KR20190110934A

KR20190110934A - 라파마이신을 포함하는 심근 전구 세포 노화 억제용 배지 조성물

Info

Publication number: KR20190110934A
Application number: KR1020190030437A
Authority: KR
Inventors: 권상모; 박지혜
Original assignee: 부산대학교 산학협력단
Priority date: 2018-03-21
Filing date: 2019-03-18
Publication date: 2019-10-01

Abstract

라파마이신을 포함하는 심근 전구 세포 노화억제용 배지 조성물, 또는 심근 전구 세포 생물학적 활성 증가용 배지 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 심근 전구 세포가 가지는 줄기 세포능을 유지한 상태에서 심근 전구 세포를 높은 수율로 확보할 수 있을 뿐만 아니라, 심근 전구 세포의 배양 시 심근 전구 세포의 노화를 억제한다. 구체적으로, 심근전구세포에서 노화표지자의 발현 감소, 단일세포클론 형성능의 유의적인 증가, 줄기세포 표지자 발현증가를 통해 줄기세포능 유지능에 우수한 효과를 가지고 노화된 세포의 전반적인 기능 및 세포 활성의 증가를 통해 심근 전구 세포가 세포 치료제로 이용될 수 있도록 하는 장점을 가진다.

Description

라파마이신을 포함하는 심근 전구 세포 노화 억제용 배지 조성물 {Medium Composition for attenuation senescence in cardiac progenitor cells containing rapamycin}

라파마이신을 포함하는 심근 전구 세포의 노화 억제, 생물학적 활성증가용 배지 조성물, 및 라파마이신을 유효성분으로 포함하는 심근 전구 세포 치료 보조제에 관한 것이다.

심근 전구 세포는 심장 조직 내 소수로 존재하는 자가 줄기세포군으로 심장손상시 혈관내피세포, 평활근세포, 심근 세포로 분화가능하며 손상된 심장을 회복시킬 수 있는 세포이다. 심장 유래 줄기세포는 심장 조직 내 생착률이 우수하고 심장 내 세포 분화의 조건에 가장 합목적인 세포이나 심장 내 그 수가 매우 적어 심장재생을 위한 자가 줄기세포 치료제로 사용하기 위해서는 체외배양의 과정이 반드시 필요하다.

세포의 체외배양 과정에서는 반복적인 계대배양이 수반되고, 그로 인해 세포노화가 진행된다. 노화된 세포는 줄기세포능, 세포기능 등이 매우 저하되어 있어 이를 극복하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.

심근 전구 세포의 분리 및 배양은 종래의 3가지 방법이 적용되고 있다. 첫째, 심근절편을 콜라제네이즈 (collagenase), 디스페이즈(dispase), 혹은 트립신(trypsin) 등과 같은 조직분해효소를 처리하여 고형성 심근으로부터 해리된 단일세포군을 분리하는 조직해리과정을 거친 후, 면역학적 방법으로 특정 표지자를 발현하는 세포만을 해리된 단일세포군으로부터 선택적으로 정제하고, 단층배양법으로 정제된 세포를 증폭하는 방법이 있다. 둘째, 심근을 조직분해효소를 약하게 처리한 후 조직을 느슨하게 만든 후 심근을 2차원 방법으로 배양용기에 파종한 후 배양하는 방법이 있으며 셋째, 두 번째 방법으로 배양하는 과정 중 배양 7일 이후에 형성되는 심장구(cardiosphere)를 선택적으로 분리한 후 심장구를 다시 단층 배양법으로 분리하는 방법이 사용되고 있다.

이러한 분리 및 배양 방법에서는 모두 앞서는 바와 같이 반복적인 계대배양과 이로 인한 세포 노화의 문제점을 고려조차 하지 못하고, 이와 관련된 해결 방안을 마련하지 못하고 있다.

라파마이신은 이스터섬에서 사는 세균에서 처음 발견된 항생물질로 FDA승인을 받아 면역억제제로 널리 쓰이고 있으며, 항종양 효능이 보고되고 있어 항암치료제의 가능성이 제시되었다.

그러나 라파마이신을 포함하는 배양법을 통한 심근 전구 세포의 노화 억제에 대한 연구는 보고된 바가 없다. 이러한 배경하에 본 발명자들은 세포 치료제의 효율성을 제고하기 위해 심근 전구 세포를 배양 및 보관하는 과정에서 이의 노화를 억제하는 기술을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

대한민국 공개특허공보 10-2016-0009420 (2006. 1. 26. 공개) 대한민국 공개특허공보 10-2011-0044722 (2011. 4. 29. 공개)

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 라파마이신을 포함하는 심근 전구 세포 노화억제용 배지 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 라파마이신을 포함하는 심근 전구 세포 노화억제용 배지 조성물을 이용한 심근 전구 세포 배양 방법을 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 라파마이신을 포함하는 심근 전구 세포의 생물학적 활성 증가용 배지 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 라파마이신을 유효성분으로 포함하는 심근 전구 세포 치료 보조제를 제공하는 것이다.

상기한 과제를 해결하기 위한, 본 발명은 라파마이신을 포함하는 심근 전구세포 노화억제, 생물학적 활성증가용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 심근 전구 세포의 체외배양을 통한 수적확보 및 줄기세포 기능 보존 및 심근 전구 세포의 노화억제를 위한 심근 전구 세포 배양 조성물을 제공한다.

보다 상세하게는 라파마이신을 포함하는 심근 전구 세포 노화 억제용 배양 조성물을 사용하여 심근 전구세포의 줄기세포능(고활성)을 향상시킬 수 있는 방법으로서, 라파마이신을 포함하는 심근 전구 세포 노화 억제용 배양조성물을 처리하였을 때 줄기세포의 세포생존능, 이동능의 세포기능 및 세포노화의 완화효과를 검증하였다.

라파마이신은 FDA 승인을 받은 인체에 무해한 항생물질로 본 발명에서는 심근 전구 세포의 배양시 라파마이신을 함유하는 조성물을 사용하여 장기간 배양시 심근 전구 세포의 전반적인 생물활적 활성이 (증식능 및 혈관분화능) 증진되며 세포노화가 회복됨을 다양한 실험을 통해 검증하였다. 기존 배양법에 의해 계대배양된 심근 전구 세포는 노화된 표현형을 보이는 반면 라파마이신을 포함하는 조성물을 사용하여 장기간 배양한 심근 전구 세포는 노화의 표현형(노화마커 p21, p53, p16의 발현 및 세포길이의 증가, SA-b-gal 양성세포의 증가)이 라파마이신 농도 의존적으로 감소함을 확인하였다. 또한 RNA seq을 통해 노화표현형 SASP 연관 유전자의 발현 분석 결과에서도 라파마이신을 포함하는 조성물을 사용하여 장기간 배양한 심근 전구 세포는 초기passage의 심근 전구 세포와 비슷한 표현형을 나타냄을 검증하였다. 본 발명을 통해 라파마이신을 함유한 조성물을 사용하여 지속적으로 배양된 심근 전구 세포는 기존 배양법에 비교하여 세포증식능이 증진되며 혈관으로의 분화능이 유의적으로 증진됨을 검증하였고 심근 전구 세포의 노화를 억제함을 검증하였다.

라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 장기간 배양한 심근 전구 세포는 동일한 passage의 노화된 심근 전구 세포에 비교하여 437개 유전자의 발현이 유의적으로 다르게 나타남을 RNA seq을 통해 검증하였고, Gene ontology 분석을 통해 biological process category에서 p값 0.001 미만으로 차이 나는 유전체 분석결과 세포주기와 분화, 세포 이동과 관련된 유전자의 발현이 유의적으로 차이 나는 것을 확인하였다. 또한, 혈관 및 심근 분화 관련 유전자의 발현이 유의적으로 차이 나는 것을 검증하였다. 본 발명을 통해 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 장기간 배양한 심근 전구 세포가 세포주기와 세포이동, 분화와 관련된 유전체의 발현을 조절하여 세포기능 및 세포노화를 억제함을 검증하였다.

이에 따라 본원 발명에서는 라파마이신을 포함하는 심근 전구 세포 노화억제용 배지 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서 라파마이신이란 하기 화학식 1의 구조를 가지는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이다.

[화학식 1]

본 발명에 있어서 심근 전구 세포는 심장 조직 내 소수로 존재하는 자가 줄기세포군으로 예를 들어 혈관내피세포, 평활근세포, 심근 세포로 분화가능하며 손상된 심장을 회복시킬 수 있는 세포로써, 심장 조직 내 생착률이 우수한 세포를 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "노화(senescence)"는, 심근 전구 세포가 내부 혹은 외부로부터 받는 다양한 스트레스 (예를 들어 연속되는 계대 배양 및 체외 배양시의 고농도의 산소 조건 등)에 대항하여, 세포 성장(cell growth) 및 세포 분열이 정지되거나 유의성 있게 지연되는 것, 노화 표현형이 표현되는 것, 줄기세포 기능이 저하되는 것 등을 의미한다. 구체적으로, 연속되는 체외 배양시에 수반되는 노화표현형의 표현 및 줄기세포 기능 저하를 의미할 수 있다.

본 발명에서 노화의 억제란 세포 성장(cell growth) 및 세포 분열이 정지되거나 유의성 있게 지연되는 등의 심근 전구 세포에서의 통상의 노화와 관련된 현상들을 늦추거가 개선하는 것을 의미한다. 예를 들어, 노화의 억제는 노화표지자의 발현 감소, 단일세포클론 형성능 유지 및/또는 증가, 줄기세포능 유지 및/또는 증가, 세포 증식능 유지 및/또는 증가, 세포이동능 유지 및/또는 증가, 생착능 유지 및/또는 증가, 혈관신생 촉진능의 유지 및/또는 증가 및 혈관형성능의 유지 및/또는 증가로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 특성을 포함하는 것이다.

본 발명에 따른 배지 조성물은 ex vivo 또는 in vitro 상의 전처리에 따라, in vitro 및 in vivo상에서 위 언급된 노화의 억제와 관련된 특성을 개선시킴으로써 심근 전구 세포의 배양에 우수한 효과를 나타낼 뿐만 아니라 이식에 적합한 상태로 세포를 활성화시키고 이의 특성을 인체 등에 적합하게 변형시킴으로써 세포치료제로 적합한 심근 전구 세포의 특성을 가진 세포를 제공하도록 한다.

이에 국한되는 것은 아니나, 이러한 노화의 억제는 라파마이신을 통한 mTORC1의 지속적인 억제가 STAT3, Pim1의 유전자 수준을 상승시켜 심근 전구 세포의 기능을 증진시키는 것일 수 있다.

본 발명에서 “노화표지자의 발현 감소“란 노화의 지표가 되는 유전자 등의 발현의 감소, 노화의 지표가 되는 특정 세포의 수 감소 등 노화에 따라 발생하게 되는 세포 내 변화의 억제 의미한다. 이에 한정되지 않으나 예를 들어, SA-b-gal 양성세포의 감소, p53, p21 및 p16로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 발현 감소, 노화관련 분비 표현형 IL-1A, IL-6 또는 이들 모두의 감소일 수 있다.

본 발명에서 “세포이동능”이란 심근 전구 세포의 이동 활성 (migration activity)에서의 증진 효과를 의미하며, 이식부위로부터 손상부위로 세포의 이동 능력 증가의 효과를 포함한다. 예컨대, 이식 부위에서 손상 부위로 이동 촉진에 따라 유효 이식 세포 수의 절감, 이에 따른 세포 체외 배양 기간 단축 및 세포의 안전성 증가와 제조 원가 절감의 효과를 가질 수 있다.

본 발명에서 “생착능”이란 이식된 심근 전구 세포가 분화된 후속세포, 이식된 후 체내에서 생산한 세포 또는 주입된 세포가 손실 혹은 손상된 세포를 대체할 수 있는 능력을 말한다. 생착능 증진에 따라 예컨대 유효 이식 세포 수의 절감, 이에 따른 세포 체외 배양 기간 단축 및 세포의 안전성 증가와 제조원가 절감의 장점을 가질 수 있다.

본 발명에서 “단일세포 클론 형성능”이란 하나의 심근 전구 세포가 증식되어서 콜로니를 이루는 것을 말한다. 단일세포 클론 형성능(CFUFs) 형성능 증진에 따라 예컨대 세포의 줄기세포성(Stemness)의 연장 및 증식능 증진에 따른 안전하고 효과적인 ex vivo 및 in vitro 확장(Expansion)에 장점을 가진다.

본 발명에서, "증식(proliferation)"은 특징적인 세포 유형, 또는 동일할 수 있거나 동일하지 않을 수 있는 세포의 시원 세포 집단으로부터의 세포 유형들의 개수의 증가를 의미한다.

본 발명에서 “혈관신생 촉진능” 또는 “혈관형성능”이란 혈관이 형성되는 과정, 즉 혈관이 세포, 조직 또는 기관 내로 발생 및 분화하는 것을 촉진하는 기능을 의미한다. 본 발명의 혈관신생 촉진 또는 혈관 형성능은, 내피세포 활성화, 이동, 증식, 매트릭스 재형성 및 세포 안정화를 비롯한 혈관 형성 과정에 관련된 혈관재생, 혈관회복 및 혈관 분화의 촉진을 포함한다.

본 발명에서 배지(media)는 in vitro에서 세포 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 배지를 의미하고, 세포의 배양에 적절한 당 분야에서 사용되는 통상의 배지를 모두 포함한다. 세포의 종류에 따라 배지와 배양 조건을 선택할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 바람직하게는 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium: CCMM)로, 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 이런 세포 배양 최소 배지에는 예들 들어, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, Ham’s F12, αMEM(α Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다. 또한 상기 배지는 페니실린 (penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 겐타마이신(gentamicin) 등의 항생제를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시양태에 따르면, 상기 배지는 Ham’s F12배지일 수 있으며, 선택적으로 혈청 성분 및 항생제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서 배지 조성물은 라파마이신을 유효 농도로 배지에 포함한다. 본 발명에서 유효 농도는 라파마이신이 심근 전구 세포의 노화표지자의 발현 감소, 단일세포클론 형성능 증진, 줄기세포능 증진, 세포 증식능 증진, 세포이동능 증진, 생착능 증진, 혈관신생 촉진능 증진 및/또는 혈관형성능 증진의 효과를 나타낼 충분한 양을 의미하며, 유효 농도 이하에서는 활성을 나타내지 않고 유효 농도 이상에서는 세포에 독성을 나타내게 되므로 유효 농도 내에서 라파마이신을 사용하도록 한다. 본 발명에서 바람직한 처리 농도는 0.01 nM 내지 1,000 nM, 보다 바람직하게 1 nM 내지 100 nM이다.

또한, 본 발명에서 라파마이신은 지속적으로 계대배양시에 심근 전구 세포에 처리될 수 있고, 필요에 따라 배지와 함께 라파마이신을 교환하면서 지속적으로 처리할 수 있다.

본 발명은 또한 라파마이신을 심근 전구 세포에 처리하는 단계를 포함하는 심근 전구 세포의 노화 억제 방법을 제공한다.

이러한 라파마이신의 처리는 생체로부터 분리된 심근 전구 세포에 처리일 수 있다.

상기 라파마이신을 심근 전구 세포에 처리하는 단계는 일반 혈청 배지에서 수행되거나, 혈청 배지에서 계대 배양된 줄기세포를 무혈청 배지로 옮긴 후 수행되는 것일 수 있다. 무혈청 배지 중에서의 배양은 혈청 배지에서의 배양액을 제거하고, 세포를 인산염 완충용액으로 세척한 후에 수행될 수 있다.

앞서 살핀바와 같이, 이에 제한되지 않으나 바람직한 처리 농도는 0.01 nM 내지 1000 nM, 보다 바람직하게 1 nM 내지 100 nM일 수 있고, 지속적으로 계대배양시에 심근 전구 세포에 처리될 수 있고, 필요에 따라 배지와 함께 라파마이신을 교환하면서 지속적으로 처리할 수 있다.

본 발명의 일실시양태에 따르면, 심근 전구 세포에 라파마이신을 처리함으로서 G0/G1기의 세포가 감소하고 S기의 세포가 유의적으로 증가하여 cell cycle arrest를 해소한다.

본 발명의 일실시양태에 따르면, 심근 전구 세포에 라파마이신을 처리함으로서 혈관 형성능을 증진시킨다.

본 발명의 일실시양태에 따르면, 심근 전구 세포에 라파마이신을 처리함으로서 노화표현형인 SA-b-gal 양성세포를 유의적인 감소시킨다.

본 발명의 일실시양태에 따르면, 심근 전구 세포에 라파마이신을 처리함으로서 노화표지자 p53, p21, p16를 감소시킨다.

본 발명의 일실시양태에 따르면, 심근 전구 세포에 라파마이신을 처리함으로서 노화 관련 유전자들의 발현 수준을 조절한다.

본 발명의 일실시양태에 따르면, 심근 전구 세포에 라파마이신을 처리함으로서 심근 전구 세포의 분열한계를 증진시킨다.

본 발명의 일실시양태에 따르면, 심근 전구 세포에 라파마이신을 처리함으로서

CENP-A의 발현 수준을 증가시킨다.

본 발명의 일실시양태에 따르면, 심근 전구 세포에 라파마이신을 처리함으로서 단일세포 유래의 클론 형성능을 증진시킨다.

줄기세포의 다능성에 작용하는 전사인자로 예컨대 OCT4, KLF4, NANOG 등의 발현을 증진시킨다.

본 발명의 일실시양태에 따르면, 심근 전구 세포에 라파마이신을 처리함으로서 세포 이동능을 증진시킨다.

본 발명의 일실시양태에 따르면, 심근 전구 세포에 라파마이신을 처리함으로서 myocyte로의 전환에 관여하는 전사인자로 예컨대 GATA4, MEF2C, HAND2, TBX5의 발현을 증진시킨다.

본 발명의 일실시양태에 따르면, 심근 전구 세포에 라파마이신을 처리함으로서 노화를 억제하는 방향으로 유전자의 발현 수준을 조절한다.

또한 본원 발명은 라파마이신을 포함하는 배지 조성물을 심근 전구 세포에 처리하는 단계를 포함하는 심근 전구 세포의 배양 방법을 제공한다.

또한 본원 발명은 라파마이신을 포함하는 심근 전구 세포의 생물학적 활성 증가용 배지 조성물을 제공하는 것이다.

생물학적 활성 증가란 노화표지자의 발현 감소, 단일세포클론 형성능 증진, 줄기세포능 증진, 세포 증식능 증진, 세포이동능 증진, 생착능 증진, 혈관신생 촉진능 증진 및/또는 혈관형성능 증진의 효과와 같이 생물학적인 활성 측면에서 전반적 증가를 의미한다.

또한 본원 발명은 라파마이신을 유효성분으로 포함하는 심근 전구 세포 치료 보조제를 제공할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "심근 전구 세포 치료 보조제"는, 당업계에서 일반적으로 사용되는 심근 전구 세포 치료제의 효과를 증진시키기 위하여 보조적으로 사용될 수 있는 제재를 말하며, 본 발명에 의한 보조제를 사용함으로써 심근 전구 세포 치료제에 있어서 세포의 노화 억제 및 증식을 촉진하여 치료제의 효과를 향상시킬 수 있다.

"세포 치료제"란, 세포와 조직의 기능을 복원하기 위하여 살아 있는 자가(autologous), 동종(allogenic), 이종 (xenogenic) 세포를 체외에서 증식, 선별하거나 여타 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등 일련의 행위를 통하여 치료, 진단, 예방 목적으로 사용되는 의약품을 말한다.

상기 치료 보조제는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 인체에 투여될 수 있다.

비경구 투여, 예를 들어 복강 내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 심근 전구 세포 치료 보조제는 또한 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 세포 치료에 일반적으로 사용되는 약제학적 담체와 함께 투여될 수 있으며, 이런 담체로 생리학적 식염수를 예로 들 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 심근 전구 세포 치료는 허혈성 질환 치료이다.

상기 허혈성 질환은, 허혈성 심장질환, 허혈성 심근경색, 허혈성 심부전, 허혈성 뇌졸중 및/또는 허혈성 하지질환일 수 있다. 바람직하게는 허혈성 심근경색일 수 있다.

본 발명의 조성물은 심근 전구 세포가 가지는 줄기 세포능을 유지한 상태에서 심근 전구 세포를 높은 수율로 확보할 수 있을 뿐만 아니라, 심근 전구 세포의 배양 시 심근 전구 세포의 노화를 억제한다. 구체적으로, 심근전구세포에서 노화표지자의 발현 감소, 단일세포클론 형성능의 유의적인 증가, 줄기세포 표지자 발현증가 등을 통해 줄기세포능 유지능에 우수한 효과를 가지고 노화된 세포의 전반적인 기능 및 세포 활성의 증가를 통해 심근전구세포가 세포 치료제로 이용될 수 있도록 하는 장점을 가진다.

도 1a는 라파마이신을 농도별로 심근 전구 세포에 단기 처리하여 세포 증식능 및 세포독성 검증을 확인한 실험으로, 1μM 이하의 농도에서는 세포독성이 나타나지 않았으며, 0.1μM의 농도에서 세포증식능이 유의하게 증가하는 것을 확인하였다.
도 1b는 라파마이신을 포함하는 심근 전구 세포 조성물에 장기간 배양한 심근 전구 세포의 세포 증식능을 BrdU assay를 통해 확인한 결과이다. 노화된 심근 전구 세포(senescent)에 비교하여 동일 passage의 라파마이신 장기간 처리군에서 라파마이신 농도 의존적으로 세포증식능이 증가한 것을 확인하였다.
도 1c는 PI 염색법을 통해 세포주기분석을 수행한 결과로, 노화된 심근전구에 비교하여 동일 passage의 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 장기간 배양된 심근 전구 세포에서 라파마이신 농도 의존적으로 G0/G1기의 세포가 감소하고 S기의 세포가 유의적으로 증가하는 것을 통해 세포의 증식능이 라파마이신 장기 처리에 의해 유의적으로 증가함을 확인하였다.
도 1d는 tube formation assay를 통해 심장줄기세포의 혈관형성능을 검증한 결과이다. 노화된 심근 전구 세포에 비교하여 동일 passage의 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 장기간 배양된 심근 전구 세포에서 혈관형성능이 유의하게 증가함을 확인하였다.
도 2a는 심근 전구 세포의 형태학적 분석을 수행한 결과이다. 세포가 노화될수록 세포의 길이가 길어지는 형태학적인 변화가 나타나는데, 노화된 심근 전구 세포의 세포 길이에 비교하여 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 장기간 배양된 심근 전구 세포에서 노화된 세포의 형태학적인 변화의 감소를 확인하였다.
도 2b는 심근 전구 세포의 노화 표현형을 검증하기 위해 SA-b-gal assay를 검증한 결과이다. 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 장기간 배양된 심근 전구 세포에서 동일 passage의 심근전구에 비교하여 노화표현형인 SA-b-gal 양성세포의 유의적인 감소를 확인하였다.
도 2c는 노화된 심근 전구 세포에 비교하여 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 장기간 배양된 동일 passage의 심근 전구 세포에서 노화표지자 p53, p21, p16의 단백질 발현이 감소되어 있음을 western blot을 통해 확인한 결과이다.
도 2d는 노화된 심근 전구 세포에 비교하여 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 장기간 배양된 동일 passage의 심근 전구 세포에서 노화표지자 p53, p21, p16의 mRNA 발현이 감소되어 있음을 real time PCR을 통해 확인한 결과이다. (*** p ≤ 0.001, n=3).
도 3a는 초기 passage(Young)의 심근 전구 세포와 지속적인 계대배양을 통해 구축된 노화된 심근 전구 세포(Sene), 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 장기간 배양된 동일한 passage의 심근 전구 세포(Sene+Rapa)에서 노화관련 분비 표현형 SASP연관 유전체 발현변화를 분석한 결과이다. 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 장기간 배양된 심근 전구 세포가 초기 passage와 유사한 노화관련 분비표현형을 보이는 것을 검증하였다.
도 3b는 초기 passage(Young)의 심근 전구 세포와 지속적인 계대배양을 통해 구축된 노화된 심근 전구 세포(Sene), 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 장기간 배양된 동일한 passage의 심근 전구 세포(Sene+Rapa)에서 노화관련 분비 표현형 SASP관련 transcript IL-1A, IL-6의 transcript level을 real time PCR를 통해 확인한 결과이다. ( **p ≤ 0.01, n=3).
도 3c는 라파마이신을 농도별로 처리하여 계대배양한 심근 전구 세포의 분열한계 (hayflick limit) passage를 표로 나타낸 결과이다. (*** p ≤ 0.001, n=6)
도 3d는 초기 passage 심근 전구 세포에 비교한 라파마이신 포함하는 배지 조성물에 장기간 배양된 심근 전구 세포의 상대적인 텔로미어길이를 real time PCR을 통해 정량한 결과이다. (***p ≤ 0.001, vs. Young, ##***p≤ 0.01, vs. Sene, n=3)
도 4a는 초기 passage 심근 전구 세포와, 노화된 심근 전구 세포, 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 장기간 배양된 심근 전구 세포의 세포증식능을 실시간 세포 모니터링을 통해 확인한 결과이다. 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 장기간 배양된 심근 전구 세포는 동일한 passage의 노화된 심근 전구 세포에 비해 증식능이 증가한 결과를 보였다.
도 4b는 심근 전구 세포의 증식과 관련 있는 CENP-A의 mRNA level을 real time PCR로 정량한 결과이며 protein level은 도 4c에서 나타내었다. 라파마이신을 1, 10, 100nM 농도별로 포함하는 배지 조성물에 배양한 심근 전구 세포에서 CENP-A의 mRNA level(도 4d), 단백질 발현정도(도 4e)를 검증한 결과 심근 전구 세포의 증식마커인 CENP-A의 발현이 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에서 배양된 심근 전구 세포에서 유의적으로 증가되어 있음을 검증하였다.
도 5a는 단일세포를 96well plate에 주입하고 14일 동안 배양 후 단일세포 유래의 클론 형성능을 확인한 결과이다. 초기 passage 심근 전구 세포에 비교하여 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 장기간 배양된 심근 전구 세포의 클론형성능은 유의적인 차이가 없었으며, 노화된 심근 전구 세포에 비교하여 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 장기간 배양된 심근 전구 세포의 단일세포유래 클론형성능이 유의적으로 증진되어 있음을 검증하였다. (**p ≤ 0.01,vs. Young, ### p ≤ 0.001, vs. Sene)
도 5b는 줄기세포의 다능성에 작용하는 전사인자 OCT4, KLF4, NANOG의 유전자 발현을 real time PCR로 정량한 결과이다. 라파마아신을 포함하는 배지 조성물에 장기간 배양된 심근 전구 세포에서 줄기세포 다능성에 관여하는 OCT4, KLF4, NANOG의 mRNA level이 유의적으로 증가되어 있음을 검증하였다. (*p ≤ 0.05).
도 6a는 transwell migration assay를 통하여 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 장기간 배양된 심근 전구 세포의 세포 이동능을 확인한 결과이다. 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 장기간 배양된 심근 전구 세포의 세포이동능이 노화된 심근 전구 세포에 비교하여 유의적으로 증가되어 있음을 검증하였다.
도 6b는 RNA-seq을 통한 myocyte로의 전환에 관여하는 전사인자 GATA4, MEF2C, HAND2, TBX5의 발현정도분석 결과이다. 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 장기간 배양된 심근 전구 세포에서 GATA4, MEF2C, HAND2, TBX5의 transcript 발현이 유의적으로 증가되어 있음을 검증하였다.
도 7a는 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 장기간 배양된 심근 전구 세포의 유전체 발현변화를 분석하기 위해 RNA seq분석법을 수행한 결과이다. 총 23,362개의 유전자를 비교분석한 결과 q-value 0.05이하의 유의차를 가지며 2배 이상 발현차이를 보이는 유전자가 437개 검출되었다. 라파마이신을 통해 발현이 증가된 유전자(빨간색)는 265개, 발현이 감소된 유전자는 172개가 확인되었다.
도 7b는 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 장기간 배양된 심근 전구 세포를 RNA seq을 통해 gene ontology를 분석하고, Biological process에서 p-value 0.001이하의 유의차를 가지는 유전자들을 category화 하고 축약하여 제시한 도표이다. 라파마이신을 처리하여 장기간 배양된 심근 전구 세포와 노화된 심근 전구 세포의 세포주기, MAPK cascade 연관 유전자들의 차이가 유의적으로 확인되었으며 세포이동, 세포 분화와 관련된 유전자들의 유의적인 차이도 검출되었다. 또한 근육세포, 혈관분화 및 발달, 심장근육세포로의 분화와 관련된 유전자들의 유의적인 차이의 검출을 통해 라파마이신을 포함하는 배지 조성물이 심근 전구 세포의 세포노화와 분화와 관련된 유전자의 발현을 조절하는 것을 검증하였다.
도 7c는 노화된 심근 전구 세포와 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 장기간 배양된 동일 passage의 심근 전구 세포의 유전체발현분석을 수행하여 가장 유의적으로 차이 나는 유전체 KEGG pathway를 확인하여 도표화 한 결과이다. cell cycle 관련된 pathway의 유전체가 유의적으로 가장 차이 나는 pathway로 검증되었다. 이를 통해 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 장기간 배양된 심근 전구 세포는 cell cycle관련 유전자들의 유전자발현조절을 통해 세포증식능을 증가시키는 것을 검증하였다.
도 8a는 초기 passage 심근 전구 세포와, 노화된 심근 전구 세포, 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 장기간 배양된 심근 전구 세포의 STAT3, Pim1, Bcl-2의 mRNA level을 real time PCR로 확인한 결과를 나타낸다. 또한, 초기 passage 심근 전구 세포와 노화된 심근 전구 세포, 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 장기간 배양된 심근 전구 세포의 STAT3, Pim1, Bcl-2의 단백질 발현정도를 western blot으로 확인한 결과이다. 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 장기간 배양된 심근 전구 세포의 p-STAT3, Pim1, Bcl-2의 발현이 노화된 심근 전구 세포에 비교하여 증가됨을 검증하였다.
도 8b는 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 STAT3 억제제를 농도별로 처리하고 STAT3 신호 억제 후 세포증식능에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 8c는 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 STAT3 억제제를 농도별로 처리하고 라파마이신으로 완화된 세포성 노화에서 STAT3 신호 억제가 미치는 영향을 확인한 결과이다. STAT3 억제시 라파마이신으로 완화된 세포성 노화가 다시 유의적으로 증가되는 것을 확인하였다.
도 8d는 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 Pim1 억제제(SMI-4a)를 농도별로 처리하고 세포증식능에 미치는 영향을 확인한 결과이다. 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 Pim1을 억제하였을 때 세포증식능이 감소하는 것을 확인하였다.
도 8e는 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 Pim1 억제제를 농도별로 처리하고 라파마이신으로 완화된 세포성 노화에서 Pim1 신호 억제가 미치는 영향을 확인한 결과이다. Pim1 억제 시 라파마이신으로 완화된 세포성 노화가 다시 유의적으로 증가되는 것을 확인하였다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 발명자들은 라파마이신을 포함하는 심근 전구 세포 배양법을 통해 심근줄기세포 노화억제 및 생리학적 활성증가를 검증하였다.

<실시예 1> 라파아미이신 처리에 따른 심근줄기세포의 노화 억제 확인

라파아미이신 처리에 따른 심근줄기세포의 노화 억제를 세포 증식능 증가, 세포 주기 변화 및 혈관 형성능 변화에 관한 실험을 통해 확인하였다.

실시예 1-1. 인간심근 전구 세포 분리 및 배양

c-kit 양성 인간심근 전구 세포는 양산부산대학교 어린이 병원에서 IRB승인을 받고(IRB 05-2015-133) 수술 후 폐기되는 조직을 제공받아 분리 배양하였다. 0.2% coolagenase type II (Warthington Biochemical Corp)을 사용하여 효소분리법을 통해 단일세포로 분리 후 배양하였다. c-kit 항체(santa cruz)와 rabbit-IgG bead(Miltenyi)를 conjugate하여 magenetically activaed cell sorting을 이용하여 c-kit 양성세포를 분리하였다. 본 특허에 사용된 심근세포는 young (passage 8이하), senescence(passage 16이상)을 사용하였다.

심근 전구 세포는 Ham’s F12 배지(Hyclone)에 10% 소 태아 혈청(Gibco), 페니실린 스트렙토마이신 1%, 5μg의 recombinant human basic fibroblast growth factor(Peprotech), 2.5U human erythropoietin(hEPO, R&D systems), 2mM glutachion (sigma aldrich)의 조성의 배지를 사용하여 배양하였다. rapamycin(sigma)은 passage 7부터 1, 10, 100 nM을 함유한 배지를 사용하여 이틀에 한번씩 배지를 교환하여 장기적으로 처리하였다. 동일한 양의 DMSO(sigma)를 처리한 배지에 배양한 심근 전구 세포를 비교군으로 사용하였다.

실시예 1-2. 라파마이신을 농도별로 심근 전구 세포에 단기 처리하여 세포 증식능 및 세포독성 검증

라파마이신을 농도별로 심근 전구 세포에 단기적으로 처리하여 세포 증식 및 세포 독성을 검증하였다. 위 실시예 1-1의 심근 전구 세포를 0.01, 0.1ㅡ 1, 10 및 100 μM의 농도로 24시간 동안 단기로 처리한 후, 세포 독성 등을 확인하였다. 그 결과를 도 1의 a에 나타내었다. 도 1의 a에서 확인할 수 있는 바와 같이 1μM 이하의 농도에서는 세포독성이 나타나지 않음을 확인하였다.

실시예 1-3. 세포 증식 실험

BrdU assay(cell signaling technology)는 위 실시예 1-1의 동일한 세포를 96well에 배양 후 BrdU labeling을 통해 증식하고 있는 세포를 확인하였다. 실시간 세포 증식능 검증은 96well에 2000개의 세포를 seeding 후 Incucyte에서 일주일간 배양하면서 4시간에 한번씩 image를 얻어 세포 증식능을 검증하였다.

그 결과를 도 1의 b에 나타내었다. 도 1의 b는 라파마이신을 포함하는 심근 전구 세포 조성물에 장기간 배양한 심근 전구 세포의 세포 증식능을 BrdU assay를 통해 확인한 결과이다. 노화된 심근 전구 세포(senescent)에 비교하여 동일 passage의 라파마이신 장기간 처리군에서 라파마이신 농도 의존적으로 세포증식능이 증가한 것을 확인하였다.

실시예 1-4. PI 염색법을 통한 세포 주기 분석

위 실시예 1-1의 조건 하에 세포를 배양하고 PI 염색법을 통해 세포주기분석을 수행하여, 그 결과를 도 1의 c에 나타내었다. 도 1의 c에서 확인할 수 있는 바와 같이, 노화된 심근전구에 비교하여 동일 passage의 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 장기간 배양된 심근 전구 세포에서 라파마이신 농도 의존적으로 G0/G1기의 세포가 감소하고 S기의 세포가 유의적으로 증가하는 것을 통해 세포의 증식능이 라파마이신 장기처리에 의해 유의적으로 증가함을 확인하였다.

실시예 1-5. tube formation assay를 통해 심장줄기세포의 혈관형성능 검증

혈관형성능은 Mtrigel assay방법을 통해 검증하였다. 96well plate에 55μl의 growth factor-reduced matrigel(BD bioscience)이 코팅 후 8000개의 심근 전구 세포를 seeding 하였다. 실시예 1-1의 조건 하에 5% CO₂, 37℃ 환경에서 6시간 배양 후 형성된 tube를 현미경상에서 관찰하고 이미지화하였다. Image J를 이용하여 전체 형성된 tube의 개수와 길이를 정량화하였다.

그 결과를 도 1의 d에 나타내었다. 그 결과, 노화된 심근 전구 세포에 비교하여 동일 passage의 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 장기간 배양된 심근 전구 세포에서 혈관형성능이 유의하게 증가함을 확인하였다.

<실시예 2> 라파마이신 처리에 따른 심근줄기세포의 형태학적 변화 및 노화 관련 유전자 발현 변화 확인

라파마이신 처리에 따른 심근줄기세포의 노화 억제를 세포의 형태학적 변화, SA-b-gal 양성세포의 변화 및 노화 관련 유전자의 발현 변화 확인을 통해 검증하였다.

실시예 2-1. 형태학적 변화의 확인

위 실시예 1-1의 조건과 유사하게 배양된 심근 전구 세포를 현미경상에서 이미지화 하여 세포의 길이를 Image J를 이용하여 정량화하였다. 그 결과를 도 2의 a에 나타내었다. 도 2의 a에서 확인할 수 있는 바와 같이, 세포가 노화될수록 세포의 길이가 길어지는 형태학적인 변화가 나타나는데, 노화된 심근 전구 세포의 세포 길이에 비교하여 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 장기간 배양된 심근 전구 세포에서 노화된 세포의 형태학적인 변화의 감소를 확인하였다.

실시예 2-2. SA b-gal activity 확인

또한, SA b-gal activity는 SA b-gal kit (cell signaling)를 사용하여 검증하였다. 6well plate에 각 농도의 라파마이신이 함유된 배양액에 배양한 심근 전구 세포와 동일한 passage의 심근 전구 세포(노화 비교군)를 well당 100,000개씩 주입하고 5% CO2, 37℃ 환경에서 하루 동안 배양 후 다음날 제공하는 프로토콜에 따라 b-gal 염색을 수행하였으며, 200배 현미경 이미지를 촬영하여 그룹당 10장이상의 이미지의 전체 세포수 대비 b-gal 양성세포를 세어 그래프로 표기하였다.

그 결과를 도 2의 b에 나타내었다. 도 2의 b에서 확인할 수 있는 바와 같이, 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 장기간 배양된 심근 전구 세포에서 동일 passage의 심근전구에 비교하여 노화표현형인 SA-b-gal 양성세포의 유의적인 감소를 확인하였다.

실시예 2-3. 노화표지자 발현 변화의 확인

라파마이신이 함유된 심근 전구 세포와 동일한 passage의 심근 전구 세포, young passage의 심근 전구 세포에서 RIPA buffer를 사용하여 단백질을 분리 및 추출하고 정량 후 동일한양의 단백질을 사용하여 면역블롯실험을 수행하였다. 단백질은 SAS-PAGE 전기영동 후 PVDF 멤브레인으로 옮기고 5% skim milk에서 blocking 과정을 수행 후 p16(abcam, 1:1000), p21(santacruz 1:1000), p53(1:1000 abcam), GAPDH(santacruz, 1:2000) 항체를 사용하여 각 호스트에 맞는 HRP가 conjugate 된 2차 항체를 사용하였으며, TBS-T 용액으로 washing후 단백질 발현양을 LAS3000 (Fujifile)으로 이미지화하였다.

그 결과를 도 2의 c에 나타내었다. 도 2의 c에서 확인할 수 있는 바와 같이, 노화된 심근 전구 세포에 비교하여 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 장기간 배양된 동일 passage의 심근 전구 세포에서 노화표지자 p53, p21, p16의 단백질 발현이 감소되어 있음을 western blot을 통해 확인할 수 있었다.

또한, q-PCR을 통해서도 동일한 결과를 확보하였다. 구체적으로, Trizol reagent(invitrogen)을 사용하여 RNA를 분리 정제하였다. PrimScript 1st strand cDNA syntehsis kit(Taraka biotechonology)를 사용하여 cDNA를 합헝하였으며, SYBR green PCR master mix를 사용하여 프로토콜에 따라 추출한 DNA를 100ng 넣고 PCR 혼합액을 총 20μl로 혼합한 후 PCR을 시행하였다. 사용된 primer의 염기서열은 다음과 같다.

서열번호 1: P16 forward 5′-CCCCGATTGAAAGAACCAGAG A-3′,

서열번호 2: P16 reverse 5′-ACGGTAGTGGGGGAAGGCATAT-3′,

서열번호 3: p21 forward 5′-CCGCCCCCTCCTCTAGCTGT-3,

서열번호 4: P21 reverse 5′-CCCCCATCATATACCCCTAACACA-3′,

서열번호 5: P53 forward 5′-CCGGCGCACAGAGGAAGAGA-3′,

서열번호 6: P53 reverse 5′-TGGGGAGAGGAGCTGGTGTTGT-3′,

그 결과를 도 2의 d에 나타내었다. 도 2의 d에서 확인할 수 있는 바와 같이, 노화된 심근 전구 세포에 비교하여 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 장기간 배양된 동일 passage의 심근 전구 세포에서 노화표지자 p53, p21, p16의 mRNA 발현이 감소되어 있음을 확인하였다.

<실시예 3> 노화관련 SASP 연관 유전체 발현 변화, 분열 한계 및 텔로미어 변화 확인

실시예 3-1. SASP연관 유전체 발현변화 확인

초기 passage(Young)의 심근 전구 세포와 지속적인 계대배양을 통해 구축된 노화된 심근 전구 세포(Sene), 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 장기간 배양된 동일한 passage의 심근 전구 세포(Sene+Rapa)에서 노화관련 분비 표현형 SASP연관 유전체 발현변화를 분석하여, 그 결과를 도 3의 a에 나타내었다. 그 결과, 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 장기간 배양된 심근 전구 세포가 초기 passage와 유사한 노화관련 분비표현형을 보이는 것을 검증하였다.

실시예 3-2. IL-1A 및 IL-6의 발현 변화 확인

초기 passage(Young)의 심근 전구 세포와 지속적인 계대배양을 통해 구축된 노화된 심근 전구 세포(Sene), 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 장기간 배양된 동일한 passage의 심근 전구 세포(Sene+Rapa)에서 노화관련 분비 표현형 SASP관련 transcript IL-1A, IL-6의 transcript level을 real time PCR를 통해 확인하였다. 그 결과, 라파마이신을 처리한 실험 군에서 transcript IL-1A, IL-6의 transcript level이 매우 낮게 나오는 것을 확인하였다.

실시예 3-3. 분열한계 확인

라파마이신을 농도별로 처리하여 계대배양한 심근 전구 세포의 분열한계 (hayflick limit) passage를 확인하였다. 구체적으로, 세포의 계대배양이 더 이상 이루어지지 않는 세포의 passage를 count하여 그래프화 하였다. 라파마이신이 농도별로 함유된 배지에서 배양된 세포와 동일한 농도의 DMSO가 들어간 환경에서 배양한 세포를 지속적으로 계대배양 하고 70-80% 정도 세포가 찼을 때 accutase용액을 이용하여 세포를 탈착하고 단일 세포화하여 세포를 카운트한다. 300,000개의 세포를 100mm² plate에 주입하고 배양한다. 주입한 세포보다 세포 탈착 후 카운트 되는 세포가 적은 passage, 더 이상 doubling하지않는 세포의 passage를 카운트하여 그래프화 하였다.

그 결과를 도 3의 c에 나타내었다. 도 3의 c에서 확인할 수 있는 바와 같이, 라파마이신 처리에 따라 심근 전구 세포의 분열한계가 크게 증가한 것을 확인할 수 있었다.

또한, 초기 passage 심근 전구 세포에 비교한 라파마이신 포함하는 배지 조성물에 장기간 배양된 심근 전구 세포의 상대적인 텔로미어 길이를 real time PCR을 통해 정량한 결과를 도 3의 d에 나타내었으며, 라파마이신 처리에 의해 텔로미어 길이가 유지되는 것을 확인하였다.

<실시예 4> 라파마이신 처리에 따른 세포 증신 연관 유전자 발현 변화 및 증식 증진 확인

실시예 4-1. 세포 증식 변화 확인

초기 passage 심근 전구 세포와, 노화된 심근 전구 세포, 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 장기간 배양된 심근 전구 세포의 세포증식능을 실시간 세포 모니터링을 통해 증식능에 라파마이신이 미치는 영향을 확인하여, 그 결과를 도 4의 a에 나타내었다. 도 4의 a에 나타낸 바와 같이, 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 장기간 배양된 심근 전구 세포는 동일한 passage의 노화된 심근 전구 세포에 비해 증식능이 증가한 결과를 보였다.

실시예 4-2. CENP-A 발현 변화 확인

아래 서열번호 7 및 8을 사용한 것을 제외하고, 실시예 2-3과 유사하게 CENP-A의 발현 변화를 확인하였다.

서열번호 7: CENP-A forward 5′-ACGCCTATCTCCTCACCTT-3′,

서열번호 8: CENP-A reverse 5′- TGGCTGAGCAGGAAAGAC -3

도 4의 b는 심근 전구 세포의 증식과 관련 있는 CENP-A의 mRNA level을 real time PCR로 정량한 결과이며 protein level은 도 4의 c에서 나타내었다. 또한, 라파마이신을 1, 10, 100nM 농도별로 포함하는 배지 조성물에 배양한 심근 전구 세포에서 CENP-A의 mRNA level(도 4d), 단백질 발현정도(도 4e)를 검증하였다. 위 도면들에서 확인할 수 있는 바와 같이, 심근 전구 세포의 증식마커인 CENP-A의 발현이 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에서 배양된 심근 전구 세포에서 유의적으로 증가되어 있음을 확인하였다.

<실시예 5> 라파마이신 처리에 따른 세포 증신 연관 유전자 발현 변화 및 증식 증진 확인

실시예 5-1. 클론 형성능의 확인

단일세포 유래의 클론형성능을 검증하기 위해 1% gelatin이 코팅된 96well에 serial dilution을 통해 well당 단일세포를 seeding하였다. 5% CO₂, 37℃ 환경에서 배양하며, 3일에 한번 50 μl의 각 조건의 배양액을 첨가해주었다. 2주간 배양 후 클론이 형성된 well을 세어 전체 well 대비 형성된 well의 수를 정량화 하여 그래프화하였다.

그 결과를 도 5의 a에 나타내었다. 도 5의 a에서 확인할 수 있는 바와 같이, 초기 passage 심근 전구 세포에 비교하여 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 장기간 배양된 심근 전구 세포의 클론형성능은 유의적인 차이가 없었으며, 노화된 심근 전구 세포에 비교하여 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 장기간 배양된 심근 전구 세포의 단일세포유래 클론형성능이 유의적으로 증진되어 있음을 확인하였다.

실시예 5-2. 줄기세포의 다능성 관련 유전자 발현 변화 확인

또한, 줄기세포의 다능성에 작용하는 전사인자 OCT4, KLF4, NANOG의 유전자 발현을 real time PCR로 정량하여 그 결과를 도 5의 b에 나타내었다. 도 5의 b에서 확인할 수 있는 바와 같이, 라파마아신을 포함하는 배지 조성물에 장기간 배양된 심근 전구 세포에서 줄기세포 다능성에 관여하는 OCT4, KLF4, NANOG의 mRNA level이 유의적으로 증가되어 있음을 확인하였다.

서열번호 9: OCT4 Forward 5' - CAGTGCCCGAAACCCACAC - 3'

서열번호 10: OCT4 Reverse 5' - GGAGACCCAGCAGCCTCAAA -3'

서열번호 11: KLF4 Forward 5' - CAAAGAGTTCCCATCTCAAG - 3’

서열번호 12: KLF4 reverse 5' - AAAAATGCCTCTTCATGTGT - 3'

서열번호 13: NANOG Forward 5' - CAGAAGGCCTCAGCACCTAC - 3’

서열번호 14: NANOG Reverse 5' - ATTGTTCCAGGTCTGGTTGC - 3'

<실시예 6> 라파마이신 처리에 따른 세포 이동능 변화 확인

실시예 6-1. 클론 형성능의 확인

세포이동능을 비교 검증하기위해 12 well에 200,000개의 세포를 seeding하고 well에 세포가 찰 때까지 배양하였다. yellow tip을 사용하여 각 well에 스크레치를 낸 후 PBS washing을 해주었다. 8시간 배양 후 현미경 상에서 세포의 wound sitance를 이미지화하였다. trans well migration assay는 혈청이 포함되지 않은 배지에 세포를 현탁하여 8μm pore insert(corning)에 넣고 아래 well에는 심근 전구 세포 배양배지를 넣어주었다. 24시간 배양 후 배양액을 제거하고 4% paraformaldehyde로 고정 후 20% 메탄올이 함유된 0.005% crystal violet 용액으로 상온에서 30분간 방치하여 이동한 세포를 염색하였다. 이동하지 않은 세포는 면봉으로 닦아 제거하고 1차수로 washing 후 커버글라스 위에 membran을 옮겨 마운팅 후 이동하여 염색된 세포를 현미경으로 이미지를 얻어 카운팅하였다.

그 결과를 도 6의 a에 나타내었다. 그 결과, 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 장기간 배양된 심근 전구 세포의 세포이동능이 노화된 심근 전구 세포에 비교하여 유의적으로 증가되어 있음을 검증하였다.

실시예 6-2. RNA-seq을 통한 myocyte로의 전환에 관여하는 전사인자 분석

RNA-seq을 통한 myocyte로의 전환에 관여하는 전사인자 GATA4, MEF2C, HAND2, TBX5의 발현정도를 분석하여, 그 결과를 도 6의 b에 나타내었다. 분석 결과, 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 장기간 배양된 심근 전구 세포에서 GATA4, MEF2C, HAND2, TBX5의 transcript 발현이 유의적으로 증가되어 있음을 검증하였다.

<실시예 7> 라파마이신 처리에 따른 유전체 발현 변화 분석 확인

라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 장기간 배양된 심근 전구 세포의 유전체 발현변화를 분석하기 위해 RNA seq분석법을 수행하였다. 2μg의 total RNA를 사용하여 사용하였다. RNA seq library는 Terage Bio institue에 의뢰하여 제공되는 라이브러리를 통해 분석하였다. Differentially expressed gene (DEG)분석은 Cuffdiff 방법을 기반으로 하였다. q-value threshold가 0.05미만을 추출하여 분석하였다.

그 결과를 도 7의 a에 나타내었다. 총 23,362개의 유전자를 비교분석한 결과 q-value 0.05이하의 유의차를 가지며 2배 이상 발현차이를 보이는 유전자가 437개 검출되었다. 라파마이신을 통해 발현이 증가된 유전자(빨간색)는 265개, 발현이 감소된 유전자는 172개가 확인되었다.

또한, 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 장기간 배양된 심근 전구 세포를 RNA seq을 통해 gene ontology를 분석하고, Biological process에서 p-value 0.001이하의 유의차를 가지는 유전자들을 category화 하고 축약하여 그 결과를 도 7의 b에 나타내었다. 라파마이신을 처리하여 장기간 배양된 심근 전구 세포와 노화된 심근 전구 세포의 세포주기, MAPK cascade 연관 유전자들의 차이가 유의적으로 확인되었으며 세포이동, 세포 분화와 관련된 유전자들의 유의적인 차이도 검출되었다. 또한 근육세포, 혈관분화 및 발달, 심장근육세포로의 분화와 관련된 유전자들의 유의적인 차이의 검출을 통해 라파마이신을 포함하는 배지 조성물이 심근 전구 세포의 세포노화와 분화와 관련된 유전자의 발현을 조절하는 것을 검증하였다.

또한, 노화된 심근 전구 세포와 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 장기간 배양된 동일 passage의 심근 전구 세포의 유전체발현분석을 수행하여 가장 유의적으로 차이 나는 유전체 KEGG pathway를 확인하여 그 결과를 도 7의 c에 나타내었다. cell cycle 관련된 pathway의 유전체가 유의적으로 가장 차이 나는 pathway로 검증되었다. 이를 통해 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 장기간 배양된 심근 전구 세포는 cell cycle관련 유전자들의 유전자발현조절을 통해 세포증식능을 증가시키는 것을 검증하였다.

<실시예 8> 라파마이신 처리에 따른 STAT3-Pim1 기전 변화 확인

실시예 8-1. STAT3, Pim1, Bcl-2의 발현 변화 확인

STAT3, Pim1, Bcl-2의 발현 변화를 앞서는 실시예와 유사하게 real time PCR 및 western blot을 통해 확인하여, 그 결과를 도 8의 a에 나타내었다. 그 결과, 라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 장기간 배양된 심근 전구 세포의 p-STAT3, Pim1, Bcl-2의 발현이 노화된 심근 전구 세포에 비교하여 증가됨을 검증하였다.

실시예 8-2. STAT3 억제제 처리에 따른 세포 증식능 억제 효과 확인

라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 STAT3 억제제를 농도별로 처리하고 STAT3 신호 억제 후 세포증식능에 미치는 영향을 확인하여, 그 결과를 도 8의 b 및 c에 나타내었다.

도 8의 b에서 확인할 수 있는 바와 같이 STAT3 억제제 처리는 세포 증식능을 억제하였으며, 도 8의 c에서 확인할 수 있는 바와 같이 세포의 형태학적 변화를 가져왔다. 즉, STAT3 억제시 라파마이신으로 완화된 세포성 노화가 다시 유의적으로 증가되는 결과를 나타내었다.

실시예 8-3. Pim1 억제제(SMI-4a) 처리에 따른 세포 증식능 억제 효과 확인

라파마이신을 포함하는 배지 조성물에 Pim1 억제제를 농도별로 처리하고 Pim1 신호 억제 후 세포증식능에 미치는 영향을 확인하여, 그 결과를 도 8의 d 및 e에 나타내었다.

도 8의 d에서 확인할 수 있는 바와 같이 Pim1 억제제 처리는 세포 증식능을 억제하였으며, 도 8의 e에서 확인할 수 있는 바와 같이 세포의 형태학적 변화를 가져왔다. 즉, Pim1 억제시 라파마이신으로 완화된 세포성 노화가 다시 유의적으로 증가되는 결과를 나타내었다.

이를 통해 라파마이신으로 인한 세포성 노화 억제에 STAT3-Pim1이 관여함을 검증하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Pusan National University Industry-University Cooperation Foundation <120> Medium Composition for attenuation senescence in cardiac progenitor cells containing rapamycin <130> Pusan1.370P-1 <150> KR 2018/0032630 <151> 2018-03-21 <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P16 forward primer <400> 1 ccccgattga aagaaccaga ga 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P16 reverse primer <400> 2 acggtagtgg gggaaggcat at 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p21 forward primer <400> 3 ccgccccctc ctctagctgt 20 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p21 reverse primer <400> 4 cccccatcat atacccctaa caca 24 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P53 forward primer <400> 5 ccggcgcaca gaggaagaga 20 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P53 reverse primer <400> 6 tggggagagg agctggtgtt gt 22 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CENP-A forward primer <400> 7 acgcctatct cctcacctt 19 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CENP-A reverse primer <400> 8 tggctgagca ggaaagac 18 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OCT4 forward primer <400> 9 cagtgcccga aacccacac 19 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OCT4 reverse primer <400> 10 ggagacccag cagcctcaaa 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KLF4 forward primer <400> 11 caaagagttc ccatctcaag 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KLF4 reverse primer <400> 12 aaaaatgcct cttcatgtgt 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NANOG forward primer <400> 13 cagaaggcct cagcacctac 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NANOG reverse primer <400> 14 attgttccag gtctggttgc 20

Claims

라파마이신을 포함하는 심근 전구 세포 노화억제용 배지 조성물.
제1항에 있어서, 심근 전구 세포는 혈관내피세포, 평활근세포 및 심근 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상으로 분화될 수 있는 것인 노화억제용 배지 조성물.
제1항에 있어서, 노화억제는 노화표지자의 발현 감소, 단일세포클론 형성능 증진, 줄기세포능 증진, 세포 증식능 증진, 세포이동능 증진, 생착능 증진, 혈관신생 촉진능 증진 및 혈관형성능 증진으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 특징을 가지는 것인 노화억제용 배지 조성물.
제1항에 있어서, 노화억제는 STAT3, Pim1 또는 이들 모두의 유전자 수준을 상승시키는 것인 노화억제용 배지 조성물.
제1항에 있어서, 배지는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, Ham’s F12, αMEM(α Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium) 및 Iscove's Modified Dulbecco's Medium 로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 노화억제용 배지 조성물.
제1항에 있어서, 배지는 Ham’s F12인 노화억제용 배지 조성물.
제1항에 있어서, 배지는 무혈청 배지인 노화억제용 배지 조성물.
제1항에 있어서, 라파마이신을 조성물 내 0.01 nM 내지 1000 nM 농도로 포함하는 것인 노화억제용 배지 조성물.
라파마이신을 심근 전구 세포에 처리하는 단계를 포함하는 심근 전구 세포의 노화 억제 방법.
제9항에 있어서, 심근 전구 세포는 생체로부터 분리된 심근 전구 세포인 심근 전구 세포의 노화 억제 방법.
제9항에 있어서, 라파마이신을 심근 전구 세포에 처리하는 단계는 체외(ex vivo) 또는 시험관 내 (in vitro)에서 수행되는 것인 심근 전구 세포의 노화 억제 방법.
제9항에 있어서, 라파마이신을 0.01 nM 내지 1000 nM 농도로 심근 전구세포에 처리하는 단계를 포함하는 것인 심근 전구 세포의 노화 억제 방법.
제9항 내지 제12항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 심근 전구 세포.
라파마이신을 유효성분으로 포함하는 심근 전구 세포 치료 보조제.