室機能不全、左心障害、心機能不全、家族性心血管疾患、脳血管機能不全、左心室異常、心室異常、末梢血管疾患、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、血管閉塞、血管閉塞症、動脈閉塞、うっ血性心不全、及び心不全に関連するシグナル伝達経路が抑制されることが推定された（図４Ａ）。よって、心血管疾患に関連するシグナル伝達経路が、ＲＯＣＫ阻害薬の処理された心筋細胞において、減少することが示唆された。また、心筋細胞をＹ－２７６３２（Ｙ）で処理した場合に、心収縮、血圧、及び心筋収縮に関連するシグナル伝達経路が抑制され、内皮細胞の細胞運動、脈管形成、血管新生、及び脈管構造の発達に関連するシグナル伝達経路が活性化することが推定された（図４Ｂ）。よって、ＲＯＣＫ阻害薬により処理した心筋細胞において、心血管系の発達及び機能に関連するシグナル伝達経路が活性化することが示唆された。
　また、このようなシグナル系の変化より、ＲＯＣＫ阻害薬で処理した心筋細胞は、再生特性を表し、悪性の形質転換を受けにくいことが示唆された。
（実施例４）心筋幹／前駆細胞からのエクソソームの精製及び解析
　心筋幹／前駆細胞が７０％コンフルエントに達するまで、細胞を完全培地で培養した。完全培地は、上述の物を使用した。その後、完全培地をＡｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）に交換し、さらに４８時間培養した。その後、培養液を回収し、遠心分離（２，０００×ｇ、１０分間、４℃）及び０．２２μｍフィルターによるろ過の後、細胞ペレットを廃棄し上清を回収した。その上清からエクソソームを連続で超遠心分離により単離した。そして、エクソソームを超遠心分離（３５，０００×ｇ、７０分間、４℃）して、ＰＢＳに溶解して保存した。
　図５は、Ａ－８３－０１及びＹ－２７６３２により処理された心筋細胞の培養上清中から超遠心法で精製されたセクレトームの一種であるエクソソーム（ＥＶ）をナノ粒子補足システム（Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ　ＬＭ－１０）で測定した粒子数（Ａ）を示す。さらに、ウエスタンブロット法により同定されたエクソソームが含有するＣＤ９分子、ＣＤ６３分子及びＣＤ８１の分子の存在を示す。このことから、実際にエクソソームが回収できたことが示された。
（実施例５）ＴＧＦβ受容体阻害薬及びＲＯＣＫ阻害薬により処理された心筋細胞と共培養したＴＧＦβ刺激線維芽細胞におけるマーカー発現
　ヒト心臓線維芽細胞をＴＧＦβで２４時間活性化させた。活性化された線維芽細胞をＡ－８３－０１又はＹ－２７６３２で処理された心筋細胞と４８時間以上共培養した。線維症活性化マーカー分析のために総ＲＮＡ及びタンパク質を抽出した。
　図６は、Ａ－８３－０１及びＹ－２７６３２により処理された心筋細胞と共培養したＴＧＦβ刺激線維芽細胞における線維関連遺伝子であるＡＣＴＡ２のｍＲＮＡレベル（Ａ、Ｃ）、及び線維化マーカーであるαＳＭＡのタンパク質レベル（Ｂ、Ｄ）を表すグラフである。ＡＣＴＡ２及びαＳＭＡの発現レベルは、細胞の繊維化の指標とすることができる。ＡＣＴＡ２及びαＳＭＡ発現レベルは、ＴＧＦβ処理によるヒト心臓線維芽細胞の繊維化に伴って上昇するが、心筋細胞との共培養によってそのレベルは低下したことから、線維芽細胞の活性化が抑制されたことがわかった。よって、ＴＧＦβ受容体阻害薬及びＲＯＣＫ阻害薬により処理された心筋細胞から精製されたセクレトームにより線維芽細胞の活性化が抑制される効果が示された。
　図７は、Ａ－８３－０１及びＹ－２７６３２により処理された心筋細胞と共培養したＴＧＦβ刺激線維芽細胞における線維関連遺伝子であるＡＣＴＡ２のｍＲＮＡレベル（Ａ、Ｃ）、及び線維化マーカーであるαＳＭＡのタンパク質レベル（Ｂ、Ｄ）を表すグラフである。グラフは平均値±標準偏差で示す。ＡＣＴＡ２及びαＳＭＡの発現レベルは、細胞の繊維化の指標とすることができる。ＡＣＴＡ２及びαＳＭＡ発現レベルは、ＴＧＦβ処理によるヒト心臓線維芽細胞の繊維化に伴って上昇するが、心筋細胞との共培養によってそのレベルは低下したことから、線維芽細胞の活性化が抑制されたことがわかった。よって、ＴＧＦβ受容体阻害薬及びＲＯＣＫ阻害薬により処理された心筋細胞から精製されたセクレトームにより線維芽細胞の活性化が抑制される効果が示された。
（実施例６）ＴＧＦβ受容体阻害薬及びＲＯＣＫ阻害薬により処理された心筋細胞由来のエクソソーム存在下で培養したＴＧＦβ刺激線維芽細胞におけるマーカー発現
　ヒト心臓線維芽細胞をＴＧＦβで２４時間活性化させた。次に、Ｙ－２７６３２で処理された心筋細胞由来のエクソソーム（ＥＶ）を添加し、線維芽細胞をさらに４８時間培養した。線維症活性化マーカー分析のために総ＲＮＡ及びタンパク質を抽出した。
　図８は、Ａ－８３－０１及びＹ－２７６３２により処理された心筋細胞から精製されたエクソソームをＴＧＦβ処理によって活性化した線維芽細胞に取り込ませた線維芽細胞が発現するＡＣＴＡ２のｍＲＮＡレベル（Ａ、Ｃ）、及びαＳＭＡのタンパク質レベル（Ｂ、Ｄ）を表すグラフである。ＡＣＴＡ２及びαＳＭＡ発現レベルは、ＴＧＦβ処理によるヒト心臓線維芽細胞の繊維化に伴って上昇するが、エクソソームの添加によってそのレベルは顕著に低下したことから、線維芽細胞の活性化が抑制されたことがわかった。よって、Ａ－８３－０１及びＹ－２７６３２により処理された心筋細胞から精製されたエクソソームにより線維芽細胞の活性化が抑制される効果が示された。
　図９は、Ａ－８３－０１及びＹ－２７６３２により処理された心筋細胞から精製されたエクソソームをＴＧＦβ処理によって活性化した線維芽細胞に取り込ませた線維芽細胞が発現するＡＣＴＡ２のｍＲＮＡレベル（Ａ、Ｃ）、及びαＳＭＡのタンパク質レベル（Ｂ、Ｄ）を表すグラフである。グラフは平均値±標準偏差で示す。ＡＣＴＡ２及びαＳＭＡ発現レベルは、ＴＧＦβ処理によるヒト心臓線維芽細胞の繊維化に伴って上昇するが、エクソソームの添加によってそのレベルは顕著に低下したことから、線維芽細胞の活性化が抑制されたことがわかった。よって、Ａ－８３－０１及びＹ－２７６３２により処理された心筋細胞から精製されたエクソソームにより線維芽細胞の活性化が抑制される効果が示された。
（実施例７）免疫染色
　実施例５又は実施例６と同様に、ＴＧＦβで２４時間活性化させた線維芽細胞をＡ－８３－０１又はＹ－２７６３２で処理されたＨＣＭ細胞と共培養し、又は該ＨＣＭ細胞由来のエクソソーム（ＥＶ）の存在下で４８時間培養した。次に、細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、４％パラホルムアルデヒドを１０分間加え固定した。細胞膜をＰＢＳで溶解した０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘで透過処理した。ブロッキングは、ブロッキングワン（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｏｎｅ、ナカライテスク）で３０分間実行し、細胞を室温で１時間、一次抗体（抗αＳＭＡ、抗フィブロネクチン、抗コラーゲンＩ）とインキュベートした。　ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ　５９４に結合した二次抗体をさらに１時間インキュベートした。核をＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ）で染色した。
　Ａ－８３－０１又はＹ－２７６３２により処理されたＨＣＭと、ＴＧＦβ処理によって活性化した線維芽細胞を共培養した場合の免疫染色の結果を図１０に示す。αＳＭＡ、フィブロネクチン、コラーゲンＩの発現が、ＲＯＣＫ阻害薬により処理されたＨＣＭとの共培養によって顕著に抑制されていることが分かり、心臓線維芽細胞の繊維化の阻害効果が確認できた。
　Ａ－８３－０１又はＹ－２７６３２により処理されたＨＣＭ由来のエクソソームをＴＧＦβ処理によって活性化した線維芽細胞に添加して培養した場合の免疫染色結果を図１１に示す。αＳＭＡ、フィブロネクチン、コラーゲンＩの発現が、ＲＯＣＫ阻害薬により処理されたＨＣＭ由来のエクソソームによって顕著に抑制されていることが分かり、心臓線維芽細胞の繊維化の阻害効果が確認できた。
　Ａ－８３－０１又はＹ－２７６３２により処理されたＨＣＭ由来のエクソソームをＴＧＦβ処理によって活性化した線維芽細胞に添加して培養した場合の代表的な免疫染色結果を図１２に示す。αＳＭＡ陽性細胞を白色矢印で示す。また、グラフは平均値±標準偏差で示す。ＴＧＦβ処理により、αＳＭＡの発現が誘導され、αＳＭＡ陽性細胞が増えるが、さらに、Ｙ－２７６３２により処理されたＨＣＭ由来のエクソソームを添加することにより、ＴＧＦβによる発現が抑制され、αＳＭＡ陽性細胞が減少することが分かった。同様に、フィブロネクチン、コラーゲンＩの発現についても、Ｙ－２７６３２により処理されたＨＣＭ由来のエクソソームによって顕著に抑制されていることが分かり、心臓線維芽細胞の繊維化の阻害効果が確認できた。
（実施例８）ＲＯＣＫ阻害薬により処理された心筋細胞由来のエクソソーム存在下で培養した線維芽細胞におけるシグナル伝達経路の変化
　活性化された線維芽細胞、及びＹ－２７６３２（Ｙ）で処理された心筋細胞由来のエクソソームを処理された線維芽細胞において、未処理の心筋細胞と比較して変化するシグナル伝達経路を推定した。該推定には、ＩＰＡをメーカーの取扱説明書に従って使用した。
　活性化された繊維芽細胞において、肝繊維症／肝呈細胞の活性化、神経細胞におけるＣＲＥＢシグナリング、軸策誘導シグナリング、心肥大シグナリング（増加）、Ｓｔａｔｈｍｉｎ１による乳癌制御、アテローム性動脈硬化シグナリング、肝繊維症シグナル伝達経路、ＳＴＡＴ３経路、マクロファージ、繊維芽細胞、内皮の役割、及び骨関節炎経路の順で、関連するシグナル伝達経路が促進されることが推定された（図１３Ａ）。一方で、Ｙ－２７６３２（Ｙ）で処理された心筋細胞由来のエクソソームを処理された線維芽細胞においては、神経細胞におけるＣＲＥＢシグナリング、精子運動、Ｓｔａｔｈｍｉｎ１による乳癌制御、心肥大シグナリング、ＳＴＡＴ３経路、エストロゲン受容体シグナリング、マクロファージ、繊維芽細胞、内皮の役割、ＩＬ－１５生成、肝繊維症／肝呈細胞の活性化、ＰＴＥＮシグナリングの順で、関連するシグナル伝達経路が促進されることが推定された（図１３Ｂ）。
（実施例９）ＲＯＣＫ阻害薬により処理された心筋細胞由来のエクソソーム存在下で培養した線維芽細胞における活性化シグナル伝達因子の変化
　実施例８において推定されたシグナル伝達経路について、より具体的なシグナル伝達因子を推定するために、活性化された線維芽細胞において、未処理の心筋細胞と比較して、抑制又は促進されるシグナル伝達経路、並びに活性化された線維芽細胞に対して、ＲＯＣＫ阻害薬により処理されたＨＣＭ細胞由来のエクソソームを処理した場合に、未処理の心筋細胞と比較して、抑制又は促進されるシグナル伝達経路を推定した。該推定には、ＩＰＡをメーカーの取扱説明書に従って使用した。
　活性化された繊維芽細胞において、ＮＦκＢ（複合体）、ＨＧＦ、Ｖｅｇｆ、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＣＳＦ２、ＣＨＵＫ、ＥＧＦ、Ｔｌｒ、ＴＬＲ４の順で関連するシグナル伝達経路が抑制され、ＴＧＦＢ１、Ｔｇｆ　ｂｅｔａ、ＴＧＦＢ３、ＮＵＰＲ１、ＮＯＲＡＤ、ＴＡＺ、ＭＲＴＦＡ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢ２、ＤＲＤ２の順で関連するシグナル伝達経路が促進されることが推定された（図１４Ａ、Ｂ）。
　一方で、活性化された線維芽細胞に対して、ＲＯＣＫ阻害薬により処理されたＨＣＭ細胞由来のエクソソームを処理した場合には、ＥＳＲ１、ＴＣＦ７Ｌ２、ＩＲＧＭ、ＭＲＴＦＢ、ＨＧＦ、ＣＤ２４、ＭＲＴＦＡ、ＭＡＰＫ１、Ｖｅｇｆ、ＮＫＸ２－３、ＲＣ３Ｈ１、Ｉｒｇｍ１、ＩＬ１ＲＮ、ＡＣＫＲ２、ＩＬ４、ＴＲＩＭ２４、Ｔｇｆ　ｂｅｔａ、ＳＭＡＤ４、ＥＳＲ２、ＰＴＧＥＲ４の順で関連するシグナル伝達経路が抑制され、ＩＦＮＬ１、ＩＲＦ７、ＩＦＮＡ２、ＭＩＲ１７ＨＧ、ＧＲＩＮ３Ａ、Ｈｂｂ－ｂ１、Ｉｆｎａｒ、ＩＦＮＢ１、ＩＲＦ３、ＳＴＡＴ１、ＳＴＩＮＧ１、ＳＥＬ１Ｌ、ＲＮＹ３、ＩＲＦ１、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　ａｌｐｈａ、ＰＭＬ、ＭＡＶＳ、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＧ、ＫＬＦ３の順で関連するシグナル伝達経路が促進されることが推定された（図１４Ｃ、Ｄ）。したがって、活性化した繊維芽細胞において活性化されたシグナル伝達経路は、エクソソームの処理により抑制されることが分かった。よって、具体的な線維芽細胞のシグナル伝達経路は、ＲＯＣＫ阻害薬処理した心筋細胞由来のエクソソームの処理により回復することが示唆された。
（実施例１０）ｍｉｃｒｏＲＮＡの機能解析
　ＲＯＣＫ阻害薬により処理されたＨＣＭ細胞由来のエクソソームについて、内包されているｍｉｃｒｏＲＮＡが最も高く発現しているエクソソーム群を選択し（図１５Ａ参照）、そのｍｉｃｒｏＲＮＡの標的遺伝子を同定した。具体的には、ＲＯＣＫ阻害薬により処理されたＨＣＭ細胞の培養液を、血清フリーの培養液に交換し、７２時間培養後、その培養上清液５００ｍｌを回収した。その培養上清液を１０，０００×ｇ、３０分遠心して細胞の破砕物などを除去した後、ベックマンコールター社製超遠心機（Ｏｐｔｉｍａ－ＸＥ－９０）にて１００，０００×ｇ、４℃、７０分で超遠心した後、ペレットをＰＢＳ（－）にて溶解し、さらに１００，０００×ｇ、４℃、７０分間超遠心した後、適量のＰＢＳ（－）に溶解した。このエクソソーム分画から、マイクロＲＮＡｅａｓｙキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、ｍｉｃｒｏＲＮＡを回収し、その８ｎｇを次世代シークエンサーでＲＮＡ解析を行った（ＤＮＡｃｈｉｐ研究所）。
　その結果、選択されたｍｉｃｒｏＲＮＡが標的とする５１３種類の遺伝子のうちの１８．５％が、心臓のネクローシス及び細胞死、心拡大、心不全などの心血管疾患に関連することが示された（図１５Ｂ参照）。また、選択されたｍｉｃｒｏＲＮＡの標的遺伝子は、ＴＧＦＢ１シグナル伝達経路に深く関与していることが示された（図１５Ｃ参照）。

Claims (23)

  1. 　心筋細胞をＲＯＣＫ阻害薬で処理することを含む、心筋幹／前駆細胞の作製方法。
  2. 　ＲＯＣＫ阻害薬の存在下で心筋細胞を培養することを含む、心筋細胞の培養方法。
  3. 　培養期間が１月以上であり、及び／又は培養期間経過後において前記心筋細胞が発現する、心筋細胞の成熟マーカー、老化マーカー、及び内皮細胞マーカーから選択される１種類以上のマーカーのレベルが、ＲＯＣＫ阻害薬の非存在下で培養した心筋細胞が発現する心筋細胞の当該マーカーのレベルより低いことを特徴とする、請求項２に記載の培養方法。
  4. 　成熟マーカーがＭＹＬ２であり、かつ／あるいは、老化マーカーがＣＤＫＮ１Ａ及び／又はＣＤＫＮ２Ａであり、かつ／あるいは、内皮細胞マーカーがＣＤ３１である、請求項３に記載の培養方法。
  5. 　培養期間経過後において前記心筋細胞が発現する、心筋前駆細胞マーカーのレベルが、ＲＯＣＫ阻害薬の非存在下で培養した心筋細胞が発現する心筋細胞の当該マーカーのレベルより高いことを特徴とする、請求項３又は請求項４に記載の培養方法。
  6. 　ＲＯＣＫ阻害薬の存在下で心筋幹／前駆細胞を培養させることを含む、心筋幹／前駆細胞の維持培養方法。
  7. 　請求項２～請求項５に記載の方法で培養された心筋細胞からセクレトーム又はエクソソームを回収することを含む、セクレトーム又はエクソソームの調製方法。
  8. 　ＲＯＣＫ阻害薬で処理された心筋細胞を、該心筋細胞がパラクライン効果を発揮可能な位置で線維芽細胞と局在させることを含む、線維芽細胞の線維化抑制方法。
  9. 　線維芽細胞に対してパラクライン作用を発揮可能な位置に存在する心筋細胞をＲＯＣＫ阻害薬で処理することを含む、線維芽細胞の線維化抑制方法。
  10. 　ＲＯＣＫ阻害薬の存在下で培養した心筋細胞から抽出されたセクレトーム又はエクソソームで、線維芽細胞を処理することを含む、線維芽細胞の線維化抑制方法。
  11. 　ＲＯＣＫ阻害薬の存在下で心筋細胞を培養すること、
    　培養された心筋細胞からセクレトーム又はエクソソームを回収すること、
    　回収されたセクレトーム又はエクソソームで、線維芽細胞を処理することを含む、請求項８に記載の線維芽細胞の線維化抑制方法。
  12. 　前記ＲＯＣＫ阻害薬が、（１Ｒ、４ｒ）－４－（（Ｒ）－１－アミノエチル）－Ｎ－（ピリジン－４－イル）シクロヘキサンカルボキサミドである、請求項１～請求項１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 　前記心筋細胞が、ヒト心筋細胞である、請求項１～請求項１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 　ＲＯＣＫ阻害薬を有効成分として含有する、心筋幹／前駆細胞の誘導剤、又は心筋幹／前駆細胞の維持培養剤。
  15. 　心筋細胞をＲＯＣＫ阻害薬の存在下で培養することにより得られた心筋幹／前駆細胞。
  16. 　ＲＯＣＫ阻害薬の存在下で培養された心筋細胞由来のエクソソーム若しくはセレクトーム。
  17. 　心血管疾患に関連する遺伝子を標的とするｍｉｃｒｏＲＮＡを含有する、請求項１６に記載のエクソソーム若しくはセレクトーム。
  18. 　前記心血管疾患に関連する遺伝子が、ＴＧＦＢ１シグナル伝達経路に関与する遺伝子である、請求項１７に記載のエクソソーム若しくはセレクトーム。
  19. 　ＲＯＣＫ阻害薬、ＲＯＣＫ阻害薬の存在下で培養された心筋細胞、又は請求項１６～請求項１８のいずれか１項に記載のエクソソーム若しくはセレクトームを有効成分として含有する、線維化抑制剤又は脱繊維化剤。
  20. 　前記ＲＯＣＫ阻害薬が、（１Ｒ、４ｒ）－４－（（Ｒ）－１－アミノエチル）－Ｎ－（ピリジン－４－イル）シクロヘキサンカルボキサミドである、請求項１４に記載の心筋幹／前駆細胞の誘導剤、又は心筋幹／前駆細胞の維持培養剤、請求項１５に記載の心筋幹／前駆細胞、請求項１６～請求項１８のいずれか１項に記載のエクソソーム若しくはセレクトーム、あるいは、請求項１９に記載の線維化抑制剤又は脱繊維化剤。
  21. 　心筋細胞に作用させるためのＲＯＣＫ阻害薬を有効成分として含有する、心血管疾患の発症及び／若しくは増悪の抑制剤、又は治療剤。
  22. 　前記心血管疾患が、心室機能不全、左心室機能不全、左心障害、心機能不全、家族性心血管疾患、脳血管機能不全、左心室異常、心室異常、末梢血管疾患、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、血管閉塞、血管閉塞症、動脈閉塞、うっ血性心不全、及び心不全からなる群より選ばれる少なくとも１つの疾患である、請求項２１に記載の抑制剤又は治療剤。
  23. 　心筋細胞に作用させるためのＲＯＣＫ阻害薬を有効成分として含有する、内皮細胞の細胞運動、脈管形成、血管新生、及び脈管構造形成の促進剤。
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