CN116806257A - 心肌干细胞/心肌前体细胞的制备方法及心肌纤维化抑制方法 - Google Patents

心肌干细胞/心肌前体细胞的制备方法及心肌纤维化抑制方法 Download PDF

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Abstract

【技术问题】本发明提供一种不伴随基因修饰而将成熟/未成熟心肌细胞高效率地重组为心肌干细胞/心肌前体细胞的方法、及/或抑制纤维化的方法。【解决问题的技术手段】通过在ROCK抑制药的存在下培养原代心肌细胞，而能够维持心肌干细胞/心肌前体细胞。此外，通过使在这些低分子化合物的存在下所培养的心肌细胞或来自该心肌细胞的胞外体或分泌组作用于心脏纤维母细胞而抑制纤维化。

Description

心肌干细胞/心肌前体细胞的制备方法及心肌纤维化抑制 方法
相关申请的交叉引用
本国际申请要求2020年10月14日在日本专利局提交的日本发明专利申请第2020-173581号的优先权，所述日本发明专利申请的全部内容通过引用而并入本文。
技术领域
本发明涉及使用低分子化合物的心肌干细胞/心肌前体细胞的制备方法、心肌细胞的纤维化抑制方法、或长期培养方法。
背景技术
干细胞生物学的显著发展在运用于心肌再生医学中时占据着重要的位置，但当下尚未实现。作为最受期待的细胞源之一的人工多能性干细胞(iPS细胞)仍存在肿瘤形成的风险，在实际临床应用中，虽已有临床研究，但难以实现实用化(非专利文献1～3)。另一方面，据最新研究表明，可将不同谱系的细胞直接转化(直接重组)为心肌前体细胞样的细胞。然而，与iPS细胞的情形相同，直接重组会伴随有因Gata4、Mef2c、Tbx5等基因转移而引起的基因修饰，因此仍存在无法预料的风险，从而无法应用于再生医学(非专利文献4)。
最近相继报告有心脏的纤维母细胞重组为心肌细胞的事实(非专利文献5)。这些革新性发现为心肌干细胞理论、甚至是心肌再生研究提供了深刻见解。即，若能再现此种重组，则由此获得的心肌干细胞/心肌前体细胞将有望成为心肌再生医学中的革新性细胞源。然而，业界对于不伴随基因修饰而将各个阶段的心肌细胞重组为心肌干细胞/心肌前体细胞的方法尚全然不知。
本发明的发明人等及其他研究组曾报告过某种低分子抑制药的组合有助于在肝脏或胃等中诱导及维持干细胞的多能性(专利文献1、非专利文献6～9)。然而，针对低分子抑制药，当下尚无报告指出其与由成熟/未成熟心肌细胞重组为心肌干细胞/心肌前体细胞之间的关系。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本再表2018-079714
非专利文献
非专利文献1：Cell.2014Oct 9；159(2):428-39
非专利文献2：Cell Metab.2016Apr 12；23(4):622-634
非专利文献3：Intech Open,2019
DOI:http://dx.doi.org/10.5772/intechopen.88878.
非专利文献4：Stem Cells International,Volume 2018,Article ID 1435746,https://doi.org/10.1155/2018/1435746
非专利文献5：Circulation Report.2019,review,doi:10.1253/circrep.CR-19-0104
非专利文献6：Proc Natl Acad Sci U S A.2010Aug 10；107(32):14223-8.
非专利文献7：Cell Stem Cell.2017Jan 5；20(1):41-55
非专利文献8：Cell Stem Cell.2016Oct 6；19(4):449-461
非专利文献9：eLIFE,2019,https://doi.org/10.7554/eLife.47313.001
发明内容
发明要解决的技术问题
本发明的目的在于提供一种不伴随基因修饰而将成熟/未成熟心肌细胞高效率地重组为心肌干细胞/心肌前体细胞的方法。在另一方面，本发明的目的在于提供一种使心肌干细胞/心肌前体细胞长期维持在不分化的状态的方法。在又一方面，本发明的目的在于提供一种抑制纤维母细胞的纤维化，及/或使其进行去纤维化的方法。此外，在另一方面，本发明的目的在于提供一种抑制心血管系统疾病的发病及/或恶化，使心血管系统的发育及/或功能活化的方法。
解决问题的技术方案
本发明的发明人等为达成上述目的而对可有助于心肌细胞重组的低分子化合物反复进行研究，结果发现，若在Rho激酶抑制药的存在下培养心肌细胞，则能够维持未分化标记物的表达，且能够抑制成熟心肌细胞标记物、衰老标记物、及/或内皮细胞标记物的表达上升。由此，通过作为低分子化合物的Rho激酶抑制药而成功实现心肌细胞的重组。又发现，在Rho激酶抑制药的存在下所培养的心肌细胞可维持作为干细胞的状态，并且可长期增殖，故Rho激酶抑制药可维持未分化状态。又发现，在经本发明的ROCK抑制药处理的心肌细胞中，与心血管疾病相关的信号传递路径受到抑制，与心血管的发育及/或功能相关的信号传递路径得到活化。进而发现，这些在低分子化合物存在下所培养的心肌细胞与纤维母细胞的共培养、或在来自该心肌细胞的胞外体的存在下的纤维母细胞的培养可抑制纤维化。又发现，该胞外体能够使已纤维化的细胞进行去纤维化。
发明的效果
根据本发明，能够不伴随基因修饰而安全且迅速地从各种心肌细胞诱导具有自体增殖能力的心肌干细胞/心肌前体细胞。此外，根据本发明，能够长期稳定地培养包含心肌干细胞/心肌前体细胞的心肌细胞。此外，通过用本发明的ROCK抑制药实施处理，心肌细胞有望抑制心血管疾病的发病及/或恶化，以及使心血管系统的发育及/或功能活化。此外，经本发明的ROCK抑制药处理的心肌细胞或来自该心肌细胞的分泌组或胞外体能够安全且迅速地抑制纤维母细胞的纤维化，及/或使其进行去纤维化。本发明的方法能够供给自体/异体移植中的心肌细胞，除此以外，能够应用于心肌症、心肌炎、或其他与心肌的纤维化相关的疾病的治疗及预防，进而能够应用于这些模型细胞的制备或治疗药的评价、心脏毒性的评价等。进而，本发明的方法能够不伴随基因修饰而安全且迅速地从心肌细胞诱导且/或维持心肌干细胞/心肌前体细胞，故而可应用于心脏功能再生医学。
附图说明
图1表示经TGFβ受体抑制药或ROCK抑制药处理的心肌细胞的细胞形态的变化及增殖。A是表示通过在TGFβ受体抑制药(A)的单独处理、ROCK抑制药(Y)的单独处理下长期培养，而使心肌细胞成为心肌干细胞/心肌前体细胞的形态的照片。B是表示在单独施用TGFβ受体抑制药(A)、单独施用ROCK抑制药(Y)的条件下的HCM细胞的增殖的图表。C是表示在单独施用TGFβ受体抑制药(A)、单独施用ROCK抑制药(Y)的条件下的原代人类冠状动脉平滑肌细胞PC-100-021细胞的增殖的图表。
图2是表示经TGFβ受体抑制药(A)或ROCK抑制药(Y)处理的心肌细胞中的心肌前体细胞标记物(GATA4、VCAM-1)、及作为心肌细胞的成熟标记物的MYL2的mRNA表达的图表。纵轴表示将培养前的细胞的表达量设为1时的各mRNA的表达量(Relative mRNA level：相对mRNA量)，横轴的文字表示作为对象的mRNA，数值表示培养时间(月)。在各mRNA的各月中，左侧的条形图表示药剂处理组的数据，右侧的条形图表示药剂未处理组(对照组)的数据。
图3的A是表示经TGFβ受体抑制药(A)或ROCK抑制药(Y)处理的心肌细胞中的心肌前体细胞标记物(GATA4、VCAM-1)、心肌细胞的成熟标记物(MYL2)、及衰老标记物(CDKN1A、CDKN2A)的mRNA表达的图表。在各图表中，纵轴表示将培养前的细胞的表达量设为1时的各mRNA的表达量(Relative mRNA expression：相对mRNA表达量)，横轴的数值表示培养时间(天)。B是通过西方墨点法对经TGFβ受体抑制药(A)或ROCK抑制药(Y)处理的原代人类心肌细胞(HCM)或原代人类冠状动脉平滑肌细胞(PC-100-021)中的内皮细胞标记物(CD31)、肌细胞标记(Troponin T)、及Actin的表达进行确认所得的结果的照片。NT表示药剂未处理的对照组，HUVEC表示使用人类脐带静脉内皮细胞(作为内皮细胞标记物的CD31阳性)的结果。
图4是表示使用Ingenuity(注册商标)Pathway Analysis(IPA)，将经ROCK抑制药处理的心肌细胞的总RNA与未处理的心肌细胞的总RNA进行比较，并由此推测信号传递路径变化的结果的图表。A表示与心血管疾病相关的信号传递路径中的变化的推测结果。B表示与心血管系统的发育及功能相关的信号传递路径中的变化的推测结果。图表中的Activation z-score(活化z分值)参照Bioinformatics.(2014)；30(4):523-530。#Molecules表示分子数。
图5的A是表示通过超离心法从经TGFβ受体抑制药或ROCK抑制药处理的心肌细胞的培养上清液中纯化的细胞外囊泡的颗粒数的图表。B是表示利用西方墨点法对通过超离心法从经TGFβ受体抑制药及ROCK抑制药处理的心肌细胞的培养上清液中纯化的细胞外囊泡内的CD9分子、CD63分子及CD81的分子进行鉴定后的结果的照片。
图6是将经TGFβ受体抑制药或ROCK抑制药处理的心肌细胞与通过TGFβ处理而活化的纤维母细胞共培养的实验的模式图、及表示其结果的图。A及C是表示与HCM细胞(A)或者与PC-100-021细胞(C)共培养的纤维母细胞的ACTA2mRNA量的图表。纵轴表示将未经TGFβ处理的纤维母细胞中的ACTA2 mRNA的表达量设为1时的各纤维母细胞的ACTA2 mRNA的表达量(Relative mRNA level：相对mRNA量)。横轴表示有无TGFβ处理及经处理的药剂(左起依序为TGF-β(-)：无TGFβ处理、无药剂处理、无共培养；-：经TGFβ处理、药剂未处理、无共培养；N.T：经TGFβ处理、药剂未处理、与心肌细胞共培养；Y：经TGFβ处理、经ROCK抑制药处理、与心肌细胞共培养；A：经TGFβ处理、经TGFβ受体抑制药处理、与心肌细胞共培养)(以下图7～图9的图表的横轴与之相同)。B及D是表示通过西方墨点法对与HCM细胞(B)或者与PC-100-021细胞(D)共培养的纤维母细胞的αSMA蛋白质的表达量进行确认所得的结果的照片及图表。照片自左起依序表示TGF-β(-)：无TGFβ处理、无药剂处理、无共培养；-：经TGFβ处理、药剂未处理、无共培养；N.T：经TGFβ处理、药剂未处理、与心肌细胞共培养；Y：经TGFβ处理、经ROCK抑制药处理、与心肌细胞共培养；A：经TGFβ处理、经TGFβ受体抑制药处理、与心肌细胞共培养(以下图7～图9的照片与之相同)。图表示出将未经TGFβ处理的纤维母细胞中的αSMA蛋白质的表达量设为1时的各纤维母细胞的αSMA蛋白质的表达量(Relative protein level：相对蛋白质量)。
图7是将经TGFβ受体抑制药或ROCK抑制药处理的心肌细胞与通过TGFβ处理而活化的纤维母细胞共培养的实验的模式图、及表示其结果的图。A及C是表示与HCM细胞(A)或者与PC-100-021细胞(C)共培养的纤维母细胞的ACTA2mRNA量的图表。纵轴表示将经TGFβ处理、药剂未处理、未与心肌细胞共培养的纤维母细胞中的ACTA2 mRNA的表达量设为1时的各纤维母细胞的ACTA2 mRNA的表达量(Relative mRNA level：相对mRNA量)。B及D是表示通过西方墨点法对与HCM细胞(B)或者与PC-100-021细胞(D)共培养的纤维母细胞的αSMA蛋白质的表达量进行确认所得的结果的照片及图表。图表示出将经TGFβ处理、药剂未处理、未与心肌细胞共培养的纤维母细胞中的αSMA蛋白质的表达量设为1时的各纤维母细胞的αSMA蛋白质的表达量(Relative protein level：相对蛋白质量)。
图8是来自经TGFβ受体抑制药或ROCK抑制药处理的心肌细胞的胞外体与通过TGFβ处理而活化的纤维母细胞共培养的实验的模式图、以及表示其结果的图。A及C是表示在来自HCM细胞(A)或PC-100-021细胞(C)的胞外体的存在下所培养的纤维母细胞的ACTA2 mRNA量的图表。纵轴表示将未经TGFβ处理的纤维母细胞中的ACTA2 mRNA的表达量设为1时的各纤维母细胞的ACTA2 mRNA的表达量(Relative mRNA level：相对mRNA量)。B及D是表示通过西方墨点法对与来自HCM细胞(B)或PC-100-021细胞(D)的胞外体培养的纤维母细胞的αSMA蛋白质的表达量进行确认所得的结果的照片及图表。图表示出将未经TGFβ处理的纤维母细胞中的αSMA蛋白质的表达量设为1时的各纤维母细胞的αSMA蛋白质的表达量(Relativeprotein level：相对蛋白质量)。
图9是将来自经TGFβ受体抑制药或ROCK抑制药处理的心肌细胞的胞外体和通过TGFβ处理而活化的纤维母细胞共培养的实验的模式图、及表示其结果的图。A及C是表示在来自HCM细胞(A)或PC-100-021细胞(C)的胞外体的存在下所培养的纤维母细胞的ACTA2mRNA量的图表。纵轴表示将经TGFβ处理、药剂未处理、且未添加胞外体的纤维母细胞中的ACTA2 mRNA的表达量设为1时的各纤维母细胞中的ACTA2 mRNA的表达量(Relative mRNAlevel：相对mRNA量)。B及D是表示通过西方墨点法对与来自HCM细胞(B)或PC-100-021细胞(D)的胞外体培养的纤维母细胞的αSMA蛋白质的表达量进行确认所得的结果的照片及图表。图表示出将经TGFβ处理、药剂未处理、且未添加胞外体的纤维母细胞中的αSMA蛋白质的表达量设为1时的各纤维母细胞的αSMA蛋白质的表达量(Relative protein level：相对蛋白质量)。
图10是将来自经TGFβ受体抑制药或ROCK抑制药处理的HCM细胞与通过TGFβ处理而活化的纤维母细胞共培养，且使用抗αSMA、抗纤连蛋白、抗胶原蛋白I抗体作为一级抗体的情形下的免疫染色的图(A)及图表(B)。图自上段起依序表示未经TGFβ处理且无共培养(TGFβ(-))、经TGFβ处理且共培养(TGFβ(+))、经TGFβ处理且与经ROCK抑制药处理的心肌细胞共培养(TGFβ(+)+Y)、及经TGFβ处理且与经TGFβ受体抑制药处理的心肌细胞共培养(TGFβ(+)+A)。图表示出在将经TGFβ处理且无共培养的纤维母细胞(TGFB)中的αSMA蛋白质、纤连蛋白、胶原蛋白I的表达量设为1时，未经TGFβ处理且无共培养(-)、经TGFβ处理且与经ROCK抑制药处理的心肌细胞共培养(Y)、或经TGFβ处理且与经TGFβ受体抑制药处理的心肌细胞共培养(A)的纤维母细胞中的αSMA蛋白质、纤连蛋白、胶原蛋白I的表达量。
图11是将来自经TGFβ受体抑制药或ROCK抑制药处理的HCM细胞的胞外体添加到通过TGFβ处理而活化的纤维母细胞中进行培养，且使用抗αSMA、抗纤连蛋白、抗胶原蛋白I抗体作为一级抗体的情形下的免疫染色的图(A)及图表(B)。图自上段起依序表示：未经TGFβ处理且未添加胞外体(TGFβ(-))、经TGFβ处理且未添加胞外体(TGFβ(+))、经TGFβ处理且添加来自经ROCK抑制药处理的心肌细胞的胞外体(TGFβ(+)+Y)、及经TGFβ处理且添加来自经TGFβ受体抑制药处理的心肌细胞的胞外体(TGFβ(+)+A)。图表示出在将经TGFβ处理的纤维母细胞(未添加胞外体)(TGFB)中的αSMA蛋白质、纤连蛋白、胶原蛋白I的表达量设为1时，未经TGFβ处理且无共培养(-)、经TGFβ处理且添加来自经ROCK抑制药处理的心肌细胞的胞外体(Y)、或经TGFβ处理且添加来自经TGFβ受体抑制药处理的心肌细胞的胞外体(A)的纤维母细胞的αSMA蛋白质、纤连蛋白、胶原蛋白I的表达量。
图12是将来自经TGFβ受体抑制药或ROCK抑制药处理的HCM细胞的胞外体添加到通过TGFβ处理而活化的纤维母细胞中进行培养，且使用抗αSMA、抗纤连蛋白、抗胶原蛋白I抗体作为一级抗体的情形下的免疫染色的图(A)及图表(B)。图自上段起依序表示未经TGFβ处理且未添加胞外体(TGFβ(-))、经TGFβ处理且未添加胞外体(TGFβ(+))、经TGFβ处理且添加来自经ROCK抑制药处理的心肌细胞的胞外体(TGFβ(+)+Y)、及经TGFβ处理且添加来自经TGFβ受体抑制药处理的心肌细胞的胞外体(TGFβ(+)+A)。图中的箭头表示αSMA阳性细胞。图表示出在将经TGFβ处理的纤维母细胞(未添加胞外体)中的αSMA蛋白质、纤连蛋白、胶原蛋白I的表达量设为1时，未经TGFβ处理且无共培养、经TGFβ处理且添加来自经ROCK抑制药处理的心肌细胞的胞外体、或经TGFβ处理且添加来自经TGFβ受体抑制药处理的心肌细胞的胞外体的纤维母细胞的αSMA蛋白质、纤连蛋白、胶原蛋白I的表达量。图表自左起依序分别表示未经TGFβ处理且无共培养、经TGFβ处理且未添加胞外体、经TGFβ处理且添加来自经ROCK抑制药处理的心肌细胞的胞外体、经TGFβ处理且添加来自经TGFβ受体抑制药处理的心肌细胞的胞外体的纤维母细胞的结果。
图13是表示使用IPA对纤维化细胞从既有的信号传递路径而产生的变化进行分析所得的结果的图表。(A)是表示在对纤维母细胞进行活化处理的情形下产生变化的信号传递路径的前10种的图表；(B)是表示在利用通过对心肌细胞实施ROCK抑制药处理所得的胞外体对已活化的纤维母细胞实施了处理的情形下下产生变化的信号传递路径的前10种的图表。
图14是表示在经活化处理的纤维母细胞中，使用IPA对(A)受到抑制的前10种信号传递路径、及(B)活化的前10种信号传递路径进行分析所得的结果的图表。此外，表示在利用通过对心肌细胞实施ROCK抑制药处理所得的胞外体对已活化的纤维母细胞实施了处理的情形下，使用IPA对(C)受到抑制的前20种信号传递路径、及(D)活化的前20种信号传递路径进行分析所得的结果的图表。
图15的(A)是在实施例10中对所选的微RNA(microRNA)高度表达的胞外体进行分析的图表。横轴表示表达量。(B)是表示所选的胞外体所含的微RNA成为靶向的513种基因中的18.5％与心血管疾病相关的图。(C)是表示所选的微RNA成为靶向的基因参与的前5种信号传递路径的图。
具体实施方式
1.由心肌细胞制备心肌干细胞/心肌前体细胞的制备方法、及所制备的心肌干细胞/心肌前体细胞
本发明的一个方面涉及一种心肌干细胞/心肌前体细胞的制备方法，该制备方法包括通过ROCK抑制药处理心肌细胞(以下也称为“本发明的心肌重组法”)。
本发明的心肌重组法中所使用的“心肌细胞”可以是成熟心肌细胞和未成熟心肌细胞中的任一者。例如，心肌细胞可以是表达出心肌细胞标记物基因(例如，MYL2、cardiactroponin 1、GATA4、VCAM-1、Nkx2.5等)中的至少一种的细胞，优选为表达出MYL2及cardiactroponin 1的细胞。
提供用于本发明的重组法的心肌细胞的动物优选为哺乳动物，例如可为人类、大鼠、小鼠、豚鼠、兔、羊、马、猪、牛、猴等，优选为人类、大鼠、小鼠，最优选为人类。
心脏细胞可以是从自哺乳动物摘除的心脏中单离的心肌细胞(原代心肌细胞)；永生化心肌细胞(例如导入有SV40大T抗原的心肌细胞)；利用公知的分化诱导方法(例如，J.Clin.Inv.,1999；103:697-705.；Circ Res.2009；104(4):e30-41)从胚性干细胞(ES细胞)或iPS细胞等多能干细胞或间叶系干细胞获得的心肌细胞；及通过直接重组从纤维母细胞所诱导的心肌细胞(Circulation Report,Vol.1(2019),No.12:pp.564-567)等，优选为原代心肌细胞。或者，心肌细胞也可以是存在于哺乳动物体内的心脏中的心肌细胞。
在使用原代心肌细胞的情形下，例如，当为啮齿类时，优选使用从10-20周龄的成体中摘除的心脏，也可以使用8周龄以下的未成熟个体的心脏。当为人类时，优选使用通过外科手术切除的成人的心脏组织片，也可以使用从死亡胎儿切除的心脏。或者，也可以使用将从这些已摘除的心脏中单离纯化的心肌细胞进行冷冻所得的细胞(冷冻心肌细胞)。作为从哺乳动物的心脏或其组织片获得心肌细胞的方法，可使用以胶原酶将心肌组织分解，并通过过滤、离心等去除非实质细胞及细胞片的方法。
在本说明书中，“心肌干细胞/心肌前体细胞”(以下也称为“CMSC”)是指具有注定向心肌分化的分化单能性(unipotency)及自体再生能力的细胞。本说明书中的CMSC的干细胞标记物的表达量以高为佳。例如，本说明书中的CMSC的干细胞标记物的表达量可高于成熟心肌细胞。在本说明书中，“干细胞标记物”是指选自Pdx1、Nkx6.1、Gata4、Vcam1、Hes1、Sox9、Foxa2、CK19、及CD133中的一种以上的标记物，优选为Gata4及/或Vcam1。此外，本说明书中的CMSC的成熟标记物的表达量以低为佳。例如，本说明书中的CMSC的成熟标记物的表达量可低于完全分化的心肌细胞。在本说明书中，“成熟标记物”是指心肌细胞的成熟标记物，可例举：Myl2、Myl7、Myh7、Herg、Kcnq1、Tcap、Vcam1、Sirpa等。此外，本说明书中的CMSC因ROCK抑制药的处理所造成的细胞死亡较少。本说明书中的CMSC的衰老标记物的表达量以低为佳。例如，本说明书中的CMSC的衰老标记物的表达量可低于成熟心肌细胞或未经ROCK抑制药处理的心肌细胞。在本说明书中，“衰老标记物”是指心肌细胞的衰老标记物，可例举：CDKN1A、CDKN2A、p53、衰老相关酸性β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)等。该干细胞标记物、成熟标记物、衰老标记物、内皮细胞标记物的量可以是mRNA量或蛋白质量。
在本说明书中，ROCK抑制药是指已知具有抑制Rho结合激酶的功能的作用的物质，例如可例举：N-[3-[2-(4-氨基-1,2,5-噁二唑-3-基)-1-乙基咪唑并[5,4-d]吡啶-6-基]氧基苯基]-4-(2-吗啉-4-基-乙氧基)苯甲酰胺(GSK269962A)、法舒地尔(Fasudil)盐酸盐、反式-4-[(1R)-1-氨基乙基]-N-4-吡啶基环己烷甲酰胺(Y-27632)、4-甲基-5-[[(2S)-2-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基]磺酰基]异喹啉(H-1152)等，优选为Y-27632。这些ROCK抑制药可使用一种化合物，也可以组合使用两种以上的化合物。ROCK抑制药可为游离体，可为盐酸盐、硫酸盐等盐的形态，可为溶剂合物或水合物。
此外，在本发明的重组法中，可将ROCK抑制药以外的低分子信号传递路径抑制药与ROCK抑制药组合使用。作为此种抑制药，例如可例举GSK3抑制药、MEK抑制药等，但并不限定于此。
在体外(in vitro)实施本发明的重组法时，可通过在上述抑制药的存在下培养心肌细胞来实施。具体而言，向培养基中以有效浓度来添加这些抑制药并进行培养。在此，作为培养基，只要是能够用于心肌细胞培养的培养基即可，作为市售的培养基，例如可例举CMC培养基等。此外，亦可使用实施例所记载的向肌细胞基础培养基(Myocyte basalmedium)中添加Supplement Pack Myocyte Cell GM(含5％FBS(fetal bovine serum；胎牛血清)、5μg/mL胰岛素、2ng/mL FGF-b及0.5ng/mL EGF(epithelium growth factor，表皮生长因子))及1％抗生素×抗有丝分裂素(Antibiotic×Antimitotic)所得的培养基。向培养基中添加的ROCK抑制药的浓度例如可从0.01-500μM、0.1-100μM、1-50μM的范围中适当选择，更优选为10μM。
用于培养的培养容器例如可例举：皿、皮氏培养皿、组织培养用培养皿、多量培养皿、微量培养盘、微孔培养盘、多量培养盘、多孔培养盘、腔室载玻片、培养皿、试管、托盘、培养袋等。培养容器可使用用以进行细胞的悬浮培养的培养容器。或者，当在贴附位置使用时，可使用内表面涂布有细胞支持用基质以提升与细胞的贴附性。作为此种细胞支持用基质，例如可例举：胶原蛋白、缺端胶原、明胶、基质胶(Matrigel)、聚-L-赖氨酸、层粘连蛋白、纤连蛋白等。
心肌细胞可以以102-106细胞/cm2，优选为103-105细胞/cm2的细胞密度在培养容器上进行接种。可在CO2培养箱(优选约5％的CO2浓度)的气氛下，并以30-40℃(优选约37℃)进行心肌细胞的培养。作为培养时间，例如可例举1-4周，优选为1-3周。此外，可每1-3天更换成新鲜的培养基(可包含上述抑制剂)。可根据培养心肌细胞中的上述干细胞标记物的表达来确认对CMSC的诱导。此外，可视需要通过利用上述干细胞标记物的方法(例如FACS(Fluorescence-activated cell sorting，荧光活化细胞分选术)等)对所获得的CMSC进行单离。
在进行传代时，在培养细胞达到80％融合的阶段对细胞进行胰蛋白酶处理而使其解离，在新培养容器上以103-105细胞/cm2的密度进行接种。优选更换为含有ROCK抑制药的培养基。在约4～6次传代时可获得稳定的CMSC。在10次以上传代后，可通过常规方法进行选殖化。作为确认CMSC是否在传代后仍得以维持的方法的一个示例，可使低密度(例如102-103细胞/cm2)的细胞在上述培养容器中接种，并随时间观察或测量计算细胞的形态或数量，也可以确认CMSC标记物的表达。
通过在活体内(in vivo)进行利用ROCK抑制药对心肌细胞实施的处理，可对存在于生物体内的心脏的心肌细胞直接重组。在该情形下，通过利用ROCK抑制药处理哺乳动物的心脏中的心肌细胞而进行。ROCK抑制药可对心脏或心脏内的目标部位进行局部施用，也可以全身施用。
此外，本发明涉及通过在ROCK抑制药的存在下培养心肌细胞而获得的CMSC。该CMSC可用作以下所记载的纤维母细胞的纤维化抑制剂，亦可经由增殖及再分化而作为移植用心肌细胞进行制备。例如，可通过公知的分化诱导法(例如J.Clin.Inv.,1999；103:697-705.；Circ Res.2009；104(4):e30-41)使CMSC再分化成心肌细胞。CMSC或由CMSC分化而成的心肌细胞例如可利用于受验物质的心脏毒性的评价、移植用心肌的制备、所释放的分泌组的来源、及心肌细胞的纤维化抑制剂等。
受验物质的心脏毒性的评价方法包括在受验物质的存在下培养CMSC或再分化的心肌细胞。通常通过向培养CMSC或心肌细胞的培养基或培养液中添加受验物质来进行利用受验物质对CMSC或心肌细胞实施的处理，但并不限定于该方法。例如，在受验物质为蛋白质等情形下，可通过将表达该蛋白质的DNA载体导入至该细胞来进行处理。受验物质的心脏毒性的评价方法进而可包括：测定或观察经受验物质处理的CMSC的损伤；及在确认到CMSC的损伤的情形下，判定该受验物质是否具有心肌毒性。
例如，评价受验物质的心肌毒性的方法可包括：用ROCK抑制药处理心肌细胞而获得CMSC；用受验物质处理所获得的CMSC；测定或观察经受验物质处理的CMSC的损伤；及在确认到CMSC的损伤的情形下，判定该受验物质是否具有心肌毒性。或者，评价受验物质的心肌毒性的方法亦可包括：用ROCK抑制药处理心肌细胞而获得CMSC；使所获得的CMSC再分化为心肌细胞；用受验物质处理再分化的心肌细胞；测定或观察经受验物质处理的心肌细胞的损伤；及在确认到心肌细胞的损伤的情形下，判定该受验物质是否具有心肌毒性。损伤的程度例如可以将CMSC或心肌细胞的生存率、形态、或者细胞凋亡或坏死标记物作为指针。具体而言，例如在因向CMSC或心肌细胞的培养液中添加受验物质而致使CMSC或心肌细胞的生存率降低的情形下，判定该受验物质具有心脏毒性，在生存率无显著变化的情形下，判定该受验物质不具有心脏毒性。
此外，本发明的CMSC可利用于移植用心肌的制备。移植用心肌的制备方法可包括：培养CMSC并使其增殖；使增殖的CMSC再分化为心肌细胞；及对再分化的心肌细胞进行移植用心肌的制备。因此，本发明的一个方面涉及一种含有本发明的CMSC或由本发明的CMSC所诱导的心肌细胞的移植用心肌。此外，上述移植用心肌可用作心肌损伤的治疗剂或预防剂。心肌损伤是指心肌出现某些异常，心脏的动作产生异常的状态，包括急性心血管疾病及慢性心血管疾病。作为慢性心血管疾病，例如可例举：心肌症(扩张型心肌症等)、心肌炎、心肌梗塞、心肥大、高血压等。CMSC可悬浮于适当的等渗缓冲液(例如PBS(Phosphate BufferedSaline，磷酸盐缓冲液))而加以使用。CMSC悬浮液的使用因心脏疾病的种类、心肌损伤的严重程度等有所不同，例如，当为成人时，可通过将108-1011个细胞直接施用到心肌内或利用导管从心房内向心肌直接施用等，而进行移植。此外，关于移植用心肌，可将由本发明的CMSC分化而成的心肌细胞与血管内皮细胞、血管壁细胞混合培养而制成心肌片。该心肌片通过贴附在哺乳动物的心脏的治疗部位而进行移植。
2.心肌细胞的培养方法和CMSC的维持培养方法
本发明的一个方面涉及一种心肌细胞的培养方法，其包括在ROCK抑制药的存在下培养心肌细胞。此外，本发明的另一个方面涉及一种CMSC的维持培养方法，其包括在ROCK抑制药的存在下培养CMSC。
可通过依据上述培养方法进行传代培养而进行心肌细胞及CMSC的培养。尤其是，本发明的培养方法能够在维持CMSC的干细胞性/前体细胞性的同时进行长期培养。在本说明书中，CMSC的维持或干细胞性/前体细胞性的维持是指，成熟标记物的量较低，且/或干细胞标记物的量较高。例如，经过较长期的培养时间后，上述心肌细胞或CMSC所表达的成熟标记物的量可低于在ROCK抑制药的非存在下所培养的心肌细胞所表达的成熟标记物的量。此外，经过较长期的培养时间后，上述心肌细胞或CMSC所表达的干细胞标记物的量可高于在ROCK抑制药的非存在下所培养的心肌细胞所表达的干细胞标记物的量。在本说明书中，“长期”是指，与未经ROCK抑制药处理的心肌细胞相比，心肌细胞或所诱导的CMSC实现增殖的培养时间较长，可以是指20天以上、1个月以上、40天以上、或2个月以上。
3.用于从心肌细胞诱导CMSC的药剂、心肌细胞的长期培养剂、或CMSC的维持用药剂
本发明的一个方面涉及一种含有ROCK抑制药作为有效成分的用于从心肌细胞诱导CMSC的药剂、心肌细胞的长期培养剂、或CMSC的维持用药剂。该包含ROCK抑制药的药剂可单独含有ROCK抑制药作为有效成分，亦可含有其他药剂。
本发明的另一个方面涉及一种ROCK抑制药在制备用于从心肌细胞诱导CMSC的药剂中的用途。本发明进而涉及一种从心肌细胞诱导CMSC的方法，其包括：对有需求的患者施用有效量的ROCK抑制药。本发明还涉及一种在从心肌细胞诱导CMSC的方法中使用的ROCK抑制药。
4.分泌组及胞外体
本发明的一个方面涉及一种来自在ROCK抑制药的存在下所培养的心肌细胞的胞外体或分泌组。在本说明书中，“分泌组”是指细胞培养上清液中所分泌的有用成分的总称，例如包含各种细胞因子、趋化因子等蛋白质成分；或ECM等细胞外基质或细胞外囊泡等微颗粒。此外，在本说明书中，“胞外体”是指从各种细胞释放的直径约20～200nm(优选为50～150nm)的在胞吞作用过程中形成的来自内体膜的囊泡，主要由脂质、蛋白质、核酸(microRNA：微RNA、messengerRNA：信使RNA、DNA)构成。
本发明的另一个方面涉及一种分泌组或胞外体的制备方法，其包括：在ROCK抑制药的存在下培养心肌细胞、及从所培养的心肌细胞回收分泌组或胞外体。
本发明的分泌组可作为在ROCK抑制药的存在下培养心肌细胞或CMSC的培养液(例如培养上清液)而获得。心肌细胞及CMSC的培养可依据上述记载而进行。
本发明的胞外体可从上述分泌组中回收。从培养液或分泌组中回收胞外体的方法可使用任意公知的方法或市售的套组而进行。例如可例举：超离心分离法(例如Thery C.,Curr.Protoc.Cell Biol.(2006)Chapter 3:Unit 3.22.)、聚合物沉淀法、免疫沉淀法、FACS法、超过滤法、凝胶过滤法、HPLC(High Performance Liquid Chromatography，高效液相层析)法、及利用抗体或凝集素吸附于珠粒等载体的方法。此外，亦可使用市售的胞外体单离用套组回收胞外体。
在上述回收方法中，超离心分离法是最常用于胞外体单离的标准方法。超离心分离法中的离心力例如可以为50,000×g以上、100,000×g以上、或1,500,000×g以上，此外，可以为300,000×g以下、250,000×g以下、或200,000×g以下。离心时间并无限定，例如可设为30分钟～120分钟、60分钟～90分钟、或70分钟～80分钟。此外，离心分离前可视需要使用过滤器过滤及/或以更低的离心力进行离心分离，由此去除或减少夹杂物。
胞外体的存在可通过纳米颗粒跟踪系统(例如，如Nano Sight的仪器)进行测量计算。此外，在胞外体的颗粒表面存在例如作为四跨膜蛋白的CD9、CD63、CD81等分子，这些分子可成为胞外体的标记物。也可以通过免疫学测定法等(例如西方墨点法等)确认这些蛋白质及/或基因的表达，由此确认胞外体的存在。
5.纤维化抑制方法、纤维化抑制剂、去纤维化方法、及去纤维化剂
经ROCK抑制药处理的心肌细胞或CMSC所释放的分泌组或胞外体能够抑制心肌细胞的纤维化，且能够对已纤维化的心肌细胞进行去纤维化。因此，本发明的另一个方面涉及一种利用ROCK抑制药、在ROCK抑制药的存在下所培养的心肌细胞、或经ROCK抑制药处理的心肌细胞所释放的分泌组或胞外体而进行的纤维化抑制方法及去纤维化方法。在本方法中，可通过施用ROCK抑制药，而使ROCK抑制药直接作用于生物体内的心肌细胞而使其释放分泌组或胞外体，亦可以使用经ROCK抑制药处理的心肌细胞，还可以将经ROCK抑制药处理的心肌细胞所释放的分泌组或胞外体单离及/或纯化而加以使用。此外，关于心肌细胞的纤维化、或纤维化的心肌细胞的去纤维化，例如可通过如下操作发生：通过经ROCK抑制药处理的心肌细胞所释放的分泌组或胞外体所含的微RNA，而使得与纤维化细胞的活化或纤维化相关的信号传递路径所含之基因受到抑制。作为此种信号传递路径，可例举：TGFB1、E2F1、EGF、HRAS、AGT等，优选为TGFB1。
在施用ROCK抑制药而直接处理生物体内的心肌细胞的情形下，可使ROCK抑制药作用于已位于纤维母细胞附近的心肌细胞。因此，本发明包括一种纤维母细胞的纤维化抑制方法及去纤维化方法，其包括：用ROCK抑制药对处在能够对纤维母细胞发挥旁分泌作用的位置的心肌细胞进行处理。
在利用细胞的情形下，可使用预先经ROCK抑制药处理的心肌细胞，使该心肌细胞定位于纤维母细胞的附近或者对两种细胞进行共培养，由此来加以实施。或者，也可以用ROCK抑制药对已位于纤维母细胞附近或与纤维母细胞共培养的心肌细胞进行处理。更具体而言，本发明涉及一种纤维母细胞的纤维化抑制方法，其包括：通过ROCK抑制药处理心肌细胞；及在该心肌细胞能够对纤维母细胞发挥旁分泌作用的位置使该心肌细胞与纤维母细胞定位。
“旁分泌作用”是指，从经ROCK抑制药处理的心肌细胞或CMSC所分泌的物质作用于该心肌细胞或CMSC周围的细胞或组织。因此，“能够发挥旁分泌作用的位置”是指由经ROCK抑制药处理的心肌细胞或CMSC产生的分泌组或胞外体能够抑制作为目标的纤维母细胞的纤维化的位置，优选心肌细胞或CMSC处在纤维母细胞附近或与其邻近的位置。在使预先经ROCK抑制药处理的心肌细胞作用于生物体内的纤维母细胞的情形下，该心肌细胞可局部移植至心脏或心脏内的作为目标的部位。即，通过将经本发明的ROCK抑制药处理的心肌细胞或CMSC移植至心脏，而能够在心脏局部释放分泌组，并通过旁分泌作用抑制因周围的纤维母细胞所造成的纤维化。
在将心肌细胞与纤维母细胞共培养的情形下，可以在同一表面上进行培养，亦可利用腔室等，并在从心肌细胞释放的分泌组或胞外体能够作用于纤维母细胞的形态下进行培养。在培养细胞的情形下，可通过ROCK抑制药对与纤维母细胞共培养的心肌细胞进行处理，而抑制纤维母细胞的纤维化。
经ROCK抑制药处理的心肌细胞或CMSC的培养上清液及从培养上清液分离纯化的胞外体抑制心肌细胞的纤维化。因此，还可以使用从经ROCK抑制药处理的心肌细胞或CMSC释放的分泌组或胞外体来实施本发明的纤维化抑制方法。因此，本发明涉及一种纤维母细胞的纤维化抑制方法，其包括：用从在ROCK抑制药的存在下所培养的心肌细胞提取出的分泌组或胞外体处理纤维母细胞。例如，本发明的方法可以是一种纤维母细胞的纤维化抑制方法，其包括：在ROCK抑制药的存在下培养心肌细胞；从所培养的心肌细胞回收分泌组或胞外体；及使用所回收的分泌组或胞外体处理纤维母细胞。
在本说明书中，纤维母细胞的纤维化抑制方法可设为伴随心肌细胞的纤维化的疾病的预防方法或治疗方法，纤维母细胞的纤维化抑制剂可设为伴随心肌细胞的纤维化的疾病的预防剂或治疗剂。伴随心肌细胞的纤维化的疾病包括：因心肌细胞的纤维化而发病的疾病及因心肌细胞的纤维化而恶化的疾病，例如可例举：心肌损伤、心肌纤维化、心肌梗塞、心衰竭、心肥大、高血压等。
6.心血管系统疾病的发病及/或恶化的抑制方法、以及抑制剂
来自经ROCK抑制药处理的心肌细胞的胞外体所内含的微RNA以与心血管疾病相关的基因作为靶，具体而言，以与作为心血管疾病的心脏坏死及细胞死亡、心肥大、心衰竭、心脏麻痹相关的基因作为靶。因此，通过利用ROCK抑制药处理心肌细胞，而能够抑制心血管疾病的发病及/或恶化。此外，通过利用ROCK抑制药对心肌细胞实施处理，而能够使与心血管系统的发育及/或功能相关的信号传递路径活化。由此，例如能够促进内皮细胞的细胞运动、脉管形成、血管新生、及脉管结构发育。因此，本发明的另一方面涉及一种心血管系统疾病的发病及/或恶化的抑制剂、心血管系统疾病的治疗剂、内皮细胞的细胞运动促进剂、脉管形成促进剂、血管新生促进剂、及脉管结构发育促进剂，其包括：通过ROCK抑制药、ROCK抑制药、在ROCK抑制药的存在下所培养的心肌细胞、经ROCK抑制药处理的心肌细胞所释放的分泌组或胞外体对心肌细胞进行处理。在本方法中，可以通过施用ROCK抑制药，而使ROCK抑制药直接作用于生物体内的心肌细胞，并释放分泌组或胞外体，也可以使用经ROCK抑制药处理的心肌细胞，或可以使经ROCK抑制药处理的心肌细胞所释放的分泌组或胞外体单离及/或纯化而加以利用。此外，本方法可包括：利用来自经ROCK抑制药处理的心肌细胞的胞外体所内含的微RNA，来抑制与该心血管疾病相关的信号传递路径，且/或使与心血管系统的发育及/或功能相关的信号传递路径活化。作为心血管疾病，除上述急性心血管疾病及慢性心血管疾病(例如心肌症(扩张型心肌症等)、心肌炎、心肌梗塞、心肥大、高血压等)以外，还可以是心室功能衰竭、左心室功能衰竭、左心障碍、心功能衰竭、家族性心血管疾病、脑血管功能衰竭、左心室异常、心室异常、末梢血管疾病、动脉粥状硬化症、动脉硬化症、血管阻塞、血管阻塞症、动脉阻塞、郁血性心衰竭、及心衰竭。
本发明的另一方面涉及一种心血管系统疾病的发病及/或恶化的抑制方法或治疗方法，其包括：将ROCK抑制药、经ROCK抑制药处理的心肌细胞、或经ROCK抑制药处理的心肌细胞所释放的分泌组或胞外体以有效量施用给有需求的患者。此外，本发明涉及一种ROCK抑制药、经ROCK抑制药处理的心肌细胞、或经ROCK抑制药处理的心肌细胞所释放的分泌组或胞外体在制造心血管系统疾病的发病及/或恶化的抑制剂或治疗剂中的用途。或者，本发明涉及一种用于抑制或治疗心血管系统疾病的发病及/或恶化的ROCK抑制药、经ROCK抑制药处理的心肌细胞、或经ROCK抑制药处理的心肌细胞所释放的分泌组或胞外体。
7.施用方法、制剂
可通过上述方法从经ROCK抑制药处理的心肌细胞获取分泌组及胞外体。在体外进行由分泌组或胞外体实施的处理的情形下，可通过在分泌组或胞外体的存在下培养心肌细胞或纤维母细胞而进行。在活体内进行的情形下，可以对心脏或心脏内的目标部位局部施用分泌组或胞外体，也可以全身施用分泌组或胞外体。
上述药剂可单独含有ROCK抑制药、经ROCK抑制药处理的心肌细胞、或经ROCK抑制药处理的心肌细胞所释放的分泌组或胞外体作为有效成分，也可以视需要含有其他成分。例如，在该药剂以施用于动物为目的的情形下，其他成分可以是药学许可的添加物，例如可以是杀菌水、生理盐水、缓冲剂、赋形剂、结合剂、崩解剂、乳化剂、界面活性剂、稳定剂、润滑剂、稀释剂、流动性促进剂、矫味剂、着色剂及香料等。例如，在以施用于动物为目的而使用本发明的药剂的情形下，可以以口服施用形态、或注射剂、点滴剂等非口服施用形态施用这些药剂。此外，这些药剂也可以制成片剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂等而进行口服施用，或制成注射剂、点滴剂而进行非口服施用。施用量只要是能够达成目的的有效量即可，可根据症状、年龄、性别、体重、施用形态等而决定。
本发明的方法除如此解释不匹配的情形以外，均可以活体内、离体(ex vivo)、或体外进行。
以下使用实施例更详细地对本发明进行说明，但其并不限定本发明的范围。此外，本案说明书通篇所引用的文献整体作为参照并入本案说明书中。
[实施例]
(培养基的制备)
心肌细胞培养基(CMM)以如下方式调整：向肌细胞基础培养基(Myocyte BasalMedium)中添加Supplement Pack Myocyte Cell GM(包含5％FBS、5μg/mL胰岛素、2ng/mLFGF-b、0.5ng/mL EGF)(PromoCell，Cat#C-39270)及1％抗生素×抗有丝分裂素。
PC-100-021的培养用培养基以如下方式调整：向血管平滑肌细胞生长培养基(Vascular Smooth Muscle Cell growth medium)中添加血管平滑肌细胞生长套组(Vascular Smooth Muscle Cell growth Kit)(包含5％FBS、5％L-谷氨酰胺、50μg/mL抗坏血酸、5ng/mL EGF、5μg/mL胰岛素、5ng/mL FGF-b)(ATCC，Cat#PCS-100-042)及1％抗生素×抗有丝分裂素。
完全培养基使用高级(Advanced)DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium，达尔伯克改良伊格尔培养基)(Gibco,cat.No.12491)。
(实施例1)心肌细胞的培养
(1)原代培养
将原代人类心肌细胞(HCM、PromoCell)及作为对照组的原代人类冠状动脉平滑肌细胞(PC-100-021、ATCC)分别接种至含有适于心肌细胞培养的心肌细胞培养基(CMM)、及PC-100-021的培养用培养基的培养皿上，在培养箱内(37℃、5％CO2/95％空气)进行平面培养。
(2)传代培养
通过TrypLE Express(Thermo Fisher)对上述原代培养的人类心肌细胞进行处理和回收，将其以9×103细胞/cm2接种至涂布有胶原蛋白I的培养容器(2μg/cm2、150mm培养皿)中，在血管平滑肌细胞生长培养基(Vascular Smooth Muscle Cell growth medium)或肌细胞基础培养基(Myocyte basal medium)中进行培养。使用CELLBANKER(注册商标)1(Takara Bio)，将所培养的细胞制备成冷冻储料。
(实施例2)心肌细胞培养中的TGFβ受体抑制药及ROCK抑制药的作用
(1)在受验低分子化合物的存在下的培养
在包含3mL血管平滑肌细胞生长培养基(Vascular Smooth Muscle Cell growthmedium)或肌细胞基础培养基(Myocyte basal medium)的35mm培养盘(IWAKI)上，以0.5×102细胞/cm2接种传代培养的人类心肌细胞，该血管平滑肌细胞生长培养基或肌细胞基础培养基含有低分子化合物即作为TGFβ受体抑制药的3-(6-甲基-2-吡啶基)-苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-硫代酰胺(A-83-01:A)(最终浓度1μM)、作为ROCK抑制药的(1R,4r)-4-((R)-1-氨基乙基)-N-(吡啶-4-基)环己烷甲酰胺(Y-27632:Y)(最终浓度10μM)、或含有A-83-01及Y-27632两种化合物，或者不含该两种化合物。在第3天更换为含有各低分子化合物的血管平滑肌细胞生长培养基或肌细胞基础培养基。随后，每3天同样地进行培养基更换。
(2)在低细胞密度下的低速摄影
培养基更换后，使用BZ9000一体化(All in one)荧光显微镜(基恩士)进行低速摄影。此外，在摄影期间(110天)内跟踪各细胞，测量计算来自各细胞的最终的细胞数量。
图1的(A)示出经A-83-01或Y-27632处理的心肌细胞的细胞形态的变化。通过用A-83-01或Y-27632进行处理，显示出心肌干细胞/心肌前体细胞样的形态。在HCM中，以A-83-01处理、Y-27632处理诱导长期培养(图1的(B))。在PC-100-021中，以A-83-01处理诱导长期培养(图1(C))。
(3)定量性RT-PCR
使用miRNeasy Mini Kit(QIAGEN)，从在受验低分子化合物的存在下培养1个月后及2个月后的各心肌细胞中单离出全部的RNA。使用大容量cDNA反转录套组(High-CapacitycDNA Reverse Transcription Kit)Life technologies，按照制造人员准则来实施反转录反应。将所得的cDNA作为模板，使用TaqMan Probe(Thermo Fisher)进行PCR。靶基因的表达量通过作为内在性对照组的β-肌动蛋白实现标准化。
图2示出在A-83-01(A)或Y-27632(Y)的存在下培养HCM细胞及PC-100-021细胞后的心肌前体细胞标记物(GATA4、VCAM-1)的mRNA、及作为心肌细胞的成熟标记物的MYL2的mRNA的表达量。在药剂未处理组(N.T.)中对HCM细胞及PC-100-021细胞一并进行继续培养，由此促进分化，从而前体细胞标记物(GATA4、VCAM-1)的表达减少，并且成熟标记物(MYL2)的表达上升。通过利用Y-27632处理HCM细胞及PC-100-021细胞而抑制该前体细胞标记物(GATA4、VCAM-1)的减少及成熟标记物(MYL2)的上升。另一方面，显示出利用A-83-01的处理促进了前体细胞标记物(GATA4、VCAM-1)的减少及成熟标记物(MYL2)的上升。
图3的(A)示出在A-83-01(A)或Y-27632(Y)的存在下培养HCM细胞及PC-100-021细胞后的心肌前体细胞标记物(GATA4、VCAM-1)的mRNA、作为心肌细胞的成熟标记物的MYL2的mRNA、及衰老标记物(CDKN1A、CDKN2A)的mRNA的表达量。在药剂未处理组(N.T.)中对HCM细胞及PC-100-021细胞一并进行继续培养，由此促进分化，从而前体细胞标记物(GATA4、VCAM-1)的表达减少，并且成熟标记物(MYL2)的表达上升。通过利用Y-27632处理HCM细胞及PC-100-021细胞而抑制该前体细胞标记物(GATA4、VCAM-1)的减少及成熟标记物(MYL2)的上升。另一方面，显示出利用A-83-01的处理促进了成熟标记物(MYL2)的上升。进而，衰老标记物(CDKN1A、CDKN2A)在经A-83-01(A)或Y-27632(Y)处理的HCM细胞及PC-100-021细胞中几乎未表达。因此，显示出A-83-01(A)或Y-27632(Y)的处理所造成的细胞死亡较少。此外，根据图3的(B)，在经A-83-01(A)或Y-27632(Y)处理的HCM细胞及PC-100-021细胞中，内皮细胞标记物(CD31)未表达，而肌细胞标记物有所表达，确认到这些细胞仅包含肌细胞，在原代培养中，未混入内皮细胞。
(实施例3)与经ROCK抑制药处理的心肌细胞的信号传递路径相关的特性
在通过Y-27632(Y)处理心肌细胞的情形下，对与未处理的心肌细胞相比而变化的信号传递路径进行推定。在该推定中，按照制造商的操作说明书使用Ingenuity(注册商标)Pathway Analysis(IPA)(QIAGEN公司)。
在经作为ROCK抑制药的Y-27632(Y)处理的心肌细胞中，与未处理的心肌细胞相比，与循环系统疾病相关的路径受到抑制。具体而言，推定与如下疾病相关的信号传递路径受到抑制：心室功能衰竭、左心室功能衰竭、左心障碍、心功能衰竭、家族性心血管疾病、脑血管功能衰竭、左心室异常、心室异常、末梢血管疾病、动脉粥状硬化症、动脉硬化症、血管阻塞、血管阻塞症、动脉阻塞、郁血性心衰竭、及心衰竭(图4的(A))。因此，显示出与心血管疾病相关的信号传递路径在经ROCK抑制药处理的心肌细胞中减少。此外，在通过Y-27632(Y)处理心肌细胞的情形下，推定与心脏收缩、血压及心肌收缩相关的信号传递路径受到抑制，与内皮细胞的细胞运动、脉管形成、血管新生、及脉管结构发育相关的信号传递路径活化(图4的(B))。因此，示出在经ROCK抑制药处理的心肌细胞中，与心血管系统的发育及功能相关的信号传递路径活化。
此外，由此种信号系统的变化示出，经ROCK抑制药处理的心肌细胞显示再生特性，不易发生恶性转化。
(实施例4)来自心肌干细胞/心肌前体细胞的胞外体的纯化及解析
用完全培养基培养细胞，直至心肌干细胞/心肌前体细胞达到70％融合为止。完全培养基使用上述物质。随后，将完全培养基更换为高级(Advanced)DMEM(Gibco)，进而培养48小时。随后，回收培养液，进行离心分离(2,000×g、10分钟、4℃)及利用0.22μm过滤器过滤后，废弃细胞颗粒，并回收上清液。通过超离心分离连续地从该上清液单离胞外体。随后，对胞外体实施超离心分离(35,000×g、70分钟、4℃)，并溶解于PBS中进行保存。
图5表示通过纳米颗粒捕获系统(Nanosight LM-10)测定如下胞外体(EV)所得的颗粒数(A)，该胞外体(EV)是通过超离心法从经A-83-01及Y-27632处理的心肌细胞的培养上清液中纯化的分泌组的一种。进而表明，利用西方墨点法进行鉴定的胞外体所含的CD9分子、CD63分子及CD81的分子的存在。据此表明，实际上实现了胞外体的回收。
(实施例5)与经TGFβ受体抑制药及ROCK抑制药处理的心肌细胞共培养的TGFβ刺激纤维母细胞中的标记物表达
用TGFβ使人类心脏纤维母细胞活化24小时。使活化的纤维母细胞与经A-83-01或Y-27632处理的心肌细胞共培养48小时以上。提取总RNA及蛋白质以进行纤维化症活化标记物分析。
图6是表示作为与经A-83-01及Y-27632处理的心肌细胞共培养的TGFβ刺激纤维母细胞中的纤维化相关基因的ACTA2的mRNA量(A、C)、及作为纤维化标记物的αSMA的蛋白质量(B、D)的图表。ACTA2及αSMA的表达量可作为细胞的纤维化的指标。ACTA2及αSMA表达量伴随着经TGFβ处理所造成的人类心脏纤维母细胞的纤维化而上升，但通过与心肌细胞共培养而使其量有所降低，由此可知纤维母细胞的活化受到抑制。因此，显示出从经TGFβ受体抑制药及ROCK抑制药处理的心肌细胞中纯化的分泌组使纤维母细胞的活化受到抑制的效果。
图7是表示作为与经A-83-01及Y-27632处理的心肌细胞共培养的TGFβ刺激纤维母细胞中的纤维化相关基因的ACTA2的mRNA量(A、C)、及作为纤维化标记物的αSMA的蛋白质量(B、D)的图表。图表以平均值±标准偏差来显示。ACTA2及αSMA的表达量可作为细胞的纤维化的指标。ACTA2及αSMA表达量伴随着经TGFβ处理所造成的人类心脏纤维母细胞的纤维化而上升，但通过与心肌细胞共培养而使其量有所降低，由此可知纤维母细胞的活化受到抑制。因此，显示出从经TGFβ受体抑制药及ROCK抑制药处理的心肌细胞中纯化的分泌组使纤维母细胞的活化受到抑制的效果。
(实施例6)在来自经TGFβ受体抑制药及ROCK抑制药处理的心肌细胞的胞外体的存在下所培养的TGFβ刺激纤维母细胞中的标记物表达
用TGFβ使人类心脏纤维母细胞活化24小时。继而，添加来自经Y-27632处理的心肌细胞的胞外体(EV)，进而培养纤维母细胞48小时。提取总RNA及蛋白质以进行纤维化症活化标记物分析。
图8是表示将从经A-83-01及Y-27632处理的心肌细胞中纯化的胞外体导入至通过TGFβ处理而活化的纤维母细胞中所得的纤维母细胞所表达的ACTA2的mRNA量(A、C)、及αSMA的蛋白质量(B、D)的图表。ACTA2及αSMA表达量伴随着经TGFβ处理所造成的人类心脏纤维母细胞的纤维化而上升，但通过胞外体的添加而使其量显著降低，由此可知纤维母细胞的活化受到抑制。因此，显示出从经A-83-01及Y-27632处理的心肌细胞中纯化的胞外体使纤维母细胞的活化受到抑制的效果。
图9是表示将从经A-83-01及Y-27632处理的心肌细胞中纯化的胞外体导入至通过TGFβ处理而活化的纤维母细胞中所得的纤维母细胞所表达的ACTA2的mRNA量(A、C)、及αSMA的蛋白质量(B、D)的图表。图表以平均值±标准偏差来显示。ACTA2及αSMA表达量伴随着经TGFβ处理所造成的人类心脏纤维母细胞的纤维化而上升，但通过胞外体的添加而使其量显著降低，由此可知纤维母细胞的活化受到抑制。因此，显示出从经A-83-01及Y-27632处理的心肌细胞中纯化的胞外体使纤维母细胞的活化受到抑制的效果。
(实施例7)免疫染色
与实施例5或实施例6同样地，使通过TGFβ活化24小时的纤维母细胞与经A-83-01或Y-27632处理的HCM细胞共培养，或在来自该HCM细胞的胞外体(EV)的存在下培养48小时。继而，以PBS将细胞清洗2次后，历时10分钟添加4％多聚甲醛而实施固定。通过利用PBS溶解的0.1％Triton X对细胞膜实施透过处理。利用封闭剂-1(Blocking One，Nacalai Tesque)实行30分钟封闭，在室温下历时1小时培养细胞及一级抗体(抗αSMA、抗纤连蛋白、抗胶原蛋白I)。进而培养与Alexa Fluor 594结合的二级抗体1小时。通过DAPI(Vectashield)对细胞核染色。
图10示出将经A-83-01或Y-27632处理的HCM与通过TGFβ处理而活化的纤维母细胞共培养的情形下的免疫染色的结果。可知αSMA、纤连蛋白、胶原蛋白I的表达通过与经ROCK抑制药处理的HCM进行共培养而得到显著抑制，确认到心脏纤维母细胞的纤维化的抑制效果。
图11示出将来自经A-83-01或Y-27632处理的HCM的胞外体添加到通过TGFβ处理而活化的纤维母细胞中进行培养的情形下的免疫染色结果。可知αSMA、纤连蛋白、胶原蛋白I的表达通过来自经ROCK抑制药处理的HCM的胞外体而得到显著抑制，确认到心脏纤维母细胞的纤维化的抑制效果。
图12示出将来自经A-83-01或Y-27632处理的HCM的胞外体添加到通过TGFβ处理而活化的纤维母细胞中进行培养的情形下的代表性的免疫染色结果。以白色箭头表示αSMA阳性细胞。此外，图表以平均值±标准偏差来显示。可知通过TGFβ处理，诱导出αSMA的表达，αSMA阳性细胞增加，进而，通过添加来自经Y-27632处理的HCM的胞外体，使TGFβ的表达受到抑制，αSMA阳性细胞减少。同样地，关于纤连蛋白、胶原蛋白I的表达，亦可知通过来自经Y-27632处理的HCM的胞外体而受到显著抑制，确认到心脏纤维母细胞的纤维化的抑制效果。
(实施例8)在来自经ROCK抑制药处理的心肌细胞的胞外体的存在下所培养的纤维母细胞中的信号传递路径的变化
在活化的纤维母细胞、及对来自经Y-27632(Y)处理的心肌细胞的胞外体进行处理所得的纤维母细胞中，对与未处理的心肌细胞相比而变化的信号传递路径进行推定。在该推定中，按照制造商的操作说明书使用IPA。
在活化的纤维母细胞中，推定相关的信号传递路径按照如下顺序受到促进：肝纤维化/肝星状细胞的活化、神经细胞中的CREB信令、轴突诱导信令、心肥大信令(增加)、利用Stathmin1的乳癌控制、动脉粥状硬化信令、肝纤维化信号传递路径、STAT3路径、巨噬细胞、纤维母细胞、内皮的作用、及骨关节炎路径(图13的(A))。另一方面，在对来自经Y-27632(Y)处理的心肌细胞的胞外体进行处理所得的纤维母细胞中，推定相关的信号传递路径按照如下顺序受到促进：神经细胞中的CREB信令、精子运动、利用Stathmin1的乳癌控制、心肥大信令、STAT3路径、雌激素受体信令、巨噬细胞、纤维母细胞、内皮的作用、IL-15生成、肝纤维化/肝星状细胞的活化、PTEN信令(图13的(B))。
(实施例9)在来自经ROCK抑制药处理的心肌细胞的胞外体的存在下所培养的纤维母细胞中的活化信号传递因子的变化
对于实施例8所推定的信号传递路径，为了推定更具体的信号传递因子，在活化的纤维母细胞中，推定与未处理的心肌细胞相比受到抑制或促进的信号传递路径；以及针对活化的纤维母细胞，对来自经ROCK抑制药处理的HCM细胞的胞外体进行处理的情形下，推定与未处理的心肌细胞相比受到抑制或促进的信号传递路径。在该推定中，按照制造商的操作说明书使用IPA。
在活化的纤维母细胞中，推定相关信号传递路径按照如下顺序受到抑制：NFκB(复合体)、HGF、Vegf、IL17A、IL1B、CSF2、CHUK、EGF、Tlr、TLR4，推定相关信号传递路径按照如下顺序受到促进：TGFB1、Tgf beta、TGFB3、NUPR1、NORAD、TAZ、MRTFA、TGFBR1、TGFB2、DRD2(图14的(A)和(B))。
另一方面，在针对活化的纤维母细胞，对来自经ROCK抑制药处理的HCM细胞的胞外体进行处理的情形下，推定相关信号传递路径按照如下顺序受到抑制：ESR1、TCF7L2、IRGM、MRTFB、HGF、CD24、MRTFA、MAPK1、Vegf、NKX2-3、RC3H1、Irgm1、IL1RN、ACKR2、IL4、TRIM24、Tgfbeta、SMAD4、ESR2、PTGER4，推定相关信号传递路径按照如下顺序受到促进：IFNL1、IRF7、IFNA2、MIR17HG、GRIN3A、Hbb-b1、Ifnar、IFNB1、IRF3、STAT1、STING1、SEL1L、RNY3、IRF1、干扰素α、PML、MAVS、IFNAR1、IFNG、KLF3(图14的(C)和(D))。因此，可知活化的纤维母细胞中的活化的信号传递路径通过胞外体的处理而受到抑制。因此，示出具体的纤维母细胞的信号传递路径通过来自经ROCK抑制药处理的心肌细胞的胞外体的处理而恢复。
(实施例10)微RNA的功能解析
针对来自经ROCK抑制药处理的HCM细胞的胞外体，选择内含的微RNA最高度表达的胞外体群(参照图15的(A))，鉴定该微RNA的靶基因。具体而言，将经ROCK抑制药处理的HCM细胞的培养液更换为无血清的培养液，培养72小时后，回收500ml的该培养上清液。以10,000×g使该培养上清液离心30分钟，以去除细胞的破碎物等，然后，利用贝克曼库尔特公司制造的超离心机(Optima-XE-90)，在100,000×g、4℃下进行超离心70分钟后，使颗粒溶解于PBS(-)中，进而在100,000×g、4℃下进行超离心70分钟后，溶解于适量的PBS(-)中。使用微RNA简易套组(QIAGEN)，从该胞外体组份中回收微RNA，通过下一代核酸定序仪对该8ng实施RNA解析(DNA chip研究所)。
其结果表明所选的微RNA靶向的513种基因中的18.5％与心脏的坏死及细胞死亡、心肥大、心衰竭等心血管疾病相关(参照图15的(B))。此外，表明所选的微RNA的靶基因与TGFB1信号传递路径密切相关(参照图15的(C))。

Claims (23)

1.一种心肌干细胞/心肌前体细胞的制备方法，其包括通过ROCK抑制药处理心肌细胞。
2.一种培养方法，是心肌细胞的培养方法，其包括在ROCK抑制药的存在下培养心肌细胞。
3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，
培养时间为1个月以上，及/或经过培养时间后所述心肌细胞所表达的、选自心肌细胞的成熟标记物、衰老标记物、及内皮细胞标记物中的一种以上的标记物的量低于在ROCK抑制药的非存在下所培养的心肌细胞所表达的心肌细胞的该标记物的量。
4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，
成熟标记物为MYL2，并且/或者衰老标记物为CDKN1A及/或CDKN2A，并且/或者内皮细胞标记物为CD31。
5.根据权利要求3或4所述的培养方法，其特征在于，
经过培养时间后所述心肌细胞所表达的、心肌前体细胞标记物的量高于在ROCK抑制药的非存在下所培养的心肌细胞所表达的心肌细胞的该标记物的量。
6.一种心肌干细胞/心肌前体细胞的维持培养方法，其包括在ROCK抑制药的存在下培养心肌干细胞/心肌前体细胞。
7.一种分泌组或胞外体的制备方法，其包括从利用权利要求2～5所述的方法所培养的心肌细胞回收分泌组或胞外体。
8.一种纤维母细胞的纤维化抑制方法，其包括使经ROCK抑制药处理的心肌细胞和纤维母细胞一起存在于该心肌细胞能够发挥旁分泌效果的位置。
9.一种纤维母细胞的纤维化抑制方法，其包括通过ROCK抑制药对存在于能够对纤维母细胞发挥旁分泌作用的位置的心肌细胞进行处理。
10.一种纤维母细胞的纤维化抑制方法，其包括通过从在ROCK抑制药的存在下所培养的心肌细胞提取出的分泌组或胞外体对纤维母细胞进行处理。
11.根据权利要求8所述的纤维母细胞的纤维化抑制方法，其特征在于，包括：
在ROCK抑制药的存在下培养心肌细胞；
从所培养的心肌细胞回收分泌组或胞外体；及
通过所回收的分泌组或胞外体处理纤维母细胞。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的方法，其特征在于，
所述ROCK抑制药为(1R,4r)-4-((R)-1-氨基乙基)-N-(吡啶-4-基)环己烷甲酰胺。
13.根据权利要求1～12中任一项所述的方法，其特征在于，
所述心肌细胞为人类心肌细胞。
14.一种心肌干细胞/心肌前体细胞的诱导剂或心肌干细胞/心肌前体细胞的维持培养剂，其含有ROCK抑制药作为有效成分。
15.一种心肌干细胞/心肌前体细胞，其通过在ROCK抑制药的存在下培养心肌细胞而获得。
16.一种胞外体或分泌组，其来自在ROCK抑制药的存在下所培养的心肌细胞。
17.根据权利要求16所述的胞外体或分泌组，其特征在于，
含有以与心血管疾病相关的基因作为靶的微RNA。
18.根据权利要求17所述的胞外体或分泌组，其特征在于，
所述与心血管疾病相关的基因是与TGFB1信号传递路径相关的基因。
19.一种纤维化抑制剂或去纤维化剂，其含有ROCK抑制药、在ROCK抑制药的存在下所培养的心肌细胞、或根据权利要求16～18中任一项所述的胞外体或分泌组作为有效成分。
20.根据权利要求14所述的心肌干细胞/心肌前体细胞的诱导剂或心肌干细胞/心肌前体细胞的维持培养剂，根据权利要求15所述的心肌干细胞/心肌前体细胞，根据权利要求16～18中任一项所述的胞外体或分泌组，或根据权利要求19所述的纤维化抑制剂或去纤维化剂，其特征在于，
所述ROCK抑制药为(1R,4r)-4-((R)-1-氨基乙基)-N-(吡啶-4-基)环己烷甲酰胺。
21.一种抑制剂或治疗剂，是心血管疾病的发病及/或恶化的抑制剂或治疗剂，其含有用以作用于心肌细胞的ROCK抑制药作为有效成分。
22.根据权利要求21所述的抑制剂或治疗剂，其特征在于，
所述心血管疾病是选自心室功能衰竭、左心室功能衰竭、左心障碍、心功能衰竭、家族性心血管疾病、脑血管功能衰竭、左心室异常、心室异常、末梢血管疾病、动脉粥状硬化症、动脉硬化症、血管阻塞、血管阻塞症、动脉阻塞、郁血性心衰竭、及心衰竭中的至少一种疾病。
23.一种内皮细胞的细胞运动、脉管形成、血管新生、及脉管结构形成的促进剂，其含有用以作用于心肌细胞的ROCK抑制药作为有效成分。
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