JP2020534793A - 幹細胞の治療特性を改善するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は米国仮特許出願第62/534,905号(2017年7月20日出願、発明の名称:幹細胞の治療特性を改善するための方法)の利益を主張する。尚、当該仮特許出願の全体が参照によって本明細書中に組み込まれる。
a)複数の標的幹細胞を含むサンプルを提供する工程、
b)標的幹細胞に、放射線照射期間中に放射線源から放射される第1の線量の放射線を照射して、標的幹細胞を、その後の治療的処置プロセスにおける使用のために好適である放射線照射されているプレコンディショニングされた幹細胞に転換する工程。
本開示はまた、LDRにさらされた幹細胞を含む細胞集団(例えば、細胞培養物)を提供する。1つの実施形態において、細胞集団は、本明細書中に記載される方法によって得られるプレコンディショニングされた幹細胞を含む。本明細書中で使用される場合、用語「細胞」は、ただ1個だけの細胞及び複数の細胞の両方を示す。「複数の細胞」には、細胞集団が含まれる場合がある。
本明細書中に記載される教示の別の幅広い局面に一致して、有効成分として、本明細書中に記載される方法を使用して作製されるプレコンディショニングされた幹細胞を、好適な医薬的に許容され得る担体と一緒に含む医薬組成物が作製される場合がある。
プレコンディショニングされた幹細胞の集団を本明細書中に記載される方法に従って得ることができる。プレコンディショニングされた幹細胞の適用及び使用には、増殖期間中における幹細胞特性の保持、特定の系譜への幹細胞の分化(例えば、筋線維への筋幹細胞の分化)、及び組織再生が含まれる場合があるが、これらに限定されない。分化した系譜物をインビトロ目的又はインビボ目的の両方のために使用することができる。
低線量のX線及びγ放射線は、細胞レベル及び生物レベルでの様々な刺激効果(これらはまとめて、放射線ホルミシス又は放射線恒常性と呼ばれる)を生じさせることが示されている[Calabrese、2015;Calabrese、2016;Baldwin及びGrantham、2015;Jolly及びMeyer、2009]。以前の結果では、低線量の放射線(LDR)、具体的には低線量のγ放射線が腫瘍形成の開始をインビボで遅らせ得ること[Mitchel他、2003;Mitchel、1999]、そして、DNA傷害の加齢に関連した蓄積をインビボで抑制し得ること[Osipov他、2013]が明らかにされた。幹細胞に対するLDRの影響についてはほとんど知られていない。幹細胞に対するLDRの影響を調べた数少ない研究の結果には一貫性がない。本発明者らは、マウス筋幹細胞及びヒト筋幹細胞の治療特性が、LDRを使用して筋幹細胞をプレコンディショニングすることによって高められ得ることを発見している。
C2C12マウス筋幹細胞
この細胞(これは筋芽細胞とも呼ばれており、元々は成体C3Hマウスの後肢筋肉に由来するものである)をATCCから購入した。C2C12筋芽細胞はC2筋芽細胞の効率的融合サブクローンであり、組織培養における筋分化及び筋幹細胞生物学のためのモデルとして広範囲に使用されている。成長のために、細胞を、細胞密度が80%超の細胞密集度を達成することがないようにしながら、10%のウシ胎児血清、4mMのL−グルタミン及び1.5g/Lの重炭酸ナトリウムを添加したダルベッコ改変培地(4.5g/Lのグルコース)で維持した。
筋生検由来の幹細胞をバイオテクノロジー企業のLonzaから購入した。指数関数的に成長する培養を達成するために、細胞を、細胞密度が80%超の細胞密集度を達成することがないようにしながら、20%のFBS(ウシ胎児血清)、4mMのL−グルタミン、ゲンタマイシン、ヒトEGF(上皮増殖因子)、デキサメタゾン及び1.5g/Lの重炭酸ナトリウムを添加した骨格筋基礎培地で維持した。
筋組織再生は、生物の寿命の全体にわたって続く連続プロセスであり、増殖モード(筋芽細胞)と、分化及び自己再生と、スタンバイモード又は予備モードとの間における多数回の連続した変化を伴う(図1)。これをインビトロでモデル化するために、C2C12筋芽細胞(増殖モード)を、分化し、自己再生し、その後、自己再生したスタンバイ細胞(これは予備細胞とも呼ばれる)を放出し、増殖モードに戻るように刺激することができる[Yaffe及びSaxel、1997]。多数回のこれらの変化により、筋幹細胞の尽きてくる筋原性潜在能のインビトロモデルが表される(図1)。この低下は、インビトロの増殖条件のもとでのサテライト細胞において生じる変化によく似ている場合がある。予備細胞はサテライト細胞の多くの古典的な特徴を示す(例えば、非対称的な幹細胞分裂、特定化のマーカー(例えば、Pax7など)のより大きい発現、及び分化のための潜在能など)。多数回の分化−増殖を受ける筋幹細胞の機能的特性がその回数とともに低下するであろう。予備細胞を、示差的な酵素消化を行うことによって、分化した筋線維の培養から得た。
成長培地において80%〜90%の細胞密集度にまで成長させた培養物をリン酸塩緩衝生理食塩水により2回洗浄し、分化培地(DM:2%ウマ血清及び抗生物質を含むDMEM)においてインキュベーションした。DMを、終点に達するまで毎日取り替えた。DM培地におけるインキュベーションにより、分化のプロセス(その不可欠な部分が多核筋線維への筋芽細胞の融合である)が誘発される。分化の72時間までに、およそ50%〜70%の筋芽細胞が筋線維に融合する。
成長培地において80%〜90%の細胞密集度にまで成長させた培養物をリン酸塩緩衝生理食塩水により2回洗浄し、分化培地(DM:2%ウマ血清及び抗生物質を含む1:1のDMEM−F12)においてインキュベーションした。
本例において、若齢のC2C12筋芽細胞に、10mGy又は100mGyの放射線照射あるいは擬似の放射線照射を、60Co線源を備えるGamma−Cell 200装置を使用して行った。放射線照射後、細胞を、「長期培養」のサブセクションで記載されるように、最大で90日間にわたって培養で維持した(図2)。30日、60日及び90日の時点で、細胞を増殖及び分化の評価項目についてアッセイした。
様々な期間にわたって分化を受けているガラス製カバースリップ上の培養物を4%パラホルムアルデヒドにおいて固定し、PBS/5%BSA溶液で希釈される一次抗MyH3抗体(ミオシン重鎖)により4℃で一晩、免疫標識した。洗浄後、細胞を、Alexa Fluor 488とコンジュゲート化される二次抗体(Invitrogen−A11001)とインキュベーションした。可視化に先立って、カバースリップをDAPI(Vector Laboratories Inc.H−1500)とともに封入剤で固定した。画像を40倍の倍率で、Zeiss Epifluorescence Observer Z1顕微鏡を使用して取得した。
lf=N融合/N総数×100%、
式中、
N融合は、ミオシン陽性細胞(筋線維)内の核の数であり、
N総数は、スコア化された核の総数である。
全細胞溶解物を、分化したC2C12筋線維から下記のように調製した。細胞ペレットを1ペレット体積の改変緩衝液C(20mM Hepes(pH7.6)、1.5mM MgCl2、650mM KCl、ベンゾナーゼ(2.5単位/107細胞)、0.2mM PMSF、0.5mM DTT、5mM β−グリセロールリン酸、及び1mMオルトバナジン酸ナトリウム)に再懸濁し、4℃で30分間にわたって遠心分離した。その後、ホモジネートを1ペレット体積の緩衝液E(20mM Hepes(pH7.6)、1.5mM MgCl2、0.2mM EDTA、1mM PMSF、0.5mM DTT、5mM β−グリセロールリン酸、及び1mMオルトバナジン酸ナトリウム)により希釈した。その後、抽出されたタンパク質を、15,000×gでの遠心分離を4℃で30分間行うことによって細胞から回収した。抽出物をSDS−PAGEに先立ってタンパク質濃度について定量化した。それぞれの定量化された抽出物をグラジエントポリアクリルアミドゲルにおいて負荷し、分離し、ウエスタンブロット分析のためのPVDFメンブレンに転写した。抗体を、Santa Cruz Biotechnologiesから購入した(MyoD、SC304;ミオゲニン、SC12732;Myh3、SC53091;及びチューブリン、SC23948)。
細胞培養物をトリプシン処理し、ペレットを遠心分離によって得た。RNAを、Qiazol(Qiagen)を使用して培養細胞から単離した。付着している培養物を冷PBSにより1回洗浄し、残留PBSを除き、細胞をQiazol内に掻き取った(4X106個の細胞については1mL、2X106個については0.5mL)。溶解物を激しくボルテックス処理して、ゲノムDNAをせん断し、その後、さらに処理するまで−70℃で貯蔵した。RNAを製造者の説明書(Invitrogen)に従って精製した。簡単に記載すると、サンプルを室温で5分間解凍し、1mLのQiazolあたり200μLのクロロホルムを加え、30秒間にわたって激しくボルテックス処理し、相を12000rpmでの遠心分離によって分離させた。水相中のRNAを慎重に取り出し、mi RNeasyミニキット(Qiagenカタログ#217004)を使用して処理した。最後に、RNAをヌクレアーゼ非含有水(エッペンドルフ)に溶解/溶出し、Nanodrop分光光度計及びExperionを使用して品質及び量について調べた。2.5μgの総RNAを使用して、cDNAを作製した(RT first strand Kit、Qiagenカタログ#330404)。cDNAをH2Oに1:5で希釈し、Sybrグリーンマスターミックス(2x SYBR Biotool)及び2.5ピコモルのプライマーと混合した。分析を、7900HT Sequence Detection Systemsサイクラー(BioRad)及びCFXマネージャーソフトウェアを使用して三連で行った。定量的RT−PCRで使用されるプライマーをPrimer3ソフトウェアによって設計し、BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)分析によって確認した。この研究で使用されるプライマー配列が下記のように列挙される。ミオゲニンフォワード、GGC TCA AGA AAG TGA ATG AGG C;ミオゲニンリバース、CGA TGG ACG TAA GGG AGT GC;Myh3フォワード、GCATAGCTGCACCTTTCCTC;Myh3リバース、GGC CAT GTC CTC AAT CTT GT;TKSフォワード、CTT TGT GGG GAA GAT GCT CG;TKS5リバース、TCC TTC TGG CCA CCT TCA AT;TMEM8Cフォワード、GCT CCT ATG CAA AGA CTG GC;TMEM8Cリバース、GGT CGA TCT CTG GGG TTC AT。
60日齢のマウス筋肉(C2C12)細胞培養物をトリプシン処理し、ペレットを遠心分離によって得た。RNAを本明細書中に記載されるように製造者の説明書(Invitrogen)に従って単離し、精製した。精製されたRNAを後に品質管理のために供した。5μgのRNAをライブラリー調製において使用し、75塩基対の片側配列決定を、Next Seq 500ゲノムシーケンサーのための標準的なイルミナ手順に従って行った。RNAseqデータを、Bowtie,Tophat2 Cuffdiff(CuffLinks v1)ソフトウェアスイートを使用して分析した。配列決定読取りを、GENCODE vm12遺伝子発現モデルによって導かれるHISAT2(v2.0.4)によるGRC m38マウスゲノムアセンブリーに対してマッピングした。異なる発現を示した遺伝子の特定及び定量を、Cuffdiffと、ベン図として示されるデータセットとを使用して行った。LDR(10mGy及び100mGy)処理群における示差的発現遺伝子の機能的関連性を、生物学的プロセス(BP)を特に考慮するGene Ontology(GO)経路分析ソフトウェアを使用して解釈した。
RNAseqを除くすべての実験を組織培養開始及びLDR曝露の段階から3回繰り返し、その結果、生物学的反復物が表されるようにした。3つの反復物からの平均値を計算した。群を比較している際の統計学的有意性を、スチューデントt検定によりP<0.05で求めた。
LDRは、筋線維に分化するC2C12細胞の潜在能を改善する
長期培養実験の期間中の様々な時点での、筋線維を形成するC2C12筋芽細胞の潜在能、及びこの潜在能がLDRによってどのように影響され得るかを評価した。筋線維を形成する能力は筋幹細胞の重要な機能的特徴を表している。この能力は、筋芽細胞を数日間にわたって分化誘導成長条件のもとで維持し、その後、新たに形成された筋線維の一部となった筋芽細胞の割合を定量化することによって実験的に確実に測定することができる。この測定が免疫蛍光顕微鏡法によって行われ、この場合、筋線維がMyH3により染色され、線維内の核が核の総数に対して定量化される(図3)。筋線維の一部である核の得られた割合が融合指数と呼ばれる。
マウス筋肉の筋芽細胞に加えて、実験をヒト筋肉生検由来の幹細胞に対して行った。この筋幹細胞が、放射線照射された培養物を形成するように放射線照射されたならば、放射線照射された培養物の融合指数(すなわち、処理時融合指数)が、未処理/放射線非照射の筋幹細胞を含むコントロール培養物の融合指数(すなわち、コントロール融合指数)よりも大きいことが認められた。例えば、図7A及び図7Bを参照した場合、図7Aに例示されるように、筋幹細胞への10mGy又は100mGyの放射線照射が実験開始時に行われ、細胞を培養で14日間にわたって加齢させ、その後、3日間にわたって分化させたならば、放射線照射された培養物は、(例えば、図7Bに示されるように)未処理(放射線非照射)のコントロール幹細胞と比較して約2.5倍増大した融合指数を示した。例示された例において、処理時融合指数は加齢時融合指数よりも大きく、10mGy及び100mGyの放射線線量の両方についての初期融合指数(コントロール)の約70%を超えていた。
LDR曝露筋芽細胞の進んだ培養齢の培養物における高まった筋線維形成が古典的な筋分化経路に起因するかどうかを調べるために、最終分化のいくつかの古典的マーカーを総タンパク質抽出物においてウエスタンブロット分析によって定量化した。これらは、ミオゲニン、Myh3(ミオシン重鎖)及びMyoDであった。ミオゲニン及びMyH3は、コントロール群では長期培養したときには同程度の減少を示し、これに対して、これらのタンパク質レベルにおける顕著な増大が放射線照射細胞において見出された(図4Aにおいて、10mGy群及び100mGy群についての60日及び90日を培養齢一致コントロールと比較のこと)。
C2C12筋芽細胞の能力の保持が通常、培養における時間/細胞齢とともに、また、分化サイクルの回数とともに低下する。しかしながら、本明細書中に記載される方法を利用すると、C2C12筋芽細胞の能力の保持が、培養物をLDRにさらすことによって高められている。ヒト筋幹細胞の分化の認められた2.5倍の改善は、幹細胞のプレコンディショニングにおける低線量放射線の有益な効果の少なくとも一部を強調している(図7)。注目すべきことに、ヒト筋幹細胞の限定された倍加能力が、記載された培養を不死C2C12マウス筋肉細胞における延長された90日よりはむしろ、14日〜17日に制限するための基礎であった。
本明細書中に記載される教示の別の幅広い局面に一致して、間葉系幹細胞及び内皮幹細胞に対するLDRの影響を、本明細書中に記載される方法に従って詳しく調べた。
細胞培養
本例において、臍帯血(UCB)由来の間葉系の間質細胞/幹細胞及び始原体細胞(MSPC)を、American Type Culture Collection(ATCC、Manassas、VA、米国)から得て、製造者の説明書に従ってUCB間葉系幹細胞(MSC)増殖培地(#PCS−500−030及びPCS−500−040、ATCC)において増やした。内皮コロニー形成細胞(ECFC)を、承認された倫理プロトコル(Veritas Independent Research Board)に従って新鮮な臍帯血単位物(Canadian Blood Services、Ottawa、ON、カナダ)から得た。臍帯血を、Ficoll Paque Plus密度分離勾配(GE Healthcare Bio−Sciences AB、Uppsala、スウェーデン)を使用して処理して、単核細胞(MNC)を得た。MNCをCellBind被覆の6ウエルプレート(#3335、Corning、NY、米国)に置床し、ECFC増殖培地(#CC−3162、Lonza Group Ltd.、Basel、スイス)を添加した。培地を2日毎〜3日毎に交換した。すべての細胞を標準的な加湿CO2インキュベーターにおいて37℃で接着させ、増やした。
加齢を、培養細胞の増殖能力(機能)における漸進的低下としてこの場合には定義した。細胞培養物が「加齢した」と見なされる継代がMSPC及びECFCクローンについては異なり、MSPCについてはp15であると定め、ECFCクローン3−2についてはp5であると定め、ECFCクローン13についてはp8であると定め、ECFCクローン3−3についてはp11であると定めた。細胞培養物についての成長曲線を、Incucyte機器(Essen Bioscience,Inc.、Ann Arbor、Michigan、米国)によって行われるパーセント細胞密集度測定に基づいて作成した。Incucyteを使用して、細胞の画像を継代毎において細胞培養の1時間毎に4倍及び10倍の対物レンズにより撮影した。細胞増殖を、通常の場合には20%〜80%の細胞密集度の間で細胞成長曲線の直線部分における倍加時間として測定した。次式を倍加時間の計算のために使用した:
(t2−t1)/(3.32×(log n2−log n1))、式中
t2−最終時点
t1−初期時点
n1−t1での細胞数/細胞密集度
n2−t2での細胞数/細胞密集度
すべての値を未処理(UT)の初期継代(p4又はp5)細胞に対してプロットした。処理された加齢群を、同じ継代での未処理の加齢コントロールと比較し、有意性を、p<0.5が有意な変化を表すペアード片側スチューデントt検定を使用して求めた。
低線量放射線照射細胞の遅れた加齢
培養における幹細胞の加齢に対するLDRの影響を調べるために、未処理細胞及び放射線照射細胞の培養物の画像を継代毎について1時間毎に取得し、細胞単層のパーセント細胞密集度を測定した。これらの値を使用して、成長曲線を作製し、細胞の倍加時間を材料及び方法において記載されるように求めた。図8Aは、MSCPがp4からp15にまで加齢する際のMSCPの倍加時間における変化を示し、増殖における比較的有意な低下がp14〜p15で認められる。同様の観察がECFCについてなされた。図9Aには、ECFCクローン13の加齢プロセスが表される。興味深いことに、MSPC及びECFCが初期の継代において放射線照射され、培養で加齢させられるとき、加齢プロセスが遅れる。図8B及び図9Bは、放射線照射群対未処理コントロールについての低下した倍加時間によって測定されるような、MSPC及びECFCSについての加齢における遅れをそれぞれ明らかにする。
間葉系幹細胞/間質細胞の決定的特徴の1つが、この細胞は骨格系譜の細胞(例えば、軟骨細胞など)に分化することができることである。MSPCの機能的能力における変化に対するLDRの影響を調べるために、p4において前もって放射線照射された5回継代細胞及び15回継代細胞を軟骨形成系譜に沿って分化させた。14日間の分化の後、軟骨細胞ペレットを切片化し、アグリカンについて染色し、染色量を定量化した。染色量を図10Aに示す。p15細胞の分化能力をp5の若齢MSPCの分化と比較して表した。未処理の若齢コントロールに対して、未処理の加齢細胞では、軟骨形成分化におけるおよそ1/2の低下が認められた。しかしながら、LDR処理したとき、加齢細胞はその分化潜在能を維持し、改善さえした(例えば、10mGyの条件)。加齢UT群及び加齢の10mGy群についての軟骨細胞ペレット切片の代表的な画像を図10Bに示す。
ECFCの機能的能力に対するLDRの影響を評価するために、細胞遊走アッセイを行った。内皮幹細胞の最も重要な機能的属性の1つが、この細胞は組織損傷の部位に移動/遊走し、血管ネットワークを修復することができることである。ECFCの遊走能力を調べるために、引っ掻き創傷アッセイを、未処理の加齢ECFC及び放射線照射の加齢ECFCを用いて行った。すべての値を、若齢(すなわち、非加齢の)未処理(すなわち、放射線非照射)コントロールと比較して表した。2つの別個の測定を材料及び方法の節で記載されるように行った。図11Aは、引っ掻きが行われた10時間後における創傷部の相対的パーセント細胞密集度を示し、図11Bは、細胞が創傷部内において60%の細胞密集度に達するために要した相対的時間を要約する。加齢細胞は、若齢細胞と比較した場合、低下した遊走を明らかにすることが、両方のグラフから明白である。例えば、加齢細胞は、細胞密集度に到達することにおいて若齢細胞の約70%の効率であり、創傷部を閉じるために約1.8倍長い時間を要している。しかしながら、加齢の放射線照射細胞は、若齢細胞と同様なパフォーマンスを示さないが、その遊走能力の大部分を依然として維持している。したがって、図11は、未処理のコントロールと比較した場合、その遊走能力における有意な増大によって明白であるように、培養で増やされたときの放射線照射ECFCの遅れた加齢能力を明らかにしている。
Claims (72)
- 幹細胞をプレコンディショニングする方法であって、
a)複数の標的幹細胞を含むサンプルを提供すること、
b)標的幹細胞に、放射線照射期間中に放射線源から放射される第1の線量の放射線を照射して、標的幹細胞を、その後の治療的処置プロセスにおける使用のために好適である放射線照射されているプレコンディショニングされた幹細胞に転換すること
を含む上記方法。 - 標的幹細胞に放射線照射することにより、それぞれの標的幹細胞の少なくとも第1の細胞機能の加齢に伴う低下が軽減される、請求項1に記載の方法。
- 第1の細胞機能が初期パフォーマンス値を有し、閾値加齢時間における加齢時パフォーマンス値を定義し、プレコンディショニングされた幹細胞が、加齢時パフォーマンス値と初期パフォーマンス値との間である閾値加齢時間での処理時パフォーマンス値を有する、請求項2に記載の方法。
- 処理時パフォーマンス値が加齢時パフォーマンス値よりも初期パフォーマンス値に近い、請求項2に記載の方法。
- 標的幹細胞はそれぞれが、第2の初期パフォーマンス値を有し、かつ、第2の閾値加齢時間における第2の加齢時パフォーマンス値を定義する第2の細胞機能を含み、プレコンディショニングされた幹細胞が、第2の加齢時パフォーマンス値と第2の初期パフォーマンス値との間である第2の閾値加齢時間における第2の処理時パフォーマンス値を有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 第2の閾値加齢時間が第1の閾値加齢時間と異なる、請求項5に記載の方法。
- 第2の処理時パフォーマンス値が第2の加齢時パフォーマンス値よりも第2の初期パフォーマンス値に近い、請求項5又は6に記載の方法。
- 閾値加齢時間及び第2の閾値加齢時間のうちの少なくとも一方が閾値回数の細胞継代の完了によって決定される、請求項3〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞継代の閾値回数が4を超える、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞継代の閾値回数が4〜23の間である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 閾値加齢時間及び第2の閾値加齢時間のうちの少なくとも一方が細胞培養における経過時間によって決定される、請求項3〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 標的幹細胞が筋幹細胞を含み、第1の細胞機能が細胞融合であり、初期パフォーマンス値が初期融合指数を含み、加齢時パフォーマンス値が加齢時融合指数を含み、及び処理時パフォーマンス値が処理時融合指数を含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 処理時融合指数が加齢時融合指数よりも大きい、請求項12に記載の方法。
- 処理時融合指数が加齢時融合指数の少なくとも2倍である、請求項12又は13に記載の方法。
- 処理時融合指数が50%を超える、請求項12〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 処理時融合指数が60%を超える、請求項12〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 処理時融合指数が70%を超える、請求項12〜16のいずれか一項に記載の方法。
- プレコンディショニングされた幹細胞が、放射線照射されない標的幹細胞と比較して、筋線維への増大した分化を示す、請求項12〜17のいずれか一項に記載の方法。
- プレコンディショニングされた幹細胞が、放射線照射されない標的幹細胞と比較して、ミオゲニン、MyH3、MyoD、TKS5及びTMEM8cからなる群から選択される少なくとも1つのマーカーの発現が高くなっている、請求項12〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 標的幹細胞が間葉系幹細胞を含み、第1の細胞機能が増殖であり、初期パフォーマンス値が初期倍加時間を含み、加齢時パフォーマンス値が加齢時倍加時間を含み、及び処理時パフォーマンス値が処理時倍加時間を含む、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 処理時倍加時間が加齢時倍加時間よりも少ない、請求項20に記載の方法。
- 処理時倍加時間が加齢時倍加時間の50%未満である、請求項20〜21のいずれか一項に記載の方法。
- 処理時倍加時間が初期倍加時間の3倍未満である、請求項20〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞継代の閾値回数が12〜15の間である、請求項20〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞継代の閾値回数が14又は15である、請求項20〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞継代の閾値回数が15である、請求項20〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 軟骨形成分化である第2の細胞機能、初期分化能力を含む第2の初期パフォーマンス値、第2の閾値加齢時間における加齢時分化能力を含む第2の加齢時パフォーマンス値、及び第2の閾値加齢時間における処理時分化能力を含む第2の処理時パフォーマンス値をさらに含む、請求項20〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 標的幹細胞が間葉系幹細胞を含み、第1の細胞機能が軟骨形成分化であり、初期パフォーマンス値が初期分化能力を含み、加齢時パフォーマンス値が加齢時分化能力を含み、及び処理時パフォーマンス値が処理時分化能力を含む、請求項1〜27のいずれか一項に記載の方法。
- 処理時分化能力が加齢時分化能力よりも大きい、請求項28に記載の方法。
- 処理時分化能力が初期分化能力よりも大きい、請求項28〜29のいずれか一項記載の方法。
- 処理時分化能力が初期分化能力の少なくとも60%である、請求項28〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 処理時分化能力が加齢時分化能力の少なくとも150%である、請求項28〜31のいずれか一項に記載の方法。
- 処理時分化能力と初期分化能力との差が、加齢時分化能力と初期分化能力との差よりも小さい、請求項28〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 標的幹細胞が内皮幹細胞を含み、第1の細胞機能が増殖であり、初期パフォーマンス値が初期倍加時間を含み、加齢時パフォーマンス値が加齢時倍加時間を含み、処理時パフォーマンス値が処理時倍加時間を含む、請求項1〜33のいずれか一項に記載の方法。
- 処理時倍加時間が加齢時倍加時間よりも少ない、請求項34に記載の方法。
- 処理時倍加時間が加齢時倍加時間よりも少ない、請求項34又は35に記載の方法。
- 閾値加齢時間が、5〜8の間である細胞継代の閾値回数によって規定される、請求項34〜36のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞継代の閾値回数が7又は8である、請求項37に記載の方法。
- 細胞継代の閾値回数が少なくとも5である、請求項37〜38のいずれか一項に記載の方法。
- 遊走である第2の細胞機能、所定の細胞密集度を達成するための初期時間を含む第2の初期パフォーマンス値、所定の細胞密集度を第2の閾値時間において達成するための加齢時時間を含む第2の加齢時パフォーマンス値、及び所定の細胞密集度を第2の閾値時間において達成するための処理時時間を含む第2の処理時パフォーマンス値をさらに含む、請求項34〜39のいずれか一項に記載の方法。
- 所定の細胞密集度が少なくとも60%である、請求項40に記載の方法。
- 所定の細胞密集度を達成するための処理時時間が、所定の細胞密集度を達成するための加齢時時間よりも少ない、請求項41又は42に記載の方法。
- 所定の細胞密集度を達成するための処理時時間が、所定の細胞密集度を達成するための初期時間の約1.4倍〜1.8倍の間である、請求項40〜42のいずれか一項に記載の方法。
- 標的幹細胞が内皮幹細胞を含み、細胞機能が遊走を含み、初期パフォーマンス値が、所定の細胞密集度を達成するための初期時間を含み、加齢時パフォーマンス値が、所定の細胞密集度を達成するための加齢時時間を含み、及び処理時パフォーマンス値が、所定の細胞密集度を達成するための処理時時間を含む、請求項1〜43のいずれか一項に記載の方法。
- 所定の細胞密集度が少なくとも60%である、請求項44に記載の方法。
- 所定の細胞密集度を達成するための処理時時間が、所定の細胞密集度を達成するための加齢時時間よりも少ない、請求項44又は45に記載の方法。
- 所定の細胞密集度を達成するための処理時時間が、所定の細胞密集度を達成するための初期時間の約1.4倍〜1.8倍の間である、請求項44〜46のいずれか一項に記載の方法。
- 標的幹細胞がヒト幹細胞である、請求項1〜47のいずれか一項に記載の方法。
- 標的幹細胞がマウス幹細胞である、請求項1〜47のいずれか一項に記載の方法。
- 放射線が電離放射線を含む、請求項1〜49のいずれか一項に記載の方法。
- 放射線が低線エネルギー付与(LET)電離放射線を含む、請求項1〜50のいずれか一項に記載の方法。
- 放射線がγ放射線及びX線放射線の少なくとも1つを含む、請求項1〜51のいずれか一項記載の方法。
- 放射線がγ放射線を含む、請求項1〜52のいずれか一項に記載の方法。
- 放射線の第1の線量が約1mGy〜約500mGyの間の放射線を含む、請求項1〜53のいずれか一項に記載の方法。
- 放射線の第1の線量が約2mGy〜約200mGyの間の放射線を含む、請求項1〜54のいずれか一項に記載の方法。
- 放射線の第1の線量が約10mGy〜約150mGyの間の放射線を含む、請求項1〜55のいずれか一項に記載の方法。
- 放射線の第1の線量が約10mGy〜約100mGyの間の放射線を含む、請求項1〜56のいずれか一項に記載の方法。
- 放射線の第1の線量が約10mGyである、請求項1〜57のいずれか一項に記載の方法。
- 放射線の第1の線量が約50mGyである、請求項1〜58のいずれか一項に記載の方法。
- 放射線の第1の線量が約100mGyである、請求項1〜59のいずれか一項に記載の方法。
- 標的幹細胞がインビトロの間に放射線照射される、請求項1〜60のいずれか一項に記載の方法。
- 標的幹細胞がエクスビボの間に放射線照射される、請求項1〜61のいずれか一項に記載の方法。
- プレコンディショニングされた幹細胞をその後の治療プロセスにおいて使用することをさらに含む、請求項1〜62のいずれか一項に記載の方法。
- プレコンディショニングされた幹細胞をその必要性のある対象に投与することをさらに含む、請求項63に記載の方法。
- 対象がヒトである、請求項63に記載の方法。
- 対象が筋疾患を有する、請求項63〜65のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜66のいずれか一項に記載の方法を使用することによって得られる、プレコンディショニングされた幹細胞の集団。
- プレコンディショニングされた幹細胞が筋幹細胞を含み、LDRにさらされたことがない標的幹細胞と比較したとき、閾値加齢時間において筋線維への増大した分化を示す、請求項67に記載の集団。
- プレコンディショニングされた筋幹細胞は、LDRにさらされたことがない筋幹細胞と比較して、ミオゲニン、MyH3、MyoD、TKS5及びTMEM8cからなる群から選択される少なくとも1つのマーカーの発現が高くなっている、請求項68に記載の集団。
- 請求項1〜66のいずれか一項に記載の方法を使用することによって得られるプレコンディショニングされた幹細胞と、担体とを含む医薬組成物。
- 請求項1〜66のいずれか一項に記載の方法を使用することによって得られるプレコンディショニングされた幹細胞をその必要性のある対象に投与することを含む、筋疾患を処置する方法。
- 筋疾患の処置をその必要性のある対象において行うための、請求項1〜66のいずれか一項に記載の方法に従って作製されるプレコンディショニングされた幹細胞の使用。
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