KR20230042365A - 인간 만능 줄기 세포 유래 심장 간질 세포의 대량 생산 - Google Patents

인간 만능 줄기 세포 유래 심장 간질 세포의 대량 생산 Download PDF

Info

Publication number
KR20230042365A
KR20230042365A KR1020237006980A KR20237006980A KR20230042365A KR 20230042365 A KR20230042365 A KR 20230042365A KR 1020237006980 A KR1020237006980 A KR 1020237006980A KR 20237006980 A KR20237006980 A KR 20237006980A KR 20230042365 A KR20230042365 A KR 20230042365A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
cardiac
serum
glutamine
basal medium
Prior art date
Application number
KR1020237006980A
Other languages
English (en)
Inventor
울프람-후베르투스 짐머만
말티 티버시
Original Assignee
게오르그-아우구스트-우니베시태트 괴팅겐 스티프퉁 외펜틀리헨 레흐츠, 우니베시태츠메디진
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 게오르그-아우구스트-우니베시태트 괴팅겐 스티프퉁 외펜틀리헨 레흐츠, 우니베시태츠메디진 filed Critical 게오르그-아우구스트-우니베시태트 괴팅겐 스티프퉁 외펜틀리헨 레흐츠, 우니베시태츠메디진
Publication of KR20230042365A publication Critical patent/KR20230042365A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0657—Cardiomyocytes; Heart cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0697—Artificial constructs associating cells of different lineages, e.g. tissue equivalents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/99—Serum-free medium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/16—Activin; Inhibin; Mullerian inhibiting substance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/165—Vascular endothelial growth factor [VEGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/33—Insulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/385—Hormones with nuclear receptors of the family of the retinoic acid recptor, e.g. RAR, RXR; Peroxisome proliferator-activated receptor [PPAR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/02—Drug screening
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/52—Fibronectin; Laminin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

본 출원은 만능 줄기 세포로부터 심장 간질 세포의 집단을 생산하는 방법을 기술한다. 구체적으로, 상기 방법은 (i) 만능 줄기 세포 유래 심외막 세포의 상피-간엽 전이를 유도하고 (ii) 무혈청 조건에서 심장 간질 세포의 수를 증폭시키는 것에 관한 것이다. 이들 심장 간질 세포는 기술된 방법에 따라 대량 생산될 수 있고 상기 세포는 심장 간질 세포의 적어도 80%에서 CD90, CD73 및 CD44의 발현을 유지한다. 또한, 본 출원은 만능 줄기 세포 유래의 심장 간질 세포 집단에 관한 것이며, 여기서 심장 간질 세포의 적어도 80%는 CD90, CD73 및 CD44를 발현한다. 상기 심장 간질은 조작된 기관 조직의 생산 및 예를 들어 심장 복구의 지원과 같은 여러 시험관내 및 생체내 적용을 위한 기초를 형성한다. 또한, 심장 간질 세포의 증폭을 위한 무혈청 배양 배지가 제공된다.

Description

인간 만능 줄기 세포 유래 심장 간질 세포의 대량 생산
심장은 심근 세포와 비-근세포로 구성되어 있다. 심장의 비-근세포 분획은 주로 간질 세포(stromal cell), 내피 세포(endothelial cell) 및 백혈구(leukocyte)로 이루어져 있다(Naito et al. 2006, Pinto et al. 2016, Zhou and Pu 2016). 상주 중간엽 세포로도 알려진 심장 간질 세포(Pinto et al. 2016)는 대부분 섬유아세포 또는 섬유아세포 유사 세포를 포함한다. 심장 섬유아세포의 발달 기원은 여전히 논쟁의 여지가 있지만, 주로 심외막에서 유래하는 것으로 보인다(Ivey and Tallquist 2016). 심외막은 심장의 최외층이다. 이것은 전심외막 기관으로부터 배아 심장의 루핑 단계 동안 발생한다(Witty et al. (2014)). 구체적으로, 전심외막은 심장을 둘러싸서 외부 상피층인 심외막을 형성한다. 그런 다음 심외막은 TGFβ1, Wnt, 레티노산(RA), FGF 및 PDGF를 비롯한 다양한 신호에 반응하여 상피에서 중간엽으로의 전이(EMT)를 거쳐 심근층을 침범하고 발달중인 심장의 구조적 및 혈관 집단에 기여하는 심장 혈관 평활근 세포 및 심장 섬유아세포로 된다. 이들 세포는 심장 간질 세포(또는 심외막 유래 세포)로도 알려져 있으며 심근층 내 비심근 세포 집단의 상당 부분을 구성한다(Witty et al(2014)). 심외막 유래 섬유아세포와 심근 세포 사이의 주변 분비 누화는 적절한 심장 발달에 필수적인 것으로 밝혀졌다(Ieda et al. 2009). 마우스 모델에서의 이러한 시험관내 관찰과 일치하는 것으로, 본 발명자들은 이전에 주로 인간 만능 줄기 세포(PSC) 유래 심근 세포로부터 조작된 인간 심근(EHM)의 형성에서 일차 인간 섬유아세포의 필수적인 역할을 입증하였다(Tiburcy et al. 2017).
PSC가 심장 근육 세포로 분화하는 동안 심장 간질 세포는 통제되지 않는 부산물이다. 본 발명자들은 이전에 심장 근육 조작 시 균질한 간질 세포 집단(예: 섬유아세포)의 추가(Naito et al. 2006, Tiburcy et al. al. 2017)에 의해, 또는 유도된 분화(WO2015/040142)에 의한 비-근세포 간질 세포 비율의 제어가 조작된 심장 근육의 기능을 증가시키는 것을 입증하였다, 거의 순수한(>90%) 세포 출발 물질을 제공하기 위해 심근 세포 및 간질 세포의 생산을 개별적으로 제어하는 것은 치료 산물(예: 조직 공학 산물 첨단 치료 의약품[TEP-ATMP]) 및 강력한 연구(예: 의약품 개발에 필요한) 응용을 위해 PSC(예: 유도된 PSC, iPSC)로부터 심장 근육을 공학적으로 처리하는 데 가장 중요하다. 심장 근육 공학적 처리에서의 사용을 넘어, 항섬유화 치료제 개발(Santos et al. 2019)에서의 적용을 위해 섬유증을 모델링하고 결합 조직을 생산(Dworatzek et al. 2019, Schlick et al. 2019, Zimmermann et al. 2006)하기 위한 고품질(즉, 순도 및 기능) 및 다량의 간질 세포 집단에 대한 필요성이 시급하다.
따라서, 인간 심근과 같은 조작된 조직을 생성할 수 있도록 고도의 균질성을 갖는 다량의 심장 간질 세포를 생산하는 방법이 당업계에 필요하다. 본 발명은 확장 가능한 GMP 호환 프로세스에서 충분한 수의 인간 iPSC 유래 심외막 세포로부터 적합한 심장 간질 세포 집단을 유도하는 방법에 관한 것이다. 서로 다른 기관의 간질 세포는 매우 상이할 수 있으므로, 일차 심장 섬유아세포와 유사한 특성을 가진 심장 간질 세포를 추구하였다. 생체내에서 심장이 발달하는 동안, 대부분의 심장 섬유아세포는 심외막에서 유래하므로 본 발명자들은 심외막 세포의 상피-중간엽 전이를 유도하여 심장 간질 세포를 생성하였다. 이전 연구에서는 심외막 세포가 단계별 분화 프로토콜을 사용하여 인간 만능 줄기 세포로부터 분화될 수 있음을 보여주었다(Witty et al. 2014, Iyer et al. 2015, Bao et al. 2016, 및 Bao et al. 2017, Zhang et al. 2019). 그러나, 이들 개시된 프로토콜 중 어느 것도 조직 공학에서와 같은 임상 규모를 포함한 대규모 적용에 사용될 수 있는 균질한 심장 간질 세포 집단의 확장 가능한 생산에 적합하지 않다. 또한, [Giacomelli et al. 2020]은 심장 외막 세포로의 iPSC의 분화에 이어 혈청 함유 배지에서 매트리겔 코팅된 플레이트에 세포를 시딩하여 심장 섬유아세포로의 분화를 개시한다. 따라서, [Giacomelli et al. (2020)]은 또한 무혈청 방법에 의존하지 않으며 매트리겔과 같은 미한정(undefined) 물질을 피하지 않는다. 예를 들어, [Tran et al. (2012)]에 의한 대안 프로토콜은 순도가 20%에 불과하고 지방세포, 조골세포 및 연골세포로 분화하는 경향이 있는 중간엽 줄기 세포의 유도를 개시하고; 만능 중간엽 줄기 세포는 분화된 심장 간질 세포와 구별된다.
또한, US 2018/0094245 A1에는 고수율 심장 섬유아세포를 생성하는 방법이 개시되어 있다. 그러나, 여기에 개시된 심장 섬유아세포와 본원에 기재된 심장 간질 세포 사이에는 분명한 차이가 있다. 가장 중요하게는, US 2018/0094245 A1의 심장 섬유아세포는 계대로 발현의 추가적인 손실(도 3C 참조)과 함께 이미 하루 후에CD90(또한 Thymocyte Differentiation Antigen 1(Thy1)으로 알려짐)의 현저한 감소(분화 유도; 도 2C 참조)를 나타낸다. 그러나, CD90은 심장에서 상주하는 섬유아세포를 분류하기 위해 일반적으로 사용되는 세포 표면 마커이며 이의 손실은 병리학적 표현형과 관련이 있는 것으로 보고되었다(Li et al. 2020).
본 발명들이 아는 한, 선행 기술은 혈청 및 매트리겔과 같은 기타 미한정 물질을 피하는, 만능 줄기 세포로부터 CD90 및 비멘틴(VIM)을 안정하게 발현하는 심장 간질 세포의 생산을 위한 한정된 방법이 부족하다.
발명의 요약
선행 기술에 개시된 프로토콜의 단점을 극복하기 위해, 본 발명자들은 심외막 세포로부터 무혈청 조건 하에 (1) 다량 및 (2) 고품질, 즉 (만능 줄기 세포 유래) 동질성(적어도 80% 90, CD73 및 CD44)으로 심장 간질 세포 집단의 생성 및 증폭을 가능하게 하는 한정된 무혈청 프로토콜을 개발하였다. 만능 줄기 세포는 인간의 유전적 정체성이 생식계열에서 변경되거나 인간 배아가 산업적 또는 상업적 목적으로 사용되는 과정에 의해 생산되지 않는다.
본원에 개시된 바와 같은 심장 간질 세포의 집단은 심장 간질 세포가 대량 생산될 수 있도록 여러 계대에 걸쳐 확장될 수 있다. 무혈청 환경에서의 증폭은 임상 및 연구(예: 약물 개발) 용도를 위해 조작된 인간 심근(EHM; Tiburcy et al. 2017) 및 조작된 결합 조직(ECT; Dworatzek et al. 2019, Santos et al. 2019, Schlick et al. 2019)과 같은 대규모 조작된 기관 조직 생산에 필수적이며 가장 중요하다. 또한 GMP(Good Manufacturing Practise)에 따라 임상 용도로 조작된 기관 조직을 대규모로 생산하고, 산업 규모의 약물 개발에서 간질 세포 또는 조작된 기관 조직의 적용을 위해 유사하고 재현 가능한 품질과 양의 세포를 생산할 수 있는 방법을 갖추는 것이 가장 중요하다. 적어도 6회 계대에 걸쳐 심장 간질 세포 수를 증폭/확장하는 능력은 실험 데이터(실시예 2 및 4; 도 2 및 3D)에 의해 뒷받침된다. 고품질(심장 간질 세포의 높은 균질성)은 유세포 분석 데이터, 유전자 발현 데이터, 면역형광 데이터 및 전사체 데이터에 의해서도 뒷받침된다(실시예 3-5, 도 3, 4 및 5 참조). 본원에서 생산되는 대량 생산된 심장 간질 세포는 일차 심장 섬유아세포와 매우 유사한 RNA 발현 프로파일을 나타내지만 본질적으로 피부 및 치은 섬유아세포와는 다르다. 또한, 생산된 심장 간질 세포는 조작된 심장 근육에서 힘 생성을 지원하고(실시예 6; 도 6A) 심장 조직과 비숫한 점탄성 특성을 갖는 조작된 결합 조직을 생성하는 데 사용될 수 있다(실시예 6; 도 6B). 본원에서 생산된 심장 간질 세포는 일반적으로 고품질 간질 세포일 뿐만 아니라 섬유아세포 특성을 가진 심장 특이적 간질 세포임이 입증되었다.
제1 측면에서, 만능 줄기 세포로부터 심장 간질 세포의 집단을 생산하는 방법이 기술되며, 여기서 방법은 하기 단계를 포함한다:
i. 만능 줄기 세포의 분화에 의해 수득된 윌름스 종양 항원(WT-1)을 발현하는 심외막 세포의 상피-중간엽 전이를 유도하는 단계 - 여기서 상피-중간엽 전이를 유도함으로써 심외막 세포가 심장 간질 세포로 분화되고, 여기서 상피-중간엽 전이를 유도하는 것은 a1) 상기 심외막 세포를 무혈청 기본 배지에서 제1 세포외 기질 단백질의 존재하에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계; 이어서 a2) 단계 (i) a1)의 세포를 무혈청 기본 배지에서 제2 세포외 기질 단백질의 존재하에 적합한 조건 하에 배양하는 단계를 포함하고; 여기에서 수득된 심장 간질 세포 집단의 세포 중 적어도 약 80%는 CD90, CD73 및 CD44를 발현함 -; 및
ii. 상기 단계 (i)의 심장 간질 세포 집단을 무혈청 기본 배지에서 적어도 하나의 제3 세포외 기질 단백질의 존재하에 배양함으로써 상기 심장 간질 세포의 수를 증폭시키는 단계 - 상기 심장 간질 세포 집단의 세포 중 적어도 약 80%는 청구범위에 정의된 바와 같이 CD90, CD73 및 CD44의 발현을 유지함 -.
또한, 심장 간질 세포의 단리된 집단이 기술되며, 여기서 심장 간질 세포는 만능 줄기 세포의 분화에 의해 얻어지고 심장 간질 세포 집단의 세포 중 적어도 약 80%는 청구범위에 정의된 바와 같이 CD90, CD73 및 CD44를 발현한다.
또한, 본원에 정의된 바와 같은 심장 간질 세포 집단을 포함하는 조작된 기관 조직은 청구범위에 정의된 바와 같이 한정된다.
또한, 약물 스크리닝을 위한 시험관내 모델, 바람직하게는 약물 효능 스크리닝 또는 약물 독성 스크리닝을 위한 시험관내 모델에서 본원에 정의된 바와 같거나 본원에 개시된 방법에 의해 수득된 바와 같은 심장 간질 세포 집단의 용도, 또는 본원에 정의된 바와 같은 조작된 기관 조직의 용도가 기재된다.
다른 측면에서, 조작된 기관 조직, 바람직하게는 인간의 조작된 기관 조직의 시험관내 생산에서 본원에 정의된 바와 같거나 본원에 정의된 바와 같은 방법에 의해 수득된 심장 간질 세포 집단의 용도가 기술되며, 보다 바람직하게는 조작된 인간 기관 조직은 조작된 인간 심근 또는 조작된 인간 결합 조직이다.
또한, 기관 복구, 바람직하게는 심장 복구 또는 연조직 복구에 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같거나 본원에 정의된 바와 같은 방법에 의해 수득된 심장 간질 세포(cStC) 집단이 개시된다.
마지막으로, 무혈청 세포 배양 배지가 한정되며, 여기서 배지는 (a) 무혈청 기본 배지, (b) 10-200 ng/ml FGF2, (c) 5-100 ng/ml VEGF, (d) 0.2-20 mM 글루타민, 및 (e) 6.6-165 μg/ml 아스코르브산, 2-50 μg/ml 인슐린, 1.1-27.5 μg/ml 트랜스페린, 1660-41500 μg/ml 알부민 및 11-145 nM 셀레늄을 포함하는 진핵 세포 배양 배지 보충제를 포함하는 심장 간질 세포의 증폭에 적합하다.
발명의 상세한 설명
제1 측면에서, 만능 줄기 세포로부터 심장 간질 세포의 집단을 생산하는 방법이 기술되며, 여기서 방법은 하기 단계를 포함한다:
i. 만능 줄기 세포의 분화에 의해 수득된 윌름스 종양 항원(WT-1)을 발현하는 심외막 세포의 상피-중간엽 전이를 유도하는 단계 - 여기서 상피-중간엽 전이를 유도함으로써 심외막 세포가 심장 간질 세포로 분화되고, 여기서 상피-중간엽 전이를 유도하는 것은 a1) 상기 심외막 세포를 무혈청 기본 배지에서 제1 세포외 기질 단백질의 존재하에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계; 이어서 a2) 단계 (i) a1)의 세포를 무혈청 기본 배지에서 제2 세포외 기질 단백질의 존재하에 적합한 조건 하에 배양하는 단계를 포함하고; 여기에서 수득된 심장 간질 세포 집단의 세포 중 적어도 약 80%는 CD90, CD73 및 CD44를 발현함 -; 및
ii. 상기 단계 (i)의 심장 간질 세포 집단을 무혈청 기본 배지에서 적어도 하나의 제3 세포외 기질 단백질의 존재하에 배양함으로써 상기 심장 간질 세포의 수를 증폭시키는 단계 - 상기 심장 간질 세포 집단의 세포 중 적어도 약 80%는 청구범위에 정의된 바와 같이 CD90, CD73 및 CD44의 발현을 유지함 -.
일반적으로 세포의 "집단"은 아래에 정의된 바와 같이 전체적으로 동일한 특성을 나타내는 세포 그룹을 의미한다. 이러한 특성은 유세포 분석법 또는 형광 현미경 검사법과 같은 당업계에 공지된 분석법에 의해 검출될 수 있다. 본원에서 사용되는 "심장 간질 세포"는 콜라겐 생성 중배엽 세포이다. 특히, 심장 간질 세포는 유세포 측정법에 의해 검출될 수 있다. "유세포 분석법"의 방법론은 당업자에게 공지되어 있다. 유세포 분석에서는 세포 집단의 물리적 및/또는 화학적 특성이 검출된다. 본 경우에, 분화 특이적 마커 또는 특히 심장 간질 세포 특이적 마커의 존재는 상기 발현된 마커를 형광 표지화함으로써 유세포 측정법에 의해 검출될 수 있다. 심장 간질 세포에 대한 예시적인 마커는 CD90, CD44 및 CD73이다. 따라서, 이들 마커의 발현은 본원에서 생산된 바와 같은 심장 간질 세포의 존재를 나타낸다. 본원에서 생산된 심장 간질 세포는 섬유아세포 특성을 갖는다. 이는 본원에서 생산된 심장 간질 세포가 상처 치유 과정/흉터 형성의 맥락에서 또는 예를 들어 TGFb1 및 안지오테닌 II에 의해 유도된 근섬유아세포로의 전환뿐만 아니라 콜라겐 분비가 가능할 수 있음을 의미한다(예를 들어 도 5C 참조). 본원에 정의된 바와 같은 심장 간질 세포의 집단은 심장 간질 세포의 그룹을 지칭하며, 여기서 세포의 적어도 약 80%는 CD90, CD73 및 CD44를 발현한다.
당업자는 유세포 측정법에 의해 CD90, CD73 및/또는 CD44와 같은 마커의 발현을 용이하게 평가할 수 있다. 예를 들어, CD90, CD73 및/또는 CD44와 같은 마커를 발현하는 세포 집단은 세포를 적어도 음성 대조군과 비교함으로써 예시적인 마커를 발현하지 않는 세포와 구별될 수 있다. 예를 들어, 이소형 대조군이 음성 대조군으로 제공될 수 있다. 이소형 대조군은 표적에 대한 특이성이 결여된 일차 항체이지만 적용에 사용된 일차 항체의 클래스 및 유형과 일치한다. 이소형 대조군의 도움으로 마커를 발현하는 세포와 마커를 발현하지 않는 세포를 구별할 수 있다. 음성 대조군의 일례는 다클론 토끼 IgG 항체일 수 있다. 유세포 분석을 위한 바람직한 방법은 실시예 3에 예시되어 있다.
Thy-1로도 알려진 CD90(분화 클러스터(Cluster of Differentiation) 90)은 글리코포스파티딜이노시톨(GPI) 고정 세포 표면 단백질이다. 또한, CD90은 심장에 상주하는 섬유아세포를 분류하기 위해 일반적으로 사용되는 세포 표면 마커이다(Li et al. 2020). Li et al.은 또한 CD90이 결여된 세포는 심장 섬유증에서 병원성 심장 섬유아세포 분획의 일부이며 심부전의 병태생리학에서 CD90 발현의 중요한 역할을 제안한다는 것을 보여주었다. 일 실시양태에서, 유세포 분석법으로 측정되어 심장 간질 세포 집단의 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 81%, 보다 바람직하게는 적어도 82%, 보다 더 바람직하게는 적어도 83%, 보다 더 바람직하게는 적어도 83%, 보다 더 바람직하게는 적어도 84%, 보다 더 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 86%, 보다 더 바람직하게는 적어도 87%, 보다 더 바람직하게는 적어도 88%, 보다 더 바람직하게는 적어도 89%, 및 가장 바람직하게는 적어도 90%가 CD90을 발현한다. 수득된 심장 간질 세포에서 CD90의 발현에 대한 예시적인 데이터가 도 3A, 3C 및 3D에 제공된다.
5'-뉴클레오티다제(5'-NT) 또는 엑토-5'-뉴클레오티다제(분화 클러스터 73)로도 알려진 CD73은 인간에서 NT5E 유전자에 의해 인코딩되는 효소이다. CD73은 섬유아세포 집단에서 매우 풍부한 것으로 밝혀졌다(Tiburcy et al. 2017). CD73의 발현은 심장 간질 세포의 형성에 대한 지표일 수 있다. 일 실시양태에서, 유세포 분석법으로 측정되어 단계 (ii)에 의해 수득된 심장 간질 세포 집단의 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 81%, 보다 바람직하게는 적어도 82%, 보다 더 바람직하게는 적어도 83%, 보다 더 바람직하게는 적어도 84%, 보다 더 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 86%, 보다 더 바람직하게는 적어도 87%, 보다 더 바람직하게는 적어도 88%, 보다 더 바람직하게는 적어도 89%, 및 가장 바람직하게는 적어도 90%가 CD73을 발현한다. 수득된 심장 간질 세포에서 CD73의 발현에 대한 예시적인 데이터는 도 3A, 3C 및 3D에 제공된다.
CD44는 다수의 세포외 기질 단백질, 특히 풍부한 기질 글리코사미노글리칸 히알루로난에 대한 세포 표면 수용체 역할을 하는 세포 표면, 막관통 당단백질이다. CD44를 통한 히알루로난은 섬유아세포를 활성화하고 섬유아세포 기능을 조절한다. CD44는 섬유아세포 집단에서 풍부한 것으로 밝혀진 중간엽 세포 마커이다(Tiburcy et al. 2017). CD44의 발현은 심장 간질 세포의 형성에 대한 지표일 수 있다. 일 실시양태에서, 유세포 분석법으로 측정되어 단계 (ii)에 의해 수득된 심장 간질 세포 집단의 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 81%, 보다 바람직하게는 적어도 82%, 보다 더 바람직하게는 적어도 83%, 보다 더 바람직하게는 적어도 84%, 보다 더 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 86%, 보다 더 바람직하게는 적어도 87%, 보다 더 바람직하게는 적어도 88%, 보다 더 바람직하게는 적어도 89%, 및 가장 바람직하게는 적어도 90%가 CD44를 발현한다. 수득된 심장 간질 세포에서 CD44의 발현에 대한 예시적인 데이터가 도 3A, 3C 및 3D에 제공된다.
만능 줄기 세포의 심장 간질 세포로의 세포 분화를 달성하기 위해, 특정 화학적 인자, 첨가제 및/또는 억제제가 배양 배지에 첨가된다. 특히, 만능 줄기 세포의 심외막 세포로의 분화는 당업계에 잘 알려져 있다. 바람직하게는, 심외막 세포는 [Schlick (2018) doctoral Thesis, November 2018, University of Goettingen, Witty et al Nat. Biotechnology 32, 1026-1035 (2014)]에 기술된 바와 같이, 또는 심외막 세포를 얻기 위한 기타 적절한 방법으로 수득할 수 있다. 당업계에 기술된 다른 프로토콜은 [Iyer et al. 2015], [Bao et al. 2016], 및 [Bao et al. 2017], [Zhang et al. 2019]에서 확인할 수 있다. 보다 바람직하게는, 당업자는 본원의 실시예 1에 기술된 바와 같이 만능 줄기 세포로부터 심외막 세포를 얻을 수 있다. 분자 수준에서, 발달하는 심외막은 WT-1과 같은 전사 인자의 발현에 의해 심근 및 심내막과 구별될 수 있다. 당업자는 심외막 세포에서 WT-1을 검출하는 방법을 알고 있다. 심외막 세포에서 WT-1을 검출하는 바람직한 방법은 형광 현미경이다. WT-1의 발현은 현미경으로 검출할 수 있는 형광 신호를 유도하며 당업자는 형광 현미경을 알고 있다. 예를 들어, 도 1C는 실험 데이터를 제공하고 심외막 세포의 WT-1 발현을 나타내며, 이는 당업계의 임의의 적합한 방법 또는 바람직하게는 본원에 개시된 방법에 의해 수득될 수 있다. 다른 가능한 구별 인자는 TBX18 및 알데히드 데하이드로게나제 효소 레틴알데히드 데하이드로게나제 2(ALDH1A2)의 발현이다.
WT-1의 발현은 또한 RT-PCR에 의해서도 평가될 수 있다. 당업자는 예를 들어 심외막 분화 유도 후 qRT-PCR을 사용하여 WT-1을 검출하는 [Witty et al. (2014)]에 의해 예시된 바와 같이, qRT-PCR을 사용하여 신뢰성있게 WT-1을 검출하는 방법을 알고 있다. 일 실시양태에서, 단계 (ii) 후의 세포는 예를 들어 TBP(TATA-결합 단백질)보다 적어도 2배 윌름스 종양 항원 1(WT-1) RNA를 발현한다. TBP는 하우스키핑 유전자로 간주되며 분화 과정에서 다른 발현을 보일 것으로 예상되지 않는다. 하우스키핑 유전자는 전형적으로 기본적인 세포 기능의 유지에 필요한 구성 유전자이며, 정상 및 병태생리학적 조건 하에 유기체의 모든 세포에서 발현된다. 따라서, 다른 하우스키핑 유전자도 WT-1의 비교 발현에 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 심외막 세포는 qRT-PCR에 의해 결정되어, TBP와 같은 하우스키핑 유전자보다 적어도 3배 이상, 보다 바람직하게는 4배, 보다 더 바람직하게는 적어도 5배, 가장 바람직하게는 적어도 6배; 및 최대 15배 윌름스 종양 항원 1(WT-1) RNA를 발현한다.
"만능 줄기 세포"(PSC)는 신체의 모든 세포 유형으로 분화할 수 있다. 따라서, 만능 줄기 세포는 예를 들어 심장 간질 세포를 얻을 수 있는 현저한 가능성을 제공한다. 현재 가장 보편적으로 사용되는 만능 세포는 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 또는 배아 줄기 세포(ESC)이다. 인간 ESC 계통은 Thomson et al. (1998)에 의해 처음 생산되었다. 오늘날, 인간 ESC 연구는 체세포를 ES 유사 세포로 재프로그래밍하는 새로운 기술 개발을 가능하게 하였다. 이 기술은 Yamanaka et al.에 의해 2006년에 개척되었고, 인간 세포에도 적용 가능하다(Takahashi & Yamanaka (2006) 및 Takahashi et al. (2007)). 생성된 유도 만능 세포(iPSC)는 ESC와 매우 유사한 거동을 보이며 신체의 모든 세포로 분화할 수 있다. 또한, 처녀생식 줄기 세포가 추가 실시양태에서 사용될 수 있다. 처녀생식 줄기 세포는 포유동물, 바람직하게는 마우스 및 인간에서 미수정 난세포의 시험관내 활성화 후 발생하는 배반포로부터 얻을 수 있다. 이들 세포는 만능 줄기 세포의 주요 특성을 나타내어 시험관내에서 모든 세포 유형으로 분화할 수 있다(Didi
Figure pct00001
et al(2013)). 따라서, 만능 줄기 세포는 유도 만능 줄기 세포, 배아 줄기 세포 및 처녀생식 줄기 세포에서 선택될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 만능 줄기 세포는 인간의 유전적 정체성이 생식계열에서 변형되거나 인간 배아가 산업적 또는 상업적 목적으로 사용되는 과정에 의해 생산되지 않는다. 일 실시양태에서, 만능 줄기 세포는 영장류 기원의 만능 줄기 세포, 바람직하게는 인간 만능 줄기 세포이다. 바람직한 실시양태에서, 만능 줄기 세포는 유도 만능 줄기 세포 및 처녀생식 줄기 세포로부터 선택되며, 바람직하게 만능 줄기 세포는 유도 만능 줄기 세포(iPSC)이다. 특히 바람직한 실시양태에서 유도 만능 줄기 세포(iPSC)가 선택된다.
발생 동안, 심외막 세포는 상피에서 중간엽으로의 전이(EMT)를 겪는다. 본원에 개시된 방법에서, 심외막 세포를 심장 간질 세포로 분화시키기 위해 심외막 세포의 EMT가 유도된다. 상기 분화 단계는 얻어진 세포의 적어도 약 80%가 CD90, CD73 및 CD44를 발현하도록 하는 심장 간질 세포를 얻기에 적합한 조건 하에서 일어나며, 이는 유세포 측정법에 의해 결정될 수 있다. 본 개시내용의 관점에서, 당업자는 심외막 세포의 EMT를 유도하기에 적합한 조건을 용이하게 결정할 수 있다. 본원에 개시된 방법의 단계 (i) 완료 후 CD90, CD73 및 CD44를 발현하는 심장 간질 세포에 대한 예시적인 실험 데이터는 도 3A에서 확인할 수 있다.
구체적으로, EMT는 제1 및 제2 세포외 기질 단백질의 존재하에 적합한 조건 하에서 유도된다. "세포외 기질 단백질"이라는 용어는 평균적인 기술을 가진 사람에게 알려진 모든 세포외 기질(ECM) 단백질을 지칭한다(Hynes AND Naba (2012)). 특히, 세포외 기질 단백질은 종종 아미노산 서열 RGD를 포함한다. 바람직하게는, 제1 및/또는 제2 세포외 기질 단백질은 라미닌, 비트로넥틴, 콜라겐, 특히 젤라틴, 피브로넥틴, 엘라스틴을 포함한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 콜라겐은 젤라틴 형태로 존재한다. 젤라틴은 콜라겐으로부터 가수분해 및 변성을 거친 후 유래된다. 보다 바람직한 것은 제1 세포외 기질 단백질이 라미닌을 포함하는 것이고 보다 더 바람직한 것은 제1 세포외 기질 단백질이 라미닌인 것이다.
라미닌은 일반적으로 알파 사슬, 베타 사슬 및 감마 사슬의 조합이다. 바람직한 실시양태에서, 알파-사슬, 베타-사슬 및 감마-사슬이 독립적으로 선택될 수 있다. 예를 들어, 알파 사슬은 알파-1, 알파-2, 알파-3, 알파-4, 알파-5에서 선택될 수 있고; 베타 사슬은 베타-1, 베타-2 및 베타-3에서 선택될 수 있으며; 감마 사슬은 감마-1, 감마-2 및 감마-3에서 선택될 수 있다. 라미닌의 알파-5 사슬, 베타-2 사슬 및 감마-1 사슬의 조합이 특히 바람직하다. 상기 라미닌은 라미닌-521로도 알려져 있다. 당업자는 라미닌이 재조합적으로 생성될 수 있고 상업적으로 이용가능하다는 것을 알고 있다. 예를 들어, Biolamina는 당업계에 잘 알려진 공급업체이다. 또 다른 실시양태에서, 라미닌은 사용될 때 둘베코(Dulbecco)의 인산염 완충 염수(DPBS)에 용해된다. 실시예 섹션에서 입증된 바와 같이, 상업적으로 입수가능한 라미닌-521이 보다 더 바람직하다.
또 다른 실시양태에서, 제2 세포외 기질 단백질(ECM)은 제1 세포외 기질 단백질과 동일하거나 상이하다. 바람직하게는, 제2 세포외 기질 단백질은 제1 세포외 기질 단백질과 상이하다. 제2 세포외 기질 단백질이 비트로넥틴, 라미닌, 콜라겐, 특히 젤라틴, 피브로넥틴 또는 엘라스틴을 포함하는 것이 또한 바람직하다. 제2 ECM이 비트로넥틴을 포함하는 것이 특히 바람직하다.
단계 (i)가 "무혈청 기본 배지"의 존재하에 일어나는 것이 추가로 고려된다. 세포 배양을 위한 기본 배지는 일반적으로 필수 영양소(예: 아미노산, 탄수화물, 비타민, 미네랄) 및 가스(예: CO2, O2)를 공급하고 물리 화학적 환경(예: pH 버퍼)을 조절한다. 임의의 적합한 기본 배지가 본원에 기재된 방법에 사용될 수 있다. 기본 배지는 상업적으로 이용 가능하거나 ATCC 카탈로그로부터 공개적으로 이용 가능한 레시피에 따라 생산될 수 있다. 적절하다고 판단되는 경우, 기본 배지는 예를 들어 아미노산으로 보충될 수 있다. "무혈청 기본 배지"는 태아 소 혈청과 같은 혈청을 보충제로 포함하지 않는다. 이는 예를 들어 혈청 배치에 따라 성분이 달라지지 않는다는 점에서 무혈청 기본 배지가 정의된다는 장점이 있다. 무혈청 기본 배지의 추가 바람직한 실시양태는 하기에 기술된다.
단계 (i)의 완료 후, 세포 집단의 적어도 80%가 CD90, CD73 및 CD44를 발현하도록 심장 간질 세포를 얻는다. 다음 증폭 단계 (ii)에서, 심장 간질 세포의 수는 한정된 조건 하에 증폭된다. 그렇게 함으로써 심장 간질 세포는 CD90, CD73 및 CD44의 발현을 유지하며 이는 유세포 분석으로 결정될 수 있다. 일 실시양태에서, 단계 (ii)는 유세포 측정법을 사용하여 CD90, CD73 및 CD44의 적어도 80%의 유지된 발현에 의해 결정된 바와 같이 집단 심장 간질 세포를 안정적으로 증폭시킨다. 심장 간질 세포의 수를 증폭시키는 것은 적어도 하나의 제3 세포외 기질 단백질의 존재하에 일어난다. 제2 세포외 기질 단백질과 유사하게, "적어도 하나의 제3 세포외 기질 단백질"은 바람직하게는 비트로넥틴, 라미닌, 콜라겐, 특히 젤라틴, 피브로넥틴, 엘라스틴, 매트리겔, 아미노산 서열 RGD를 함유하는 펩티드, 아미노산 서열 RGD를 포함하는 단백질 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는 적어도 하나의 제3 세포외 기질 단백질은 비트로넥틴, 라미닌, 콜라겐, 특히 젤라틴, 피브로넥틴 및 엘라스틴으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 제3 세포외 기질 단백질은 비트로넥틴이다.
방법의 단계 (ii)는 또한 본원에 정의된 바와 같이 무혈청 기본 배지의 존재하에 일어난다. 무혈청 기본 배지는 단계 (i) a1), (i) a2), 및 (ii)에서 독립적으로 선택될 수 있는 것이 추가로 고려되고 이들 각각의 단계에 대한 무혈청 기본 배지의 바람직한 실시양태는 아래에 기재된다.
일 실시양태에서, 단계 (i) a1), 단계 (i) a2)에서의 세포 배양 및/또는 단계 (ii)에서의 상기 심장 간질 세포 집단의 배양은 현탁 배양으로 수행된다. 현탁 배양에서, 단일 세포 또는 세포의 작은 집합체는 교반된 액체 배지에 현탁된 동안 분화 또는 증식한다. 당업자는 일반적으로 다양한 세포 유형에 대한 세포 현탁 배양을 알고 있다. 예를 들어, [Chen et al. (2012)]는 스피너 플라스크에서 인간 배아 줄기 세포를 배양하기 위한 확장 가능한 현탁 배양 시스템을 설명하였다. 상기 현탁 배양 시스템은 임상 및 연구 적용을 위해 한정되고 무혈청 조건 하에서 hESC의 스케일업 확장을 위한 접근법을 제공한다. 3년 후, [Chen et al. (2015)]은 확장 가능한 현탁 배양 시스템을 사용하여 인간 만능 줄기 세포로부터 심근 세포를 생성하는 방법을 설명하였다. 따라서, 당업자는 심장 외막 세포의 심장 간질 세포로의 분화가 현탁 배양에서도 일어날 수 있다고 예상할 수 있을 것이다. 바람직한 실시양태에서, 단계 (i) a1)의 제1 세포외 기질 단백질은 가용성 형태로 현탁 배양물에 제공된다. 다른 바람직한 실시양태에서, 제2 세포외 기질 단백질은 가용성 형태로 단계 (i) a2)의 현탁 배양물에 제공된다. 보다 더 바람직한 것은 제1 및 제2 세포외 기질 단백질이 가용성 형태로 단계 (i) a1) 및 (i) a2)에서 제공된다는 것이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 단계 (ii)에서 적어도 하나의 제3 세포외 기질 단백질은 가용성 형태로 현탁 배양물에 제공된다.
다른 실시양태에서, 제1, 제2 및 적어도 하나의 제3 세포외 기질 단백질은 기질 상에 고정된 형태로 또는 가용성 형태로 현탁 배양물에 제공된다. 세포외 기질 단백질이 기질 상에 고정된 형태로 제공되는 것이 보다 더 바람직하다. 본원에서 사용되는 "기질"은 세포가 분화 또는 증폭될 수 있는 표면이다. 또한, 당업자는 세포의 분화 또는 증폭을 지원하기 위한 적합한 기질을 알고 있다. ECM 단백질이 고정된 형태로 제공되는 경우, 기질은 상기 ECM 단백질로 커버링될 수 있다. 상기 커버링/코팅에 적합한 농도는 당업계에 공지되어 있고 아래에 추가로 기재되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 세포는 ECM 코팅 플레이트에서 배양되지만, 세포는 또한 응집 배양물로서 비드 상에서 및/또는 생물반응기에서 배양될 수 있다. 예를 들어 [Frank et al. (2019)]는 인간 중간엽 줄기 세포 배양을 위한 중공사 생물반응기를 제공한다. 따라서, 본원에 개시된 바와 같은 방법은 또한 생물반응기에서 수행될 수 있음이 고려된다. 본원에 개시된 바와 같은 방법을 위한 바람직한 기질은 플레이트 또는 비드이다. 가장 바람직한 기질은 플레이트이다. 플레이트에서의 배양에 대한 예시적인 데이터는 실시예 섹션과 도 1C 및 도 7에서 확인할 수 있다.
본 개시내용과 관련하여, 단계 (i) a1)의 제1 ECM 단백질이 기질 상에 고정된 형태로 제공되거나, 또는 단계 (i) a2)의 제2 ECM 단백질이 기질 상에 고정된 형태로 제공되는 것이 바람직하다. 또한, 단계 ii)에서 적어도 하나의 제3 세포외 기질 단백질이 기질 상에 고정된 형태로 제공되는 것이 바람직하다.
단계 i)는 (i) a1) 및 (i) a2)의 두 단계로 세분화된다. 예를 들어, 당업자는 단계 (i) a1) 및 (i) a2) 동안 CD90의 발현을 모니터링할 수 있다. 단계 (i) a1)은 단계 (i) a1)에 의해 생산된 세포의 적어도 50%가 CD90을 발현할 때 완료되는 것이 바람직하며, 이는 유세포 측정법에 의해 결정될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 유세포 측정법에 의해 결정된 바와 같이, 단계 (i) a1)에 의해 생산된 세포 집단의 적어도 50%가 CD90을 발현하고, 단계 (i) a1)에 의해 생산된 세포 집단의 50% 미만이 CD73을 발현하고, 단계 (i) a1)에 의해 생산된 세포 집단의 30% 미만이 CD44를 발현한다.
또한, 바람직한 실시양태에서, 배양 단계 (i) a1)은 2-8일, 바람직하게는 2.5-7일, 보다 바람직하게는 3-6일, 보다 더 바람직하게는 3.5-5일 및 가장 바람직하게는 대략 4일 동안 수행된다. 또한, 배양 단계 (i) a2)는 10-20일, 바람직하게는 11-19일, 보다 바람직하게는 12-18일, 보다 바람직하게는 13-17일, 보다 더 바람직하게는 14-16일 및 가장 바람직하게는 대략 15일 동안 수행된다.
또한 바람직하게는 단계 (i) (i a1 및 i a2)는 12-28일 동안 수행되며, 바람직하게는 단계 (i a1 및 i a2)는 15-25일 동안 수행되며, 더욱 바람직하게는 단계 (i a1 및 i a2)는 16-23일 동안 수행되며, 가장 바람직하게는 단계 (i a1 및 i a2)는 17-21일 동안 수행된다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 단계 (i) a1)의 무혈청 기본 배지는 유효량의 (a) FGF2, (b) 혈관 내피 성장 인자(VEGF), (c) 글루타민 및 (d) GSK-3 저해제를 포함하며, 여기서 상기 양은 단계 (i) a1)에 의해 얻어진 세포의 적어도 50%에서 CD90의 발현, 단계 (i) a1)에 의해 얻어진 세포의 최대 50%에서 CD73의 발현, 및 단계 (i) a1)에 의해 얻어진 세포의 최대 30%에서 CD44의 발현으로 이어진다. 상기 발현 프로파일에 대한 예시적인 데이터는 유세포 측정법에 의해 측정된 도 3C에서 확인할 수 있다.
단계 (i) a2)의 무혈청 기본 배지가 유효량의 (a) FGF2, (b) 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 및 (c) 글루타민을 포함하고, 상기 양은 단계 (i) a2)에 의해 수득된 상기 심장 간질 세포 집단의 적어도 80%에서 CD90, CD73 및 CD44의 발현을 초래하는 것이 또한 고려된다.
단계 ii)의 무혈청 기본 배지는 유효량의 (a) FGF2, (b) VEGF 및 (c) 글루타민을 포함하는 것이 바람직하며, 여기서 단계 (ii)의 상기 양은 심장 간질 세포수를 증폭시키는데 효과적이다.
특히 바람직한 실시양태에서, 만능 줄기 세포로부터 심장 간질 세포의 집단을 생산하는 방법은 다음 단계를 포함한다:
(i) 만능 줄기 세포의 분화에 의해 수득된 윌름스 종양 항원(WT-1)을 발현하는 심외막 세포의 상피-중간엽 전이를 유도하는 단계 - 여기서 상피-중간엽 전이를 유도함으로써 심외막 세포가 심장 간질 세포로 분화되고, 여기서 상피-중간엽 전이를 유도하는 것은
a1) 상기 심외막 세포를 유효량의 (a) FGF2, (b) 혈관 내피 성장 인자(VEGF), (c) 글루타민 및 (d) GSK-3 억제제를 포함하는 무혈청 기본 배지에서 제1 세포외 기질 단백질의 존재하에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계 - 여기서 상기 양은 단계 (i) a1)에 의해 수득된 세포의 적어도 50%에서 CD90의 발현을 초래하고, 단계 (i) a1)에 의해 수득된 세포의 최대 50%에서 CD73의 발현을 초래하고, 단계 (i) a1)에 의해 수득된 세포의 최대 30%에서 CD44의 발현을 초래함 -; 이어서
a2) 단계 (i) a1)의 세포를 유효량의 (a) FGF2, (b) VEGF 및 (c) 글루타민을 포함하는 무혈청 기본 배지에서 제2 세포외 기질 단백질의 존재하에 적합한 조건 하에 배양하는 단계 - 여기서 상기 양은 단계 (i) a2)에 의해 수득된 상기 심장 간질 세포 집단의 적어도 80%에서 CD90, CD73 및 CD44의 발현을 초래함 -를 포함하고;
(ii) 단계 (i)의 심장 간질 세포의 집단을 유효량의 (a) FGF2, (b) VEGF, 및 (c) 글루타민을 포함하는 무혈청 기본 배지에서 적어도 하나의 제3 세포외 기질 단백질의 존재하에 배양함으로써 상기 심장 간질 세포의 수를 증폭시키는 단계 - 상기 양은 상기 심장 간질 세포 집단의 적어도 80%에서 CD90, CD73 및 CD44의 유지된 발현을 초래함 -.
위에서 언급한 바와 같이, 무혈청 기본 배지는 상업적으로 이용 가능하며 레시피는 ATCC 카탈로그와 같은 카탈로그에서 확인할 수 있다. 바람직하게는, 단계 (i) a1), (i) a2) 및/또는 단계 (ii)의 기본 배지는 KO DMEM, DMEM, DMEM/F12, RPMI, IMDM, alphaMEM, 배지 배지 199, Hams F-10, 또는 Hams F-12일 수 있다. KO DMEM이 특히 바람직하다. 단계 (i) a1), (i) a2) 및/또는 단계 (ii)의 기본 배지는 유사하게 또는 독립적으로 선택될 수 있다.
단계 (i) a1), (i) a2) 및/또는 (ii)의 무혈청 기본 배지는 10-200 ng/ml FGF, 바람직하게는 15-100 ng/ml, 보다 바람직하게는 20-80 ng/ml, 보다 더 바람직하게는 30-70 ng/ml, 가장 바람직하게는 40-60 ng/ml, 및 가장 바람직하게는 약 50 ng/ml FGF의 최종 농도를 포함하는 것이 특히 바람직하다. FGF2의 농도는 단계 (i) a1), (i) a2) 및/또는 (ii)에서 유사하게 또는 독립적으로 선택될 수 있다.
또한, 단계 (i) a1), (i) a2) 및/또는 (ii)의 무혈청 기본 배지는 5-100 ng/ml VEGF, 바람직하게는 7-50 ng/ml, 보다 바람직하게는 10-40 ng/ml, 보다 더 바람직하게는 15-35 ng/ml, 가장 바람직하게는 20-30 ng/ml, 및 가장 바람직하게는 약 25 ng/ml VEGF의 최종 농도를 포함할 수 있는 것이 구상된다. VEGF의 농도는 단계 (i) a1), (i) a2) 및/또는 (ii)에서 유사하게 또는 독립적으로 선택될 수 있다. 포유동물에서 VEGF 계열은 VEGF-A, 태반 성장 인자(PGF), VEGF-B, VEGF-C 및 VEGF-D의 5개 구성원으로 구성된다. VEGF-A가 처음 발견되었으며 일반적으로 VEGF라고도한다. 본원에서 사용된 바와 같이, VEGF-A 및 VEGF는 동의어로 지칭된다. 단일, 8-엑손 VEGFA 유전자로부터 mRNA의 선택적 스플라이싱으로 인해 발생하는 VEGF-A의 여러 이소형이 있다. 이들은 말단 엑손(엑손 8) 스플라이스 부위에 따라 지칭되는 두 그룹으로 분류된다: 근위 스플라이스 부위(VEGFxxx로 표시) 또는 원위 스플라이스 부위(VEGFxxxb). 또한, 엑손 6과 7의 교대 스플라이싱은 헤파린 결합 친화력과 아미노산 수를 변경한다. 인간에서 다음의 VEGF 형태가 알려져 있다: VEGF121, VEGF121b, VEGF145, VEGF165, VEGF165b, VEGF189, VEGF206. 특히 바람직한 실시양태에서, VEGF는 VEGF165이다.
또한, 단계 (i) a1), (i) a2) 및/또는 (ii)의 무혈청 기본 배지는 0.2-20 mM 글루타민, 바람직하게는, 0.5-10 mM 글루타민, 보다 바람직하게는 0.75-5 mM 글루타민, 보다 더 바람직하게는 1-3 mM 글루타민, 보다 더 바람직하게는 1.5-2.5 mM 글루타민, 및 가장 바람직하게는 약 2 mM 글루타민의 최종 농도를 포함하는 것이 바람직하다. 글루타민의 농도는 단계 (i) a1), (i) a2) 및/또는 (ii)에서 유사하게 또는 독립적으로 선택될 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 글루타민은 L-알라닐-L-글루타민 디펩티드로서 존재한다. 그러나, 임의의 적합하고 생체이용가능한 형태의 글루타민이 사용될 수 있다. 예를 들어, 당업자는 L-알라닐-L-글루타민이 글루타민 자체보다 더 안정하고 수용성이라는 것을 알고 있다.
단계 (i) a1)의 무혈청 기본 배지는 CHIR99021, CHIR98014, SB216763, TWS119, 티데글루십(Tideglusib), SB415286, 6-브로모인더루빈-3-옥심 및 발프로에이트 염으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는 GSK-3 억제제를 포함하는 것이 구상되며, 바람직하게는 여기서 GSK-3 억제제는 CHIR99021이다. 그러나, 본원에 기재된 방법에 적합한 임의의 GSK3-억제제가 적용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 단계 (i) a1)의 기본 배지에서 GSK3-억제제는 CHIR99021이다. GSK3-억제제의 유효량의 농도는 해당 억제제의 가용성 및 억제 상수에 따라 달라진다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 본원에서 사용되는 용어 "유효량"은 GSK3-억제제와 관련하여 효소 불활성화 농도를 의미하는 것으로 의도된다. 예를 들어, CHIR99021의 경우, 단계 (i)의 기본 배지는 0.1-10 μM CHIR99021, 바람직하게는 0.2-9 μM, 보다 바람직하게는 0.3-8 μM, 보다 더 바람직하게는 0.4-7 μM, 보다 더욱 바람직하게는 0.5-6 μM, 보다 바람직하게는 0.6-5 μM, 보다 바람직하게는 0.7-4 μM, 보다 바람직하게는 0.8-3 μM, 가장 바람직하게는 0.9-2 μM, 및 보다 가장 바람직하게는 약 1 μM CHIR99021의 최종 농도를 포함한다.
일 실시양태에서, 단계 (i) a2) 및/또는 (ii)의 무혈청 기본 배지는 (e) 무혈청 "진핵 세포 배양 배지"(ECCM) 보충제를 추가로 포함할 수 있다. ECCM의 성분 및 농도는 단계 (i) a1), (i) a2) 및/또는 (ii)에서 유사하게 또는 독립적으로 선택될 수 있다. ECCM은 적절한 농도의 아스코르브산, 인슐린, 트랜스페린, 알부민 및 셀레늄을 포함하는 것이 바람직하다. 당업자는 유효 농도가 각각의 물질의 이용가능성 및 생물학적 활성에 따라 달라진다는 것을 알고 있다. 바람직한 실시양태에서, ECCM 보충제는 1.5-180 μg/ml 아스코르브산 (바람직하게는 5-120 μg/ml 아스코르브산, 보다 바람직하게는 15-70 μg/ml 아스코르브산, 보다 더 바람직하게는 22-50 μg/ml 아스코르브산, 보다 더 바람직하게는 27-40 μg/ml 아스코르브산, 보다 더 바람직하게는 30-36 μg/ml 아스코르브산, 가장 바람직하게는 약 33 μg/ml 아스코르브산);
2-50 μg/ml 인슐린; (바람직하게는 4-40 μg/ml 인슐린, 보다 바람직하게는 5-30 μg/ml 인슐린, 보다 더 바람직하게는 6-22 μg/ml 인슐린, 보다 더 바람직하게는 7-15 μg/ml 인슐린, 보다 더 바람직하게는 9-11 μg/ml 인슐린, 가장 바람직하게는 약 10 μg/ml 인슐린);
1.1-27.5 μg/ml 트랜스페린 (바람직하게는 2-20 μg/ml 트랜스페린, 보다 바람직하게는 3-12.5 μg/ml 트랜스페린, 보다 더 바람직하게는 4-8 μg/ml 트랜스페린, 보다 더 바람직하게는 4.5-7 μg/ml 트랜스페린, 보다 더 바람직하게는 5-6 μg/ml 트랜스페린, 가장 바람직하게는 약 5.5 μg/ml 트랜스페린);
1660-41500 μg/ml 알부민(바람직하게는 3200-30000 μg/ml 알부민, 보다 바람직하게는 4800-20000 μg/ml 알부민, 보다 더 바람직하게는 6000-11000 μg/ml 알부민, 보다 더 바람직하게는 7500-9200 μg/ml 알부민, 보다 더 바람직하게는 8000-8600 μg/ml 알부민, 가장 바람직하게는 약 8300 μg/ml 알부민); 및
11-145 nM 셀레늄 (바람직하게는 20-105 nM 셀레늄, 보다 더 바람직하게는 25-80 nM 셀레늄, 보다 더 바람직하게는 30-50 nM 셀레늄, 보다 더 바람직하게는 35-45 nM 셀레늄, 및 가장 바람직하게는 약 40.5 nM 셀레늄)의 최종 농도를 제공하도록 제형화된다.
ECCM의 일부인 아스코르브산은 아스코르베이트-2-포스페이트와 같은 그의 적합한 유도체도 포함하도록 본원에서 정의된다. 즉, ECCM은 배지에 10-1000 μM 아스코르브산, 바람직하게는 20-500 μM, 보다 바람직하게는 100-300 μM, 보다 더 바람직하게는 150-250 μM, 및 가장 바람직하게는 약 195　μM의 아스코르브산 또는 이의 유도체의 최종 농도를 제공하도록 제형화된다. 아스코르브산의 유도체가 아스코르베이트-2-포스페이트인 것이 특히 바람직하다.
ECCM의 일부인 셀레늄은 배지에서 생체이용 가능한 염으로 사용될 수 있다. 바람직하게는, 셀레늄은 소듐 셀레나이트로 제공된다. 셀레늄이 소듐 셀레나이트로 제공되는 경우 ECCM 보충제는 기본 배지에서 0.002-0.025 μg/ml 소듐 셀레나이트, 바람직하게는 0.004-0.01 μg/ml 소듐 셀레나이트, 보다 바람직하게는 0.006-0.008 μg/ml의 최종 농도를 제공하도록 제형화되며, 보다 더 바람직하게는 ECCM 보충제는 기본 배지에서 약 0.007 μg/ml 소듐 셀레나이트의 최종 농도를 제공하도록 제형화된다.
특히 바람직한 실시양태에서, ECCM은 적절한 양의 글루타티온 및 미량 원소를 추가로 포함한다. 보다 더 바람직한 실시양태에서 ECCM 보충제는 알부민, 티아민, 트랜스페린, 인슐린, 환원된 글루타티온, 아스코르브산 및 아스코르브산-2-포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 항산화제, L-히스티딘, L-이소류신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-하이드록시프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 10개 이상의 아미노산 및 Ag+, Al3+, Ba2+, Cd2+, Co2+, Cr3+, Ge4+, Se4+, Br-, I-, Mn2+, F-, Si +, V5+, Mo6+, Ni2+, Rb+, Sn2+ 및 Zr4+로 이루어진 군으로부터 선택된 15종 이상의 미량 원소를 포함한다. 보다 더 바람직한 형태에서, ECCM은 표 2에 열거된 물질의 유효 농도를 포함한다. 보다 더 바람직한 실시양태에서, ECCM 보충제는 표 2에 명시된 바와 같이 기본 배지에 5-20% (v/v), 바람직하게는 6-17.5% (v/v), 보다 바람직하게는 7-15% (v/v), 보다 바람직하게는 8%-12% (v/v), 보다 바람직하게는 9%-11% (v/v), 및 가장 바람직하게는 약 10% (v/v) ECCM 보충제로 제공된다. 평균적인 기술을 가진 사람은 ECCM 보충제를 알고 있으며 ECCM 보충제는 상업적으로 Knockout serum replacement™(KSR™)로도 불린다. ECCM은 당업계에 기재된 바와 같이, 예를 들어 특허 출원 WO 98/30679에 따라 기재된 바와 같이 생성될 수 있다. 대안적으로, ECCM은 예를 들어 Gibco로부터 KSR™ 명으로 상업적으로 이용 가능하다.
특히 바람직한 실시양태에서, 단계 (i) a1)의 무혈청 기본 배지는 약 50 ng/ml FGF, 약 25 ng/ml VEGF, 약 2 mM 글루타민 및 약 1 μM의 GSK-억제제를 포함하며, 여기서 GSK-억제제는 바람직하게는 CHIR99021, CHIR98014, SB216763, TWS119, 티데글루십, SB415286, 6-브로모인더루빈-3-옥심 및 발프로에이트 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 단계 (i) a1)에서 사용되는 무혈청 기본 배지는 약 2 mM 글루타민, 약 10% KSRTM 보충제, 약 50 ng/ml FGF, 약 25 ng/ml VEGF 및 약 1 μM CHIR를 포함하는 녹아웃 DMEM 배지인 것이 보다 더 바람직하다.
또 다른 특히 바람직한 실시양태에서, 단계 (i) a2)의 무혈청 기본 배지는 약 50 ng/ml FGF, 약 25 ng/ml VEGF, 및 약 2 mM 글루타민을 포함한다. 단계 (i) a2)에서 사용되는 무혈청 기본 배지는 약 2 mM 글루타민, 약 10% KSRTM 보충제, 약 50 ng/ml FGF 및 약 25 ng/ml VEGF를 포함하는 녹아웃 DMEM 배지인 것이 보다 더 바람직하다.
추가의 특히 바람직한 실시양태에서, 단계 (ii)의 무혈청 기본 배지는 약 50 ng/ml FGF, 약 25 ng/ml VEGF, 및 약 2 mM 글루타민을 포함한다. 단계 ii)에서 사용되는 무혈청 기본 배지는 약 2 mM 글루타민, 약 10% KSRTM 보충제, 약 50 ng/ml FGF 및 약 25 ng/ml VEGF를 포함하는 녹아웃 DMEM 배지인 것이 더욱 바람직하다.
특히 바람직한 실시예에서, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(i) 만능 줄기 세포의 분화에 의해 수득된 윌름스 종양 항원(WT-1)을 발현하는 심외막 세포의 상피-중간엽 전이를 유도하는 단계 - 여기서 상피-중간엽 전이를 유도함으로써 심외막 세포가 심장 간질 세포로 분화되고, 여기서 상피-중간엽 전이를 유도하는 것은
a1) 상기 심외막 세포를 (a) 10-200 ng/ml FGF2, (b) 5-100 ng/ml 혈관 내피 성장 인자(VEGF), (c) 0.2-20 mM 글루타민, (d) 0.1-10 μM GSK-3 억제제, 및 (e) ECCM 보충제를 포함하는 무혈청 기본 배지에서 제1 세포외 기질 단백질의 존재하에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계 - 여기서 ECCM 보충제는 기본 배지에 6.6-165 μg/ml 아스코르브산, 2-50 μg/ml 인슐린, 1.1-27.5 μg/ml 트랜스페린, 1660-41500 μg/ml 알부민, 및 11-145 nM 셀레늄의 최종 농도를 제공하도록 제형화되고, 상기 세포의 적어도 50%는 CD90을 발현하고, 상기 세포의 최대 50%는 CD73을 발현하고, 상기 세포의 최대 30%는 CD44를 발현함 -; 이어서
a2) 단계 (i) a1)의 세포를 (a) 10-200 ng/ml FGF2, (b) 5-100 ng/ml VEGF, 및 (c) 0.2-20 mM 글루타민, 및 (d) 단계 (i) a1)에서와 같은 ECCM 보충제를 포함하는 무혈청 기본 배지에서 제2 세포외 기질 단백질의 존재하에 적합한 조건 하에 배양하는 단계 - 여기에서 수득된 심장 간질 세포 집단의 세포 중 적어도 약 80%는 CD90, CD73 및 CD44를 발현함 -를 포함하고;
(ii) 단계 (i)의 심장 간질 세포 집단을 (a) 10-200 ng/ml FGF2, (b) 5-100 ng/ml VEGF, (c) 0.2-20 mM 글루타민, 및 (d) 단계 (i) a1)에서와 같은 ECCM 보충제를 포함하는 무혈청 기본 배지에서 적어도 하나의 제3 세포외 기질 단백질의 존재하에 배양함으로써 상기 심장 간질 세포의 수를 증폭시키는 단계 - 상기 심장 간질 세포 집단의 적어도 80%는 CD90, CD73 및 CD44의 발현을 유지함 -.
바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 제3 세포외 기질 단백질은 기질 상에 고정된 형태로 제공된다. 기질이 단계 (ii)에서 비트로넥틴, 라미닌, 콜라겐, 특히 젤라틴, 매트리겔 및 피브로넥틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 제3 세포외 기질 단백질로 코팅되는 것이 추가로 고려된다. 단계 (ii) 동안 심장 간질 세포의 수를 증폭시키기 위해 심장 간질 세포를 여러 번 계대할 수 있다. 단계 (ii)에서 적어도 하나의 제3 세포외 기질 단백질 코팅된 기질이 하나 이상의 계대(들)에서 비트로넥틴으로 코팅되고 하나 이상의 후속 계대(들)에서 비트로넥틴, 라미닌, 콜라겐, 특히 젤라틴, 매트리겔 또는 피브로넥틴으로 코팅되는 것이 바람직하다. 단계 (ii)에서 적어도 하나의 제3 세포외 기질 단백질 코팅된 기질이 하나의 계대 동안 비트로넥틴으로 코팅되고 후속 계대 동안 비트로넥틴, 라미닌, 콜라겐, 특히 젤라틴, 매트리겔 또는 피브로넥틴으로 코팅되는 것이 보다 더 바람직하다. 이러한 심장 간질의 계대에 대한 예시적인 데이터가 도 7에 나와 있다. 적어도 하나의 제3 세포외 기질 단백질은 비트로넥틴, 라미닌, 콜라겐, 특히 젤라틴, 매트리겔 및 피브로넥틴으로부터 선택되고, 바람직하게는 여기서 세포외 기질 단백질은 비트로넥틴인 것이 또한 고려된다.
당업자는 고정된 기질을 코팅하기 위한 적절한 농도를 알고 있으며 그러한 기질을 코팅하기 위한 적절한 농도를 결정할 수 있다. 예를 들어, 적어도 하나의 제3 세포외 기질 단백질은 비트로넥틴일 수 있으며, 이는 이후 0.1125 μg/㎠ - 7.2 μg/㎠ 비트로넥틴, 바람직하게는 0.225 μg/㎠ - 3.6 μg/㎠ 비트로넥틴, 보다 바람직하게는 0.45 μg/㎠ - 1.8 μg/㎠ 비트로넥틴, 보다 더 바람직하게는 0.6 μg/㎠ - 1.2 μg/㎠ 비트로넥틴, 보다 더 바람직하게는 0.7 μg/㎠ - 1.1 μg/㎠ 비트로넥틴, 보다 더 바람직하게는 0.8 μg/㎠ - 1 μg/㎠ 비트로넥틴, 가장 바람직하게는 약 0.9 μg/㎠ 비트로넥틴의 최종 농도로 기질 상에 고정된 형태로 제공될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 제3 세포외 기질 단백질은 0.1125 μg/㎠ - 7.2 μg/㎠ 라미닌, 바람직하게는 0.225 μg/㎠ - 3.6 μg/㎠ 라미닌, 보다 바람직하게는 0.45 μg/㎠ - 1.8 μg/㎠ 라미닌, 보다 더 바람직하게는 0.6 μg/㎠ - 1.2 μg/㎠ 라미닌, 보다 더 바람직하게는 0.7 μg/㎠ - 1.1 μg/㎠ 라미닌, 보다 더 바람직하게는 0.8 μg/㎠ - 1 μg/㎠ 라미닌, 가장 바람직하게는 약 0.9 μg/㎠ 라미닌의 최종 농도로 기질 상에 고정된 형태로 제공될 수 있다. 또한, 적어도 하나의 제3 세포외 기질 단백질은 콜라겐일 수 있고 8 μg/㎠ - 800 μg/㎠ 콜라겐, 바람직하게는 16 μg/㎠ - 400 μg/㎠ 콜라겐, 보다 바람직하게는 35 μg/㎠ - 250 μg/㎠ 콜라겐, 보다 더 바람직하게는 50 μg/㎠ - 180 μg/㎠ 콜라겐, 보다 더 바람직하게는 60 μg/㎠ - 100 μg/㎠ 콜라겐, 보다 더 바람직하게는 70 μg/㎠ 90 μg/㎠ 콜라겐, 보다 더 바람직하게는 약 80 μg/cm의 최종 농도로 기질 상에 고정된 형태로 제공될 수 있으며, 가장 바람직하게는 콜라겐은 젤라틴 형태로 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 제3 세포외 기질 단백질은 피브로넥틴이고 0.125 μg/㎠ - 8 μg/㎠ 피브로넥틴, 바람직하게는 0.25 μg/㎠ - 4 μg/㎠ 피브로넥틴, 보다 바람직하게는 0.5 μg/㎠ - 2 μg/㎠ 피브로넥틴, 보다 더 바람직하게는 0.7 μg/㎠ - 1.3 μg/㎠ 피브로넥틴, 보다 더 바람직하게는 0.8 μg/㎠ - 1.2 μg/㎠ 피브로넥틴, 보다 더 바람직하게는 0.9 μg/㎠ - 1.1 μg/㎠ 피브로넥틴, 가장 바람직하게는 약 1 μg/㎠ 피브로넥틴의 최종 농도로 기질 상에 고정된 형태로 제공될 수 있다. ECM 단백질로 고정된 기질을 코팅하는 예시적인 데이터는 본원의 실시예 1에 제공된다.
상기 논의된 바와 같이, 단계 (i) a2)에 의해 수득된 세포는 심장 간질 세포이고, 여기서 수득된 심장 간질 세포 집단의 적어도 약 80%는 CD90, CD73 및 CD44를 발현한다. 이 세 가지 마커 외에도 심장 간질 세포는 또한 비멘틴을 발현할 수도 있다.
당업자는 당업계의 표준 절차에 따라 비멘틴을 신뢰성있게 검출하는 방법을 알고 있다. 예를 들어, 비멘틴의 발현은 본원의 실시예 3에서와 같이 유세포 분석법으로 검출할 수 있다. 비멘틴은 중간엽 세포에서 발현되는 유형 III 중간 필라멘트(IF) 단백질이다. 따라서, 비멘틴은 중간엽 세포에 대한 표준 마커이다. 바람직한 실시양태에서, 유세포 분석법으로 측정되어, 단계 (i) a2)에 의해 수득된 심장 간질 세포 집단의 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 81%, 보다 바람직하게는 적어도 82%, 보다 더 바람직하게는 적어도 83%, 보다 더 바람직하게는 적어도 84%, 보다 더 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 86%, 보다 더 바람직하게는 적어도 87%, 보다 더 바람직하게는 적어도 88%, 보다 더 바람직하게는 적어도 89%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 보다 더 바람직하게는 적어도 91%, 보다 더 바람직하게는 적어도 92%, 보다 더 바람직하게는 적어도 93%, 보다 더 바람직하게는 적어도 94%, 보다 더 바람직하게는 적어도 95%, 보다 더 바람직하게는 적어도 96%, 보다 더 바람직하게는 적어도 97%, 보다 더 바람직하게는 적어도 98%는 비멘틴을 발현한다. 심장 간질 세포에서 비멘틴의 발현에 대한 예시적인 데이터는 또한 본원에 개시된 바와 같이 도 3A에서 확인할 수 있다. 단계 (ii)는 심장 간질 세포의 수를 증폭시키면서 심장 간질 세포의 표현형을 유지하기 때문에, 증폭 단계 (ii)는 세포 집단을 제공하는 것이 또한 바람직하며, 여기서 상기 심장 간질 세포 집단의 세포 중 적어도 약 90%는 비멘틴을 발현한다.
단계 (i) a2)에 의해 수득된 심장 간질 세포가 I형 콜라겐(콜라겐-1)을 발현하는 것이 또한 추가로 고려된다. 당업자는 당업계의 표준 절차에 따라 콜라겐-1을 신뢰성있게 검출하는 방법을 알고 있다. 예를 들어, 콜라겐-1의 발현은 본원의 실시예 3에 예시된 바와 같이 유세포 측정법에 의해 검출될 수 있다. I형 콜라겐(콜라겐 1)은 인체에서 가장 풍부한 콜라겐이다. 그것은 콜라겐 섬유로 알려진 큰 호산구성 섬유를 형성한다. 콜라겐 1은 세포 외부의 효소에 의해 처리되는 삼중 가닥의 로프 모양의 프로콜라겐 분자에 의해 형성된다. 이들 분자가 처리되면 세포 주변 공간에서 서로 교차 연결되는 길고 가는 피브릴로 배열된다. 가교결합은 매우 강한 성숙한 I형 콜라겐 섬유(콜라겐 1)의 형성을 야기하며, 이는 당업자에게 모두 알려져 있다. 바람직한 실시양태에서, 유세포 분석법으로 측정되어 단계 (i) a2)에 의해 수득된 심장 간질 세포 집단의 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 82%, 보다 바람직하게는 적어도 82%, 보다 더 바람직하게는 적어도 84%, 보다 더 바람직하게는 적어도 86%, 보다 더 바람직하게는 적어도 88%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 보다 더 바람직하게는 적어도 91%, 보다 더 바람직하게는 적어도 92%, 보다 더 바람직하게는 적어도 93%, 보다 더 바람직하게는 적어도 94%, 보다 더 바람직하게는 적어도 95%, 보다 더 바람직하게는 적어도 96%, 및 가장 바람직하게는 적어도 97%가 콜라겐 1을 발현한다. 콜라겐-1의 발현에 대한 예시적인 데이터는 도 3A에서 확인할 수 있다. 단계 (ii)는 심장 간질 세포의 수를 증폭시키면서 심장 간질 세포의 표현형을 유지하기 때문에, 증폭 단계 (ii)가 세포 집단을 제공하는 것이 또한 바람직하며, 여기서 상기 심장 간질 세포 집단의 세포 중 적어도 약 90%가 콜라겐 1을 발현한다. 도 3A에 도시된 바와 같이, 심장 간질 세포는 개시된 방법의 단계 (i)에 따른 방법에 의해 바람직하게 수득될 수 있으며, 여기서 단계 (i) a2)에 의해 생산된 심장 간질 세포 집단의 세포 중 적어도 약 90%는 비멘틴, CD90, 콜라겐-1 및 CD73을 발현하고, 심장 간질 세포 집단의 세포 중 적어도 약 80%는 CD44를 발현한다.
증폭 단계 (ii)가 세포 집단을 제공하는 것이 특히 바람직하며, 여기서 심장 간질 세포 집단의 세포 중 적어도 약 90%는 CD90, CD73 및 CD44를 발현하고, 바람직하게는 세포의 적어도 90%는 또한 비멘틴과 콜라겐 1을 표현한다.
전술한 바와 같이, 심외막 세포는 [Witty et al. (2014)] 또는 [Schlick (2018) Doctoral Thesis, November 2018, University of Goettingen]와 같이 당업계에 기술된 많은 프로토콜에 따라 수득될 수 있다. 하기 및 실시예 1에서 추가로 기술되는 바와 같이 단계 (i*) 및 (i**)에 따라 만능 줄기 세포로부터 심외막 세포를 수득하는 것이 보다 더 바람직하다. 특히, 심외막 세포는 단계 (i*)에서 만능 줄기 세포의 중배엽 분화를 유도한 후, 단계 (i**) 심외막 분화를 유도함으로써 만능 줄기 세포의 분화에 의해 수득될 수 있다.
"중배엽 분화"는 단계 (i*)에서 특정 인자/첨가제에 의해 유도된다. 중배엽은 초기 배아의 세 가지 기본 배엽 중 하나이다. 다른 두 층은 외배엽(외부 층)과 내배엽(내부 층)이며, 중배엽은 이들 사이의 중간 층이다. 바람직한 실시양태에서, 단계 (i*)에서의 중배엽 분화는 상기 만능 줄기 세포를 무혈청 기본 배지에서 라미닌 코팅된 고정화 기질 상에서 적합한 조건 하에 배양하는 것을 포함한다. 단계 (i*)에서 사용되는 무혈청 기본 배지가 유효량의 (a) 골형성 단백질 4(BMP4), (b) 액티빈 A(ActA), (c) GSK-3 억제제, (d) 염기성 섬유아세포 성장 인자(FGF2), (e) 글루타민, 및 (f) 알부민, 트랜스페린, 에탄올 아민, 셀레늄 또는 이의 생체이용가능 염, L-카르니틴, 지방산 보충제, 및 트리오도-L-티로닌(T3)을 포함하는 무혈청 보충제를 포함하는 것이 더 바람직하며, 여기서 양은 만능 줄기 세포의 중배엽 분화를 유도하기에 효과적이다.
라미닌 코팅된 고정화 기질은 단계 (i) a1)에 대해 기술된 바와 같이 코팅될 수 있다.
단계 (i*)의 길이 및 (a) 골형성 단백질 4(BMP4), (b) 액티빈 A(ActA), (c) GSK-3 억제제, (d) 염기성 섬유아세포 성장 인자(FGF2), (e) 글루타민, 및 (f) 무혈청 보충제와 같은 인자의 농도는 중배엽 분화 유도 효율을 모니터링하여 조정할 수 있다. 이는 세포 표면 마커 CD309 및/또는 CD140a의 발현을 모니터링함으로써 달성될 수 있다. 이들 세포 표면 마커의 발현을 평가하는 것은 예를 들어 유세포 측정법에 의해 평가될 수 있다. 당업자는 당업계에 공지된 표준 절차를 사용하여 유세포 측정법에 의해 CD309 및/또는 CD140a를 신뢰성있게 검출하는 방법을 알고 있다. 예를 들어, [Kattman et al. (2011)]은 중배엽 분화 유도 후 유세포 측정법으로 CD309 및 CD140a를 검출하였다.
일 실시양태에서, 유세포 분석법에 의해 결정된 바와 같이 단계 (i*) 후 수득된 세포의 적어도 50%가 CD309를 발현하고, 바람직하게는 단계 (i*) 후 세포의 적어도 55%가 CD309를 발현하고, 보다 바람직하게는 단계 (i*) 후 세포의 적어도 60%가 CD309를 발현하고, 보다 바람직하게는 단계 (i*) 후 세포의 적어도 65%가 CD309를 발현하고, 더욱 바람직하게는 단계 (i*) 후 세포의 적어도 70%가 CD309를 발현하고, 보다 바람직하게는 단계 (i*) 후 세포의 적어도 75%가 CD309를 발현하고, 보다 더 바람직하게는 단계 (i*) 후 세포의 적어도 80%가 CD309를 발현한다. 또 다른 실시양태에서, 유세포 분석법에 의해 결정된 바와 같이 단계 (i*) 후 수득된 세포의 적어도 50%가 CD140a를 발현하고, 바람직하게는 단계 (i*) 후 세포의 적어도 55%가 CD140a를 발현하고, 보다 바람직하게는 단계 (i*) 후 세포의 적어도 60%가 CD140a를 발현하고, 단계 (i*) 후 세포의 적어도 65%가 CD140a를 발현하고, 더욱 바람직하게는 단계 (i*) 후 세포의 적어도 70%가 CD140a를 발현하고, 보다 바람직하게는 단계 (i*) 후 세포의 적어도 75%가 CD140a를 발현하고, 보다 더 바람직하게는 단계 (i*) 후 세포의 적어도 80%가 CD140a를 발현한다. 보다 더 바람직한 실시양태에서, 단계 (i*) 후 세포의 적어도 80%가 CD309 및 CD140a를 발현한다.
CD309 및/또는 CD140a의 발현에 따라, 당업자는 중배엽 분화 단계가 완료되는 시기를 결정할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 방법의 단계 (i*)는 3-9일 동안 수행되며, 보다 바람직하게는 단계 (i*)는 4-8일 동안 수행되며, 더욱더 바람직하게는 단계 (i*)는 5-7일 동안 수행되며, 가장 바람직하게는 단계 (i*)는 약 6일 동안 수행된다.
단계 (i*)에서 사용되는 기본 배지는 RPMI, DMEM, αMEM, DMEM/F12, StemPro, 및 Iscove's 배지 중에서 선택될 수 있다. 바람직하게는 기본 배지는 RPMI이다. 그러나, 임의의 적합한 기본 배지가 단계 (i*)에 사용될 수 있다. 기본 배지는 상업적으로 이용 가능하거나 ATCC 카탈로그와 같이 공개적으로 이용 가능한 레시피에 따라 생산할 수 있다. 적절하다고 판단되는 경우 기본 배지에 아미노산을 보충할 수 있다.
또한, 단계 (i*)의 기본 배지는 아스코르브산 또는 이의 유도체를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 아스코르브산이 단계 (i*)의 기본 배지에 포함되는 경우 10-1000 μM, 바람직하게는 50-400 μM, 보다 바람직하게는 100-300 μM, 보다 더 바람직하게는 150-250 μM, 및 가장 바람직하게는 약 200 μM의 농도 범위가 사용된다. 보다 더 바람직한 것은 아스코르베이트-2-포스페이트 형태의 아스코르브산이다.
또한, 단계 (i*)의 기본 배지는 피루베이트를 추가로 포함하는 RPMI일 수 있다. RPMI에서 피루베이트의 특히 바람직한 농도 범위는 0.1-10 mM 피루베이트, 보다 바람직하게는 0.2-5 mM 피루베이트, 보다 더 바람직하게는 0.4-2.5 mM 피루베이트, 보다 더 바람직하게는 0.8-1.5 mM 피루베이트, 보다 더 바람직하게는 0.9-1.2 mM 피루베이트, 가장 바람직하게는 약 1 mM 피루베이트이다.
바람직한 실시양태에서, 단계 (i*)의 기본 배지는 기본 배지에 1-100 ng/ml BMP4, 바람직하게는 2-50 ng/ml, 보다 바람직하게는 4-25 ng/ml, 보다 더 바람직하게는 7-15 ng/ml, 보다 더 바람직하게는 8-12.5 ng/ml, 보다 더 바람직하게는 9-11 ng/ml, 및 가장 바람직하게는 약 10 ng/ml;
0.3-30 ng/ml 액티빈 A, 바람직하게는 0.5-15 ng/ml, 보다 바람직하게는 0.8-7 ng/ml, 보다 더 바람직하게는 1-5 ng/ml, 보다 더욱 바람직하게는 2-4 ng/ml, 가장 바람직하게는 2.5-3.5 ng/ml, 및 보다 가장 바람직하게는 약 3 ng/ml;
0.1-10 ng/ml FGF2, 바람직하게는 1-9 ng/ml, 보다 바람직하게는 2-8 ng/ml, 보다 더 바람직하게는 3-7 ng/ml, 가장 바람직하게는 4-6 ng/ml, 및 보다 가장 바람직하게는 약 5 ng/ml; 및 또는
0.2-20 mM 글루타민(바람직하게는 0.4-10 mM 글루타민, 보다 바람직하게는 0.5-5 mM 글루타민, 보다 바람직하게는 1-3 mM 글루타민, 보다 바람직하게는 1.8-2.2 mM 글루타민, 더 바람직하게는 약 2 mM 글루타민)의 최종 농도를 포함한다.
특히 바람직한 실시양태에서, 글루타민은 L-알라닐-L-글루타민 디펩티드의 형태로 제공된다.
단계 (i*)의 GSK-3 억제제는 CHIR99021, CHIR98014, SB216763, TWS119, 티데글루십, SB415286, 6-브로모인더루빈-3-옥심 및 발프로에이트 염으로부터 선택될 수 있다. 그러나, 본원에 기재된 방법에 적합한 임의의 GSK3-억제제가 적용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 단계 (i*)의 기본 배지에서 GSK3-억제제는 CHIR99021이다. 유효량의 GSK3-억제제의 농도는 해당 억제제의 가용성 및 억제 상수에 따라 달라진다는 것을 당업자는 이해할 것이다. GSK3-억제제와 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "유효량"은 효소 불활성화 농도를 의미하는 것으로 의도된다. 예를 들어, CHIR99021의 경우, 단계 (i*)의 기본 배지는 0.1-10 μM CHIR99021, 바람직하게는 0.2-9 μM, 보다 바람직하게는 0.3-8 μM, 보다 더 바람직하게는 0.4-7 μM, 보다 바람직하게는 0.5-6 μM, 보다 바람직하게는 0.6-5 μM, 보다 바람직하게는 0.7-4 μM, 보다 바람직하게는 0.8-3 μM, 가장 바람직하게는 0.9-2 μM, 및 보다 가장 바람직하게는 약 1 μM CHIR99021의 최종 농도를 포함한다.
배지는 또한 무혈청 보충제를 포함한다. 단계 (i*)의 무혈청 보충제는 기본 배지에서 다음 성분의 최종 농도를 제공하도록 제형화된다: 0.25-25 mg/ml 알부민(바람직하게는 0.5-20 mg/ml, 보다 바람직하게는 1-15 mg/ml, 보다 바람직하게는 1.5-10 mg/ml, 보다 바람직하게는 2-5 mg/ml 및 가장 바람직하게는 2.25-3.75 mg/ml, 예컨대 약 2.5 mg/ml);
0.5-50 μg/ml 트랜스페린, (바람직하게는 1-45 μg/ml, 보다 바람직하게는 1.5-40 μg/ml, 보다 바람직하게는 2-35 μg/ml, 보다 바람직하게는 2.5-30 μg/ml, 보다 바람직하게는 3-25 μg/ml, 보다 바람직하게는 3.5-20 μg/ml, 보다 바람직하게는 4-15 μg/ml, 보다 바람직하게는 4.5-10 μg/ml, 예컨대 약 5 μg/ml);
0.05-5 μg/ml 에탄올아민, (바람직하게는 0.1-4.5 μg/ml, 보다 바람직하게는 0.15-4 μg/ml, 보다 더 바람직하게는 0.2-3.5 μg/ml, 보다 더 바람직하게는 0.25-3 μg/ml, 보다 바람직하게는 0.3-2.5 μg/ml, 보다 바람직하게는 0.35-2 μg/ml, 보다 바람직하게는 0.4-1.5 μg/ml, 가장 바람직하게는 0.5-1.25 μg/ml, 예컨대 약 1 μg/ml);
7.2-723 nM 셀레늄 또는 이의 생체이용가능 염, (바람직하게는 20-350 nM, 보다 바람직하게는 35-150 nM, 보다 더 바람직하게는 65-80 nM, 가장 바람직하게는 약 72.3 nM);
0.2-20 μg/ml L-카르니틴 HCl(바람직하게는 0.25-15 μg/ml, 보다 바람직하게는 0.5-10 μg/ml, 보다 더 바람직하게는 1-5 μg/ml, 보다 바람직하게는 1.5-2.5 μg/ml, 및 가장 바람직하게는 약 2 μg/ml);
0.5-50 μg/ml 지방산 보충제, (바람직하게는 0.7-40 μg/ml, 보다 바람직하게는 0.9-20 μg/ml, 보다 더 바람직하게는 1-12 μg/ml, 보다 바람직하게는 1.2-4 μg/ml, 및 가장 바람직하게는 1.6-3 μg/ml, 예컨대 약 2 μg/ml); 및
0.0002-0.02 μg/ml 트리오도-L-티로닌(T3)(바람직하게는 0.0005-0.01 μg/ml, 보다 바람직하게는 0.0008-0.005 μg/ml, 보다 더 바람직하게는 0.001-0.003 μg/ml, 가장 바람직하게는 약 0.002 μg/ml).
지방산 보충제는 예를 들어 리놀레산 및/또는 리놀렌산을 포함할 수 있다.
예를 들어, 생체이용 가능한 셀레늄 염은 소듐 셀레나이트이므로 무혈청 보충제가 배지에 제공되는 경우 기본 배지에서 소듐 셀레나이트의 최종 농도는 0.00125-0.125 μg/ml(바람직하게는 0.0025-0.08 μg/ml, 보다 바람직하게는 0.005-0.05 μg/ml, 보다 더 바람직하게는 0.01-0.025 μg/ml, 및 가장 바람직하게는 0.0125 μg/ml)이도록 제공된다.
또 다른 실시양태에서, 무혈청 보충제는 또한 D-갈락토스, 프로게스테론 및 푸트레신 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 이들 성분은 세포 생존에 유익하다. 각 성분의 적절한 농도는 당업자에게 알려져 있거나 일상적인 실험에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
무혈청 보충제의 일례는 공개된 프로토콜(Brewer et al. 1993 참조)에 따라 제조되거나 상업적으로 구입할 수 있다. 예를 들어, B27 마이너스 인슐린(표 1a)이 사용될 수 있다. B27 및 'B27 마이너스 인슐린'은 각각 인슐린을 포함하거나 포함하지 않는다. 바람직한 실시양태에서, 단계 (i*)의 무혈청 보충제는 기본 배지에 0바람직하게는 상업적으로 구입하거나 바람직하게는 표 1a에 따라 제조된 기본 배지에 .1-10% (v/v) B27 마이너스 인슐린, 0.5-8% (v/v), 보다 바람직하게는 1-6% (v/v), 보다 바람직하게는 1.5-4% (v/v), 보다 더 바람직하게는 1.5-4% (v/v), 보다 더 바람직하게는 1.7-2.5% (v/v) B27 마이너스 인슐린, 및 가장 바람직하게는 약 2% (v/v) B27 마이너스 인슐린으로 제공된다.
심외막 세포를 얻기 위해, 단계 (i*)에서 만능 줄기 세포의 중배엽 분화에 이어 단계 (i**)에서 심외막 분화 유도가 이어진다. "심외막 분화"는 단계 (i**)에서 특정 인자/첨가제에 의해 유도된다. 구체적으로, 단계 (i*)의 세포를 유효량의 (a) BMP4, (b) 레티노산(RA), (c) GSK-3 억제제, (d) 인슐린, 및 (e) 글루타민 및 (f) (i*)에서와 같은 무혈청 보충제를 포함하는 무혈청 기본 배지에서 라미닌 코팅된 플레이트 상에서 적합한 조건 하에 배양함으로써 심외막 분화를 유도할 수 있다; 이에 의해 수득된 세포는 qRT-PCR에 의해 결정된 바와 같이 윌름스 종양 항원 1(WT-1)을 발현한다. 라미닌 코팅된 고정 기질은 단계 (i) a1)에 대해 기술된 바와 같이 코팅될 수 있다. 상술한 바와 같이, 발생하는 심외막은 예를 들어 WT-1과 같은 전사 인자의 발현에 의해 심근 및 심내막과 구별될 수 있다. 단계 (i**)의 길이 및 (a) BMP4, (b) 레티노산(RA), (c) GSK-3 억제제, (d) 인슐린, 및 (e) 글루타민 및 (f) 무혈청 보충제와 같은 인자의 농도는 심외막 분화 유도 효율을 모니터링하여 조정할 수 있다.
또한, 단계 (i**)에서 사용되는 무혈청 기본 배지는 유효량의 (a) BMP4, (b) 레티노산(RA), (c) GSK-3 억제제, (d) 인슐린, (e) 글루타민 및 (f) 단계 (i*)에서와 같은 무혈청 보충제를 포함할 수 있으며, 여기서 양은 단계 (i*)에 의해 수득된 세포의 심외막 분화를 유도하는 데 효과적이다. 이는 전사 인자 WT-1의 발현을 모니터링함으로써 달성될 수 있다. 상기 마커의 발현 평가는 예를 들어 qRT-PCR에 의해 평가될 수 있고 당업자는 상기 기재된 바와 같이 qRT-PCR을 사용하여 WT-1을 신뢰성있게 검출하는 방법을 알고 있다. 바람직한 실시양태에서, 단계 (i**) 이후의 세포는 qRT-PCR에 의해 결정되어 TBP와 같은 하우스키핑 유전자보다 적어도 3배, 보다 바람직하게는 적어도 4배, 보다 더 바람직하게는 적어도 5배, 가장 바람직하게는 적어도 6배; 및 최대 15배로 윌름스 종양 항원 1(WT-1) RNA를 발현한다.
WT-1 RNA의 발현 외에, 발현은 또한 WT-1의 면역형광 염색에 의해 평가될 수 있다. WT-1의 발현은 현미경으로 검출할 수 있는 형광 신호를 유도하며 당업자는 형광 현미경을 알고 있다. 예를 들어, 도 1C는 실험 데이터를 제공하고 본원에 개시된 방법의 단계 (i**) 완료 후 WT-1의 발현을 나타낸다.
TBP와 같은 하우스키핑 유전자에 비해 WT-1의 증가된 발현에 따라 당업자는 심외막 분화 단계가 완료되는 시기를 결정할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 방법의 단계 (i**)는 5-9일 동안 수행되고, 바람직하게는 단계 (i**)는 6-8일 동안 수행되며, 더욱 바람직하게는 단계 (i**)는 6.5-7.5일 동안 수행되고, 가장 바람직하게는 단계 (i**)는 약 7일 동안 수행된다.
바람직한 실시양태에서, 단계 (i**)의 기본 배지는 추가로 10-1000 μM, 바람직하게는 50-400 μM, 보다 바람직하게는 100-300 μM, 보다 더 바람직하게는 150-250 μM, 및 가장 바람직하게는 약 200　μM의 아스코르브산 또는 이의 유도체를 포함한다. 아스코르브산의 유도체가 아스코르베이트-2-포스페이트인 것이 특히 바람직하다.
단계 (i**)의 기본 배지는 예를 들어 RPMI, DMEM, αMEM, DMEM/F12, StemPro, 및 Iscove's 배지 중에서 선택될 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 기본 배지는 RPMI이다. 그러나, 임의의 적합한 기본 배지가 상기 방법에 사용될 수 있다. 기본 배지는 상업적으로 이용 가능하거나 ATCC 카탈로그와 같이 공개적으로 이용 가능한 레시피에 따라 생산할 수 있다. 적절하다고 판단되는 경우 기본 배지에 아미노산을 보충할 수 있다. 보다 더 바람직한 것은 단계 (i**)의 배지가 피루베이트를 포함하는 RPMI인 것이다. 기본 배지가 피루베이트를 포함하는 경우, 기본 배지의 예시적인 농도는 0.1-10 mM 피루베이트 (바람직하게는 0.2-5 mM 피루베이트, 보다 바람직하게는 0.4-2.5 mM 피루베이트, 보다 바람직하게는 0.8-1.5 mM 피루베이트, 보다 바람직하게는 0.9-1.2 mM 피루베이트, 가장 바람직하게는 약 1 mM 피루베이트)이다.
상기 언급된 바와 같이, 단계 (i**)의 기본 배지는 유효량의 BMP4, RA, GSK-3 억제제, 및 인슐린을 포함할 수 있다. 당업자는 수용체/효소 작용제 또는 억제제의 유효 농도 또는 양이 각각의 물질의 이용가능성 및 생물학적 활성에 따라 달라진다는 것을 알고 있다.
예를 들어, 단계 (i**)에서 이러한 기본 배지는 5-500 ng/ml BMP4, 바람직하게는 10-250 ng/ml BMP4, 보다 바람직하게는 20-125 ng/ml BMP4, 보다 더 바람직하게는 35-70 ng/ml BMP4, 보다 더 바람직하게는 40-60 ng/ml BMP4, 보다 더 바람직하게는 45-55 ng/ml BMP4, 및 가장 바람직하게는 약 50 ng/ml BMP4;
0.4-40 μM 레티노산(RA), 바람직하게는 0.8-20 μM RA, 보다 바람직하게는 1.6-10 μM RA, 보다 더 바람직하게는 2-8 μM RA, 보다 더욱 바람직하게는 2.5-7 μM RA, 보다 더 바람직하게는 2.8-6 μM RA, 보다 더 바람직하게는 3-5 μM RA, 가장 바람직하게는 3.5-4.5 μM RA, 및 보다 가장 바람직하게는 약 4 μM RA;
0.3-30 μg/ml 인슐린, 바람직하게는 0.5-20 μg/ml, 보다 바람직하게는 1-15 μg/ml, 보다 더 바람직하게는 1.5-10 μg/ml, 보다 더욱 바람직하게는 2-5 μg/ml, 보다 더 바람직하게는 2.5-3.5 μg/ml, 가장 바람직하게는 약 3 μg/ml 인슐린; 및/또는
0.2-20 mM 글루타민(바람직하게는 0.4-10 mM 글루타민, 보다 바람직하게는 0.5-5 mM 글루타민, 보다 바람직하게는 1-3 mM 글루타민, 보다 바람직하게는 1.8-2.2 mM 글루타민, 더 바람직하게는 약 2 mM 글루타민)의 최종 농도를 포함할 수 있다.
특히 바람직한 실시양태에서, 글루타민은 L-알라닐-L-글루타민 디펩티드의 형태로 제공된다.
단계 (i**)의 가능한 GSK-3 억제제 및 이의 바람직한 농도에 대한 예시적이고 바람직한 실시양태는 단계 (i*)의 예시적이고 바람직한 GSK-3 억제제로부터 유사하고 독립적으로 선택될 수 있다.
또한, 단계 (i**)에서 언급된 무혈청 보충제는 상기 단계 (i*)에 대해 한정된 무혈청 보충제와 동일한 성분 및 바람직한 농도를 포함할 수 있다. 성분은 단계 (i*)와 유사하게 또는 독립적으로 선택될 수 있다.
특히 바람직한 실시양태에서, 무혈청 보충제는 무혈청 기본 배지에 인슐린을 제공하기 위해 인슐린을 포함할 수 있다. 예를 들어, B27은 인슐린을 포함하는 무혈청 보충제이다. B27과 B27 마이너스 인슐린의 차이는 B27에 인슐린이 존재한다는 것이다. 표 1b는 B27의 성분과 농도를 제공한다. B27은 또한 당업자에게 공지되어 있고 예를 들어 [Brewer et al. (1993)]에서 공개되었으며, B27도 상업적으로 입수 가능하다. 따라서, 특히 바람직한 실시양태에서, 단계 (i**)의 무혈청 보충제 및 인슐린은 상업적으로 입수되거나 바람직하게 표 1b에 의해 제공되는 것과 같이, 기본 배지에 B27, 바람직하게는 0.1-10% (v/v)의 B27, 바람직하게는 0.5-8% (v/v), 보다 바람직하게는 1-6% (v/v), 보다 더 바람직하게는 1.5-4% (v/v), 보다 더 바람직하게는 약 2% (v/v) B27로 제공된다.
특히 바람직한 실시예에서, 방법은 다음의 단계를 포함한다:
i*. 상기 만능 줄기 세포를 무혈청 기본 배지에서 라미닌 코팅된 기질 상에서 적합한 조건 하에 배양함으로써 중배엽 분화를 유도하는 단계로서, 유세포 측정법에 의해 결정된 바와 같이 수득된 세포의 적어도 90%가 CD90을 발현하고, 수득된 세포의 최대 10%가 CD73을 발현하고, 수득된 세포의 최대 10%가 CD44를 발현하는, 단계;
i**. 단계 (i*)의 세포를 무혈청 기본 배지에서 라미닌 코팅된 기질 상에서 적합한 조건 하에 배양함으로써 심외막 분화를 유도하는 단계로서, 여기서 수득된 세포는 형광 현미경에 의해 결정된 바와 같이 윌름스 종양 항원 1(WT-1)을 발현하는, 단계,
(i) (i) a1) 단계 (i**)의 세포를 무혈청 기본 배지에서 제1 세포외 기질 단백질의 존재하에 적합한 조건 하에 배양함으로써 상피-중간엽 전이를 유도하는 단계로서, 여기서 상기 세포의 적어도 50%는 CD90을 발현하고 상기 세포의 최대 50%는 CD73을 발현하고 상기 세포의 최대 30%는 CD44를 발현하는, 단계; 이어서 a2) 단계 (i) a1)의 세포를 무혈청 기본 배지에서 제2 세포외 기질 단백질 기질의 존재하에 적합한 조건 하에 배양하는 단계로서; 여기에서 수득된 심장 간질 세포 집단의 세포 중 적어도 약 80%는 CD90, CD73 및 CD44를 발현하는, 단계; 및
(ii) 단계 (i)의 상기 심장 간질 세포 집단을 무혈청 기본 배지에서 적어도 하나의 제3 세포외 기질 단백질 기질의 존재하에 배양함으로써 상기 심장 간질 세포의 수를 증폭시키는 단계로서, 상기 심장 간질 세포 집단의 적어도 80%는 CD90, CD73 및 CD44의 발현을 유지하는, 단계.
보다 더 바람직한 실시예에서, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
i*. 상기 만능 줄기 세포를 유효량의 a) 골형성 단백질 4(BMP4), (b) 액티빈 A(ActA), (c) GSK-3 억제제, (d) 염기성 섬유아세포 성장 인자(FGF2), (e) 글루타민, 및 (f) 알부민, 트랜스페린, 에탄올 아민, 셀레늄 또는 이의 생체이용가능 염, L-카르니틴, 지방산 보충제, 및 트리오도-L-티로닌(T3)을 포함하는 무혈청 보충제를 포함하는 무혈청 기본 배지에서 라미닌 코팅된 기질 상에서 적합한 조건 하에 배양함으로써 중배엽 분화를 유도하는 단계로서, 여기서 양은 유세포 측정법에 의해 결정된 바와 같이 단계 (i*)에 의해 수득된 세포의 적어도 90%에서 CD90 발현, 단계 (i*)에 의해 수득된 세포의 최대 10%에서 CD73 발현 및 단계 (i*)에 의해 수득된 세포의 최대 10%에서 CD44 발현을 초래하는, 단계;
i**. 단계 (i*)의 세포를 유효량의 (a) BMP4, (b) 레티노산(RA), (c) GSK-3 억제제, (d) 인슐린, (e) 글루타민 및 (f) (i)에서와 같은 무혈청 보충제를 포함하는 무혈청 기본 배지에서 라미닌 코팅된 기질 상에서 적합한 조건 하에 배양함으로써 심외막 분화를 유도하는 단계로서, 여기서 상기 양은 형광 현미경에 의해 결정된 바와 같이 윌름스 종양 항원 1(WT-1)의 발현으로 이어지는, 단계,
(i) 단계 (i**)의 세포를 유효량의 (a) FGF2, (b) 혈관 내피 성장 인자(VEGF), (c) 글루타민 및 (d) GSK-3 억제제를 포함하는 무혈청 기본 배지에서 제1 세포외 기질 단백질의 존재하에 적합한 조건 하에 배양함으로써 상피-중간엽 전이를 유도하는 단계로서, 여기서 상기 양은 유세포 측정법에 의해 결정된 바와 같이 단계 (i) a1)에 의해 수득된 세포의 적어도 50%에서 CD90 발현, 단계 (i) a1)에 의해 수득된 세포의 최대 50%에서 CD73 발현 및 단계 (i) a1)에 의해 수득된 세포의 최대 30%에서 CD44 발현을 초래하는, 단계; 이어서 a2) 세포를 유효량의 (a) FGF2, (b) VEGF, 및 (c) 글루타민을 포함하는 무혈청 기본 배지에서 제2 세포외 기질 단백질 기질의 존재하에 적합한 조건 하에 배양하는 단계로서; 여기에서 상기 양은 수득된 심장 간질 세포 집단의 적어도 약 80%에서 CD90, CD73 및 CD44 발현을 초래하는, 단계; 및
(ii) 단계 (i)의 상기 심장 간질 세포 집단을 유효량의 (a) FGF2, (b) VEGF, 및 (c) 글루타민을 포함하는 무혈청 기본 배지에서 적어도 하나의 제3 세포외 기질 단백질 기질의 존재하에 배양함으로써 상기 심장 간질 세포의 수를 증폭시키는 단계로서, 상기 양은 수득된 심장 간질 세포 집단의 적어도 약 80%에서 CD90, CD73 및 CD44 발현 유지를 초래하는, 단계.
증폭 단계 (ii)는 심장 간질 세포가 세포의 적어도 80%에서 CD90, CD73 및 CD44의 발현을 유지하는 한 수행될 수 있는 것으로 고려된다. 원칙적으로 증폭은 무한으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 심장 간질 세포는 실시예 4, 도 3D에서 입증된 바와 같이 적어도 5회 계대에 걸쳐 CD90, CD73 및 CD44의 발현을 유지하였다. 바람직한 실시양태에서, 증폭 단계 (ii)를 수행하는 경우, 적어도 2배, 바람직하게는 적어도 3배, 보다 바람직하게는 적어도 4배, 보다 바람직하게는 적어도 5배, 보다 바람직하게는 적어도 6배, 보다 더 바람직하게는 적어도 7배, 보다 더 바람직하게는 적어도 8배, 보다 더 바람직하게는 적어도 9배, 보다 더 바람직하게는 적어도 10배, 보다 더 바람직하게는 적어도 11배, 보다 더 바람직하게는 적어도 12배, 보다 더 바람직하게는 적어도 13배, 보다 더 바람직하게는 적어도 14배, 보다 더 바람직하게는 적어도 15배, 보다 더 바람직하게는 적어도 20배 및 최대 200배의 집단 배가 수준을 달성할 수 있다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 증폭 단계 (ii)는 적어도 2배, 바람직하게는 적어도 3배, 보다 바람직하게는 적어도 4배, 보다 바람직하게는 적어도 5배; 및 최대 200배, 바람직하게는 최대 150배, 바람직하게는 최대 100배, 바람직하게는 최대 90배, 바람직하게는 최대 80배, 보다 바람직하게는 최대 70배, 보다 바람직하게는 최대 60배, 보다 바람직하게는 최대 50배, 보다 더 바람직하게는 최대 40배, 보다 더 바람직하게는 최대 30배, 더더욱 20배의 집단 배가 수준을 달성할 수 있다.
도 2(실시예 2)의 실험적 증거에 의해 또한 입증된 바와 같이, 증폭 단계 (ii)는 여러 계대에 걸쳐 수행될 수 있고 CD90, CD73 및 CD44의 발현이 유지된다(도 3D, 실시예 4). 바람직한 실시양태에서, 증폭 단계 (ii)는 적어도 1 계대, 바람직하게는 2 계대, 더 바람직하게는 3 계대, 더 바람직하게는 4 계대, 더 바람직하게는 5 계대, 더욱 더 바람직하게는 6 계대, 더욱 더 바람직하게는 7 계대, 보다 더 바람직하게는 10 계대; 최대 50 계대에 걸쳐 일어날 수 있다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 증폭 단계 (ii)는 적어도 1 계대; 최대 50 계대, 바람직하게는 최대 40 계대, 더욱 바람직하게는 최대 30 계대, 더욱 바람직하게는 최대 20 계대, 더욱 바람직하게는 최대 15 계대, 보다 더 바람직하게는 최대 14 계대, 보다 더 바람직하게는 최대 13 계대, 보다 더 바람직하게는 최대 12 계대, 더욱 더 바람직하게는 최대 11 계대, 더욱 더 바람직하게는 최대 10 계대, 더욱 더 바람직하게는 최대 9 계대, 더욱 더 바람직하게는 최대 8 계대, 더욱 더 바람직하게는 최대 7 계대, 및 보다 더 바람직하게는 최대 6 계대에 걸쳐 일어날 수 있다. 본 개시내용에 비추어, 당업자는 임의의 개시된 범위 종점을 조합하는 것을 용이하게 고려할 것이다.
적합한 세포 밀도를 달성하기 위해, 분화 시작 전에 만능 줄기 세포를 시딩할 수 있다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 방법은 단계 (i*) 이전에 시딩 단계를 포함하며, 여기서 상기 만능 줄기 세포는 라미닌 코팅된 플레이트 상에 시딩된다. 또한 시딩 단계에서 사용되는 배지에 ROCK-억제제를 보충하는 것이 도움이 될 수 있다. ROCK-억제제는 본원에 기술된 방법에 적합하게 적용될 수 있는 임의의 ROCK-억제제일 수 있다. 추가의 바람직한 실시양태에서, ROCK-억제제는 Y27632, H-1152P, 티아조비빈, 파수딜, 하이드록시파수딜, GSK429286A 및 RKI-1447로부터 선택되고, 바람직하게는 Y27632, H-1152P, 티아조비빈, 파수딜, 하이드록시파수딜로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 ROCK-억제제는 Y27632 또는 H-1152P이다. 하기 실시예에서 입증된 바와 같이, 특히 유용한 ROCK-억제제 중 하나는 Y27632이다. ROCK-억제제의 유효량의 농도는 해당 억제제의 이용 가능성 및 억제 상수에 따라 달라진다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 예를 들어, Y27632의 경우 시딩 단계에서 사용되는 배지는 1-50 μM, 바람직하게는 2.5-40 μM, 보다 바람직하게는 5-30 μM, 보다 더 바람직하게는 7.5-20 μM, 가장 바람직하게는 8-12 μM, 및 가장 바람직하게는 약 10 μM Y27632를 포함할 수 있다. 임의의 수용체/효소 작용제 또는 억제제의 유효 농도는 각각의 화합물의 이용 가능성 및 생물학적 활성에 따라 달라진다는 것을 이해할 것이다. 당업자는 유효 농도를 결정할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 시딩 단계는 단계 (i*) 72-120시간 전, 보다 바람직하게는 84-108시간 전, 가장 바람직하게는 약 96시간 전에 수행된다.
이전 연구에서는 심외막 세포가 단계적 분화 프로토콜을 사용하여 인간 만능 줄기 세포로부터 분화될 수 있음을 보여주었다(Witty et al. 2014, Iyer et al. 2015, Bao et al. 2016, 및 Bao et al. 2017). 그러나, 개시된 프로토콜 중 어느 것도 심장 간질 세포에 대한 증폭 단계를 포함하지 않으며 조직 공학 목적으로 사용될 수 있는 균질한 심장 간질 세포 집단의 확장 가능한 생산에 적합하지 않은 것으로 보인다. 또한, US 2018/0094245 A1에는 고수율 심장 섬유아세포를 생성하는 방법이 개시되어 있다. 상기 기술된 프로토콜은 화학적으로 정의된 조건 하에서 그리고 그러한 인간 PSC 유래 심장 섬유아세포의 장기간 유지를 위해 인간 만능 줄기 세포로부터 기능성 심장 섬유아세포를 생성한다고 주장하고 있다. 그러나, 여기에 개시된 실험은 적어도 3가지 특징에서 상이하다: 인간 PSC-유래 심장 섬유아세포는 2% FBS의 존재하에 비코팅 플라스틱 플레이트 상에 플레이팅된다. 따라서, 프로토콜은 (1) 무혈청이 아니며 (2) 심장 섬유아세포는 비코팅 플레이트 상에서 배양된다(단락 [0081]). (3) US '245는 심장 섬유아세포가 배양 3일 후에 이미 CD90의 발현을 상실하기 시작하고(도 1a) 분화 프로토콜 과정 동안 CD90의 발현을 완전히 상실한다고 개시한다(도 3c). 그러나, CD90의 발현은 심장에 상주하는 섬유아세포를 분류하기 위해 일반적으로 사용되는 세포 표면 마커이다(Li et al. 2020). 또한, [Li et al.]은 CD90이 결여된 세포는 심장 섬유증에서 병원성 심장 섬유아세포 분획의 일부이며 심부전의 병태생리학에서 발현 CD90의 중요한 역할을 제안한다. 따라서, 세포의 적어도 80%에서 CD90, CD97 및 CD44를 안정적으로 발현하는 본원에서 정의되고 수득된 심장 간질 세포는 생리학적 상태에 있고 조작된 인간 심근(예를 들어 도 6A 참조) 및 비질환 심근 및 결합 조직의 기능적 특성을 갖는 조작된 결합 조직(예를 들어, 도 6B 참조)의 형성을 각각 지원할 수 있는 것으로 간주된다. 이것은 개발된 심장 간질 세포 집단을 약물 개발(예: 항섬유화 약물) 및 조직 조작된 기관 복구에 적용하기 위한 매력적인 공급원으로 만든다. 따라서, 심장 간질 세포의 생산에서 CD90, CD73 및 CD44의 발현은 본원에서 생산되고 본원에서 정의된 바와 같은 세포의 유리한 특징이다.
선행 기술에 개시된 많은 방법과 대조적으로, 본원에 기재된 방법은 무혈청이며 완전히 한정된다. 본원에 개시된 바와 같은 심장 간질 세포는 증폭될 수 있어 심장 간질 세포가 대량 생산될 수 있다. 무혈청 환경에서 수백만 개의 세포를 생산하는 것은 잠재적인 임상 사용 및 예를 들어 약물 개발, 특히 항섬유증 약물 개발에서의 표준화된 연구를 위한 대규모 조작된 심장 근육의 생산에 필수적이며 가장 중요하다. 생산된 심장 간질 세포가 대량으로 생산될 뿐만 아니라 고품질, 즉 균질성으로 생산되는 것이 특히 중요하다. 또한, 이러한 조작된 심장 근육의 대규모 생산을 위해서는 유사하고 재현 가능한 품질과 양의 세포를 생산할 수 있는 방법을 갖는 것이 가장 중요하다. 적어도 6 계대에 걸쳐 심장 간질 세포를 확장하는 능력은 실험 데이터(실시예 2 및 도 2)에 의해 뒷받침된다. 고품질(심장 간질 세포의 높은 균질성)은 실시예 3, 4 및 도 3A, C 및 D의 유세포 분석 데이터에 의해 뒷받침된다. 본원에 개시된 바와 같이 생산된 세포는 유세포 측정법에 의해 결정된 바와 같이 CD90, CD73 및 CD44, 바람직하게는 세포의 적어도 90%를 발현한다(도 3). 또한, 생산된 심장 간질 세포는 심장 간질 세포의 추가 지표인 콜라겐 1 및/또는 비멘틴을 발현할 수도 있다(도 3A). 세포내 프로콜라겐-1의 존재(도 5C)는 생산된 세포가 콜라겐-1을 생산할 수 있는 능력을 가지고 있다는 분명한 신호이다. 프로-콜라겐-1의 생산은 TGFb1 및/또는 안지오텐신 II(ATII)의 적용에 의해 추가로 자극될 수 있으며, 이는 본원에서 생산된 iPSC 유도 심장 간질 세포에 의한 정상적인 병태생리학적 반응을 입증한다. 본원에서 생산된 심장 간질 세포는 또한 특징적인 형태를 나타낸다(도 3B에 나타낸 실시예 3). 심장 간질 세포는 면역형광에 의해 비멘틴과 콜라겐-1을 발현하며 간질 세포의 특징적인 패턴을 보인다. 또한, 심장 간질 세포는 일차 심장 섬유아세포와 비교할 때 마커 CD140a, 비멘틴, 콜라겐-1, CD90, CD73 및 CD44의 유사한 유전자 발현 프로파일을 나타내고 심근 세포와 비교하여 매우 상이한 발현 프로파일을 나타낸다(도 4). 더욱이, 생산된 심장 간질 세포는 예시적으로 RNA-시퀀싱에 의해 결정된 바와 같이 일차 심장 섬유아세포와 RNA 발현 프로파일의 압도적인 중첩을 나타낸다(실시예 6, 도 5A 및 B). 도 5A 및 B의 비교는 또한 다른 유형의 일차 섬유아세포, 즉 피부 섬유아세포 및 치은 섬유아세포를 포함하므로, 본원에서 생산된 심장 간질 세포는 일반적으로 고품질 간질 세포일 뿐만 아니라 섬유아세포 특성을 가진 심장 특이적 간질 세포임이 입증된다. 따라서, 본원에 기술된 방법은 매우 특이적이고 심장 간질 세포를 얻도록 표적화된다.
또한, 본원에서 생산된 심장 간질 세포는 섬유아세포 특성을 나타내며, 이는 프로-콜라겐 생성 능력으로 예시된다(도 5C). 또한, 본원에서 생산된 심장 간질 세포는 조작된 심장 근육 및 조작된 결합 조직에서도 기능한다(도 6A 및 6B). 예를 들어, 도 6A는 본원에서 생성되는 심장 간질 세포를 일차 심장 섬유아세포와 비교한다. 조작된 심장 근육은 필적할만한 힘 생성을 나타내므로 본원에서 생산된 심장 간질 세포는 일차 심장 섬유아세포와 동일하게 조작된 심장 근육의 생성을 지원한다. 물론 본원에서 생산된 심장 간질 세포는 인공적으로 생산될 수 있기 때문에 일차 심장 섬유아세포보다 우수하다. 또한, 본원에 기술된 방법은 만능 줄기 세포가 분화될 수 있고, 이어 질병이 없는 섬유아세포의 특성인 안정한 표현형 및 지속적인 CD90 발현으로 개시된 방법으로 확장될 수 있기 때문에 이러한 심장 간질 세포를 대량 생산할 수 있다(Li et al. 2020).
본원에 기술된 방법의 특장점은 무혈청 한정 프로토콜이 또한 심장 간질 세포의 GMP 준수 생성을 제공한다는 것이다. GMP(Good Manufacturing Practices)는 의약품 및 의료 기기의 제조 및 판매에 대한 승인 및 허가를 통제하는 기관에서 권장하는 지침을 준수하기 위해 필요한 관행이다. 이 가이드라인은 제조업체가 의도한 용도에 대해 배치마다 제품의 품질이 지속적으로 우수함을 보장하기 위해 제조업체가 충족해야 하는 최소 요구 사항을 제공한다. 본원에 설명된 방법은 배치마다 다를 수 있거나 다른 오염 물질을 포함할 수 있는 혈청 또는 미한정 플레이트 코팅에 의존하지 않는다. 따라서, 본원에 개시된 방법은 GMP 공정으로 용이하게 이전될 수 있고 이는 본원에 개시된 방법의 또 다른 이점을 제공한다.
본원에 기술된 방법은 심장 간질 세포가 자발적으로 근섬유아세포로 전환하는 경향이 있기 때문에 추가 개선될 수 있다. 그러나, 심장 간질 세포가 근섬유아세포로 전환되면 심장 간질 세포의 대량 생산이 억제된다. 즉, 일부 심장 간질 세포가 근섬유아세포로 전환되면 심장 간질 세포의 증식 감소가 동반될 수 있다. 근섬유 아세포는 콜라겐 침착, 기질 리모델링 및 흉터 형성과 같은 과정에 관여한다. 따라서, 심장 간질 세포가 근섬유아세포로 전환되는 것을 억제하는 것이 유리하다. 전환의 징후는 알파 평활근 액틴(aSMA)을 포함하는 스트레스 섬유의 형성이다. 전환은 전형적으로 섬유아세포가 배양될 때 어느 정도 발생하며, 전환을 위한 자극은 내인성 TGFb1 생산이다. 따라서, 알파 평활근 액틴(aSMA) 발현은 심장 간질 세포에서도 발견되며 외인성 공급 TGFb1 하에서 상당히 증가한다(도 5C 참조).
예를 들어 붉은털원숭이 iPSC 유래 심장 간질 세포는 특히 근섬유아세포로 전환하는 경향이 강해 상기 iPSC가 분화되고 증폭되었을 때 전환 정도가 인간 iPSC 유래 심장 간질 세포보다 훨씬 강하였다. 심장 간질 세포가 근섬유아세포로 자발적으로 전환되는 것을 방지하기 위해, 본 발명자들은 TGF베타 억제제가 전환 정도를 감소시킬 수 있다는 가설을 세웠다.
단계 (i) a2) 및/또는 (ii)의 무혈청 기본 배지는 유효량의 TGF베타 억제제를 추가로 포함할 수 있다. 특히, 유효량의 TGF베타 억제제는 심장 간질 세포의 근섬유아세포로의 전환을 감소시킬 수 있으며, 바람직하게는 근섬유아세포의 존재는 웨스턴 블롯 또는 유세포 분석법에서 평활근 액틴(α-SMA)의 증가된 발현에 의해 검출가능하다. 예를 들어, 도 5C는 평활근 액틴의 증가된 발현을 보여준다. 즉, 유효량의 TGF베타 억제제는 심장 간질 세포의 집단과 비교하여 심장 간질 세포의 근섬유아세포로의 전환을 감소시키며, 여기서 TGF베타 억제제는 단계 (i) a2) 및/또는 단계 (ii)의 배지 내에 포함되지 않는다. 예를 들어, 근섬유아세포는 예를 들어 도 5C에 도시된 바와 같이 웨스턴 블롯에서 알파 평활근 액틴(α-SMA)의 증가된 발현에 의해 검출될 수 있다. 대체 검출 방법은 알파 평활근 액틴에 대한 유세포 분석일 수 있다(도 9C). TGF베타 억제제가 단계 (i) a2) 및/또는 단계 (ii)에 공급된 배지 내에 포함되는 경우 α-SMA의 발현은 TGF베타 억제제가 배지 내에 포함되지 않은 심장 간질 세포의 집단과 비교하여 적어도 1.5배, 보다 바람직하게는 2배, 보다 바람직하게는 2.5배, 보다 더 바람직하게는 3배, 보다 더 바람직하게는 4배 및 보다 더 바람직하게는 적어도 5배, 및 최대 100배 만큼 감소한다. 물론, 당업자는 일반적으로 항체가 α-SMA에 특이적으로 결합하는 것을 보장하기 위한 품질 관리 조치뿐만 아니라 웨스턴 블롯을 수행하는 방법을 알고 있다. 또한, α-SMA에 대한 항체는 예컨대 Sigma로부터 상업적으로 이용 가능하다. α-SMA에 대한 하나의 예시적인 항체는 단클론 항-액틴, α-평활근, Sigma제 클론 1A4일 수 있다. 특히, 세포 추출물이 니트로셀룰로스 막으로 옮겨질 수 있다. 당업자는 일차 항체 종에 대해 반응성인 적합한 이차 항체를 알고 있다. 예를 들어, 클론 1A4를 사용하는 경우 이차 항체는 항마우스 항체가 된다.
마지막으로, 이차 항체는 예를 들어 SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate(Thermo Scientific) 및 ChemiDoc MP Imaging System(Bio-Rad)을 사용하여 검출할 수 있다. 그러나, 당업계에 알려진 바와 같이 임의의 적합한 기질 및 이미징 시스템이 사용될 수 있다.
TGF베타 억제제를 추가하면 근섬유아세포로의 자발적 전환 정도가 상당히 감소하였다. 상기 효과는 스트레스 섬유의 감소로 나타났다(도 9A 및 B). 당업자는 예를 들어 [Driesen et al. CVR 2014]에 기술된 바와 같이 명시야 현미경 하에서 스트레스 섬유를 검출하는 방법을 용이하게 알고 있다. 구체적으로, 유효량의 TGF베타 억제제는 단계 (i) a2) 및/또는 단계 (ii) 동안 스트레스 섬유를 나타내는 세포의 백분율을 감소시킬 수 있고 TGF베타 억제제가 없는 심장 간질 세포 집단과 비교하여 증식을 증가시킬 수 있으며, 바람직하게는 여기서 스트레스 섬유는 광학 현미경으로 세포의 형태에 의해 검출가능하고, 더 바람직하게는 스트레스 섬유를 나타내는 세포의 백분율은 TGF베타 억제제가 배지 내에 포함되지 않은 심장 간질 세포의 집단과 비교하여 적어도 20%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 보다 더 바람직하게는 적어도 60% 및 최대 100% 만큼 감소된다.
근섬유아세포의 알파 평활 액틴 발현 감소는 유세포 측정법에 의해 추가로 확인될 수 있다. 유효량의 TGF베타 억제제는 TGF베타 억제제가 배지 내에 포함되지 않은 심장 간질 세포 집단과 비교하여 단계 (i) a2) 및/또는 단계 (ii) 동안 세포에서 알파 평활 액틴 발현의 평균 형광을 감소시킬 수 있다(도 9C). 일반적으로, 항원의 발현은 세포 집단의 평균 형광과 관련이 있다.
특히, 유효량의 TGF베타 억제제는 배지 내에 TGF베타 억제제가 포함되지 않은 심장 간질 세포 집단과 비교하여 단계 (i) a2) 및/또는 단계 (ii) 동안 알파 평활근 액틴의 발현을 감소시킬 수 있다. 특히, 알파 평활근 액틴의 발현은 유세포 분석법으로 측정한 세포의 평균 형광 강도로 검출할 수 있다. 물론, 당업자는 표준 방법 및 소프트웨어에 의해 세포 집단의 평균 형광 강도를 결정하기 위한 표준 방법을 알고 있다. 간략하게, 당업자는 항체, 예를 들어 형광 표지된 항-알파 평활근 액틴 항체 또는 일차 항-알파 평활근 액틴 항체 및 이차 형광 표지된 항체로 상기 항원을 형광 표지함으로써 항원, 예를 들어 알파 평활근 액틴의 발현을 결정한다. 예를 들어, 항-액틴, α-평활근 항체, 마우스 단클론, 클론 1A4, Sigma의 카탈로그 번호 #A5228이 일차 항체로 사용될 수 있다. 적합한 예시적인 이차 항체는 염소 항-마우스 IgG (H+L) 고도 교차 흡착 이차 항체, Alexa Fluor 488, 카탈로그 번호 # A-11029(Sigma제)일 수 있다. TGF베타 억제제가 배지 내에 포함되지 않은 심장 간질 세포 집단과 비교하여 평균 형광 강도가 적어도 5%, 보다 바람직하게는 적어도 10%, 보다 바람직하게는 적어도 20%, 보다 바람직하게는 적어도 30%, 보다 바람직하게는 적어도 40%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 60%, 보다 더 바람직하게는 적어도 70% 만큼 감소하는 것이 바람직하다. 도 9C에 나타낸 바와 같이, 배지에 TGF베타 억제제를 첨가하면 평균 형광 강도가 약 80% 감소한다.
또한, 계대 2, 3 및 4 동안 세포의 집단 배가 수준(PDL)으로 분석된 심장 간질 세포의 증식은 TGF베타 억제제가 없는 경우보다 TGF베타 억제제가 있는 경우에 유의하게 더 높았다(도 9D). 일반적으로, 집단 배가 수준(PDL)은 주어진 집단의 세포가 시험관내 배양 동안, 예를 들어 여러 계대에 걸쳐 배가된 총 횟수이다. 첨가되는 경우, TGF베타 억제제는 본원에 기재된 바와 같은 방법에서 단계 (i) a2) 및/또는 (ii)에서 심장 간질 세포의 증폭을 상당히 안정화시킬 수 있다. 예를 들어, 유효량의 TGF베타 억제제는 배지 내에 TGF베타 억제제가 포함되지 않은 심장 간질 세포 집단과 비교하여 단계 (i) a2) 및/또는 단계 (ii) 동안 집단 배가 수준(PDL)을 증가시킨다. 예를 들어, PDL의 증가는 TGF베타 억제제가 배지 내에 포함되지 않은 심장 간질 세포 집단과 비교하여 적어도 1.25배, 보다 바람직하게는 1.5배, 보다 바람직하게는 1.75배, 보다 더 바람직하게는 2배, 보다 더 바람직하게는 2.5배, 보다 더 바람직하게는 3배, 및 보다 더 바람직하게는 3.5배 및 최대 20배일 수 있다. 당업자는 상업적 출처로부터의 TGF베타 억제제를 알고 있다. 특히, (TGF-β) I형 수용체/ALK5 억제제가 바람직하다. 예를 들어, TGF베타 억제제는 SB431542, RepSox, LY2157299, A83-01, 및 트라닐라스트(Tranilast)로 이루어진 목록에서 선택될 수 있다. 특히, TGF베타 억제제는 SB431542일 수 있다.
또한, 단계 (i) a2) 및/또는 단계 (ii)에서 무혈청 배지는 1-100 μM SB431542, 바람직하게는 2-90 μM, 보다 바람직하게는 3-80 μM, 보다 더 바람직하게는 4-70 μM, 보다 더욱 바람직하게는 5-50 μM, 보다 바람직하게는 6-40 μM, 보다 바람직하게는 7-30 μM, 보다 바람직하게는 8-20 μM, 가장 바람직하게는 9-15 μM, 및 보다 가장 바람직하게는 약 10 μM SB431542의 최종 농도를 추가로 포함할 수 있다.
만능 줄기 세포는 포유동물 만능 줄기 세포일 수 있다. 특히, 만능 줄기 세포는 영장류 만능 줄기 세포일 수 있으며, 바람직하게는 만능 줄기 세포는 비인간 영장류 또는 인간 줄기 세포일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 만능 줄기 세포는 영장류 만능 줄기 세포이고, 보다 더 바람직하게는 만능 줄기 세포는 붉은털원숭이 또는 인간 만능 줄기 세포이다. 붉은털원숭이 만능 줄기 세포는 특히 근섬유아세포로 전환하는 경향이 강하기 때문에, 예를 들어 도 9에서 사용되었다.
본원에서 입증된 바와 같이, 영장류 심장 간질 세포, 특히 인간 심장 간질 세포는 본원에 개시된 방법에 의해 수득될 수 있다. 또한, TGF베타 억제제의 존재는 많은 스트레스 섬유의 존재로 나타날 수 있는 근섬유아세포로 전환하는 경향이 증가하는 인간 세포에서 유용할 수 있다.
유리하게는, 배지에 TGF베타 억제제의 첨가는 세포 안정성을 추가로 개선하기 위한 선택적 단계이다. 특히, TGF베타 억제는 근섬유아세포로의 전환율을 감소시킨다. 실시예 8은 전환 경향이 특히 강한 붉은털원숭이 세포에 TGF베타 억제제를 첨가한 효과를 보여준다. 상기 첨가는 원칙적으로 인간에게도 유용하며, 특히 자발적인 섬유아세포-근섬유아세포 전환이 증가된 경우 특히 유용하다.
또 다른 측면에서, 분리된 심장 간질 세포 집단이 제공되며, 여기서 심장 간질 세포는 만능 줄기 세포의 분화에 의해 얻어지고 심장 간질 세포 집단의 세포 중 적어도 약 80%가 CD90, CD73 및 CD44를 발현한다. 위에서 언급한 바와 같이, 상기 마커의 발현은 유세포 측정법에 의해 결정되는 바와 같이 심장 간질 세포의 존재에 대한 지표이다.
일 실시양태에서, 유세포 분석법으로 결정된 바와 같이, 심장 간질 세포 집단의 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 81%, 보다 바람직하게는 적어도 82%, 보다 더 바람직하게는 적어도 83%, 보다 더 바람직하게는 적어도 84%, 보다 더 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 86%, 보다 더 바람직하게는 적어도 87%, 보다 더 바람직하게는 적어도 88%, 보다 더 바람직하게는 적어도 89%, 및 가장 바람직하게는 적어도 90%가 D44를 발현하고;
심장 간질 세포 집단의 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 81%, 보다 바람직하게는 적어도 82%, 보다 더 바람직하게는 적어도 83%, 보다 더 바람직하게는 적어도 83%, 보다 더 바람직하게는 적어도 84%, 보다 더 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 86%, 보다 더 바람직하게는 적어도 87%, 보다 더 바람직하게는 적어도 88%, 보다 더 바람직하게는 적어도 89%, 및 가장 바람직하게는 적어도 90%가 CD90을 발현하고/거나;
심장 간질 세포 집단의 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 81%, 보다 바람직하게는 적어도 82%, 보다 더 바람직하게는 적어도 83%, 보다 더 바람직하게는 적어도 84%, 보다 더 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 86%, 보다 더 바람직하게는 적어도 87%, 보다 더 바람직하게는 적어도 88%, 보다 더 바람직하게는 적어도 89%, 및 가장 바람직하게는 적어도 90%가 CD73을 발현한다. 심장 간질 세포에서 CD44, CD73 및 CD90의 발현에 대한 예시적인 데이터는 도 3A, C 및 D에 제공된다.
보다 바람직한 실시양태에서, 유세포 분석법으로 결정된 바와 같이, 심장 간질 세포 집단의 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 81%, 보다 바람직하게는 적어도 82%, 보다 더 바람직하게는 적어도 83%, 보다 더 바람직하게는 적어도 84%, 보다 더 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 86%, 보다 더 바람직하게는 적어도 87%, 보다 더 바람직하게는 적어도 88%, 보다 더 바람직하게는 적어도 89%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 보다 더 바람직하게는 적어도 91%, 보다 더욱 적어도 92%, 보다 더 바람직하게는 적어도 93%, 보다 더 바람직하게는 적어도 94%, 보다 더 바람직하게는 적어도 95%, 보다 더 바람직하게는 적어도 96%, 보다 더 바람직하게는 적어도 97%, 보다 더 바람직하게는 적어도 98%가 비멘틴을 추가로 발현한다.
유세포 분석법으로 결정된 바와 같이, 심장 간질 세포 집단의 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 81%, 보다 바람직하게는 적어도 82%, 보다 더 바람직하게는 적어도 84%, 보다 더 바람직하게는 적어도 86%, 보다 더 바람직하게는 적어도 88%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 보다 더 바람직하게는 적어도 91%, 보다 더 바람직하게는 적어도 92%, 보다 더 바람직하게는 적어도 93%, 보다 더 바람직하게는 적어도 94%, 보다 더 바람직하게는 적어도 95%, 보다 더 바람직하게는 적어도 96%, 및 가장 바람직하게는 적어도 97%가 추가로 콜라겐 1을 발현하는 것이 구상된다.
도 3에 도시된 예시적인 세포는 심장 간질 세포가 5개의 마커 CD90, 비멘틴, 콜라겐 1, CD44 및 CD73 모두를 동시에 발현할 수 있음을 입증한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 심장 간질 세포 집단의 약 95% 이상이 CD90 양성이고; 약 99% 이상이 CD44 양성이고; 약 99% 이상이 CD73 양성이고; 약 97% 이상이 콜라겐 1 양성이고; 약 98% 이상이 비멘틴 양성이다.
바람직한 실시양태에서, 심장 간질 세포 집단은 본원에 개시된 방법에 의해 얻어진다. 분리된 심장 간질 세포 집단의 실험 데이터가 도 3에 나와 있다. 또한, 집단은 본원에 개시된 방법에 의해 정의된 방법으로 얻을 수 있는 것이 바람직하다. 또한, 집단은 본원에 정의된 바와 같은 방법에 의해 수득되는 것이 구상된다.
또한, 심장 간질 세포 집단은 무혈청 방법으로 얻어질 수 있다. 상기 방법은 단계 (ii)와 같이 본원에 개시된 바와 같은 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다. 이상적으로는, 무혈청 및 무-매트리겔 방법으로 집단이 얻어질 수 있다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 매트리겔은 Engelbreth-Holm-Swarm(EHS) 마우스 육종 세포에 의해 분비되는 미한정 단백질 혼합물이다. 대안적으로, 집단은 하나 이상의 개별 세포외 기질 단백질과 같은 한정된 물질에만 의존하는 무혈청 방법에 의해 얻어질 수 있다.
본원에 정의된 바와 같은 심장 간질 세포 집단의 이점은 집단 세포의 적어도 약 80%가 CD90, CD73 및 CD44를 발현한다는 것이다. 상기 집단은 정제 단계를 포함하지 않는 방법에 의해 얻어질 수 있다. 상기 정제 단계는 항체 보조 정제 단계일 수 있다. 상기 방법은 항체 보조 정제 단계, 바람직하게는 세포 분류에 의한 항체 보조 정제, 보다 바람직하게는 CD105, CD90, CD44 및/또는 CD73에 대한 세포 분류에 의한 항체 보조 정제, 보다 더 바람직하게는 CD105에 대한 세포 분류에 의한 항체 보조 정제를 포함하지 않는 것이 바람직하다. 물론, 당업자는 FACS(Fluorescence-activated Cell Sorting)와 같은 세포 분류 방법을 알고 있다.
또 다른 측면에서, 본원에 정의된 바와 같은 심장 간질 세포의 분리된 집단을 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함하는 것이 바람직하다.
또 다른 측면에 따르면, 조작된 기관 조직이 기술되며, 상기 기관 조직은 본원에 정의된 바와 같거나, 본원에 개시된 방법에 의해 수득된 바와 같은 심장 간질 세포 집단을 포함한다. 바람직하게는 상기 조작된 기관은 조작된 인간 기관일 수 있다. 일반적으로, 본원에 개시된 바와 같은 심장 간질 세포는 인체의 임의 기관의 생성을 지원할 수 있다. 인간 심근 또는 인간 결합 조직과 같은 인간 조직의 시험관내 생산이 바람직하다. 결합 조직은 상피 조직, 근육 조직 및 신경 조직과 함께 동물 조직의 네 가지 기본 유형 중 하나이다. 결합 조직은 신경계를 포함하여 인체의 모든 곳에서 다른 조직 사이에서 발견된다. 예를 들어, 본원에서 얻은 심장 간질 세포는 임상 및 연구를 위해 본 발명자들에 의해 일차 섬유아세포로 이전에 입증된 바와 같은 프로토콜(Zimmermann et al. 2006, Dworatzek et al. 2019, Santos et al. 2019, Schlick et al. 2019)에 따라 조작된 결합 조직의 시험관내 생산에 사용될 수 있다(ECT; 도 6B의 실험 데이터에 의해 뒷받침됨). 대안적으로, 도 6A는 본원에서 생산된 심장 간질 세포가 조작된 심장 근육(인간 심근)의 형성을 지원한다는 실험 데이터를 제공한다.
추가 측면에서, 약물 스크리닝을 위한 시험관내 모델에서 본원에 개시된 바와 같은 방법에 의해 수득가능하고/거나 수득된 심장 간질 세포(cStC) 집단의 용도가 기재된다. 예를 들어, 약물의 독성 및/또는 효능이 생체외에서 시험될 수 있다. 예를 들어, 물질/약물은 TGFb1- 및 BMP-신호전달 조절제, 레닌-안지오텐신-알도스테론 시스템(RAAS; 예컨대 안지오텐신 전환 효소 억제제 또는 안지오텐신 1형 수용체 차단제) 조절제 및 코르티코이드와 같은 ECM 품질 및 양을 변경할 수 있다. 조작된 조직(ECT를 예로 들 수 있으나 이에 제한되지 않음)에서 cStC 유래 ECM의 변경은 영률의 증가 또는 감소와 같이, 각각의 조작된 조직 점탄성 특성의 변화를 초래한다. 조작된 조직의 모듈러스는 예를 들어 플레이트-콘 전단 유동 측정법(Schlick et al. 2019) 또는 응력-변형 분석(Santos et al. 2019)을 사용하여 본 발명자들에 의해 입증된 바와 같이 측정될 수 있다. 생체내 모델에 상기 약물을 사용하기 전에 약물의 효능 및/또는 독성을 스크리닝하는 능력은 여러 약물을 동시에스크리닝할 수 있고 여러 투여 요법을 용이하게 평가할 수 있기 때문에 분명한 이점이 있다. 따라서, 본 개시내용은 또한 약물 효능 스크리닝을 위한 시험관내 모델에서 심장 간질 세포의 용도에 관한 것이다. 그러한 약물 효능 스크리닝의 결과는 또한 상기 실험 약물이 생체내 시스템에서 시험되기 전에 약물 개발에 통지될 수 있다. 또, 약물 독성 스크리닝을 위한 시험관내 모델에서 심장 간질 세포의 용도가 또한 본원에 개시되어 있다. 예를 들어, 고용량의 약물은 독성을 증가시킬 수 있으며, 이는 시험관내 모델에서 심장 간질 세포를 사용하여 시험관내에서 용이하게 시험할 수 있다. 독성은 배양 시 사멸 세포의 비율로 용이하게 평가할 수 있다. 특히, 본원에서 사용되는 심장 간질 세포를 사용함으로써 항섬유성 약물 개발로 이어질 수 있다.
또한, 조작된 기관 조직의 시험관내 생산에서 본원에 정의된 바와 같거나, 본원에 개시된 방법에 의해 수득된 심장 간질 세포 집단의 용도가 본원에 기재되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 조작된 기관 조직은 인간의 조작된 기관 조직이고, 바람직하게는 조작된 인간 조직은 조작된 인간 심근이다. 다른 실시양태에서, 조작된 기관 조직은 인간의 조작된 기관 조직이고, 바람직하게는 조작된 기관 인간 조직은 조작된 인간 결합 조직이다. 본원에 정의된 바와 같거나, 본원에 개시된 방법에 따른 방법에 의해 수득된 심장 간질 세포 집단이 연구 도구로서 사용될 수 있는 것이 또한 구상된다.
일반적으로, 본원에 정의된 바와 같거나, 본원에 개시된 방법에 의해 수득된 심장 간질 세포의 집단은 또한 의약에 사용하기에 적합하다. 본원에 정의된 바와 같거나, 본원에 개시된 방법에 의해 수득된 심장 간질 세포 집단은 기관 복구, 바람직하게는 심장 복구 또는 연조직 복구, 보다 바람직하게는 심장 복구에 사용될 수 있다. 단지 예로서, 상기 심장 간질이 심장 복구에 유리하게 사용될 수 있는 것이 구상된다. 예를 들어, 심장 간질 세포는 심부전 환자에게 사용될 수 있는 조작된 심장 근육을 생산하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 도 6A는 조작된 인간 심근에서 심장 간질 세포의 사용을 보여준다. 심장 간질 세포의 사용을 위한 또 다른 적용은 연조직 복구일 수 있다. 연조직은 뼈와 치아와 같이 골화나 석회화 과정에 의해 경화되지 않은 신체의 모든 조직이다. 연조직은 내부 기관과 뼈를 연결하거나, 둘러싸거나 지지하며, 근육, 힘줄, 인대, 지방, 섬유 조직, 피부, 림프 및 혈관, 근막 및 윤활막을 포함한다. 연조직 복구 과정에서, 당업자는 연조직 복구를 지원하기 위한 여러 접근법을 알고 있다. 예를 들어 [Wehrhan et al. (2010)]은 재건 수술 후 진피 대체물로서 소 콜라겐 막의 적합성을 설명하였다. 조작된 결합 조직(ECT)을 포함하는 StC가 이식 부위 안정화 또는 확대를 통해 연조직 결함을 지원하기 위해 유사하게 적용될 수 있다. 이는 ECT를 포함하는 비수축성 일차 간질 세포가 심부전 래트 모델에서 질병 진행을 지연시키기 위해 적용될 수 있음을 보여주는 발명자들의 데이터에 의해 예시된다(Zimmermann et al. 2006). ECT의 적용은 심장에 국한되지 않고 (Wehrhan et al. 2010)에서 발명자가 제안한 것과 유사하게 비심장 조직에서, 또는 외상 후 또는 방사선 조사로 인한 조직 손상과 같은 상태에서 연조직 손실을 대체하기 위해 적용될 수도 있다. 예를 들어 본원의 도 6B에 도시된 바와 같이 조작된 결합 조직의 생성과 유사하게, 본원에 정의되거나 본원에 개시된 방법에 의해 수득된 심장 간질 세포는 또한 생체내 연조직의 복구를 지원하는 것으로 예상된다. 교원질 막과 비교하여 이러한 세포화된 조직의 장점은 조작된 연조직을 포함하는 StC가 상처 치유/복구를 촉진하여 연조직 복구를 지원하기 위해 이식 후 추가적인 영양 및 ECM 인자를 통합하고 생성하여 연조직을 지지하는 능력을 가진 StC로 구성된 생존 가능한 조직을 나타낸다는 것이다. 이러한 연조직 복구를 위한 응용 분야는 피부과, 외과, 치과, 예를 들어 개방 치경부를 위한 잇몸 구조를 지지하는 것일 수 있다.
추가 측면에서, 심장 간질 세포의 증폭에 적합한 무혈청 세포 배양 배지가 기술되며, 상기 배지는 (a) 무혈청 기본 배지, (b) 10-200 ng/ml FGF2, (c) 5-100 ng/ml VEGF, (d) 0.2-20 mM 글루타민, 및 (e) 1.5-180 μg/ml 아스코르브산, 2-50 μg/ml 인슐린, 1.1-27.5 μg/ml 트랜스페린, 1660-41500 μg/ml 알부민, 및 11-145 nM 셀레늄을 포함하는 ECCM 보충제를 포함한다. 본원에 기재된 방법의 단계 (ii)에 예시된 바와 같이, 상기 배지는 심장 간질 세포가 심장 간질 세포의 적어도 80%에서 CD44, CD73 및 CD90의 발현을 유지하는 한 심장 간질 세포를 무한정 증폭시키는 데 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 기본 배지는 KO DMEM, DMEM, DMEM/F12, RPMI, IMDM, 알파MEM, 배지 199, Hams F-10, 또는 Hams F-12이고, 바람직하게는 기본 배지는 KO DMEM이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 15-100 ng/ml FGF2, (바람직하게는 20-80 ng/ml, 보다 더 바람직하게는 30-70 ng/ml, 가장 바람직하게는 40-60 ng/ml, 및 가장 바람직하게는 약 50 ng/ml);
7-50 ng/ml VEGF, (바람직하게는 10-40 ng/ml, 보다 더 바람직하게는 15-35 ng/ml, 가장 바람직하게는 20-30 ng/ml, 및 가장 바람직하게는 약 25 ng/ml); 및/또는
0.2-20 mM 글루타민, 바람직하게는, 0.5-10 mM 글루타민, 보다 바람직하게는 0.75-5 mM 글루타민, 보다 더 바람직하게는 1-3 mM 글루타민, 보다 더 바람직하게는 1.5-2.5 mM 글루타민, 및 가장 바람직하게는 약 2 mM 글루타민의 최종 농도를 포함한다. 예를 들어, 글루타민은 L-알라닐-L-글루타민 디펩티드와 같은 생체 이용 가능한 형태로 포함될 수 있다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 ECCM 보충제를 포함하며, 여기서 ECCM은 기본 배지에서 10-80 μg/ml 아스코르브산, 4-40 μg/ml 인슐린, 2-20 μg/ml 트랜스페린, 3200-30000 μg/ml 알부민, 및 11-145 nM 셀레늄의 최종 농도를 제공하도록 제형화된다.
ECCM 보충제가 기본 배지에 15-60 μg/ml 아스코르브산, 5-30 μg/ml 인슐린, 3-12.5 μg/ml 트랜스페린, 4800-20000 μg/ml 알부민 및 20-105 nM 셀레늄의 최종 농도를 제공하도록 제형화되는 것이 특히 바람직하다. ECCM 보충제가 기본 배지에 27-40 μg/ml 아스코르브산, 7-15 μg/ml 인슐린, 4.5-7 μg/ml 트랜스페린, 7500-9200 μg/ml 알부민 및 30-50 nM 셀레늄의 최종 농도를 제공하도록 제형화되는 것이 더 바람직하다. ECCM 보충제가 기본 배지에 30-36 μg/ml 아스코르브산, 9-11 μg/ml 인슐린, 5-6 μg/ml 트랜스페린, 8000-8600 μg/ml 알부민 및 35-45 nM 셀레늄의 최종 농도를 제공하도록 제형화되는 것이 보다 더 바람직하다. ECCM 보충제가 기본 배지에 약 33 μg/ml 아스코르브산, 약 10 μg/ml 인슐린, 약 5.5 μg/ml 트랜스페린, 약 8300 μg/ml 알부민 및 약 40.5 nM 셀레늄의 최종 농도를 제공하도록 제형화되는 것이 보다 더욱 바람직하다.
ECCM 보충제가 적절한 농도의 글루타티온 및 미량 원소를 추가로 포함하는 것이 또한 구상된다. 예를 들어, ECCM은 표 2에 열거된 물질을 포함한다. 배양 배지가 표 2에 명시된 바와 같이 5-20% (v/v) ECCM, 보다 바람직하게는 6-17.5% (v/v), 보다 바람직하게는 7-15% (v/v), 보다 바람직하게는 8%-12% (v/v), 보다 바람직하게는 9%-11% (v/v), 및 가장 바람직하게는 약 10% (v/v) ECCM을 포함하는 것이 추가로 예상된다. 바람직한 실시양태에서, 배지는 위 또는 아래의 임의의 실시양태에서 정의된 바와 같은 ECCM을 포함한다.
또한, 무혈청 기본 배지가 제공되며, 여기서 배지는 약 2 mM 글루타민, 약 50 ng/ml FGF, 약 25 ng/ml VEGF 및 약 1 μM CHIR, 및 6.6-165 μg/ml 아스코르브산, 2-50 μg/ml 인슐린, 1.1-27.5 μg/ml 트랜스페린, 1660-41500 μg/ml 알부민, 및 11-145 nM 셀레늄을 포함하는 ECCM 보충제를 포함하는 녹아웃 DMEM 배지이다. 바람직한 실시양태에서, 배지는 위 또는 아래의 임의의 실시양태에서 정의된 바와 같은 ECCM을 포함한다.
마지막으로, 무혈청 기본 배지가 제공되며, 여기서 무혈청 기본 배지는 약 2 mM 글루타민, 약 50 ng/ml FGF, 약 25 ng/ml VEGF, 및 6.6-165 μg/ml 아스코르브산, 2-50 μg/ml 인슐린, 1.1-27.5 μg/ml 트랜스페린, 1660-41500 μg/ml 알부민, 및 11-145 nM 셀레늄을 포함하는 ECCM 보충제를 포함하는 녹아웃 DMEM 배지이다. 바람직한 실시양태에서, 배지는 위 또는 아래 임의의 실시양태에서 정의된 바와 같은 ECCM을 포함한다.
본 발명이 하기 실시양태에 의해 추가로 설명된다:
1. 만능 줄기 세포로부터 심장 간질 세포의 집단을 생산하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:
i. 만능 줄기 세포의 분화에 의해 수득된 윌름스 종양 항원(WT-1)을 발현하는 심외막 세포의 상피-중간엽 전이를 유도하는 단계 - 여기서 상피-중간엽 전이를 유도함으로써 심외막 세포가 심장 간질 세포로 분화되고, 여기서 상피-중간엽 전이를 유도하는 것은 a1) 상기 심외막 세포를 무혈청 기본 배지에서 제1 세포외 기질 단백질의 존재하에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계; 이어서 a2) 단계 (i) a1)의 세포를 무혈청 기본 배지에서 제2 세포외 기질 단백질의 존재하에 적합한 조건 하에 배양하는 단계를 포함하고; 여기에서 수득된 심장 간질 세포 집단의 세포 중 적어도 약 80%는 CD90, CD73 및 CD44를 발현함 -; 및
ii. 상기 단계 (i)의 심장 간질 세포 집단을 무혈청 기본 배지에서 적어도 하나의 제3 세포외 기질 단백질의 존재하에 배양함으로써 상기 심장 간질 세포의 수를 증폭시키는 단계 - 상기 심장 간질 세포 집단의 세포 중 적어도 약 80%는 청구범위에 정의된 바와 같이 CD90, CD73 및 CD44의 발현을 유지함 -.
2. 실시양태 1의 방법에 있어서, 단계 (ii)는 유세포 측정법을 사용하여 CD90, CD73 및 CD44의 적어도 80%의 유지된 발현에 의해 측정된 바와 같이 심장 간질 세포 집단을 안정적으로 증폭시키는, 방법.
3. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 단계 (i) a1)에서 제1 세포외 기질 단백질은 기질 상에 고정된 형태로 제공되고/되거나 단계 (i) a2)에서 제2 세포외 기질 단백질은 기질 상에 고정된 형태로 제공되는, 방법.
4. 전술한 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 단계 ii)에서 적어도 하나의 제3 세포외 기질 단백질은 기질 상에 고정된 형태로 제공되는, 방법.
5. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 단계 (i) a1), 단계 (i) a2)에서의 세포 배양, 및/또는 단계 (ii)에서 상기 심장 간질 세포의 상기 집단의 배양은 현탁 배양으로 수행되는, 방법.
6. 실시양태 5에 있어서, 단계 (i) a1)에서 제1 세포외 기질 단백질은 가용성 형태로 현탁 배양에 제공되고/되거나, 제2 세포외 기질 단백질은 단계 (i) a2에서 가용성 형태로 현탁 배양에 제공되고, 바람직하게는 제1 및 제2 세포외 기질 단백질은 단계 (i) a1) 및 (i) a2)에서 가용성 형태로 제공되는, 방법.
7. 실시양태 5 또는 6에 있어서, 단계 (ii)에서 적어도 하나의 제3 세포외 기질 단백질은 가용성 형태로 현탁 배양에 제공되는, 방법.
8. 전술한 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 배양 단계 (i) a1)은 6일 이하, 바람직하게는 5일 이하 또는 4일 이하 동안 수행되는, 방법.
9. 실시양태 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 배양 단계 (i) a1)은 2-8일, 바람직하게는 2.5-7일, 보다 바람직하게는 3-6일, 보다 더 바람직하게는 3.5-5일 및 가장 바람직하게는 대략 4일 동안 수행되는, 방법.
10. 실시양태 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 배양 단계 (i) a2)는 12 내지 19일의 기간, 바람직하게는 13 내지 17일의 기간 동안 수행되는, 방법.
11. 실시양태 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 배양 단계 (i) a2)는 10-20일, 바람직하게는 11-19일, 보다 바람직하게는 12-18일, 보다 바람직하게는 13-17일, 보다 더 바람직하게는 14-16일 및 가장 바람직하게는 대략 15일 동안 수행되는, 방법.
12. 전술한 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i) a1)에 의해 생산된 세포의 적어도 50%는 CD90을 발현하고, 바람직하게는 상기 발현은 유세포 분석에 의해 결정되는, 방법.
13. 실시양태 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i) a1)의 무혈청 기본 배지는 유효량의 (a) FGF2, (b) 혈관 내피 성장 인자(VEGF), (c) 글루타민 및 (d) GSK-3 억제제를 포함하고, 여기서 상기 양은 단계 (i) a1)에 의해 수득된 세포의 적어도 50%에서 CD90의 발현, 단계 (i) a1)에 의해 수득된 세포의 최대 50%에서 CD73의 발현, 및 단계 (i) a1)에 의해 수득된 세포의 최대 30%에서 CD44의 발현을 초래하는, 방법.
14. 전술한 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i) a2)의 무혈청 기본 배지는 유효량의 (a) FGF2, (b) 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 및 (c) 글루타민을 포함하고, 여기서 상기 양은 단계 (i) a2)에 의해 수득된 상기 심장 간질 세포 집단의 적어도 80%에서 CD90, CD73 및 CD44의 발현을 초래하는, 방법.
15. 전술한 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 단계 ii)의 무혈청 기본 배지는 유효량의 (a) FGF2, (b) VEGF, 및 (c) 글루타민을 포함하고, 여기서 단계 (ii)의 상기 양은 심장 간질 세포의 수를 증폭시키기에 효과적인, 방법.
16. 전술한 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 다음 단계를 포함하는 방법:
i. 만능 줄기 세포의 분화에 의해 수득된 윌름스 종양 항원(WT-1)을 발현하는 심외막 세포의 상피-중간엽 전이를 유도하는 단계 - 여기서 상피-중간엽 전이를 유도함으로써 심외막 세포가 심장 간질 세포로 분화되고, 여기서 상피-중간엽 전이를 유도하는 것은
a1) 상기 심외막 세포를 유효량의 (a) FGF2, (b) 혈관 내피 성장 인자(VEGF), (c) 글루타민 및 (d) GSK-3 억제제를 포함하는 무혈청 기본 배지에서 제1 세포외 기질 단백질의 존재하에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계 - 여기서 상기 양은 단계 (i) a1)에 의해 수득된 세포의 적어도 50%에서 CD90의 발현을 초래하고, 단계 (i) a1)에 의해 수득된 세포의 최대 50%에서 CD73의 발현을 초래하고, 단계 (i) a1)에 의해 수득된 세포의 최대 30%에서 CD44의 발현을 초래함 -; 이어서
a2) 단계 (i) a1)의 세포를 유효량의 (a) FGF2, (b) VEGF 및 (c) 글루타민을 포함하는 무혈청 기본 배지에서 제2 세포외 기질 단백질의 존재하에 적합한 조건 하에 배양하는 단계 - 여기서 상기 양은 단계 (i) a2)에 의해 수득된 상기 심장 간질 세포 집단의 적어도 80%에서 CD90, CD73 및 CD44의 발현을 초래함 -를 포함하고;
ii. 상기 단계 (i)의 심장 간질 세포 집단을 유효량의 (a) FGF2, (b) VEGF, 및 (c) 글루타민을 포함하는 무혈청 기본 배지에서 적어도 하나의 제3 세포외 기질 단백질의 존재하에 배양함으로써 상기 심장 간질 세포의 수를 증폭시키는 단계 - 상기 양은 상기 심장 간질 세포 집단의 적어도 80%에서 CD90, CD73 및 CD44의 유지된 발현을 초래함 -.
17. 전술한 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 제1, 제2 및 적어도 하나의 제3 세포외 기질 단백질은 기질 상에 고정된 형태로 또는 가용성 형태로 현탁 배양에 제공되고, 바람직하게는 제1, 제2 및 적어도 하나의 제3 세포외 기질 단백질은 기질 상에 고정된 형태로 제공되는, 방법.
18. 전술한 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 만능 줄기 세포는 영장류 기원의 만능 줄기 세포, 바람직하게는 인간 만능 줄기 세포인, 방법.
19. 전술한 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 만능 줄기 세포는 유도 만능 줄기 세포 및 처녀생식 줄기 세포로부터 선택되고, 바람직하게는 만능 줄기 세포는 유도 만능 줄기 세포인, 방법.
20. 실시양태 13 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i) a1)의 무혈청 기본 배지는 10-200 ng/ml, 바람직하게는 15-100 ng/ml, 보다 바람직하게는 20-80 ng/ml, 보다 더 바람직하게는 30-70 ng/ml, 가장 바람직하게는 40-60 ng/ml, 및 가장 바람직하게는 약 50 ng/ml FGF2의 최종 농도를 포함하는, 방법.
21. 실시양태 13 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i) a1)의 무혈청 기본 배지는 5-100 ng/ml VEGF, 바람직하게는 7-50 ng/ml, 보다 바람직하게는 10-40 ng/ml, 보다 더 바람직하게는 15-35 ng/ml, 가장 바람직하게는 20-30 ng/ml, 및 가장 바람직하게는 약 25 ng/ml VEGF의 최종 농도를 포함하는, 방법.
22. 실시양태 13 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i) a1)의 무혈청 기본 배지는 0.2-20 mM 글루타민, 바람직하게는, 0.5-10 mM 글루타민, 보다 바람직하게는 0.75-5 mM 글루타민, 보다 더 바람직하게는 1-3 mM 글루타민, 보다 더 바람직하게는 1.5-2.5 mM 글루타민, 및 가장 바람직하게는 약 2 mM 글루타민의 최종 농도를 포함하는, 방법.
23. 실시양태 13 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i) a1)의 GSK-3 억제제는 CHIR99021, CHIR98014, SB216763, TWS119, 티데글루십, SB415286, 6-브로모인더루빈-3-옥심 및 발프로에이트 염으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 GSK-3 억제제는 CHIR99021인, 방법.
24. 실시양태 23에 있어서, 단계 (i) a1)의 기본 배지는 0.1-10 μM CHIR99021, 바람직하게는 0.2-9 μM, 보다 바람직하게는 0.3-8 μM, 보다 더 바람직하게는 0.4-7 μM, 보다 더욱 바람직하게는 0.5-6 μM, 보다 바람직하게는 0.6-5 μM, 보다 바람직하게는 0.7-4 μM, 보다 바람직하게는 0.8-3 μM, 가장 바람직하게는 0.9-2 μM, 및 보다 가장 바람직하게는 약 1 μM CHIR99021의 최종 농도를 포함하는, 방법.
25. 실시양태 13 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i) a1)의 무혈청 기본 배지는 약 50 ng/ml FGF, 약 25 ng/ml VEGF, 약 2 mM 글루타민 및 약 1 μM의 GSK-억제제를 포함하고, 여기에서 GSK-억제제는 바람직하게는 CHIR99021, CHIR98014, SB216763, TWS119, 티데글루십, SB415286, 6-브로모인더루빈-3-옥심 및 발프로에이트 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
26. 실시양태 13 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i) a1)의 무혈청 기본 배지는 (e) 적절한 농도의 아스코르브산, 인슐린, 트랜스페린, 알부민 및 셀렌을 포함하는 무혈청 ECCM 보충제를 추가로 포함하고, 바람직하게는 ECCM 보충제는 기본 배지에 1.5-180 μg/ml 아스코르브산, 2-50 μg/ml 인슐린, 1.1-27.5 μg/ml 트랜스페린, 1660-41500 μg/ml 알부민, 및 11-145 nM 셀레늄의 최종 농도를 제공하도록 제형화되고, 보다 더 바람직하게는 ECCM 보충제는 기본 배지에 약 33 μg/ml 아스코르브산, 약 10 μg/ml 인슐린, 약 5.5 μg/ml 트랜스페린, 약 8300 μg/ml 알부민 및 약 40.5 nM 셀레늄의 최종 농도를 제공하도록 제형화되는, 방법
27. 실시양태 26에 있어서, 단계 (i) a1)의 ECCM 보충제 중 셀레늄은 소듐 셀레나이트로서 제공되고, 바람직하게는 ECCM 보충제는 기본 배지에 0.002-0.025 μg/ml 소듐 셀레나이트의 최종 농도를 제공하도록 제형화되고, 보다 바람직하게는 ECCM 보충제는 기본 배지에 약 0.007 μg/ml 소듐 셀레나이트의 최종 농도를 제공하도록 제형화되고, 더욱 더 바람직하게는 ECCM은 추가로 적절한 양의 글루타티온 및 미량 원소를 포함하는, 방법.
28. 실시양태 13 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i) a1)의 무혈청 기본 배지는 (e) 알부민, 티아민, 트랜스페린, 인슐린, 환원된 글루타티온, 아스코르브산 및 아스코르브산-2-포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 항산화제, L-히스티딘, L-이소류신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-하이드록시프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 10개 이상의 아미노산 및 Ag+, Al3+, Ba2+, Cd2+, Co2+, Cr3+, Ge4+, Se4+, Br-, I-, Mn2+, F-, Si +, V5+, Mo6+, Ni2+, Rb+, Sn2+ 및 Zr4+로 이루어진 군으로부터 선택된 15종 이상의 미량 원소를 추가로 포함하는, 방법.
29. 실시양태 26 내지 28에 있어서, 단계 (i) a1)의 ECCM 보충제는 표 2에 명시된 바와 같이 5-20% (v/v) ECCM 보충제, 바람직하게는 6-17.5% (v/v), 보다 바람직하게는 7-15% (v/v), 보다 바람직하게는 8%-12% (v/v), 보다 바람직하게는 9%-11% (v/v), 및 가장 바람직하게는 약 10% (v/v) ECCM 보충제로 제공되는, 방법.
30. 실시양태 13 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i) a2)의 무혈청 기본 배지는 10-200 ng/ml FGF2, 바람직하게는 15-100 ng/ml, 보다 바람직하게는 20-80 ng/ml, 보다 더 바람직하게는 30-70 ng/ml, 가장 바람직하게는 40-60 ng/ml, 및 가장 바람직하게는 약 50 ng/ml FGF2의 최종 농도를 포함하는, 방법.
31. 실시양태 13 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i) a2)의 무혈청 기본 배지는 5-100 ng/ml VEGF, 바람직하게는 7-50 ng/ml, 보다 바람직하게는 10-40 ng/ml, 보다 더 바람직하게는 15-35 ng/ml, 가장 바람직하게는 20-30 ng/ml, 및 가장 바람직하게는 약 25 ng/ml VEGF의 최종 농도를 포함하는, 방법.
32. 실시양태 13 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i) a2)의 무혈청 기본 배지는 0.2-20 mM 글루타민, 바람직하게는, 0.5-10 mM 글루타민, 보다 바람직하게는 0.75-5 mM 글루타민, 보다 더 바람직하게는 1-3 mM 글루타민, 보다 더 바람직하게는 1.5-2.5 mM 글루타민, 및 가장 바람직하게는 약 2 mM 글루타민의 최종 농도를 포함하는, 방법.
33. 실시양태 13 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i) a2)의 무혈청 기본 배지는 약 50 ng/ml FGF, 약 25 ng/ml VEGF, 및 약 2 mM 글루타민을 포함하는, 방법.
34. 실시양태 13 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i) a2)의 무혈청 기본 배지는 (d) 적절한 농도의 아스코르브산, 인슐린, 트랜스페린 및 알부민을 포함하는 무혈청 ECCM 보충제를 추가로 포함하고, 바람직하게는 여기서 ECCM 보충제는 기본 배지에 1.5-180 μg/ml 아스코르브산, 2-50 μg/ml 인슐린, 1.1-27.5 μg/ml 트랜스페린, 1660-41500 μg/ml 알부민, 및 11-145 nM 셀레늄의 최종 농도를 제공하도록 제형화되고, 보다 더 바람직하게는 ECCM 보충제는 기본 배지에 약 33 μg/ml 아스코르브산, 약 10 μg/ml 인슐린, 약 5.5 μg/ml 트랜스페린, 약 8300 μg/ml 알부민 및 약 40.5 nM 셀레늄의 최종 농도를 제공하도록 제형화되는, 방법.
35. 실시양태 34에 있어서, 단계 (i) a2)에서 ECCM 보충제는 소듐 셀레나이트로서 제공되고, 바람직하게는 ECCM 보충제는 기본 배지에 0.002-0.025 μg/ml 소듐 셀레나이트의 최종 농도를 제공하도록 제형화되고, 보다 바람직하게는 ECCM 보충제는 기본 배지에 약 0.007 μg/ml 소듐 셀레나이트의 최종 농도를 제공하도록 제형화되고, 보다 더 바람직하게는 ECCM은 적절한 양의 글루타티온 및 미량 원소를 추가로 포함하는, 방법.
36. 실시양태 13 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i) a2)의 무혈청 기본 배지는 (e) 알부민, 티아민, 트랜스페린, 인슐린, 환원된 글루타티온, 아스코르브산 및 아스코르브산-2-포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 항산화제, L-히스티딘, L-이소류신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-하이드록시프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 10개 이상의 아미노산 및 Ag+, Al3+, Ba2+, Cd2+, Co2+, Cr3+, Ge4+, Se4+, Br-, I-, Mn2+, F-, Si +, V5+, Mo6+, Ni2+, Rb+, Sn2+ 및 Zr4+로 이루어진 군으로부터 선택된 15종 이상의 미량 원소를 추가로 포함하는, 방법.
37. 실시양태 34 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i) a2)의 ECCM 보충제는 표 2에 명시된 바와 같은 5-20%(v/v) ECCM 보충제, 바람직하게는 6-17.5% (v/v), 보다 바람직하게는 7-15% (v/v), 보다 바람직하게는 8%-12% (v/v), 보다 바람직하게는 9%-11% (v/v), 및 가장 바람직하게는 약 10% (v/v) ECCM 보충제로 제공되는, 방법.
38. 실시양태 13 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 단계 (ii)의 무혈청 기본 배지는 10-200 ng/ml FGF2, 바람직하게는 15-100 ng/ml, 보다 바람직하게는 20-80 ng/ml, 보다 더 바람직하게는 30-70 ng/ml, 가장 바람직하게는 40-60 ng/ml, 및 가장 바람직하게는 약 50 ng/ml FGF2의 최종 농도를 포함하는, 방법.
39. 실시양태 13 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 단계 (ii)의 무혈청 기본 배지는 5-100 ng/ml VEGF, 바람직하게는 7-50 ng/ml, 보다 바람직하게는 10-40 ng/ml, 보다 더 바람직하게는 15-35 ng/ml, 가장 바람직하게는 20-30 ng/ml, 및 가장 바람직하게는 약 25 ng/ml VEGF의 최종 농도를 포함하는, 방법.
40. 실시양태 13 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 단계 (ii)의 무혈청 기본 배지는 0.2-20 mM 글루타민, 바람직하게는, 0.5-10 mM 글루타민, 보다 바람직하게는 0.75-5 mM 글루타민, 보다 더 바람직하게는 1-3 mM 글루타민, 보다 더 바람직하게는 1.5-2.5 mM 글루타민, 및 가장 바람직하게는 약 2 mM 글루타민의 최종 농도를 포함하는 방법.
41. 실시양태 13 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 단계 (ii)의 무혈청 기본 배지는약 50 ng/ml FGF, 약 25 ng/ml VEGF, 및 약 2 mM 글루타민을 포함하는, 방법.
42. 실시양태 13 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 단계 (ii)의 무혈청 기본 배지는 적합한 농도의 아스코르브산, 인슐린, 트랜스페린 및 알부민을 포함하는 무혈청 ECCM 보충제를 추가로 포함하고, 바람직하게는 ECCM 보충제는 기본 배지에 6.6-165 μg/ml 아스코르브산, 2-50 μg/ml 인슐린, 1.1-27.5 μg/ml 트랜스페린, 1660-41500 μg/ml 알부민, 및 11-145 nM 셀레늄의 최종 농도를 제공하도록 제형화되고, 보다 더 바람직하게는 ECCM 보충제는 기본 배지에 약 33 μg/ml 아스코르브산, 약 10 μg/ml 인슐린, 약 5.5 μg/ml 트랜스페린, 약 8300 μg/ml 알부민 및 약 40.5 nM 셀레늄의 최종 농도를 제공하도록 제형화되는, 방법.
43. 실시양태 42에 있어서, 단계 (i) a1)의 ECCM 보충제 중의 셀레늄은 소듐 셀레나이트로서 제공되고, 바람직하게는 여기서 ECCM 보충제는 기본 배지에 0.002-0.025 μg/ml 소듐 셀레나이트의 최종 농도를 제공하도록 제형화되고, 보다 바람직하게는 ECCM 보충제는 기본 배지에 약 0.007 μg/ml 소듐 셀레나이트의 최종 농도를 제공하도록 제형화되고, 보다 더 바람직하게는 ECCM은 적절한 양의 글루타티온 및 미량 원소를 추가로 포함하는, 방법.
44. 실시양태 13 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 단계 (ii)의 무혈청 기본 배지는 (e) 알부민, 티아민, 트랜스페린, 인슐린, 환원된 글루타티온, 아스코르브산 및 아스코르브산-2-포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 항산화제, L-히스티딘, L-이소류신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-하이드록시프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 10개 이상의 아미노산 및 Ag+, Al3+, Ba2+, Cd2+, Co2+, Cr3+, Ge4+, Se4+, Br-, I-, Mn2+, F-, Si +, V5+, Mo6+, Ni2+, Rb+, Sn2+ 및 Zr4+로 이루어진 군으로부터 선택된 15종 이상의 미량 원소를 추가로 포함하는, 방법.
45. 실시양태 42 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 단계 (ii)의 ECCM 보충제는 표 2에 명시된 바와 같은 5-20% (v/v) ECCM 보충제, 바람직하게는 6-17.5% (v/v), 보다 바람직하게는 7-15% (v/v), 보다 바람직하게는 8%-12% (v/v), 보다 바람직하게는 9%-11% (v/v), 및 가장 바람직하게는 약 10% (v/v) ECCM 보충제를 포함하는, 방법.
46. 전술한 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 다음 단계를 포함하는 방법:
(i) 만능 줄기 세포의 분화에 의해 수득된 윌름스 종양 항원(WT-1)을 발현하는 심외막 세포의 상피-중간엽 전이를 유도하는 단계 - 여기서 상피-중간엽 전이를 유도함으로써 심외막 세포가 심장 간질 세포로 분화되고, 여기서 상피-중간엽 전이를 유도하는 것은
a1) 상기 심외막 세포를 (a) 10-200 ng/ml FGF2, (b) 5-100 ng/ml 혈관 내피 성장 인자(VEGF), (c) 0.2-20 mM 글루타민, (d) 0.1-10 μM GSK-3 억제제, 및 (e) ECCM 보충제를 포함하는 무혈청 기본 배지에서 제1 세포외 기질 단백질의 존재하에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계 - 여기서 ECCM 보충제는 기본 배지에 6.6-165 μg/ml 아스코르브산, 2-50 μg/ml 인슐린, 1.1-27.5 μg/ml 트랜스페린, 1660-41500 μg/ml 알부민, 및 11-145 nM 셀레늄의 최종 농도를 제공하도록 제형화되고, 상기 세포의 적어도 50%는 CD90을 발현하고, 상기 세포의 최대 50%가 CD73을 발현하고, 상기 세포의 최대 30%가 CD44를 발현함 -; 이어서
a2) 단계 (i) a1)의 세포를 (a) 10-200 ng/ml FGF2, (b) 5-100 ng/ml VEGF, 및 (c) 0.2-20 mM 글루타민, 및 (d) 단계 (i) a1)에서와 같은 ECCM 보충제를 포함하는 무혈청 기본 배지에서 제2 세포외 기질 단백질의 존재하에 적합한 조건 하에 배양하는 단계 - 여기에서 수득된 심장 간질 세포 집단의 세포 중 적어도 약 80%는 CD90, CD73 및 CD44를 발현함 -를 포함하고;
(ii) 단계 (i)의 심장 간질 세포 집단을 (a) 10-200 ng/ml FGF2, (b) 5-100 ng/ml VEGF, (c) 0.2-20 mM 글루타민, 및 (d) 단계 (i) a1)에서와 같은 ECCM 보충제를 포함하는 무혈청 기본 배지에서 적어도 하나의 제3 세포외 기질 단백질의 존재하에 배양함으로써 상기 심장 간질 세포의 수를 증폭시키는 단계 - 상기 심장 간질 세포 집단의 적어도 80%는 CD90, CD73 및 CD44의 발현을 유지함 -.
47. 실시양태 46에 있어서, 제1, 제2 및 적어도 하나의 제3 세포외 기질 단백질은 기질 상에 고정된 형태로 또는 가용성 형태로 현탁 배양에 제공되고, 바람직하게는 제1, 제2 및 적어도 하나의 제3 세포외 기질 단백질은 기질 상에 고정된 형태로 제공되는, 방법.
48. 실시양태 46 또는 47에 있어서, 단계 (i) a1), 단계 (i) a2) 및/또는 단계 (ii)의 무혈청 기본 배지는 표 2에 명시된 바와 같은 5-20%(v/v) ECCM 보충제, 바람직하게는 6-17.5% (v/v), 보다 바람직하게는 7-15% (v/v), 보다 바람직하게는 8%-12% (v/v), 보다 바람직하게는 9%-11% (v/v), 및 가장 바람직하게는 약 10% (v/v) ECCM 보충제로 제공되는, 방법.
49. 전술한 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 제1 세포외 기질 단백질은 라미닌, 비트로넥틴, 콜라겐, 특히 젤라틴, 피브로넥틴, 엘라스틴을 포함하고, 바람직하게는 제1 세포외 기질 단백질은 라미닌을 포함하고, 더욱 바람직하게는 세포외 기질 단백질은 라미닌인, 방법.
50. 실시양태 49에 있어서, 라미닌은 라미닌-521인, 방법.
51. 전술한 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 제2 세포외 기질 단백질은 제1 세포외 기질 단백질과 동일하거나 상이한, 방법.
52. 실시양태 51에 있어서, 제2 세포외 기질 단백질은 제1 세포외 기질 단백질과 상이하고 비트로넥틴, 라미닌, 콜라겐, 특히 젤라틴, 피브로넥틴, 엘라스틴을 포함하고, 바람직하게는 여기서 제2 세포외 기질 단백질은 비트로넥틴인, 방법.
53. 전술한 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 제3 세포외 기질 단백질은 비트로넥틴, 라미닌, 콜라겐, 특히 젤라틴, 피브로넥틴, 엘라스틴, 매트리겔, 아미노산 서열 RGD를 함유하는 펩티드, 아미노산 서열 RGD를 함유하는 단백질 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 적어도 하나의 제3 세포외 기질 단백질은 비트로넥틴, 라미닌, 콜라겐, 특히 젤라틴, 피브로넥틴 및 엘라스틴으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 적어도 하나의 제3 세포외 기질 단백질은 비트로넥틴인, 방법.
54. 전술한 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 제3 세포외 기질 단백질은 기질 상에 고정된 형태로 제공되는, 방법.
55. 실시양태 54에 있어서, 적어도 하나의 제3 세포외 기질 단백질은 단계 (ii)에서 비트로넥틴, 라미닌, 콜라겐, 특히 젤라틴, 매트리겔 및 피브로넥틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 세포외 기질 단백질로 코팅된 기질이고,
바람직하게는 단계 (ii)에서 적어도 하나의 제3 세포외 기질 단백질 코팅된 기질은 하나 이상의 계대(들)에서 비트로넥틴으로 코팅되고 하나 이상의 후속 계대(들)에서 비트로넥틴, 라미닌, 콜라겐, 특히 젤라틴, 매트리겔 또는 피브로넥틴으로 코팅되고
보다 바람직하게는 단계 (ii)에서 적어도 하나의 제3 세포외 기질 단백질 코팅된 기질은 1 계대 동안 비트로넥틴으로 코팅되고, 후속 계대 또는 계대들 동안 비트로넥틴, 라미닌, 콜라겐, 특히 젤라틴, 매트리겔 또는 피브로넥틴으로 코팅되며, 보다 더 바람직하게는 여기서 단계 (ii)의 세포외 기질 단백질은 비트로넥틴인,
방법.
56. 실시양태 54에 있어서, 적어도 하나의 제3 세포외 기질 단백질은 비트로넥틴, 라미닌, 콜라겐, 특히 젤라틴, 매트리겔, 및 피브로넥틴으로부터 선택되고, 바람직하게는 여기서 세포외 기질 단백질은 비트로넥틴인, 방법.
57. 실시양태 54 내지 56 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 제3 세포외 기질 단백질은 비트로넥틴이고, 0.1125 μg/㎠ - 7.2 μg/㎠ 비트로넥틴, 바람직하게는 0.225 μg/㎠ - 3.6 μg/㎠ 비트로넥틴, 보다 바람직하게는 0.45 μg/㎠ - 1.8 μg/㎠ 비트로넥틴, 보다 더 바람직하게는 0.6 μg/㎠ - 1.2 μg/㎠ 비트로넥틴, 보다 더 바람직하게는 0.7 μg/㎠ - 1.1 μg/㎠ 비트로넥틴, 보다 더 바람직하게는 0.8 μg/㎠ - 1 μg/㎠ 비트로넥틴, 가장 바람직하게는 약 0.9 μg/㎠ 비트로넥틴의 최종 농도로 기질 상에 고정된 형태로 제공되는, 방법.
58. 실시양태 54 내지 57 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 제3 세포외 기질 단백질은 라미닌이고, 0.1125 μg/㎠ - 7.2 μg/㎠ 라미닌, 바람직하게는 0.225 μg/㎠ - 3.6 μg/㎠ 라미닌, 보다 바람직하게는 0.45 μg/㎠ - 1.8 μg/㎠ 라미닌, 보다 더 바람직하게는 0.6 μg/㎠ - 1.2 μg/㎠ 라미닌, 보다 더 바람직하게는 0.7 μg/㎠ - 1.1 μg/㎠ 라미닌, 보다 더 바람직하게는 0.8 μg/㎠ - 1 μg/㎠ 라미닌, 가장 바람직하게는 약 0.9 μg/㎠ 라미닌의 최종 농도로 기질 상에 고정된 형태로 제공되는, 방법.
59. 실시양태 54 내지 58 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 제3 세포외 기질 단백질은 8 μg/㎠ - 800 μg/㎠ 콜라겐, 바람직하게는 16 μg/㎠ - 400 μg/㎠ 콜라겐, 보다 바람직하게는 35 μg/㎠ - 250 μg/㎠ 콜라겐, 보다 더 바람직하게는 50 μg/㎠ - 180 μg/㎠ 콜라겐, 보다 더 바람직하게는 60 μg/㎠ - 100 μg/㎠ 콜라겐, 보다 더 바람직하게는 70 μg/㎠ 90 μg/㎠ 콜라겐, 보다 더 바람직하게는 약 80 μg/㎠의 최종 농도로 기질 상에 고정된 형태로 제공되고, 가장 바람직하게는 콜라겐은 젤라틴 형태로 제공되는, 방법.
60. 실시양태 54 내지 59 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 제3 세포외 기질 단백질은 피브로넥틴이고, 0.125 μg/㎠ - 8 μg/㎠ 피브로넥틴, 바람직하게는 0.25 μg/㎠ - 4 μg/㎠ 피브로넥틴, 보다 바람직하게는 0.5 μg/㎠ - 2 μg/㎠ 피브로넥틴, 보다 더 바람직하게는 0.7 μg/㎠ - 1.3 μg/㎠ 피브로넥틴, 보다 더 바람직하게는 0.8 μg/㎠ - 1.2 μg/㎠ 피브로넥틴, 보다 더 바람직하게는 0.9 μg/㎠ - 1.1 μg/㎠ 피브로넥틴, 가장 바람직하게는 약 1 μg/㎠ 피브로넥틴의 최종 농도로 기질 상에 고정된 형태로 제공되는, 방법.
61. 실시양태 54 내지 60 중 어느 하나에 있어서, 기질은 플레이트 또는 비드이고, 바람직하게는 기질은 플레이트인, 방법.
62. 실시양태 26 내지 61 중 어느 하나에 있어서, (i) a1, (i) a2 및/또는 (ii)에서 사용된 ECCM은 본질적으로 표 2에 열거된 농도의 성분을 함유하는, 방법.
63. 실시양태 62에 있어서, ECCM 보충제는 녹아웃 혈청 대체물(KSR™) 보충제인, 방법.
64. 전술한 실시양태 중 어느 하나에 있어서, (i) a1, (i) a2 및/또는 (ii)에서 사용된 무혈청 기본 배지는 KO DMEM, DMEM, DMEM/F12, RPMI, IMDM, 알파MEM, 배지 199, Hams F-10, Hams F-12를 포함하고, 여기서 기본 배지는 바람직하게는 KO DMEM인, 방법.
65. 실시양태 13 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i) a1)에서 사용된 무혈청 기본 배지는 약 2 mM 글루타민, 약 10% KSRTM 보충제, 약 50 ng/ml FGF, 약 25 ng/ml VEGF 및 약 1 μM CHIR를 포함하는 녹아웃 DMEM 배지인, 방법.
66. 실시양태 13 내지 65 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i) a2)에서 사용된 무혈청 기본 배지는 약 2 mM 글루타민, 약 10% KSRTM 보충제, 약 50 ng/ml FGF 및 약 25 ng/ml VEGF를 포함하는 녹아웃 DMEM 배지인, 방법.
67. 실시양태 13 내지 66 중 어느 하나에 있어서, 단계 ii)에서 사용된 무혈청 기본 배지는 약 2 mM 글루타민, 약 10% KSRTM 보충제, 약 50 ng/ml FGF 및 약 25 ng/ml VEGF를 포함하는 녹아웃 DMEM 배지인, 방법.
68. 전술한 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 심외막 세포는 형광 현미경에 의해 결정된 바와 같이 윌름스 종양 항원 1(WT-1)을 발현하는, 방법.
69. 전술한 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 심외막 세포는 qRT-PCR에 의해 결정된 바와 같이 TBP(TATA-결합 단백질)보다 적어도 2배, 바람직하게는 3배, 보다 바람직하게는 4배, 보다 더 바람직하게는 적어도 5배, 가장 바람직하게는 적어도 6배; 및 최대 15배 더 많이 윌름스 종양 항원 1(WT-1) RNA를 발현하는, 방법.
70. 전술한 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 심외막 세포는 [Schlick (2018), Doctoral Thesis, November 2018, University of Goettingen, Witty et al. Nat Biotechnology 32, 1026-1035 (2014)]에 기술된 바와 같이, 또는 심외막 세포를 제공하기 위한 기타 적절한 방법으로 수득되는, 방법.
71. 전술한 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 유세포 분석법에 의해 결정된 바와 같이 단계 (i) a1)에 의해 생산된 세포 집단의 적어도 50%는 CD90을 발현하고, 바람직하게는 유세포 분석법에 의해 결정된 바와 같이단계 (i) a1)에 의해 생산된 세포 집단의 적어도 50%는 CD90을 발현하고, 단계 (i) a1)에 의해 생산된 세포 집단의 50% 미만은 CD73을 발현하고, 단계 (i) a1)에 의해 생산된 세포 집단의 30% 미만은 CD44를 발현하는, 방법.
72. 전술한 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 증폭 단계 (ii)는 세포 집단을 제공하고, 여기서 심장 간질 세포 집단의 세포 중 적어도 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89, 약 90%, 약 91% 약 92%, 약 93%, 약 94, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%는 CD90을 발현하는, 방법.
73. 전술한 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 유세포 분석법에 의해 결정된 바와 같이 단계 (ii)에 의해 수득된 심장 간질 세포 집단의 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 81%, 보다 바람직하게는 적어도 82%, 보다 더 바람직하게는 적어도 83%, 보다 더 바람직하게는 적어도 83%, 보다 더 바람직하게는 적어도 84%, 보다 더 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 86%, 보다 더 바람직하게는 적어도 87%, 보다 더 바람직하게는 적어도 88%, 보다 더 바람직하게는 적어도 89%, 및 가장 바람직하게는 적어도 90%는 CD90을 발현하는, 방법.
74. 전술한 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 증폭 단계 (ii)는 세포 집단을 제공하고, 여기서 심장 간질 세포 집단의 세포 중 적어도 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89, 약 90%, 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%는 CD73을 발현하는, 방법.
75. 전술한 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 유세포 분석법에 의해 결정된 바와 같이 단계 (ii)에 의해 수득된 심장 간질 세포 집단의 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 81%, 보다 바람직하게는 적어도 82%, 보다 더 바람직하게는 적어도 83%, 보다 더 바람직하게는 적어도 84%, 보다 더 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 86%, 보다 더 바람직하게는 적어도 87%, 보다 더 바람직하게는 적어도 88%, 보다 더 바람직하게는 적어도 89%, 및 가장 바람직하게는 적어도 90%는 CD73을 발현하는, 방법.
76. 전술한 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 증폭 단계 (ii)는 세포 집단을 제공하고, 여기서 심장 간질 세포 집단의 세포 중 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%는 CD44를 발현하는, 방법.
77. 전술한 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 유세포 분석법에 의해 결정된 바와 같이 단계 (ii)에 의해 수득된 심장 간질 세포 집단의 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 81%, 보다 바람직하게는 적어도 82%, 보다 더 바람직하게는 적어도 83%, 보다 더 바람직하게는 적어도 84%, 보다 더 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 86%, 보다 더 바람직하게는 적어도 87%, 보다 더 바람직하게는 적어도 88%, 보다 더 바람직하게는 적어도 89%, 및 가장 바람직하게는 적어도 90%는 CD44를 발현하는, 방법.
78. 전술한 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i) a2) 후 상기 심장 간질 세포 집단의 세포 중 적어도 약 90%는 비멘틴을 발현하는, 방법.
79. 전술한 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 유세포 분석법에 의해 결정된 바와 같이 단계 (i) a2)에 의해 수득된 심장 간질 세포 집단의 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 81%, 보다 바람직하게는 적어도 82%, 보다 더 바람직하게는 적어도 83%, 보다 더 바람직하게는 적어도 84%, 보다 더 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 86%, 보다 더 바람직하게는 적어도 87%, 보다 더 바람직하게는 적어도 88%, 보다 더 바람직하게는 적어도 89%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 보다 더 바람직하게는 적어도 91%, 보다 더 바람직하게는 적어도 92%, 보다 더 바람직하게는 적어도 93%, 보다 더 바람직하게는 적어도 94%, 보다 더 바람직하게는 적어도 95%, 보다 더 바람직하게는 적어도 96%, 보다 더 바람직하게는 적어도 97%, 보다 더 바람직하게는 적어도 98%는 비멘틴을 발현하는, 방법.
80. 전술한 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 증폭 단계 (ii)는 세포 집단을 제공하고, 여기서 상기 심장 간질 세포 집단의 세포 중 적어도 약 90%는 비멘틴을 발현하는, 방법.
81. 전술한 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i) a2) 후 상기 심장 간질 세포 집단의 세포 중 적어도 약 90%는 콜라겐 1을 발현하는, 방법.
82. 전술한 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 유세포 분석법에 의해 결정된 바와 같이 단계 (i) a2)에 의해 수득된 심장 간질 세포 집단의 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 82%, 보다 바람직하게는 적어도 82%, 보다 더 바람직하게는 적어도 84%, 보다 더 바람직하게는 적어도 86%, 보다 더 바람직하게는 적어도 88%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 보다 더 바람직하게는 적어도 91%, 보다 더 바람직하게는 적어도 92%, 보다 더 바람직하게는 적어도 93%, 보다 더 바람직하게는 적어도 94%, 보다 더 바람직하게는 적어도 95%, 보다 더 바람직하게는 적어도 96%, 및 가장 바람직하게는 적어도 97%는 콜라겐 1을 발현하는, 방법.
83. 전술한 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 증폭 단계 (ii)는 세포 집단을 제공하고, 여기서 상기 심장 간질 세포 집단의 세포 중 적어도 약 90%는 콜라겐 1을 발현하는, 방법.
84. 실시양태 83에 있어서, 증폭 단계 (ii)는 세포 집단을 제공하고, 여기서 심장 간질 세포 집단의 세포 중 적어도 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%는 콜라겐 1을 발현하는, 방법.
85. 전술한 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i) a2)에 의해 생산된 심장 간질 세포 집단의 세포 중 적어도 약 90%는 비멘틴, CD90, 콜라겐-1 및 CD73을 발현하고, 심장 간질 세포 집단의 세포 중 적어도 약 80%는 CD44를 발현하는, 방법.
86. 전술한 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 유세포 분석법에 의해 결정된 바와 같이 단계 (i) a2)에 의해 수득된 심장 간질 세포 집단의 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 81%, 보다 바람직하게는 적어도 82%, 보다 더 바람직하게는 적어도 83%, 보다 더 바람직하게는 적어도 84%, 보다 더 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 86%, 보다 더 바람직하게는 적어도 87%, 보다 더 바람직하게는 적어도 88%, 보다 더 바람직하게는 적어도 89%, 및 가장 바람직하게는 적어도 90%는 CD44를 발현하는, 방법.
87. 실시양태 86에 있어서, 유세포 분석법에 의해 결정된 바와 같이 단계 (i) a2)에 의해 수득된 심장 간질 세포 집단의 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 보다 바람직하게는 적어도 92%, 보다 더 바람직하게는 적어도 93%, 보다 더 바람직하게는 적어도 94%, 보다 더 바람직하게는 적어도 95%, 보다 더 바람직하게는 적어도 96%, 보다 더 바람직하게는 적어도 97%, 보다 더 바람직하게는 적어도 98%, 및 가장 바람직하게는 적어도 99%는 CD44를 발현하는, 방법.
88. 전술한 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 증폭 단계 (ii)는 세포 집단을 제공하고, 여기서 심장 간질 세포 집단의 세포 중 적어도 약 90%는 CD90, CD73 및 CD44를 발현하고, 바람직하게는 세포의 적어도 90%는 추가로 비멘틴 및 콜라겐 1을 발현하는, 방법.
89. 전술한 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 심외막 세포는 단계 (i*)에서 만능 줄기 세포의 중배엽 분화를 유도한 후, 단계 (i**)에서 심외막 분화를 유도함으로써 만능 줄기 세포의 분화에 의해 수득되는, 방법.
90. 실시양태 89에 있어서, 단계 (i*)에서 중배엽 분화는 적합한 조건 하에 무혈청 기본 배지에서 라미닌 코팅된 기질 상에서 상기 만능 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
91. 실시양태 90에 있어서, 단계 (i*)에서 사용된 무혈청 기본 배지는 유효량의 (a) 골형성 단백질 4(BMP4), (b) 액티빈 A(ActA), (c) GSK-3 억제제, (d) 염기성 섬유아세포 성장 인자(FGF2), (e) 글루타민, 및 (f) 알부민, 트랜스페린, 에탄올 아민, 셀레늄 또는 이의 생체이용가능 염, L-카르니틴, 지방산 보충제, 및 트리오도-L-티로닌(T3)을 포함하는 무혈청 보충제를 포함하고, 여기서 양은 만능 줄기 세포의 중배엽 분화를 유도하기에 효과적인, 방법.
92. 실시양태 89 내지 91 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i*)에서 사용된 무혈청 기본 배지는 적합한 양의 아스코르브산을 추가로 포함하는, 방법.
93. 실시양태 89 내지 92 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i*)에서 중배엽 분화를 유도하는 단계는 라미닌 코팅된 기질 상에서 적합한 조건 하에 만능 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
94. 실시양태 89 내지 93 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i*)에서 중배엽 분화에 의해 수득된 세포는 CD309 및/또는 CD140a를 발현하는, 방법.
95. 실시양태 89 내지 94 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i**)에서 사용된 무혈청 기본 배지는 유효량의 (a) BMP4, (b) 레티노산(RA), (c) GSK-3 억제제, (d) 인슐린, (e) 글루타민 및 (f) 단계 (i*)에서와 같은 무혈청 보충제를 포함하고, 여기서 양은 단계 (i*)에 의해 수득된 세포의 심외막 분화를 유도하는 데 효과적인, 방법.
96. 실시양태 89 내지 95 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i**)에서 사용된 무혈청 기본 배지는 적합한 양의 아스코르브산을 추가로 포함하는 방법.
97. 실시양태 89 내지 96 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i**)에서 심외막 분화를 유도하는 단계는 단계 (i*)의 세포를 적합한 조건 하에 라미닌 코팅된 기질 상에서 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
98. 실시양태 97에 있어서, 단계 (i**)에서 수득된 심외막 세포는 윌름스 종양 항원 1(WT-1)을 발현하는, 방법.
99. 전술한 실시양태 중 어느 하나에 있어서,
i*. 상기 만능 줄기 세포를 무혈청 기본 배지에서 라미닌 코팅된 기질 상에서 적합한 조건 하에 배양함으로써 중배엽 분화를 유도하는 단계로서, 유세포 측정법에 의해 결정된 바와 같이 수득된 세포의 적어도 90%가 CD90을 발현하고, 수득된 세포의 최대 10%가 CD73을 발현하고, 수득된 세포의 최대 10%가 CD44를 발현하는, 단계;
i**. 단계 (i*)의 세포를 무혈청 기본 배지에서 라미닌 코팅된 기질 상에서 적합한 조건 하에 배양함으로써 심외막 분화를 유도하는 단계로서, 여기서 수득된 세포는 형광 현미경에 의해 결정된 바와 같이 윌름스 종양 항원 1(WT-1)을 발현하는, 단계,
i. 단계 (i**)의 세포를 무혈청 기본 배지에서 제1 세포외 기질 단백질의 존재하에 적합한 조건 하에 배양함으로써 상피-중간엽 전이를 유도하는 단계로서, 여기서 상기 세포의 적어도 50%는 CD90을 발현하고 상기 세포의 최대 50%는 CD73을 발현하고 상기 세포의 최대 30%는 CD44를 발현하는, 단계; 이어서 단계 (i) a1)의 세포를 무혈청 기본 배지에서 제2 세포외 기질 단백질 기질의 존재하에 적합한 조건 하에 배양하는 단계로서; 여기에서 수득된 심장 간질 세포 집단의 세포 중 적어도 약 80%는 CD90, CD73 및 CD44를 발현하는, 단계; 및
ii. 단계 (i)의 상기 심장 간질 세포 집단을 무혈청 기본 배지에서 적어도 하나의 제3 세포외 기질 단백질 기질의 존재하에 배양함으로써 상기 심장 간질 세포의 수를 증폭시키는 단계로서, 상기 심장 간질 세포 집단의 적어도 80%는 CD90, CD73 및 CD44의 발현을 유지하는, 단계를 포함하는,
방법.
100. 전술한 실시양태 중 어느 하나에 있어서,
i*. 상기 만능 줄기 세포를 유효량의 a) 골형성 단백질 4(BMP4), (b) 액티빈 A(ActA), (c) GSK-3 억제제, (d) 염기성 섬유아세포 성장 인자(FGF2), (e) 글루타민, 및 (f) 알부민, 트랜스페린, 에탄올 아민, 셀레늄 또는 이의 생체이용가능 염, L-카르니틴, 지방산 보충제, 및 트리오도-L-티로닌(T3)을 포함하는 무혈청 보충제를 포함하는 무혈청 기본 배지에서 라미닌 코팅된 기질 상에서 적합한 조건 하에 배양함으로써 중배엽 분화를 유도하는 단계로서, 여기서 양은 유세포 측정법에 의해 결정된 바와 같이 단계 (i*)에 의해 수득된 세포의 적어도 90%에서 CD90 발현, 단계 (i*)에 의해 수득된 세포의 최대 10%에서 CD73 발현 및 단계 (i*)에 의해 수득된 세포의 최대 10%에서 CD44 발현을 초래하는, 단계;
i**. 단계 (i*)의 세포를 유효량의 (a) BMP4, (b) 레티노산(RA), (c) GSK-3 억제제, (d) 인슐린, (e) 글루타민 및 (f) (i)에서와 같은 무혈청 보충제를 포함하는 무혈청 기본 배지에서 라미닌 코팅된 기질 상에서 적합한 조건 하에 배양함으로써 심외막 분화를 유도하는 단계로서, 여기서 상기 양은 형광 현미경에 의해 결정된 바와 같이 윌름스 종양 항원 1(WT-1)의 발현으로 이어지는, 단계,
i. 단계 (i**)의 세포를 유효량의 (a) FGF2, (b) 혈관 내피 성장 인자(VEGF), (c) 글루타민 및 (d) GSK-3 억제제를 포함하는 무혈청 기본 배지에서 제1 세포외 기질 단백질의 존재하에 적합한 조건 하에 배양함으로써 상피-중간엽 전이를 유도하는 단계로서, 여기서 상기 양은 유세포 측정법에 의해 결정된 바와 같이 단계 (i) a1)에 의해 수득된 세포의 적어도 50%에서 CD90 발현, 단계 (i) a1)에 의해 수득된 세포의 최대 50%에서 CD73 발현 및 단계 (i) a1)에 의해 수득된 세포의 최대 30%에서 CD44 발현을 초래하는, 단계;
a2) 이어서 세포를 유효량의 (a) FGF2, (b) VEGF, 및 (c) 글루타민을 포함하는 무혈청 기본 배지에서 제2 세포외 기질 단백질 기질의 존재하에 적합한 조건 하에 배양하는 단계로서; 여기에서 상기 양은 수득된 심장 간질 세포 집단의 적어도 약 80%에서 CD90, CD73 및 CD44 발현을 초래하는, 단계; 및
ii. 단계 (i)의 상기 심장 간질 세포 집단을 유효량의 (a) FGF2, (b) VEGF, 및 (c) 글루타민을 포함하는 무혈청 기본 배지에서 적어도 하나의 제3 세포외 기질 단백질 기질의 존재하에 배양함으로써 상기 심장 간질 세포의 수를 증폭시키는 단계로서, 상기 양은 수득된 심장 간질 세포 집단의 적어도 약 80%에서 CD90, CD73 및 CD44 발현 유지를 초래하는, 단계를 포함하는,
방법.
101. 실시양태 89 내지 100 중 어느 하나에 있어서, 유세포 분석법에 의해 결정된 바와 같이 단계 (i*) 후 수득된 세포의 적어도 50%는 CD309를 발현하고, 바람직하게는 유세포 분석법에 의해 결정된 바와 같이 실시양태 1의 단계 (i) 후 세포의 적어도 55%는 CD309를 발현하고, 보다 바람직하게는 실시양태 1의 단계 (i) 후 세포의 적어도 60%는 CD309를 발현하고, 보다 더 바람직하게는 실시양태 1의 단계 (i) 후 세포의 적어도 65%는 CD309를 발현하는, 방법.
102. 실시양태 89 내지 101 중 어느 하나에 있어서, 유세포 분석법에 의해 결정된 바와 같이 단계 (i*) 후 수득된 세포의 적어도 50%는 CD140a를 발현하고, 바람직하게는 단계 (i*) 후 세포의 적어도 55%는 CD140a를 발현하고, 보다 바람직하게는 단계 (i*) 후 세포의 적어도 60%는 CD140a를 발현하고, 보다 더 바람직하게는 단계 (i*) 후 세포의 적어도 65%는 CD140a를 발현하는, 방법.
103. 실시양태 89 내지 102 중 어느 하나에 있어서, qRT-PCR에 의해 결정된 바와 같이 단계 (i**) 후 수득된 세포는 TBP(TATA-결합 단백질)보다 적어도 2배, 바람직하게는 3배, 보다 바람직하게는 4배, 보다 더 바람직하게는 적어도 5배, 가장 바람직하게는 적어도 6배; 및 최대 15배 더 윌름스 종양 항원 1(WT-1) RNA를 발현하는, 방법.
104. 실시양태 89 내지 103 중 어느 하나에 있어서, 제1 세포외 기질 단백질은 라미닌이고 단계 (i*), (i**) 및/또는 (i a1)의 라미닌 코팅된 기질은 0.1125 μg/㎠ - 7.2 μg/㎠ 라미닌, 바람직하게는 0.225 μg/㎠ - 3.6 μg/㎠ 라미닌, 보다 바람직하게는 0.45 μg/㎠ - 1.8 μg/㎠ 라미닌, 보다 더 바람직하게는 0.6 μg/㎠ - 1.2 μg/㎠ 라미닌, 보다 더 바람직하게는 0.7 μg/㎠ - 1.1 μg/㎠ 라미닌, 보다 더 바람직하게는 0.8 μg/㎠ - 1 μg/㎠ 라미닌, 가장 바람직하게는 0.9 μg/㎠ 라미닌의 최종 농도로 코팅되는, 방법.
105. 실시양태 104에 있어서, 기질은 플레이트인, 방법.
106. 실시양태 89 내지 105 중 어느 하나에 있어서, 라미닌은 알파-사슬, 베타-사슬 및 감마-사슬의 조합인, 방법.
107. 실시양태 106에 있어서, 알파-사슬, 베타-사슬 및 감마-사슬은 독립적으로 선택되고, 바람직하게는 알파-사슬은 알파-1, 알파-2, 알파-3, 알파-4, 알파-5에서 선택되고, 베타-사슬은 베타-1, 베타-2 및 베타-3에서 선택되며, 감마 사슬은 감마-1, 감마-2 및 감마-3에서 선택되고, 가장 바람직하게는 라미닌은 알파-5 사슬, 베타-2 사슬 및 감마-1 사슬의 조합인, 방법.
108. 실시양태 89 내지 107 중 어느 하나에 있어서, 라미닌은 둘베코 인산염 완충 염수(DPBS)에 용해되는, 방법.
109. 실시양태 89 내지 108 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i*)는 3-9일 동안 수행되고, 바람직하게는 단계 (i*)는 4-8일 동안 수행되고, 보다 바람직하게는 단계 (i*)는 5-7일 동안 수행되고, 가장 바람직하게는 단계 (i*)는 대략 6일 동안 수행되는, 방법.
110. 실시양태 89 내지 109 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i*)의 기본 배지는 10-1000 μM, 바람직하게는 50-400 μM, 보다 바람직하게는 100-300 μM, 보다 더 바람직하게는 150-250 μM, 및 가장 바람직하게는 약 200 μM의 아스코르브산 또는 이의 유도체를 추가로 포함하는, 방법.
111. 실시양태 110에 있어서, 아스코르브산의 유도체는 아스코르베이트-2-포스페이트인, 방법.
112. 실시양태 89 내지 111 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i*)에서 사용되는 기본 배지는 RPMI, DMEM, αMEM, DMEM/F12, StemPro, 및 Iscove's 배지이고, 가장 바람직하게는 기본 배지는 RPMI인, 방법.
113. 실시양태 112에 있어서, 단계 (i*)에서 사용되는 기본 배지는 피루베이트를 포함하는 RPMI인, 방법.
114. 실시양태 112에 있어서, 단계 (i*)에서 사용되는 기본 배지는 0.1-10 mM 피루베이트, 바람직하게는 0.2-5 mM 피루베이트, 보다 바람직하게는 0.4-2.5 mM 피루베이트, 보다 바람직하게는 0.8-1.5 mM 피루베이트, 보다 바람직하게는 0.9-1.2 mM 피루베이트, 가장 바람직하게는 약 1 mM 피루베이트를 포함하는 RPMI인, 방법.
115. 실시양태 89 내지 114 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i*)에서 기본 배지는 1-100 ng/ml, 바람직하게는 2-50 ng/ml, 보다 바람직하게는 4-25 ng/ml, 보다 더 바람직하게는 7-15 ng/ml, 보다 더 바람직하게는 8-12.5 ng/ml, 보다 더 바람직하게는 9-11 ng/ml, 및 가장 바람직하게는 약 10 ng/ml BMP4의 최종 농도를 포함하는, 방법.
116. 실시양태 89 내지 115 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i*)에서 기본 배지는 0.3-30 ng/ml, 바람직하게는 0.5-15 ng/ml, 보다 바람직하게는 0.8-7 ng/ml, 보다 더 바람직하게는 1-5 ng/ml, 보다 더욱 바람직하게는 2-4 ng/ml, 가장 바람직하게는 2.5-3.5 ng/ml, 및 가장 바람직하게는 약 3 ng/ml액티빈 A의 최종 농도를 포함하는, 방법.
117. 실시양태 89 내지 116 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i*)에서 GSK-3 억제제는 CHIR99021, CHIR98014, SB216763, TWS119, 티데글루십, SB415286, 6-브로모인더루빈-3-옥심 및 발프로에이트 염으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 GSK-3 억제제는 CHIR99021인, 방법.
118. 실시양태 117에 있어서, 단계 (i*)의 기본 배지에서 GSK3-억제제는 CHIR99021인, 방법.
119. 실시양태 118에 있어서, 단계 (i*)에서 기본 배지는 0.1-10 μM CHIR99021, 바람직하게는 0.2-9 μM, 보다 바람직하게는 0.3-8 μM, 보다 더 바람직하게는 0.4-7 μM, 보다 더욱 바람직하게는 0.5-6 μM, 보다 바람직하게는 0.6-5 μM, 보다 바람직하게는 0.7-4 μM, 보다 바람직하게는 0.8-3 μM, 가장 바람직하게는 0.9-2 μM, 및 보다 가장 바람직하게는 약 1 μM CHIR99021의 최종 농도를 포함하는, 방법.
120. 실시양태 89 내지 119 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i*)에서 기본 배지는 기본 배지 중에 0.1-10 ng/ml, 바람직하게는 1-9 ng/ml, 보다 바람직하게는 2-8 ng/ml, 보다 더 바람직하게는 3-7 ng/ml, 가장 바람직하게는 4-6 ng/ml, 및 보다 가장 바람직하게는 약 5 ng/ml FGF2의 최종 농도를 포함하는, 방법.
121. 실시양태 89 내지 120 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i*)에서 사용되는 기본 배지는 0.2-20 mM, 보다 바람직하게는 0.4-10 mM 글루타민, 보다 바람직하게는 0.5-5 mM 글루타민, 보다 더 바람직하게는 1-3 mM 글루타민, 보다 더 바람직하게는 1.8-2.2 mM 글루타민, 더 바람직하게는 약 2 mM 글루타민을 포함하고, 가장 바람직하게는 글루타민은 L-알라닐-L-글루타민 디펩티드로서 존재하는, 방법.
122. 실시양태 89 내지 121 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i*)에서 기본 배지는 10-1000 μM, 바람직하게는 50-400 μM, 보다 바람직하게는 100-300 μM, 보다 더 바람직하게는 150-250 μM, 및 가장 바람직하게는 약 200　μM의 아스코르브산 또는 이의 유도체를 추가로 포함하는, 방법.
123. 실시양태 89 내지 122 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i*)에서 무혈청 보충제는 기본 배지 중에 0.25-25 mg/ml 알부민, 0.5-50 μg/ml 트랜스페린, 0.05-5 μg/ml 에탄올아민, 7.2-723 nM 셀레늄 또는 이의 생체이용가능 염, 0.2-20 μg/ml L-카르니틴, 0.25-25 μg/ml 지방산 보충제, 및 0.00005-0.05 μg/ml 트리오도-L-티로닌(T3)의 최종 농도를 제공하도록 제형화되는, 방법.
124. 실시양태 89 내지 123 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i*)의 기본 배지 중에 무혈청 보충제는 표 1a에 명시된 바와 같이 0.1-10%(v/v) B27 마이너스 인슐린, 바람직하게는 0.5-8% (v/v), 보다 바람직하게는 1-6% (v/v), 보다 더 바람직하게는 1.5-4% (v/v), 및 보다 더 바람직하게는 약 2% (v/v) B27 마이너스 인슐린으로 제공되는, 방법.
125. 실시양태 89 내지 124 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i**)는 5-9일 동안 수행되고, 바람직하게는 단계 (i**)는 6-8일 동안 수행되고, 더욱 바람직하게는 단계 (i**)는 6.5-7.5일 동안 수행되고, 가장 바람직하게는 단계 (i**)는 약 7일 동안 수행되는, 방법.
126. 실시양태 89 내지 125 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i**)의 기본 배지는 10-1000 μM, 바람직하게는 50-400 μM, 보다 바람직하게는 100-300 μM, 보다 더 바람직하게는 150-250 μM, 보다 더 바람직하게는 약 200　μM의 아스코르브산 또는 이의 유도체를 추가로 포함하고, 및 가장 바람직하게는 아스코르브산의 유도체는 아스코르베이트-2-포스페이트인, 방법.
127. 실시양태 89 내지 126 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i**)에서 사용되는 기본 배지는 RPMI, DMEM, αMEM, DMEM/F12, StemPro, 및 Iscove's 배지이고, 가장 바람직하게는 기본 배지는 RPMI인, 방법.
128. 실시양태 127에 있어서, 단계 (i**)에서 사용되는 기본 배지는 피루베이트를 포함하는 RPMI인, 방법.
129. 실시양태 128에 있어서, 단계 (i**)에서 사용되는 기본 배지는 0.1-10 mM 피루베이트, 바람직하게는 0.2-5 mM 피루베이트, 보다 바람직하게는 0.4-2.5 mM 피루베이트, 보다 바람직하게는 0.8-1.5 mM 피루베이트, 보다 바람직하게는 0.9-1.2 mM 피루베이트, 가장 바람직하게는 약 1 mM 피루베이트를 포함하는 RPMI인, 방법.
130. 실시양태 89 내지 129 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i**)에서 기본 배지는 5-500 ng/ml BMP4, 바람직하게는 10-250 ng/ml BMP4, 보다 바람직하게는 20-125 ng/ml BMP4, 보다 더 바람직하게는 35-70 ng/ml BMP4, 보다 더 바람직하게는 40-60 ng/ml BMP4, 보다 더 바람직하게는 45-55 ng/ml BMP4, 및 가장 바람직하게는 약 50 ng/ml BMP4의 최종 농도를 포함하는, 방법.
131. 실시양태 89 내지 130 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i**)에서 기본 배지는 0.4-40 μM 레티노산(RA), 바람직하게는 0.8-20 μM RA, 보다 바람직하게는 1.6-10 μM RA, 보다 더 바람직하게는 2-8 μM RA, 보다 더욱 바람직하게는 2.5-7 μM RA, 보다 더 바람직하게는 2.8-6 μM RA, 보다 더 바람직하게는 3-5 μM RA, 가장 바람직하게는 3.5-4.5 μM RA, 및 보다 가장 바람직하게는 약 4 μM RA의 최종 농도를 포함하는, 방법.
132. 실시양태 89 내지 131 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i**)에서 GSK-3 억제제는 CHIR99021, CHIR98014, SB216763, TWS119, 티데글루십, SB415286, 6-브로모인더루빈-3-옥심 및 발프로에이트 염으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 GSK-3 억제제는 CHIR99021인, 방법.
133. 실시양태 132에 있어서, 단계 (i**)의 기본 배지에서 GSK3-억제제는 CHIR99021인, 방법.
134. 실시양태 133에 있어서, 단계 (i**)에서 기본 배지는 기본 배지 중에 0.1-10 μM CHIR99021, 바람직하게는 0.2-9 μM, 보다 바람직하게는 0.3-8 μM, 보다 더 바람직하게는 0.4-7 μM, 보다 더욱 바람직하게는 0.5-6 μM, 보다 바람직하게는 0.6-5 μM, 보다 바람직하게는 0.7-4 μM, 보다 바람직하게는 0.8-3 μM, 가장 바람직하게는 0.9-2 μM, 및 가장 바람직하게는 약 1 μM CHIR99021의 최종 농도를 포함하는, 방법.
135. 실시양태 89 내지 134 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i**)에서 기본 배지는 0.3-30 μg/ml 인슐린, 바람직하게는 0.5-20 μg/ml, 보다 바람직하게는 1-15 μg/ml, 보다 더 바람직하게는 1.5-10 μg/ml, 보다 더욱 바람직하게는 2-5 μg/ml, 보다 더 바람직하게는 2.5-3.5 μg/ml, 가장 바람직하게는 약 3 μg/ml 인슐린의 최종 농도를 포함하는, 방법.
136. 실시양태 89 내지 135 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i**)에서 사용되는 기본 배지는 0.2-20 mM 글루타민, 보다 바람직하게는 0.4-10 mM, 보다 바람직하게는 0.5-5 mM, 보다 바람직하게는 1-3 mM, 보다 바람직하게는 1.8-2.2 mM, 더 바람직하게는 약 2 mM 글루타민을 포함하고, 가장 바람직하게는 여기서 글루타민은 L-알라닐-L-글루타민 디펩티드로서 존재하는, 방법.
137. 실시양태 89 내지 136 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i**)에서 무혈청 보충제는 기본 배지 중에 0.25-25 mg/ml 알부민, 0.5-50 μg/ml 트랜스페린, 0.05-5 μg/ml 에탄올아민, 7.2-723 nM 셀레늄 또는 이의 생체이용가능 염, 특히 소듐 셀레나이트, 0.2-20 μg/ml L-카르니틴, 0.25-25 μg/ml 지방산 보충제, 및 0.00005-0.05 μg/ml 트리오도-L-티로닌(T3)의 최종 농도를 제공하도록 제형화되는, 방법.
138. 실시양태 89 내지 137 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i**)의 기본 배지에 무혈청 보충제 및 인슐린은 표 1b에 명시된 바와 같이 B27에 의해 제공되고, 바람직하게는 여기서 무혈청 보충제 및 인슐린은 0.1-10% (v/v) B27 배지, 보다 바람직하게는 0.5-8% (v/v) B27, 보다 바람직하게는 1-6% B27 (v/v), 보다 더 바람직하게는 1.5-4% (v/v) B27, 보다 더 바람직하게는 약 2% (v/v) B27로 제공되는, 방법.
139. 실시양태 89 내지 138 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i a1), (i a2) 및 (ii)에서 기본 배지는 0.2-20 mM 글루타민, 바람직하게는, 0.5-10 mM 글루타민, 보다 바람직하게는 0.75-5 mM 글루타민, 보다 바람직하게는 1-3 mM 글루타민, 보다 바람직하게는 1.5-2.5 mM 글루타민, 및 가장 바람직하게는 약 2 mM 글루타민의 최종 농도를 포함하고, 가장 바람직하게는 여기서 글루타민은 L-알라닐-L-글루타민 디펩티드로서 존재하는, 방법.
140. 실시양태 91 내지 139 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i a1 및 i a2)는 14-28일 동안 수행되고, 바람직하게는 단계 (i a1 및 i a2)는 15-25일 동안 수행되고, 보다 바람직하게는 단계 (i a1 및 i a2)는 16-23일 동안 수행되고, 가장 바람직하게는 단계 (i a1 및 i a2)는 17-21일 동안 수행되는, 방법.
141. 실시양태 89 내지 140 중 어느 하나에 있어서, 기질은 플레이트 또는 비드이고, 바람직하게는 기질은 플레이트인, 방법.
142. 전술한 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i*) 이전에 시딩 단계를 포함하고, 여기서 상기 만능 줄기 세포는 라미닌 코팅된 기질 상에 시딩되는, 방법.
143. 실시양태 142에 있어서, 만능 줄기 세포는 라미닌 코팅된 플레이트 상에 시딩되는, 방법.
144. 실시양태 142 또는 143에 있어서, 시딩 단계에 사용되는 배지는 ROCK-억제제를 추가로 포함하는, 방법.
145. 실시양태 144에 있어서, ROCK-억제제는 Y27632, H-1152P, 티아조비빈, 파수딜, 하이드록시파수딜, GSK429286A, 및 RKI-1447로부터 선택되고, 바람직하게는 Y27632, H-1152P, 티아조비빈, 파수딜, 하이드록시파수딜로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 ROCK-억제제는 Y27632 또는 H-1152P인, 방법.
146. 실시양태 145에 있어서, ROCK-억제제는 Y27632인, 방법.
147. 실시양태 148에 있어서, 시딩 단계에 사용되는 배지는 1-50 μM, 바람직하게는 2.5-40 μM, 보다 바람직하게는 5-30 μM, 보다 더 바람직하게는 7.5-20 μM, 가장 바람직하게는 8-12 μM, 및 가장 바람직하게는 약 10　μM Y27632를 포함하는, 방법.
148. 실시양태 142 내지 147 중 어느 하나에 있어서, 시딩 단계는 단계 (i*)의 24-120시간 전, 보다 바람직하게는 48-108시간 전, 가장 바람직하게는 96시간 전에 수행되는, 방법.
149. 심장 간질 세포의 단리된 집단으로서, 상기 심장 간질 세포는 만능 줄기 세포의 분화에 의해 얻어지고, 심장 간질 세포 집단의 세포 중 적어도 약 80%는 CD90, CD73 및 CD44를 발현하는, 심장 간질 세포의 단리된 집단.
150. 실시양태 149에 있어서, 유세포 측정법에 의해 결정된 바와 같이 단계 (ii)에 의해 수득된 심장 간질 세포 집단의 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 81%, 보다 바람직하게는 적어도 82%, 보다 더 바람직하게는 적어도 83%, 보다 더 바람직하게는 적어도 84%, 보다 더 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 86%, 보다 더 바람직하게는 적어도 87%, 보다 더 바람직하게는 적어도 88%, 보다 더 바람직하게는 적어도 89%, 및 가장 바람직하게는 적어도 90%는 CD44를 발현하는, 심장 간질 세포의 단리된 집단.
151. 실시양태 149 또는 150에 있어서, 심장 간질 세포 집단의 세포 중 적어도 약 90%는 CD44를 발현하는, 심장 간질 세포의 단리된 집단.
152. 실시양태 149 내지 151 중 어느 하나에 있어서, 유세포 측정법에 의해 결정된 바와 같이 단계 (ii)에 의해 수득된 심장 간질 세포 집단의 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 81%, 보다 바람직하게는 적어도 82%, 보다 더 바람직하게는 적어도 83%, 보다 더 바람직하게는 적어도 83%, 보다 더 바람직하게는 적어도 84%, 보다 더 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 86%, 보다 더 바람직하게는 적어도 87%, 보다 더 바람직하게는 적어도 88%, 보다 더 바람직하게는 적어도 89%, 및 가장 바람직하게는 적어도 90%는 CD90을 발현하는, 심장 간질 세포의 단리된 집단.
153. 실시양태 149 내지 152 중 어느 하나에 있어서, 심장 간질 세포 집단의 세포 중 적어도 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%는 CD90을 발현하는, 심장 간질 세포의 단리된 집단.
154. 실시양태 149 내지 153 중 어느 하나에 있어서, 유세포 측정법에 의해 결정된 바와 같이 단계 (ii)에 의해 수득된 심장 간질 세포 집단의 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 81%, 보다 바람직하게는 적어도 82%, 보다 더 바람직하게는 적어도 83%, 보다 더 바람직하게는 적어도 84%, 보다 더 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 86%, 보다 더 바람직하게는 적어도 87%, 보다 더 바람직하게는 적어도 88%, 보다 더 바람직하게는 적어도 89%, 및 가장 바람직하게는 적어도 90%는 CD73을 발현하는, 심장 간질 세포의 단리된 집단.
155. 실시양태 149 내지 154 중 어느 하나에 있어서, 심장 간질 세포 집단의 세포 중 적어도 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%는 CD73을 발현하는, 심장 간질 세포의 단리된 집단.
156. 실시양태 149 내지 155 중 어느 하나에 있어서, 심장 간질 세포 집단의 세포 중 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%는 CD44를 발현하는, 심장 간질 세포의 단리된 집단.
157. 실시양태 149 내지 156 중 어느 하나에 있어서, 심장 간질 세포 집단의 세포 중 적어도 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%는 비멘틴을 발현하는, 심장 간질 세포의 단리된 집단.
158. 실시양태 149 내지 157 중 어느 하나에 있어서, 유세포 측정법에 의해 결정된 바와 같이 단계 (i) a2)에 의해 수득된 심장 간질 세포 집단의 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 81%, 보다 바람직하게는 적어도 82%, 보다 더 바람직하게는 적어도 83%, 보다 더 바람직하게는 적어도 84%, 보다 더 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 86%, 보다 더 바람직하게는 적어도 87%, 보다 더 바람직하게는 적어도 88%, 보다 더 바람직하게는 적어도 89%, 및 가장 바람직하게는 적어도 90%는 비멘틴을 발현하는, 심장 간질 세포의 단리된 집단.
159. 실시양태 149 내지 158 중 어느 하나에 있어서, 유세포 측정법에 의해 결정된 바와 같이 단계 (i) a2)에 의해 수득된 심장 간질 세포 집단의 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 91%, 보다 바람직하게는 적어도 92%, 보다 더 바람직하게는 적어도 93%, 보다 더 바람직하게는 적어도 94%, 보다 더 바람직하게는 적어도 95%, 보다 더 바람직하게는 적어도 96%, 보다 더 바람직하게는 적어도 97%, 보다 더 바람직하게는 적어도 98%는 비멘틴을 발현하는, 심장 간질 세포의 단리된 집단.
160. 실시양태 149 내지 159 중 어느 하나에 있어서, 심장 간질 세포 집단의 세포 중 적어도 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%는 콜라겐-1을 발현하는, 심장 간질 세포의 단리된 집단.
161. 실시양태 149 내지 160 중 어느 하나에 있어서, 유세포 측정법에 의해 결정된 바와 같이 단계 (i) a2)에 의해 수득된 심장 간질 세포 집단의 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 82%, 보다 바람직하게는 적어도 82%, 보다 더 바람직하게는 적어도 84%, 보다 더 바람직하게는 적어도 86%, 보다 더 바람직하게는 적어도 88%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 보다 더 바람직하게는 적어도 91%, 보다 더 바람직하게는 적어도 92%, 보다 더 바람직하게는 적어도 93%, 보다 더 바람직하게는 적어도 94%, 보다 더 바람직하게는 적어도 95%, 보다 더 바람직하게는 적어도 96%, 및 가장 바람직하게는 적어도 97%는 콜라겐 1을 발현하는, 심장 간질 세포의 단리된 집단.
162. 실시양태 149 내지 161 중 어느 하나에 있어서, 집단의 세포 중 약 95% 이상이 CD90 양성이고; 세포 중 약 99% 이상이 CD44 양성이고; 세포 중 약 99% 이상이 CD73 양성이고; 세포 중 약 97% 이상이 콜라겐 1 양성이고; 세포 중 약 98% 이상이 비멘틴 양성인, 심장 간질 세포의 단리된 집단.
163. 실시양태 149 내지 162 중 어느 하나에 있어서, 실시양태 1 내지 151 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 방법에 의해 수득 가능한 심장 간질 세포의 단리된 집단.
164. 실시양태 149 내지 163 중 어느 하나에 있어서, 실시양태 1 내지 151 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 방법에 의해 수득되는 심장 간질 세포의 단리된 집단.
165. 실시양태 149 내지 164, 205 및 206 중 어느 하나에서 정의된 심장 간질 세포의 단리된 집단을 포함하는 약학적 조성물.
166. 실시양태 165에 있어서, 약학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함하는 약학적 조성물.
167. 실시양태 149 내지 164, 205 및 206 중 어느 하나에서 정의된 바와 같거나, 실시양태 1 내지 148 및/또는 197 내지 204에 따른 방법에 의해 수득된 심장 간질 세포의 집단을 포함하는 조작된 기관 조직.
168. 실시양태 167에 있어서, 조직은 인간의 조작된 기관 조직이고, 바람직하게는 조작된 인간 기관 조직은 조작된 인간 심근인, 조작된 기관 조직.
169. 실시양태 1 내지 148 및/또는 197 내지 204에 따른 방법에 의해 수득되거나 실시양태 149 내지 164 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 심장 간질 세포(cStC) 집단의 약물 스크리닝을 위한 시험관내 모델에서의 용도.
170. 실시양태 1 내지 148 및/또는 197 내지 204에 따른 방법에 의해 수득되거나 실시양태 149 내지 164 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 심장 간질 세포(cStC) 집단의 약물 효능 스크리닝을 위한 시험관내 모델에서의 용도.
171. 실시양태 1 내지 148 및/또는 197 내지 204에 따른 방법에 의해 수득되거나 실시양태 149 내지 164 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 심장 간질 세포(cStC) 집단의 약물 독성 스크리닝을 위한 시험관내 모델에서의 용도.
171. 실시양태 1 내지 148 및/또는 197 내지 204에 따른 방법에 의해 수득되거나 실시양태 149 내지 164 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 심장 간질 세포(cStC) 집단의 조작된 기관 조직의 시험관내 생산에서의 용도.
173. 실시양태 172에 있어서, 조작된 기관 조직은 인간의 조작된 기관 조직이고, 바람직하게는 조작된 인간 조직은 조작된 인간 심근인, 용도.
174. 실시양태 172에 있어서, 조작된 기관 조직은 인간의 조작된 기관 조직이고, 바람직하게는 조작된 기관 인간 조직은 조작된 인간 결합 조직인, 용도.
175. 실시예 1 내지 151 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득되거나, 실시예 152 내지 167 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 심장 간질 세포(cStC) 집단의 연구 도구로서의 용도.
176. 의약에 사용하기 위한, 실시양태 1 내지 148 및/또는 197 내지 204에 따른 방법에 의해 수득되거나 실시양태 149 내지 164 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 심장 간질 세포(cStC) 집단.
177. 기관 복구, 바람직하게는 심장 복구 또는 연조직 복구, 보다 바람직하게는 심장 복구에 사용하기 위한, 실시양태 1 내지 148 및/또는 197 내지 204에 따른 방법에 의해 수득되거나 실시양태 149 내지 164, 205 및 206 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 심장 간질 세포(cStC) 집단.
178. 실시양태 1 내지 148 및/또는 197 내지 204 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 생산된 심장 간질 세포(cStC).
179. 실시양태 178에 있어서, 유세포 측정법에 의해 결정된 바와 같이 cStC의 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 보다 바람직하게는 90%, 보다 더 바람직하게는 92%, 보다 더 바람직하게는 94%, 가장 바람직하게는 95%는 CD90, CD44, CD73, 콜라겐 1 및/또는 비멘틴을 발현하는 심장 간질 세포(cStC).
180. (a) 무혈청 기본 배지, (b) 10-200 ng/ml FGF2, (c) 5-100 ng/ml VEGF, (d) 0.2-20 mM 글루타민, 및 (e) 1.5-180 μg/ml 아스코르브산, 2-50 μg/ml 인슐린, 1.1-27.5 μg/ml 트랜스페린, 1660-41500 μg/ml 알부민, 및 11-145 nM 셀레늄을 포함하는 ECCM 보충제를 포함하는, 심장 간질 세포의 증폭에 적합한 무혈청 세포 배양 배지.
181. 실시양태 180에 있어서, 기본 배지는 KO DMEM, DMEM, DMEM/F12, RPMI, IMDM, 알파MEM, 배지 199, Hams F-10, 또는 Hams F-12이고, 바람직하게는 기본 배지가 KO DMEM인, 세포 배양 배지.
182. 실시양태 180 또는 181에 있어서, 15-100 ng/ml FGF2, 바람직하게는 20-80 ng/ml, 보다 더 바람직하게는 30-70 ng/ml, 가장 바람직하게는 40-60 ng/ml, 및 가장 바람직하게는 약 50 ng/ml FGF2의 최종 농도를 포함하는 세포 배양 배지.
183. 180 내지 182 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 7-50 ng/ml VEGF, 바람직하게는 10-40 ng/ml, 보다 더 바람직하게는 15-35 ng/ml, 가장 바람직하게는 20-30 ng/ml, 및 가장 바람직하게는 약 25 ng/ml VEGF의 최종 농도를 포함하는 세포 배양 배지.
184. 실시양태 180 내지 183 중 어느 하나에 있어서, ECCM 보충제는 기본 배지 중에 10-80 μg/ml 아스코르브산, 4-40 μg/ml 인슐린, 2-20 μg/ml 트랜스페린, 3200-30000 μg/ml 알부민, 및 11-145 nM 셀레늄의 최종 농도를 제공하도록 제형화되는, 세포 배양 배지.
185. 실시양태 180 내지 184 중 어느 하나에 있어서, ECCM 보충제는 기본 배지 중에 15-60 μg/ml 아스코르브산, 5-30 μg/ml 인슐린, 3-12.5 μg/ml 트랜스페린, 4800-20000 μg/ml 알부민, 및 20-105 nM 셀레늄의 최종 농도를 제공하도록 제형화되는, 세포 배양 배지.
186. 실시양태 180 내지 185 중 어느 하나에 있어서, ECCM 보충제는 기본 배지 중에 27-40 μg/ml 아스코르브산, 7-15 μg/ml 인슐린, 4.5-7μg/ml 트랜스페린, 7500-9200 μg/ml 알부민, 및 30-50 nM 셀레늄의 최종 농도를 제공하도록 제형화되는, 세포 배양 배지.
187. 실시양태 180 내지 186 중 어느 하나에 있어서, ECCM 보충제는 기본 배지 중에 30-36 μg/ml 아스코르브산, 9-11 μg/ml 인슐린, 5-6 μg/ml 트랜스페린, 8000-8600 μg/ml 알부민, 및 35-45 nM 셀레늄의 최종 농도를 제공하도록 제형화되는, 세포 배양 배지.
188. 실시양태 180 내지 187 중 어느 하나에 있어서, ECCM 보충제는 기본 배지 중에 약 33 μg/ml 아스코르브산, 약 10 μg/ml 인슐린, 약 5.5 μg/ml 트랜스페린, 약 8300 μg/ml 알부민, 및 약 40.5 nM 셀레늄의 최종 농도를 제공하도록 제형화되는, 세포 배양 배지.
189. 실시양태 180 내지 188 중 어느 하나에 있어서, ECCM 보충제는 적합한 농도의 셀레늄 또는 그의 생체이용가능한 염, 글루타티온, 및 미량 원소를 추가로 포함하는, 세포 배양 배지.
190. 실시양태 180 내지 189 중 어느 하나에 있어서, ECCM은 표 2에 열거된 모든 물질을 포함하고, 바람직하게는 배양 배지는 단계 (i) a2) 및/또는 (ii)에서 표 2에 명시된 바와 같이 5-20% (v/v) ECCM, 보다 바람직하게는 6-17.5% (v/v), 보다 바람직하게는 7-15% (v/v), 보다 바람직하게는 8%-12% (v/v), 보다 바람직하게는 9%-11% (v/v), 및 가장 바람직하게는 약 10% (v/v) ECCM을 포함하는, 세포 배양 배지.
191. 실시양태 180 내지 190 중 어느 하나에 있어서, ECCM은 실시양태 26 내지 29 중 어느 하나에 정의된 바와 같이 제공되는, 무혈청 배양 배지.
192. 실시양태 180 내지 191 중 어느 하나에 있어서, 배양 배지는 0.2-20 mM 글루타민, 바람직하게는, 0.5-10 mM 글루타민, 보다 바람직하게는 0.75-5 mM 글루타민, 보다 바람직하게는 1-3 mM 글루타민, 보다 바람직하게는 1.5-2.5 mM 글루타민, 및 가장 바람직하게는 약 2 mM 글루타민의 최종 농도를 포함하고, 가장 바람직하게는 글루타민은 L-알라닐-L-글루타민 디펩티드로서 존재하는, 세포 배양 배지.
193. 약 2 mM 글루타민, 약 50 ng/ml FGF, 약 25 ng/ml VEGF 및 약 1 μM CHIR, 및 6.6-165 μg/ml 아스코르브산, 2-50 μg/ml 인슐린, 1.1-27.5 μg/ml 트랜스페린, 1660-41500 μg/ml 알부민, 및 11-145 nM 셀레늄을 포함하는 ECCM 보충제를 포함하는 녹아웃 DMEM 배지인 무혈청 기본 배지.
194. 실시양태 193에 있어서, ECCM은 실시양태 26 내지 29 중 어느 하나에 정의된 바와 같이 제공되는, 무혈청 기본 배지.
195. 약 2 mM 글루타민, 약 50 ng/ml FGF, 약 25 ng/ml VEGF, 및 6.6-165 μg/ml 아스코르브산, 2-50 μg/ml 인슐린, 1.1-27.5 μg/ml 트랜스페린, 1660-41500 μg/ml 알부민, 및 11-145 nM 셀레늄을 포함하는 ECCM 보충제를 포함하는 녹아웃 DMEM 배지인 무혈청 기본 배지.
196. 실시양태 195에 있어서, ECCM은 실시양태 26 내지 29 중 어느 하나에 정의된 바와 같이 제공되는, 무혈청 기본 배지.
197. 실시양태 1 내지 148 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i) a2) 및/또는 단계 (ii)에서 무혈청 기본 배지는 유효량의 TGF베타 억제제를 추가로 포함하는, 방법.
198. 실시양태 197에 있어서, 유효량의 TGF베타 억제제는 TGF베타 억제제가 배지 내에 포함되지 않은 심장 간질 세포 집단과 비교하여 단계 (i) a2) 및/또는 단계 (ii) 동안 심장 간질 세포의 근섬유아세포로의 전환을 감소시키고, 바람직하게는 근섬유아세포는 웨스턴 블롯에서 평활근 액틴(α-SMA)의 증가된 발현에 의해 검출가능하고, 보다 바람직하게는 α-SMA의 발현은 TGF베타 억제제가 배지 내에 포함되지 않은 심장 간질 세포의 집단과 비교하여 적어도 1.5배, 보다 바람직하게는 2배, 보다 바람직하게는 2.5배, 보다 더 바람직하게는 3배, 보다 더 바람직하게는 4배 및 보다 더 바람직하게는 적어도 5배, 및 최대 100배 만큼 감소되는 방법.
199. 실시양태 197 또는 198에 있어서, 유효량의 TGF베타 억제제는 TGF베타 억제제가 배지 내에 포함되지 않은 심장 간질 세포 집단과 비교하여 단계 (i) a2) 및/또는 단계 (ii) 동안 스트레스 섬유를 나타내는 세포의 백분율을 감소시키고, 바람직하게는 스트레스 섬유는 광학 현미경으로 세포의 형태에 의해 검출가능하고, 보다 바람직하게는 스트레스 섬유를 나타내는 세포의 백분율은 TGF베타 억제제가 배지 내에 포함되지 않은 심장 간질 세포의 집단과 비교하여 적어도 20%, 보다 바람직하게는 적어도 40%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 보다 더 바람직하게는 적어도 60% 및 최대 100% 만큼 감소되는 방법.
200. 실시양태 197 내지 199 중 어느 하나에 있어서, 유효량의 TGF베타 억제제는 TGF베타 억제제가 배지 내에 포함되지 않은 심장 간질 세포 집단과 비교하여 단계 (i) a2) 및/또는 단계 (ii) 동안 알파 평활근 액틴의 발현을 감소시키고, 바람직하게는 평활근 액틴의 발현은 유세포 측정법에 의해 측정된 세포의 평균 형광 강도에 의해 검출되고, 보다 바람직하게는 평균 형광 강도는 TGF베타 억제제가 배지 내에 포함되지 않은 심장 간질 세포 집단과 비교하여 적어도 5%, 보다 바람직하게는 적어도 10%, 보다 바람직하게는 적어도 20%, 보다 바람직하게는 적어도 30%, 보다 바람직하게는 적어도 40%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 60%, 보다 더 바람직하게는 적어도 70% 만큼 감소되는, 방법.
201. 실시양태 197 내지 200 중 어느 하나에 있어서, 유효량의 TGF베타 억제제는 TGF베타 억제제가 배지 내에 포함되지 않은 심장 간질 세포 집단과 비교하여 단계 (i) a2) 및/또는 단계 (ii) 동안 집단 배가 수준(PDL)을 증가시키고, 바람직하게는 여기서 PDL의 증가는 TGF베타 억제제가 배지 내에 포함되지 않은 심장 간질 세포 집단과 비교하여 적어도 1.25배, 보다 바람직하게는 1.5배, 보다 바람직하게는 1.75배, 보다 더 바람직하게는 2배, 보다 더 바람직하게는 2.5배, 보다 더 바람직하게는 3배, 및 보다 더 바람직하게는 3.5배 및 최대 20배인, 방법.
202. 실시양태 197 내지 201 중 어느 하나에 있어서, TGF베타 억제제는 SB431542, RepSox, LY2157299, A83-01, 및 Tranilast로 이루어진 목록으로부터 선택되고, 바람직하게는 TGF베타 억제제는 SB431542인, 방법.
203. 실시양태 197 내지 202 중 어느 하나에 있어서, 단계 (i) a2) 및/또는 단계 (ii)의 무혈청 기본 배지는 1-100 μM SB431542, 바람직하게는 2-90 μM, 보다 바람직하게는 3-80 μM, 보다 더 바람직하게는 4-70 μM, 보다 더욱 바람직하게는 5-50 μM, 보다 바람직하게는 6-40 μM, 보다 바람직하게는 7-30 μM, 보다 바람직하게는 8-20 μM, 가장 바람직하게는 9-15 μM, 및 보다 가장 바람직하게는 약 10 μM SB431542의 최종 농도를 포함하는, 방법.
204. 실시양태 1 내지 148 또는 197 내지 203 중 어느 하나에 있어서, 만능 줄기 세포는 포유동물 만능 줄기 세포이고, 바람직하게는 만능 줄기 세포는 영장류 줄기 세포이고, 보다 바람직하게는 만능 줄기 세포는 레서스 히말라야 원숭이(rhesus macaque) 또는 인간 만능 줄기이고, 보다 더 바람직하게는 만능 줄기 세포는 인간 만능 줄기 세포인, 방법.
205. 실시양태 149 내지 164 중 어느 하나에 있어서, 집단은 무혈청 방법에 의해 수득되고, 바람직하게는 집단은 무혈청 및 무매트리겔 방법에 의해 수득되는, 심장 간질 세포의 단리된 집단.
206. 실시양태 149 내지 164 및 205 중 어느 하나에 있어서, 집단은 정제 단계, 바람직하게는 항체-보조 정제 단계, 바람직하게는 세포 분류에 의한 항체-보조 정제, 보다 바람직하게는 CD105, CD90, CD44 및/또는 CD73에 대한 세포 분류에 의한 항체-보조 정제, 보다 더 바람직하게는 CD105에 대한 세포 분류에 의한 항체-보조 정제를 포함하지 않는 방법에 의해 수득되는, 심장 간질 세포의 단리된 집단.
도 1: (A) 안정적인 표현형을 가진 확장 가능한 간질 세포 생산. 심외막 세포에서 시작하여 심장 간질 세포로 이어지는 분화/증폭 방법의 개요 및 발생 순서. 단계 (i) a1)에서, 심외막 세포를 (a) FGF, (b) VEGF, (c) 글루타민(Gln) 및 GSK-3 억제제(예: 1 μM CHIR)를 포함하는 무혈청 기본 배지(예를 들어 KO DMEM)에서 제1 세포외 기질 단백질(예를 들어 라미닌)의 존재하에 배양하여 상피-중간엽 전이(EMT)를 유도하였다. 이 단계는 2-8일, 바람직하게는 4일이 소요되었다. 상기 단계의 완료 후, 세포의 적어도 50%가 CD90을 발현하고, 세포의 최대 50%가 CD73을 발현하고, 세포의 최대 30%가 CD44를 발현하였다. 상기 단계에 이어 단계 (i) a2)가 이어졌고, 여기서 세포는 (a) FGF, (b) VEGF 및 (c) 글루타민(Gln)을 포함하는 기본 배지(예를 들어 KO DMEM)에서 제2 세포외 기질 단백질(예: 비트로넥틴)의 존재하에 계대되고 추가 배양되었다. 상기 단계는 10-20일, 바람직하게는 13일이 소요되었으며, 세포는 일반적으로 5-10일 완료 후 한번 더 계대하였다. 단계 (i) a2) 완료 후, 세포의 적어도 80%가 CD90, CD73 및 CD44를 발현하도록 심장 간질 세포로 세포를 분화시켰다. 단계 (ii)는 무혈청 조건에서 심장 간질 세포를 증폭하였다. 구체적으로, (a) FGF, (b) VEGF, (c) 글루타민(Gln)을 포함하는 무혈청 기본 배지(KO DMEM)에서 적어도 제3 세포외 기질 단백질(예: 비트로넥틴)의 존재하에 세포를 배양하여 심장 간질 세포의 수를 증폭시켰다. 심장 간질 세포는 상기 배지에서 반복적으로 증폭될 수 있고 심장 간질 세포는 심장 간질 세포의 적어도 80%에서 CD90, CD73 및 CD44의 유지된 발현을 나타낸다.
(B) 인간 만능 줄기 세포가 심외막 세포로 분화되기 -14일 전에 인간 미분화 유도 만능 줄기 세포의 투과조명; 방법의 0일째(심외막 세포의 단계); 및 방법의 17일째(심장 간질 세포의 단계); 척도는 각각 100 μm(-14일) 및 20 μm(0일 및 17일)이다.
(C) 0일째(방법의 단계 (i) a1) 전)에 분화 및 증폭 프로토콜의 면역 형광 이미지. 왼쪽 패널은 F-액틴의 발현을 나타내고, 중간 패널은 윌름스 종양 항원 1(WT1)의 발현을 나타내고, 오른쪽 패널에서는 핵이 염색되었다.
도 2: 분화 프로토콜의 스케일링 및 간질 세포 증폭.
(A) 심장 간질 세포로의 iPSC 분화(추가적인 세부 사항은 도 8 참조)(프로토콜 단계 (i*, i** 및 i)의 완료에 의해 계대 4에서 수득) 및 방법 단계 (ii)를 따른 계대 4에서 계대 9(즉, 5 계대)로의 심장 간질 세포의 증폭의 예시적인 절차. 예를 들어, 방법은 중배엽 유도 시작(단계 (i*) 6일) 96시간 전에 T75 배양 플라스크 1개당 ~1x10E6 iPSC(성장 표면적: 75 cm2)를 시딩하는 것으로 시작하였다. -7 배양일에 얻은 세포를 6개의 T225 배양 플라스크(성장 표면적: T225 플라스크당 225 cm2)에 계대시킨 후, (전)심외막-유사 세포의 형성을 배양 0일까지 7일 동안 유도한 후(단계 (i**)), EMT를 유도하였다(단계 (i)). 단계 (i)는 2개의 하위 단계로 구성되었다: 배양 4일까지 단계 (i) a1), 이어 단계 (i) a2), 배양 4일에 단계 (i)a1)에 의해 수득된를 12개의 T225 배양 플라스크에서 1:2 계대하고 이어서 배양 11일에 다른 12개의 T225 배양 플라스크에서 1:1 후속 계대. 단계 (i) a2)는 배양 17-21일에 수득한 심장 간질 세포를 24개의 T225 배양 플라스크에 1:2로 계대하여 완료하였다. 다음 증폭 단계 (ii)는 매 7일(매주) 계대를 포함하며, 평균 집단은 매 2.1일마다 두 배, 즉 계대당 3.3배 증폭되었다. 심장 간질 세포의 평균 출력은 계대 4 후 ㎠당 1x10E5 세포였다; 재시딩을 cm2 당 3x10E4 세포로 수행하였다. 실제적인 이유로, 즉, 예를 들어 제한된 플레이트 처리 용량 및 필요한 한정된 심장 간질 세포 양으로 인해 최대 플레이트 수보다 적은 수의 플레이트가 수동 세포 증폭 과정에서 전형적으로 사용된다. 잉여 심장 간질 세포는 각 계대 끝에 심장 간질 세포 표현형을 손상시키지 않고 표준 프로토콜을 사용하여 저온 보존될 수 있다. 사용된 저온 보존 프로토콜에 따라 심장 간질 세포 회수율에 차이가 있을 수 있다. 회수율은 전형적으로 저온 보존된 심장 간질 세포 양의 60-80%이다.
(B) 무혈청 조건 하에서 간질 세포 증폭(단계 (ii)) 동안 얻은 집단 배가 수준에 대한 데이터. 2.1±0.4일의 평균 배가 시간에 따라 3.3 계대 사이의 평균 집단 배가 수준에서 계대 간 세포의 ~90%의 유효 전달을 고려하여 계대당 심장 간질 세포 수율의 3배 증가가 패널(A)에서 5 계대에 대한 심장 간질 세포 증폭 성장 영역의 계산에서 예상되고 고려될 수 있다; 5 계대에 걸친 유효 세포 배가는 15배였다. 일정한 심장 간질 세포 표현형(예: 도 3D에서 입증됨)으로 15 계대는 예를 들어 심장 간질 세포 수의 50배 증가를 허용할 수 있다.
도 3: 심장 간질 세포 및 그 전구체의 분화 및 증폭 동안 표현형 모니터링.
(A) 유세포 분석법에 의한 심장 간질 세포의 특성화. 개시된 방법의 단계 (i) a1 및 (i) a2)(및 선택적으로 도 8에 기재된 바와 같은 단계 (i*) 및 (i**))에 따른 배양에서 17일 후 마커(콜라겐 1, 비멘틴, CD90, CD73 및 CD44)의 발현. 세포의 95%는 CD90 양성이었고; 세포의 99%는 CD44 양성이었고; 세포의 99%는 CD73 양성이었고; 세포의 97%는 콜라겐-1 양성이었고; 세포의 98%는 비멘틴 양성이었다. 음성 대조군은 단지 3% 배경 신호만을 나타냈다.
(B) 면역형광에 의한 심장 간질 세포의 특성화. 상부 패널에서 비멘틴, 항인간 섬유아세포 항체(클론 TE-7, Millipore) 및 콜라겐-1(Abcam)의 발현. 해당 핵 표지는 하부 패널에 표시된다. 막대: 50 μm.
(C) 분화 프로토콜의 표시된 단계에서 표면 마커 CD90, CD73 및 CD44뿐만 아니라 중간 필라멘트 VIM(비멘틴)의 발현.
단계 (i*) 완료 후(-7 배양일; 도 8 참조) 세포의 90% 초과가 CD90을 발현하고, 세포의 10% 미만이 CD73을 발현하고, 10% 미만이 CD44를 발현하고, 40% 초과가 비멘틴을 발현하였다.
하위 단계 완료 후(i a1 - 배양 4일) 세포의 적어도 50% 초과가 CD90을 발현하고; 세포의 50% 미만이 CD73을 발현하고; 세포의 30% 미만이 CD44를 발현하였고, 세포의 80% 초과가 비멘틴을 발현하였다.
배양 17일에(단계 (i) a2) 동안) 90% 초과 세포에서 마커 CD90, CD73 및 비멘틴이 발현되었고, 80% 초과 세포에서 마커 CD44가 발현되었다.
단계 완료 후(ia2 - 배양 17일) 90% 초과 세포에서 마커 CD90, CD73, CD44 및 비멘틴이 발현되었다.
(D) 표면 마커 CD90, CD73 및 CD44의 발현은 단계 (ii), 즉 증폭 동안 세포의 >90%에서 안정적이었다. 계대 9, 즉 증폭 단계 (ii)에서 5 계대에서 얻은 데이터는 유지된 발현으로 나타난 광범위한 계대 후 심장 간질 세포 표현형의 안정성을 입증한다(비교를 위해 데이터는 도 3A 및 3C의 계대 4에 표시됨; 도 3A의 데이터는 도 3C 및 3D에서 얻은 데이터에 대한 독립 실험에서 얻은 것이다).
도 4: 다양한 세포 집단의 발현 프로파일.
(A) 미분화 iPSC, iPSC 유래 심근 세포(CM), iPSC-유래 간질 세포 및 심장 유래 일차 심장 섬유아세포(대조군으로서)에서 CD140a, 비멘틴(VIM) 및 콜라겐-1(COL1A1)의 백만 매핑 판독마다 킬로베이스당 판독값(RPKM)으로 표시되는 전사 풍부도를 갖는 RNA 시퀀싱에 의해 평가된 유전자 발현. 평균 RPKM 값은 패널에 표시된다. N=그룹당 2-5.
(B) 미분화 iPSC, iPSC 유래 심근 세포(CM), iPSC 유래 간질 세포(StC) 및 심장 유래 일차 심장 섬유아세포(대조군으로서)에서 CD90, CD73 및 CD44의 백만 매핑된 판독마다 킬로베이스당 판독값(RPKM)으로 표시되는 전사 풍부도를 갖는 RNA 시퀀싱에 의해 평가된 유전자 발현. 평균 RPKM 값은 패널에 표시된다. N=그룹당 2-5.
도 5: 전사체 분석에 의한 심장 간질 세포의 특성화.
(A) 심장 간질 세포(cStC, n=2), 일차 심장 섬유아세포(n=3), 신생아 피부 섬유아세포(n=2) 및 치은 섬유아세포(n=3)의 전사체를 비교하였다. (A) 주성분 분석은 총 분산의 46%가 주성분 1에 기인할 수 있음을 나타낸다.
(B) 문헌으로부터의 특징적인 유전자뿐만 아니라 PC1의 상위 100개 변이 유발 유전자에 대한 자세한 분석은 간질 세포의 발현 패턴이 피부 및 치은 섬유아세포보다 일차 심장 섬유아세포와 더 비슷하다는 것을 나타낸다. 이 분석은 분화/증폭 방법에 따른 일차 심장 섬유아세포와 심장 간질 세포의 발현 패턴이 현저하게 유사함을 보여준다.
(C) 상부 패널: TGFβ1 및/또는 안지오텐신 II에 의한 프로콜라겐 단백질 및 평활근 액틴 및 CTGF의 유도. 하부 패널: 전섬유성 자극이 심장 간질 세포에서 근섬유아세포 마커(평활근 작용 및 CTGF)를 유도함을 보여주는 웨스턴 블롯 분석. 표시된 농도에서 24시간 동안 안지오텐신 II(Ang II) 및/또는 TGFβ1과 함께 인큐베이션한 후 심장 간질 세포에서 근섬유아세포 단백질의 발현. 페리오스틴(POSTN)의 안정한 발현은 심장 섬유아세포 특이적 표현형을 입증한다. 튜불린이 부하 대조군로 사용되었다. 또한, 비자극 조건 하의 심장 간질 세포가 대조군으로 제공되었다(웨스턴 블롯의 첫 번째 및 마지막 레인 참조).
도 6: 조작된 심장 심근 및 조작된 결합 조직에서 심장 간질 세포의 용도.
(A) 심장 간질 세포는 기능적으로 조작된 인간 심근(EHM)의 생성을 지원한다. 생성된 (iPSC 유래) 심장 간질 세포(iPSC-cStC) 및 일차 심장 섬유아세포(심장 섬유; Lonza에서 구입)를 [Tiburcy et al. 2017]에 따라 EHM 제제의 보충제로 비교하였으며, 즉 EHM은 70% 심근 세포 및 30% 심장 섬유아세포 또는 심장 간질 세포로 구성되었다(n=4/그룹). EHM의 수축력(FOC)이 등척성 조건, 2 mmol/L의 세포외 칼슘 농도 및 표준 프로토콜(Tiburcy et al. 2017)을 사용하여 1.5 Hz에서 전기장 자극 하에서 평가되었다. 평균 ± 평균의 표준 오차가 열에 표시된다.
(B) 일차 심장 섬유아세포 또는 심장 간질 세포로 만든 조작된 결합 조직(ECT)의 강성. ECT를 5 ng/ml TGFb1로 5일 동안 처리하였다. 그룹당 n=3, 일원 ANOVA 및 Tukey 사후 검정에 의해 *p>0,05. RSA-G2 레오미터(TA Instruments)를 사용하여 파괴 인장 응력 시험으로 강성을 측정하고 응력-변형 곡선의 기울기로부터 영률로 계산하였다(E; Santos et al. 2019). 평균 ± 평균 표준 오차가 열에 표시된다.
도 7: 증폭 단계 (ii)는 세포외 기질 단백질을 필요로 한다.
세포를 비트로넥틴, 라미닌(LN-521), 젤라틴, 피브로넥틴, 매트리겔 또는 비코팅 플레이트 상에서 계대 5 및 계대 6(증폭 단계 (ii) 동안) 동안 배양하였다. 모든 코팅에서 성장이 검출되었지만, 비코팅 플레이트에서는 성장이 검출되지 않았다. 비교에 따르면 세포외 기질 단백질로 코팅하는 것이 심장 간질 세포 증폭에 필수적이라는 것을 보여준다. 코팅은 바람직하게는 비트로넥틴, 라미닌-521, 젤라틴, 피브로넥틴과 같은 한정된 물질을 사용하여 이루어질 수 있으나; 매트리겔과 같은 미한정 코팅도 적용될 수 있다. 이미지를 명시야 현미경으로 얻었다. 막대: 50 μm
도 8: 안정적인 표현형을 가진 확장 가능한 간질 세포 생산.
인간 만능 줄기 세포(hPSC) 공급원에서 심장 간질 세포의 유도에 대한 일례의 개요 및 발생 순서. 중배엽 분화를 유도하기 위해, 단계 (i*)에서 세포를 인슐린, 아스코르브산 및 피루베이트 없이 B27이 보충된 RPMI 배지에서 라미닌(LN-521) 코팅된 플레이트에서 배양하였다. 배지는 10 ng/ml BMP4, 3 ng/ml ActA, 1 μM CHIR 및 5 ng/ml FGF2를 추가로 포함하였다. 이 단계 (i*)에서 다음 단계 (i**)로의 계대까지 6일이 걸렸다. 심외막 분화를 유도하기 위해, 단계 (i**)에서 세포를 인슐린, 아스코르브산 및 피루베이트와 함께 B27이 보충된 RPMI 배지에서 라미닌(LN-521) 코팅된 플레이트에서 배양하였다. 배지는 50 ng/ml BMP4, 1 μM CHIR 및 4 μM 레티노산을 추가로 포함하였다. 이 단계 (i**)는 다음 단계 (i a1)로 추가 계대 없이 7일(6-13일)이 걸렸다. 상피-중간엽 전이(EMT)를 유도하기 위해(단계 i a1), 배양 배지를 FGF2, VEGF, 글루타민 및 아스코르브산, 인슐린, 트랜스페린, 알부민, 및 셀렌을 포함하는 진핵 세포 배양 배지(ECCM) 보충제를 포함하는 KO DMEM 배지로 교체하였다. 특히 바람직한 ECCM은 표 2에 나열된 성분을 포함한다. 이 단계는 총 17일이 걸렸지만 최대 21일(방법의 0-17일 또는 최대 0-21일)까지 연장될 수 있으며 각각 4일(방법의 0-4일; 단계 i a1) 및 13-17일(4-17일 또는 최대 4-21일; 단계 i a2)이 걸리는 두 개의 하위 단계로 나눠질 수 있다.
제1 단계 (i a1) 동안, 배지는 1 μM CHIR을 추가로 포함한다. 4일 후(단계 (i) a1 완료), EMT 과정(단계 (i) a2)을 완료하기 위해 추가 1 μM CHIR 보충 없이 세포를 비트로넥틴(VTN)-코팅된 플레이트 상에서 현재 계대 2 배양을 계속하기 위해 계대 배양하였다. 방법 24일째에 세포를 비트로넥틴(VTN)-코팅된 플레이트 상에 다시 계대하였다(계대 3). 세포 수를 증폭하기 위해(증폭 단계 ii), 세포를 ECCM, FGF2, VEGF 및 글루타민(Gln)을 포함하는 KO DMEM 배지에서 비트로넥틴(VTN)-코팅된 플레이트 상에서 배양하였다; 4 계대부터 계속.
도 9: TGF베타 억제는 심장 간질 세포 성장을 안정화시킨다.
TGF베타 억제는 감소된 증식 속도로 포유동물 근섬유아세포로 증식하는 포유동물 섬유아세포의 전환을 방지한다. 근섬유아세포 전환에 대한 특정 성향때문에 포유동물 iPSC 유래 심장 간질 세포에 대한 TGF베타 억제 효과를 예시하기 위해 히말라야 원숭이로부터의 심장 간질 세포를 조사하였다. TGF베타 억제제 SB431542(10 μM)의 (A) 부재 또는 (B) 존재에서 계대 1일 및 6일 후 계대 4 간질 세포 형태. 막대: 20 μm.
(C) 비인간 영장류 심장 간질 세포를 항-알파 평활근 액틴 항체로 면역염색하고 유세포 측정법으로 분석하였다. 이소형 IgG2a 대조군을 갖는 세포와 비교하여 10 μM TGF베타 억제제 SB431542(+SB431542)를 포함하는 배지에서 배양된 세포 및 TGF베타 억제제 SB431542(-SB431542) 없이 배양된 세포에서 알파 평활근 액틴 신호의 히스토그램. 표는 세포당 알파 평활근 액틴의 평균 형광 강도 (MFI)를 요약 한 것이다.
(D) TGF베타 억제제 SB431542(10 μM)의 존재 또는 부재하에 히말라야 원숭이 간질 세포의 증폭(단계 (i) a2) 및 (ii)) 동안 얻은 누적 집단 배가 수준(PDL).
실시예
하기 실시예는 본 발명을 추가로 예시하기 위한 것이지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 실시예는 기술적 특징을 설명하며, 본 발명은 또한 이 섹션에 제시된 기술적 특징의 조합에 관한 것이다.
실시예 1: 다량, 고품질 및 무혈청 조건 하에서 심장 간질 세포의 생성
심장 간질 세포는 조작된 심장 조직/조작된 심근의 기능에 필수적인 것으로 입증되었다. 조작된 심장 조직을 성공적으로 얻기 위한 프로토콜은 문헌에, 예를 들어 [Zimmermann et al. (2006)] 및 [Tiburcy et al. (2017)]로부터 공지되었다. 그러나, 임상 사용을 위한 조작된 심장 조직의 생성은 조작된 심장 근육을 생성하는 동안 혼합되는 심장 간질 세포 및 근세포의 가용성에 의존한다. 이러한 프로토콜의 병목 현상은 종종 다량의 심장 간질 세포를 제공한다. 본 발명자들은 다량의 심장 간질 세포뿐만 아니라 고품질의 심장 간질 세포를 제공할 수 있도록 심장 분화/증폭 방법을 최적화하였다. 임상 사용을 위해서는 방법의 재현성이 필수적이다. 재현성은 방법이 무혈청이어서 모든 배지 성분이 알려질 때 가장 잘 달성된다. 또한 무혈청 조건은 혈청 또는 매트리겔과 같은 미한정 출처의 오염을 배제할 수 있으므로 임상 사용을 허용한다. 그러한 방법은 오랫동안 추구되어 왔다. 특히 심장 간질 세포의 증폭은 혈청 보충과 매트리겔 코팅이 한정된 구성 요소로 대체될 수 있는 방법이 불분명하기 때문에 현장의 과학자들에게 특별한 어려움을 안겨주었다. 따라서, 본 발명자들은 최초의 무혈청 분화 및 증폭 방법을 개발하였으며, 여기서 심장 간질 세포는 인간 만능 줄기 세포로부터 대량, 고품질 및 무혈청 조건 하에서 생성될 수 있다. 이 과정에서 활성 물질(억제제 및 자극제뿐만 아니라 소분자)의 특정 시간적 순서가 사용되어 심외막 세포(선택적으로 인간 만능 줄기 세포에서 시작)를 심장 간질 세포로 분화시키고 많은 양을 얻기 위해 이들 심장 간질 세포의 대량 증폭을 허용한다.
무혈청 분화/증폭 방법은 도 1A 및 8에 도시되어 있다. 자세한 단계별 방법은 다음과 같다. 스톡 제제, 배지 제제, 저장 조건 및 공급업체에 대한 자세한 내용은 아래 실시예 1 마지막 재료 섹션에 나열되어 있다. 또한 일반적으로 모든 단계에 대해 당업자가 주어진 크기의 조직 배양 플라스크에 필요한 배지의 양을 결정할 수 있다는 점에 주목한다. 세포를 배양할 때 세포는 항상 주어진 배지로 덮여 있었다.
심외막 세포는 또한 본원에 개시된 바와 같이 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 방법에 의해 수득될 수 있다. 심외막 세포를 얻기 위한 당업계의 예시적인 프로토콜은 예를 들어 [Witty et al. (2014)]에서 확인할 수 있거나, [Schlick (2018) Doctoral Thesis, November 2018, University of Goettingen]에 설명되어 있다. 추가적인 지원을 위해 심외막 세포를 얻기 위한 자세한 프로토콜도 본원에 설명되어 있다.
심외막 세포에서 시작하는 경우(0일) 상피-중간엽 전이는 2개의 하위 단계: (i) a1) 및 (i) a2)를 포함하여 유도된다. 단계 (i) a1)에서, 배지는 StC-EM+C 배지이고 세포는 라미닌 코팅된 플레이트에서 배양되었다. 배지를 1일에 신선한 StC-EM+C로 교체하고 세포를 상기 배지와 함께 4일까지 인큐베이션하여 제1 하위 단계 (i) a1)를 완료하였다. 제2 하위 단계는 세포를 비트로넥틴 코팅된 플레이트에 계대하는 것으로 4일째에 시작되었다. 구체적으로, 아큐타제(accutase)를 실온으로 가온하고, 버센(versene)을 37℃로 가온하였다. 세포를 PBS(T75 플라스크의 경우 6 ml)로 1회 세척한 다음, 아큐타제(T75 플라스크의 경우 6 ml)와 함께 10-20분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 버센(T75 플라스크의 경우 6 ml)을 아큐타제에 첨가하고 5분 동안 인큐베이션하였다. StC-EM 배지(T75 플라스크의 경우 12 ml)를 풀 세포에 첨가하고 세포를 실온에서 5분 동안 300xg에서 원심분리하였다. 세포 수를 측정하고 세포가 플레이팅될 수 있도록 15 ml에서 3x10E6 세포의 밀도를 얻기 위해 세포를 StC-EM 배지로 희석하였다. 배지 농도는 아래 재료 섹션에 자세히 설명되어 있다. 7일과 9일에 배지를 새로운 StC-EM 배지로 교체하였다. 세포 분열로 인해, 세포를 방금 설명한 바와 같이 비트로넥틴 플레이트 상에서 11일째에 다시 계대하였다. 14일과 16일에 배지를 다시 신선한 StC-EM 배지로 교체하였다. 17일에 프로토콜의 단계 (i) a2)를 완료하고 심장 간질 세포를 생성하였다. 그런 다음 이들 심장 간질 세포를 수확하여 조작된 인간 심근(EHM) 및 조작된 결합 조직(ECT)과 같은 조직 공학에 사용하거나 동결할 수 있다. 그러나, 많은 양의 심장 간질 세포를 얻기 위해 세포를 추가 증폭시킬 수 있다.
심장 간질 세포의 세포 수를 증폭하기 위해, 단계 (ii), 세포를 17일째에 프로토콜의 단계 (i) a2)에 기술된 바와 같이 아큐타제 및 버센을 사용하여 계대하고 StC-EM 배지에서 배양하였다. 매 2일마다 배지를 교환하고 단계 (ii) 동안 매주 추가 계대를 수행하였다. 심장 간질 세포 증폭을 위해 최소 6회 계대를 수행할 수 있지만 단계 (ii)는 원칙적으로 무한정 수행할 수 있다. 모든 계대 후 심장 간질 세포는 또한 수확하여 조직 공학에 사용할 수 있었으며 세포의 적어도 90%에서 CD90, CD44 및 CD73의 유지된 발현의 특징을 나타내었다.
만능 줄기 세포에서 심외막 세포를 얻기 위해 다음 프로토콜을 사용할 수 있다: 인간 만능 줄기 세포를 -17일에 라미닌(LN-521) 코팅 플레이트에 시딩하고 10 μM ROCK-억제제가 보충된 iPS Brew의 존재하에서 배양하였다. -13일에 세포의 컨플루언트 층을 얻기 위해 세포를 플레이팅하였다. 시딩을 위한 최적의 세포 수는 각 세포주에 대해 개별적으로 결정되어야 한다. -14일째에 배지를 ROCK-억제제가 없는 iPS-Brew 배지로 교환하였다.
만능 줄기 세포의 중배엽 분화를 유도하기 위해(단계 (i*)), 세포를 RPMI 배지로 1회 세척한 다음 StC-IM 배지에서 추가 배양하였다(자세한 내용은 하기 재료 섹션에서 설명함). -12, -11 및 -10일에 배지를 새로운 StC-IM 배지로 교체하였다.
심외막 분화를 유도하기 위해 (단계 (i**)), 세포를 -7일에 라미닌 LMN-521 코팅된 플레이트 상에서 계대 배양하였다. 이를 위해 TrypLE를 37℃로 가온하고 배지를 제거하고 세포를 TrypLE(T75 플라스크의 경우 4 ml)로 세척한 다음 신선한 TrypLE(T75 플라스크의 경우 4 ml)에서 3-5분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, StC-SM 배지(예: 9 ml)를 첨가하고 세포를 실온에서 5분 동안 300xg에서 원심분리하였다. 세포 수를 측정하고 세포가 플레이팅될 수 있도록 15 ml에서 2x10E6 세포의 밀도를 얻기 위해 세포를 StC-SM 배지로 희석하였다. 배지 농도는 아래 재료 섹션에 자세히 설명되어 있다. -5일과 -3일에 배지를 신선한 StC-SM 배지로 교체하였다. 단계 (i**)의 완료(심외막 분화)를 면역형광을 사용하여 윌름스 종양 항원 1(WT1)의 발현에 의해 실험적으로 평가하였다(도 1C). WT-1의 명확한 발현이 세포의 핵에서 검출되었다.
심장 간질 세포의 소규모 및 대규모 생성을 위한 정확한 배지 부피를 제공하는 한 가지 예가 다음 표에 나와 있다.
Figure pct00002
재료
재료, 공급업체 및 저장 조건:
- iPS Brew Basal배지, Miltenyi Biotec, Cat No.170-076-317
- iPS Brew 보충제 R, Miltenyi Biotec, Cat No.170-076-318
- (CTS) 비트로넥틴, Thermo Scientific
- ROCK-억제제 (Stemolecule Y27632), Stemgent, Cat No. 04-0012-10, -20℃
- 버센 (1x), Gibco, Cat No. 15040-033, 100 ml
- PBS (1x), Gibco, A1285601
- 글루타맥스 함유 RPMI 1640, Invitrogen, Cat No. 61870-010, 4℃
- 100X 피루브산나트륨, Invitrogen, Cat No. 11360, 4℃
- L-아스코르브산 2 포스페이트 세스퀴마그네슘 염 수화물 (ASC), Sigma, Cat No. A8960-5G, -20℃
- 액티빈 A, CellGenix, 1022-050 GMP 또는 액티빈 A, R&D, -20℃
- BMP4, Peprotech, AF-120-05ET 또는 BMP4, R&D, -20℃
- bFGF, Peprotech, GMP100-18B 또는 bFGF, Peprotech RUO, -20℃
- VEGF165, GMP100-20 또는 VEGF165, Peprotech, RUO, -20℃
- CHIR, Stemgent, Cat No. 04-0004, -20℃
- (CTS) B27 보충제, Thermo Scientific, -20℃
- 레티노산, Sigma, Cat No. R2625
- (CTS) TrypLE select, Thermo Scientific, 4℃
- (CTS) KO DMEM, Thermo Scientific
- (CTS) KO 혈청 대체물, Thermo Scientific
- 아큐타제, Thermo Scientific
- LMN-521, Biolamina
- 글루타민, Thermo Scientific
- CryoSure DMSO, WAK, WAK-DMSO-10, 실온
- 멸균 필터 0.2 μM (Sartorius Minisart RC25, DMSO-내성)
(-20℃)에서의 스톡
- 10 ug/ml의 BMP4 스톡
- 10 ug/ml의 액티빈 A 스톡
- 10 ug/ml의 bFGF 스톡
- 5 ug/ml의 VEGF 스톡
- DMSO에서 10 mM의 CHIR 스톡
- ROCK-억제제(Stemolecule Y27632), DMSO에서 10 mM 스톡
- 수중 200 mM의 ASC-2-P 스톡(ASC)
- 레티노산(Sigma: R2625): 8 mM 스톡: 50 mg RA를 20.8 ml DMSO에 용해시키고, DMSO 내성 필터를 사용하여 멸균 여과하고, 0.5 ml 튜브에 500μl를 분취한다(최대 6개월 동안 -80℃에서 보관); 4 μM > 0.5 μl/ml 배지에서 사용
라미닌(LMN) 코팅
LMN-521 용액을 +2℃ ~ +8℃에서 서서히 해동(100 μg/ml)시켰다. LMN 521 라미닌-(100μg/ml)을 1xDPBSplus(Ca++/Mg++)로 희석하여 최종 농도 0.9 μg/㎠로 만들었다. 예를 들어 T75㎠ 플라스크의 경우 15.3 ml PBS와 0.706 ml LMN 521 용액을 혼합하였다. 코팅을 4℃에서 밤새 정치시켰다. 사용 전 1시간 동안 플라스크를 실온으로 가온하였다. 상청액을 조심스럽게 흡인하고(표면에 닿지 않고) 배지를 플라스크에 즉시 첨가하였다.
비트로넥틴(VTN) 코팅:
비트로넥틴 희석액을 만들고 사용 전에 멸균 여과(0.2 μm)하였다. 예:
Figure pct00003
코팅을 실온에서 1시간 동안 수행하였다. 플라스크를 사용하기 전에 1시간 동안 실온으로 조정하였다.
배지 제조:
iPS Brew 배지:
iPS Brew 배지를 제조업체의 지침(Miltenyi Biotec)에 따라 제조하였다.
RPMI 세척 배지:
세포를 글루타맥스를 함유한 RPMI 1640 배지(Invitrogen)로 세척하였다.
분화/증폭 프로토콜의 단계 (i*)에서 사용된 간질 세포 유도 배지(StC-IM)
성분의 최종 농도는 도 8에 나와 있다. 예를 들어, 상기 StC-IM 배지 100 ml를 다음 레시피에 따라 수득할 수 있다.
Figure pct00004
기본 무혈청 배지, 분화/증폭 프로토콜(BSFM; 4℃)의 단계 (i**) 동안 한 성분
BSFM을 제조하였고 글루타맥스, 1% 100X 피루브산나트륨, 2% B27 보충제 및 200 uM ASC를 포함하는 RPMI 1640을 포함하였다.
분화/증폭 프로토콜의 단계 (i**)에 사용되는 간질 세포 사양 배지(StC-SM)
성분의 최종 농도는 도 8에 나와 있다. BSFM에 50 ng/ml BMP4(10 ml 배지에 50 μl 스톡), 4 μmol/L 레티노산(10 ml 배지에 5 μl 스톡) 및 1 μM CHIR(10 ml 배지에 1 μl 스톡)을 보충하여 StC-SM을 수득하였다.
분화/증폭 배지의 단계 (i) a1)에서 사용되는 CHIR을 포함하는 간질 세포 증폭 배지(StC-EM+C)
분화/증폭 프로토콜의 단계 (i) a1)) 동안 StC-EM+C 배지를 사용하였다. 상기 배지는 KO DMEM 배지에 1% 글루타민, 10%(CTS) KO 혈청 대체물, 50 ng/ml FGF(10 ml 배지에 50 μl 스톡), 25 ng/ml VEGF 및 1 μM CHIR (10 ml 배지에 1 μl 스톡)을 보충하여 얻었다.
분화/증폭 배지의 단계 (i) a2) 및 (ii)에서 사용되는 간질 세포 증폭 배지(StC-EM)
단계 (i) a2)의 제2 하위 단계 동안 및 분화/증폭 방법의 단계 (ii) 동안 StC-EM 배지가 사용되었다. 상기 배지는 KO DMEM 배지에 1% 글루타민, 10%(CTS) KO 혈청 대체물, 50 ng/ml FGF(10 ml 배지에 50 μl 스톡) 및 25 ng/ml VEGF를 보충하여 얻었다.
실시예 2: 심장 간질 세포의 대량 생산; 최소 15 배가로 증폭
심장 간질 세포가 심외막 세포(또는 선택적으로 만능 줄기 세포)로부터 분화될 수 있을 뿐만 아니라 증폭될 수도 있음을 보여주기 위해, 발명자들은 증폭 단계 (도 1 및 8의 프로토콜의 단계 (ii))를 개발하였다. 상기 단계 동안, 심장 간질 세포는 그의 세포 특성/표현형을 유지하지만 세포 수는 무혈청 한정 조건 하에서 대량으로 증폭된다. 도 2A는 심장 간질 세포가 75 cm2의 일반 조직 배양 플라스크에서 시작하여 확장될 수 있는 가능성을 보여준다. 평균적으로 75 ㎠의 배양 플라스크에는 약 20x10E6 iPSC(2,7x10E5)가 들어 있다. 세포가 분화 단계 (i)(선택적으로 단계 (i*) 및 (i**)가 선행됨) 후 단계 (ii) 동안 5 계대(계대 4-9)로 증폭되었을 때, 세포를 515840 cm2의 성장 면적(즉, 약 52 m2)으로 증폭시킬 수 있다. cm2 당 평균 출력은 약 1x10E5 심장 간질 세포였다. 따라서, 이 프로토콜은 75 cm2 (또는 입력 iPSC당 2600개의 심장 간질 세포)를 가진 조직 배양 플라스크에서 인간 만능 줄기 세포의 합류층에서 시작하는 경우 5.2x10E10 심장 간질 세포를 달성할 수 있는 잠재력을 가진다.
도 2B는 세포가 배가되는 총 횟수를 보여줌으로써 심장 간질 세포 집단 배가에 대한 실험적 증거를 제공한다. 각 계대 단계에서, ㎠당 1-1.3x10E4 세포를 시딩하였다. 이 데이터는 프로토콜의 단계 (ii)가 5 계대(계대 4-9)에 대해 수행될 때 심장 간질 세포가 15배까지 확장될 수 있음을 보여준다. 이 데이터로부터 심장 간질 세포는 증폭 단계 (프로토콜의 단계 (ii)) 동안 2.1±0.4일의 평균 배가 시간을 나타냄을 알 수 있다. 이는 주당(계대당) 세포 수가 약 10배 증가한 것에 해당한다. 또한, 심장 간질 세포의 증폭은 정체되지 않으며, 이는 또한 심장 간질 세포가 증폭 단계 조건 하에서 지속적으로 확장된다는 것을 강조한다. 요약하면, 이 데이터는 주로 방법의 무혈청 증폭 단계 (ii)로 인해 무혈청 한정 프로토콜이 심장 간질 세포의 대규모 생산에 적합하다는 것을 보여준다.
실시예 3: 매우 순수하고 균질한 심장 간질 세포 집단의 생성
매우 순수하고 균질한 심장 간질 세포로의 지시된 분화 및 대량 증폭을 확인하기 위해, 본 발명자들은 몇 가지 독립적인 방법으로 심장 간질 세포를 분석하였다: 첫째, (1) 세포외 및 세포내 마커의 발현을 유세포 측정법 및 면역형광법으로 분석하였다(도 3A-C).
생산된 심장 간질 세포의 순도와 균질성을 확인하기 위해 세포를 유세포 분석으로 분석하였다(도 3A). 여기에 사용된 유세포 분석에서 심장 간질 세포 마커의 발현은 면역염색을 사용하여 측정되었다. 특히, 생산된 심장 간질 세포를 특성화하기 위해 단계 (i) a2) 후 CD90, CD44, CD73, 콜라겐 1 및 비멘틴의 발현을 평가하였다. CD90, CD44 및 CD73은 세포외 마커인 반면 콜라겐 1 및 비멘틴은 세포내 마커이다. 각각의 이소형 대조군(IgG1, BD Biosciences)에 대해 측정된 CD90 양성 세포의 비율은 95%였고; CD44 양성 세포의 비율은 99%였으며; CD73 양성 세포의 비율은 99%였다. 콜라겐 1 양성 세포의 비율은 97%였고; 비멘틴 양성 세포의 비율은 98%였다. 동시에 음성 대조군(다클론성 토끼 IgG)은 3%의 배경 신호만을 나타냈다. 이것은 수득된 심장 간질 세포가 매우 순수하고 균질하다는 것을 보여준다. 요약하면, 도 3A는 단계 (i) a2) 후에 얻은 심장 간질 세포가 적어도 90%의 세포에서 CD90, CD44, CD73, 콜라겐 1 및 비멘틴의 발현을 특징으로 하는 세포의 동종 집단임을 나타낸다.
심장 간질 세포의 생성을 더 확인하기 위해, 세포를 형광 현미경으로 분석하였다(도 3B). 이 과정에서 비멘틴, 항인간 섬유아세포 특이 단백질 및 콜라겐 1을 면역학적으로 염색하고 세포핵의 DNA를 Hoechst 33342로 시각화하였다. 세 가지 마커 모두 단계 (i) a2 이후 심장 간질 세포의 균질한 분포와 높은 순도를 나타낸다. 또한, 세포의 형태는 심장 간질 세포에 전형적인 것이다.
심장 간질 세포에서 CD90, CD73 및 CD44의 발현을 분석하기 위해, 상기 마커를 특히 분화 및 증폭 프로토콜 동안 FACS에 의해 평가하였다(도 3C). 단계 (i) a1) 완료 후(배양 4일) 세포의 50% 이상이 CD90을 발현하였고; 세포의 50% 미만이 CD73을 발현하였고; 세포의 30% 미만이 CD44를 발현하였으며, 세포의 80% 이상이 비멘틴을 발현하였다. 배양 17일(단계 (i) a2) 동안)에 마커 CD90, CD73 및 비멘틴이 세포의 90% 이상에서 발현되었고, 마커 CD44가 세포의 80% 이상에서 발현되었다. 단계 (i) a2) 완료 후(배양 17일) 마커 CD90, CD73, CD44 및 비멘틴이 세포의 90% 이상에서 발현되었다. 선택적 단계 (i*) 후의 발현 프로파일도 평가하였으며(배양일 -7일; 도 8 참조), 세포의 90% 이상이 CD90을 발현하였고, 세포의 10% 미만이 CD73을 발현하였으며, 세포의 10% 미만이 CD44를 발현하였고, 세포의 40% 이상이 비멘틴을 발현하였다. 또한, CD73은 분화 과정에서 연속적으로 더 많이 발현되었다. 유사하게, CD44 또한 분화 및 증폭 프로토콜의 과정에 걸쳐 연속적으로 더 많이 발현되었다.
실시예 4: 심장 간질 세포의 특징적인 마커의 대량 증폭 및 유지된 발현
증폭 단계 (ii)가 심장 간질 세포의 특징적인 마커의 발현을 유지한다는 것을 보여주기 위해, 계대 9에서 심장 간질 세포의 FACS 분석을 수행하였다(도 3D). 계대 9에서, 심장 간질 세포는 이미 5 계대에 걸쳐 증폭되었다(도 2 참조). 도 3D에서 입증된 바와 같이, 증폭된 심장 간질 세포의 적어도 90%가 CD90, CD44 및 CD73을 발현하였다. 따라서, 심장 간질 세포는 단계 (i) a2) 후에 표현형을 안정적으로 유지하고 상기 특성 마커의 발현을 유지하였다. 이로써 상기 증폭 단계가 한정된 무혈청 조건 하에서 심장 간질 세포의 대량 증폭에 적합하다는 것이 입증되었다. 또한, 특성 마커 CD90, CD44 및 CD73이 발현을 유지하는 한, 심장 간질 세포가 단계 (ii)의 조건 하에서 무한정 증폭될 수 있다는 것은 타당하다.
실시예 5: 수득된 심장 간질 세포의 유전적 분석 및 섬유아세포 특성의 분석
제2 및 제3의 독립적인 방법에서 심장 간질 세포의 유전적 특성을 평가하였다: 구체적으로, (2) iPSCs, iPSC 유래 심근세포(CM), (iPSC-유래) 심장 간질 세포(cStC), 및 심장 유래 일차 심장 섬유아세포(대조군)에서 CD140a, 비멘틴(VIM), 콜라겐-1(COL1A1), CD90, CD73 및 CD44의 유전자 발현을 비교하고(도 4); (3) 수득된 심장 간질 세포를 일차 심장 섬유아세포 및 기타 섬유아세포 유형과 비교 및 대조하기 위해 전사체 분석을 수행하였다(도 5A 및 B).
심장 간질 세포의 유전자 발현 프로필이 심장 간질 세포의 정체를 반영한다는 것을 추가로 입증하기 위해, 유도 만능 줄기 세포(iPSC), iPSC 유래 심근 세포(iPSC CM), 본원에 개시된 바와 같은 (iPSC 유래) 심장 간질 세포(cStC) 및 인간 일차 심장 섬유아세포에서 여러 마커 유전자의 발현을 분석하고 비교하였다.
Figure pct00005
도 4A 및 4B에서 쉽게 알 수 있는 바와 같이, iPSC 및 iPSC CM은 배경 이상의 수준에서 CD140a, 비멘틴, 콜라겐 1, CD73 또는 CD44를 발현하지 않았다. 대조적으로, 본원에 개시된 바와 같은 심장 간질 세포 및 일차 심장 섬유아세포는 CD140a, 비멘틴, 콜라겐 1, CD73 또는 CD44를 발현하였다. CD90의 발현은 iPSC, 본원에 개시된 바와 같은 심장 간질 세포(cStC) 및 일차 심장 섬유아세포에서 검출될 수 있는 반면, 심근 세포는 분화 과정에 걸쳐 CD90의 발현을 상실하였다. 요약하면, 유전자 발현 분석은 유전자 마커 또는 심장 간질 세포가 독립적인 방법으로 본원에 개시된 방법에 의해 수득된 세포에서 발현된다는 것을 나타내었다(도 4). 또한, 일차 심장 섬유아세포의 발현 프로필이 개시된 방법에 의해 수득된 심장 간질 세포에 의해 반영되었다. 또한, 유전자 발현 프로파일은 심근 세포와 비교하여 모든 시험된 마커에서 상이하였으며 심근세포와 비-근세포, 즉 심장 간질 세포 사이의 발현 프로파일의 명확한 차이를 강조한다.
특히 심장 간질 세포가 생성되었는지 확인하기 위해, 수득된 심장 간질 세포의 전사체를 일차 심장 섬유아세포, 신생아 피부 섬유아세포 및 치은 섬유아세포와 비교하였다(도 5A 및 5B). 이들 세포로부터 RNA를 추출하고, 시퀀싱하고, 집단 발현 패턴을 분석하였다. 수득된 심장 간질 세포, 일차 심장 섬유아세포, 신생아 피부 섬유아세포 및 치은 섬유아세포의 전사체를 비교할 때 주성분 분석을 수행하였으며(도 5A), 전체 변이의 46%가 주성분 1(PC1)에 기인할 수 있음을 나타냈다. PC1의 상위 100개 변이 유발 RNA 및 본 발명자들의 이전 분석(Tiburcy et al. 2017의 도 3B)으로부터의 특징적인 섬유아세포 농축 유전자에 대한 추가의 상세한 분석으로 수득한 심장 간질 세포의 발현 패턴이 일차 심장 섬유아세포와 상당히 일치하는 것으로 나타났다. 도 5B에 표시된 유전자는 다음과 같다: DDR2, THY1, TIMP2, TBX4, HOXA11, ISL1, MMP1, CD44, NTSE, BMP4, TCF21, SOX17, TBX20, HEY1, HOXAS, TBX1, COL1A1, FN1, DES, HAND1, PECAM1, WT1, TEX, HAND2, GATA4, ALDH2, POSTN.
그러나, 수득된 심장 간질 세포는 신생아 피부 섬유아세포 및 치은 섬유아세포와 비교할 때 분명한 차이를 보였다. 따라서, 얻어진 심장 기질 섬유아세포는 피부 및 치은 섬유아세포보다 일차 심장 섬유아세포에 확실히 더 필적하였다. 결과적으로, 전사체 분석은 특정 유형의 간질 세포, 즉 심장 간질 세포가 도 1 및 8에 따른 프로토콜에 의해 수득되었음을 보여준다.
생산된 심장 간질 세포의 섬유아세포 특성을 추가로 분석하기 위해, 본 발명자들은 또한 세포가 콜라겐 분비 및 근섬유아세포 마커의 발현을 향상시키도록 자극될 수 있는지의 여부를 시험하였다. 근섬유아세포로의 전환은 예를 들어 상처 치유 과정/흉터 형성의 맥락에서 중요하며 상기 전환은 예를 들어 TGFb1 및 안지오텐신 II에 의해 유도될 수 있다. 도 5C는 프로콜라겐 단백질 및 평활근 액틴(α-SMA) 및 CTGF가 모두 근섬유아세포 마커인 TGF베타 및/또는 안지오텐신 II에 의해 유도되었음을 보여준다. 튜불린을 부하 대조군으로 제공하였다. 시험관내에서 활성화된 일차 심장 섬유아세포 표현형과 일치하게, 심장 간질 세포는 RNA 발현 분석을 뒷받침하는 비자극 제어 조건 하에서도 강력한 페리오스틴 발현을 보였다(도 5B). 따라서, 본원에 개시된 방법에 따라 생산된 심장 간질 세포는 근섬유아세포로의 전환 뿐만 아니라 콜라겐을 분비할 수도 있었다.
실시예 6: 조작된 인간 조직에 대한 적합성
본 발명자들은 심장 간질 세포의 구조적 분석 외에, 수득된 심장 간질 세포의 기능적 특성을 평가하였다. 이에 따라, 네 번째(4) 독립적인 방법으로서, 심장 근육 및 결합 조직의 조작으로 예시되는 조작된 조직에 대한 적합성이 또한 본 발명자들에 의해 시험되었다. 상기 네 번째 독립 방법은 조작된 인간 심근(EHM; 도 6A) 및 조작된 결합 조직(ECT; 도 6B)에서 일차 심장 섬유아세포 및 수득된 심장 간질 세포를 비교하는 수축 실험을 수행함으로써 수행되었다.
EHM 생성을 위해, 일차 심장 섬유아세포 또는 수득된 심장 간질 세포를 [Tiburcy et al. (2017)]에 기재된 방법에 따라 심근세포 및 세포외 기질과 혼합하였다. 간단히, 이러한 수축 실험을 기관조에서 수행하였으며, 전기 자극에 대한 반응으로 생산된 조작된 심장 근육/조작된 심근의 수축력(FOC)을 측정하였다(자세한 내용은 본원의 방법 섹션 참조). 구체적으로, 조작된 인간 심근(EHM)의 FOC를 70% 심근 세포 및 30% 원발성 심장 섬유아세포(검은색 막대) 또는 본원에 개시된 심장 간질 세포(회색 막대)에 대해 수행하였다. 세포외 칼슘 농도는 2 mmol/L이었고 EHM은 1.5Hz의 전기 자극으로 자극되었으며 FOC는 밀리뉴턴(mN) 단위로 측정되었다. 일차 심장 섬유아세포로 생산된 EHM의 FOC는 0.1 mN의 표준 오차 또는 평균으로 2.0 mN인 반면, 본원에 개시된 심장 간질 세포로 생산된 EHM의 FOC는 0.03 mN의 평균 표준 오차로 1.9 mM이었다. 따라서, FOC는 비슷했고 거의 동일하였다. 또한, 수득된 심장 간질 세포는 3배 더 작은 표준 오차를 나타냈고, 이는 본원에 개시된 방법에 의해 수득된 무혈청 한정 심장 간질 세포를 사용하여 재현성이 달성됨을 강조한다. 이같은 매우 낮은 표준 오차는 도 1 과 8의 방법에 따라 얻은 심장 간질 세포의 높은 순도와 균질성을 강조한다.
유사하게, ECT를 본원에 개시된 바와 같은 일차 심장 섬유아세포 및 심장 간질 세포로 생성하고, TGFb1을 사용한 치료 시의 경직도 결과를 비교하였다. 결합 조직의 주요 특징은 이전에 [Dworatzek et al. 2019]에서 설명한 바와 같이, TGF베타1(TGFb1)과 같은 전-섬유성 자극으로 처리 시 경직이 증가한다는 것이다. 간단히, 이러한 경직 실험은 TGFb1의 존재 또는 부재에서 경직을 측정한다(자세한 내용은 본원의 방법 섹션 참조). 구체적으로, ECT의 경직을 킬로파스칼(kPa) 단위로 측정하였다. TGFb1 부재 하에, 본원에 기재된 바와 같은 일차 심장 섬유아세포 및 심장 간질 세포로 생성된 ECT의 경직은 각각 6 및 9 kPa였다(SEM: 일차 심장 섬유아세포의 경우 1 kPa 및 심장 간질 세포의 경우 2 kPa). 5 ng/ml TGFb1의 존재에서, 심장 간질 세포로 생성된 ECT의 경직은 46 kPa(SEM: 1 kPa)인 반면, 일차 심장 섬유아세포로 생성된 ECT의 경직은 21 kPa(SEM: 1 kPa)에 불과하였다. 따라서, 경직은 섬유성 반응을 나타내는 TGFb1에 의한 유도 시 상당히 더 컸다. 또한, 경직은 원발성 심장 섬유아세포로 생성된 ECT와 비교하여 본원에 개시된 심장 간질 세포로 생성된 ECT에서 상당히 더 컸다. 이것은 섬유화 촉진 자극에 대한 심장 간질 세포의 민감성을 다시 강조하고 조작된 인간 조직에서 섬유증 모델링에 대해 본원에 개시된 바와 같은 심장 간질 세포의 적합성을 강조한다.
실시예 7: 심장 간질 세포의 증폭은 세포외 기질 단백질의 존재하에서만 수행할 수 있으며 엄격한 무혈청 조건에서 코팅되지 않은 배양 표면에서는 작동하지 않는다.
도 8에 도시된 방법은 증폭 단계 (ii)가 비트로넥틴 코팅된 플레이트에서 수행되었음을 보여준다. 발명자들은 또한 다른 ECM 단백질이 증폭 단계를 지원하는지 여부와 플레이트를 코팅하지 않는 증폭이 무혈청 조건에서도 작동하는지 여부를 시험하였다. 이 아이디어를 시험하기 위해, 심장 간질 세포를 비트로넥틴, 라미닌 LN-521, 젤라틴 형태의 콜라겐, 피브로넥틴, 매트리겔 코팅 및 비코팅 플레이트에서 계대 5 및 6에 대해 배양하고 그 결과를 도 7에 나타내었다. 모든 ECM 단백질 코팅 플레이트(비트로넥틴, LN-521, 젤라틴, 피브로넥틴) 및 매트리겔 코팅 플레이트는 심장 섬유아세포의 추가 증폭을 지원하는 반면, 코팅되지 않은 플레이트의 심장 간질 세포는 코팅되지 않은 플레이트의 5 계대에서 사멸하였다. 따라서, 도 1 또는 8에 따른 심장 간질 세포는 코팅되지 않은 플레이트에서 확장될 수 없다.
예를 들어, US 2018/0094245 A1은 단락 [0081]에서 심장 섬유아세포가 증폭을 위해 코팅되지 않은 플레이트에 플레이팅되었음을 개시한다. 언뜻 보기에 도 7의 데이터는 US 2018/0094245 A1과 모순되는 것처럼 보인다. 그러나, 상기 개시의 단락 [0081]은 또한 심장 섬유아세포가 2% 태아 소 혈청의 존재하에 플레이팅되었다고 기술한다. 따라서, 플레이팅 단계는 US 2018/0094245 A1에서 무혈청이 아니다. 사실, FBS는 배양 기질을 코팅할 수 있고 따라서, 미한정 표면 코팅을 생성할 수 있는 다양한 양의 당단백질을 포함하는 것으로 알려져 있다. 따라서, US 2018/0094245 A1의 플레이팅 단계 동안 혈청이 처음에 코팅되지 않은 플레이트에서 심장 섬유아세포의 추가 성장을 지원했다는 것이 타당하다. CD90의 소실은 섬유아세포의 변형을 암시하며, 따라서, US 2018/0094245 A1에 따른 섬유아세포는 개시된 심장 간질 세포와 비교하여 상이한 표현형을 갖는다. 본원의 분화/증폭 프로토콜은 완전히 무혈청이므로 플레이트의 한정된 세포외 기질 단백질 코팅이 필수적인 것으로 입증되었다. 세포외 기질 단백질은 도 7에 따라 비트로넥틴, LN-521, 젤라틴, 피브로넥틴 또는 심지어 매트리겔로부터 선택될 수 있다. 또한, 증폭 단계를 지원하는 비트로넥틴, LN-521, 젤라틴, 피브로넥틴과 같은 방식으로 다른 세포외 기질 단백질이 증폭 단계를 지원할 가능성이 높다. 물론, 비트로넥틴, LN-521, 젤라틴 또는 피브로넥틴과 같은 한정된 세포외 기질 단백질이 바람직하다.
실시예 8: TGF 베타 신호 전달의 억제는 엄격한 무혈청 조건에서 심장 간질 세포의 증폭을 안정화한다.
시험관내 배양 동안 심장 간질 세포는 전형적으로 섬유아세포에서 근섬유아세포 표현형으로의 전환을 나타내는 "스트레스 섬유"를 획득한다. TGF베타는 섬유아세포에서 근섬유아세포로의 전환을 유도하는 강력한 유도제이며 시험관내에서 세포 증식에 부정적인 영향을 미친다(Driesen et al. 2014). 스트레스 섬유의 출현은 알파 평활근 액틴의 발현과 관련이 있다(α -SMA, 도 5C). 본 발명자들이 비인간 영장류 iPSC(Macaca mullata)로부터의 심장 간질 세포의 유도 및 증폭을 시험했을 때, 단계 (i) a2)에서 상당한 양의 스트레스 섬유로 제시된 바와 같이 비인간 영장류 간질 세포가 신속하게 근섬유아세포 표현형을 획득했음을 발견하였다(도 9A). 따라서, 본 발명자들은 TGF베타 억제가 심장 간질 세포의 증폭을 안정화시키는지를 시험하였다. TGF베타 신호 전달을 억제하기 위해, 강력하고 선택적인 형질전환 성장 인자-β(TGF-β) 유형 I 수용체/ALK5 억제제인 SB431542를 StC-EM 배지(StC-EM+SB)에 첨가하고 StC-EM 배지만을 사용한 배양과 비교하였다.
단계 i a1 완료 후(4일), 세포를 비트로넥틴 코팅 플레이트에서 계대하였다(계대 2). 구체적으로, 아큐타제를 실온으로 가온하고, 버센을 37℃로 가온하였다. 세포를 PBS(T75 플라스크의 경우 6 ml)로 1회 세척한 다음, 아큐타제(T75 플라스크의 경우 6 ml)와 함께 10-20분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 버센(T75 플라스크의 경우 6 ml)을 아큐타제에 첨가하고 5분 동안 인큐베이션하였다. StC-EM 배지(T75 플라스크의 경우 12 ml)를 풀 세포에 첨가하고, 세포 풀을 2개의 개별 튜브로 분할하고 실온에서 5분 동안 300xg에서 원심분리하였다. 세포 수를 측정하고 세포가 플레이팅될 수 있도록 15 ml에서 3x10E6 세포의 밀도를 얻기 위해 세포를 StC-EM 또는 StC-EM+SB 배지로 희석하였다. 배지 농도는 아래 재료 섹션에 자세히 설명되어 있다. 7일과 9일에 배지를 새로운 StC-EM 또는 StC-EM+SB 배지로 교체하였다. 세포를 방금 설명한 바와 같이 비트로넥틴 플레이트에서 11일째에 다시 계대하였다(계대 3). 14일과 16일에 배지를 다시 신선한 StC-EM 또는 StC-EM+SB 배지로 교체하였다. 17일째에, 세포를 방금 설명한 바와 같이 비트로넥틴 플레이트에서 다시 계대하였다(계대 4). 20일과 22일에 배지를 다시 신선한 StC-EM 또는 StC-EM+SB 배지로 교체하였다. 24일에 세포를 상기 기술된 바와 같이 효소 분해에 의해 수확하고 세포 수를 결정하기 위해 계수하고 StC-EM 대 StC-EM+SB 배지에서의 증식을 비교하였다. TGF 베타 억제제의 존재하에, 심장 간질 세포는 더 작았고 더 적은 스트레스 섬유를 보였다(도 9 A, B). 알파 평활근 액틴의 유세포 분석에 의해 TGF베타 억제제로 처리된 세포에서 α-SMA의 낮은 평균 형광을 보여 4회 계대 후 세포당 감소된 α-SMA 단백질 함량을 확인했으며(도 9C), 이는 근섬유아세포 전환의 효과적인 억제를 나타낸다. 이러한 관찰과 일치하게, 증식은 SB431542의 첨가에 의해 강화되었고(도 9D), 이는 TGF 베타 신호전달의 억제가 심장 간질 세포의 증식 상태를 안정화시킨다는 것을 나타낸다. 배경 염색을 IgG2a 이소형 대조군에 의해 결정하였다. 비교 가능한 세포 수를 양성 및 음성 세포 집단의 최적 분리를 위해 적정된 항체 농도로 염색하였다. 생존 가능한 단일 세포에 대한 게이팅 후 전체 세포 집단의 평균 형광 강도(MFI)를 결정하였다.
재료, 공급업체 및 저장 조건:
- (CTS) 비트로넥틴, Thermo Scientific
- 버센 (1x), Gibco, Cat No. 15040-033, 100 ml
- PBS (1x), Gibco, A1285601℃
- bFGF, Peprotech, GMP100-18B 또는 bFGF, Peprotech RUO, -20℃
- VEGF165, GMP100-20 또는 VEGF165, Peprotech, RUO, -20℃
- (CTS) KO DMEM, Thermo Scientific
- (CTS) KO 혈청 대체물, Thermo Scientific
- 아큐타제, Thermo Scientific
- 글루타민, Thermo Scientific
- CryoSure DMSO, WAK, WAK-DMSO-10, 실온
- 멸균 필터 0.2 μM (Sartorius Minisart RC25, DMSO-내성
- SB431542, TOCRIS bioscience" #1614; Lot:15A/254565.
- 도 9C에 사용된 일차 항체: 항-액틴, α-평활근 항체, 마우스 단일클론, 클론 1A4, #A5228
- 도 9C에 사용된 이차 항체: 염소 항-마우스 IgG(H+L) 고도로 교차 흡착된 이차 항체, Alexa Fluor 488, # A-11029
(-20℃)에서의 스톡
- DMSO에서 10 mM의 SB431542 스톡
비인간 영장류 심장 간질 세포의 분화/증폭 배지의 단계 (i) a2) 및 (ii)에 사용되는 TGF베타 억제제(StC-EM+SB)를 함유하는 간질 세포 증폭 배지
단계 (i) a2)의 제2 하위 단계 동안 및 분화/증폭 방법의 단계 (ii) 동안 StC-EM+SB 배지가 사용되었다. 상기 배지는 KO DMEM 배지에 1% 글루타민, 10%(CTS) KO 혈청 대체물, 50 ng/ml FGF(10 ml 배지에 50 μl 스톡), 25 ng/ml VEGF 및 10 μM SB431542를 보충하여 얻었다.
방법
명시야 현미경
Zeiss Axiocam MRm 카메라가 장착된 Zeiss Axiovert200 현미경을 사용하여 세포를 이미지화하였다. Zeiss Axiovision 소프트웨어를 사용하여 사진을 획득하였다.
유세포 분석
단일 생세포 현탁액을 4℃에서 10분 동안 CD44-APC H7(BD Biosciences), CD90-PE 및 CD73-APC(all BD Biosciences)로 염색한 후 분석하였다. 세척 후, 세포를 Sytox Blue Dead Cell Stain(Life Technologies, 5 nmol/L)에서 10분 동안 인큐베이션하여 죽은 세포를 제거하였다. 비멘틴(abcam) 및 콜라겐 1(abcam) 및 알파 평활근 액틴(Sigma)을 4% 포르말린 고정 세포 현탁액에서 4℃에서 45분 동안 염색한 후 적절한 이차 항체 및 Hoechst-33342(Life Technologies, 10 μg /ml)로 염색하여 4℃에서 30분 동안 핵 DNA를 검출하였다. 세포를 LSRII SORP Cytometer(BD Biosciences) 또는 CytoFlex Cytometer(Beckman Coulter)에서 실행하였다. 샘플당 최소 10,000개의 이벤트를 분석하였다.
면역 형광 염색.
세포를 4% 포르말린(Histofix, Roth)에 고정시켰다. PBS로 3회 세척한 후, 세포를 실온에서 2시간 동안 또는 4℃에서 밤새 PBS, 5% 태아 소 혈청(Thermo Scientific), 1% 소 혈청 알부민, 0.5% Triton-X(둘 다 Sigma-Aldrich)에서 일차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 사용된 항체는 비멘틴(abcam), 항-인간 섬유아세포(clone TE-7, Millipore), 콜라겐 1(abcam) 및 윌름스 종양 항원 1(WT1, abcam)이었다. 수회 세척한 후, 핵 DNA를 검출하기 위한 적절한 이차 항체 및/또는 팔로이딘(f-액틴 표지용) 및 Hoechst-33342(Life Technologies, 10 μg/ml)를 실온에서 1시간 동안 첨가하였다. Zeiss LSM710 공초점 현미경을 사용하여 면역염색을 이미지화하였다.
RNA 시퀀싱(전사체 분석)
TRIZOL 방법(Thermo Scientific)을 사용하여 RNA를 추출하였다. 표준 감도 RNA 분석 키트(DNF-471)를 사용하여 Advanced Analytical제 Fragment Analyzer로 RNA의 품질과 무결성을 평가하였다. TruSeq Stranded Total RNA(Cat.No. RS-122-2301)로서 Illumina제의 변형된 가닥 특이적 대규모 병렬 cDNA 시퀀싱(RNA-Seq) 프로토콜을 사용하여 RNA-seq 라이브러리를 작제하였다. 라이브러리를 HiSeq 4000 플랫폼(Illumina)에서 시퀀싱하여 50 bp 단일-말단 판독(샘플당 30-40 Mio 판독)을 생성하였다. 시퀀스 이미지를 Illumina 소프트웨어 BaseCaller로 BCL 파일로 변환하고 bcl2fastq v2.17.1.14를 사용하여 fastq 파일로 디멀티플렉싱하였다. FastQC(버전 0.11.5, Babraham Bioinformatics)를 사용하여 품질 검사를 수행하였다. 서열 판독물을 Star를 사용하여 인간 게놈 참조 어셈블리(UCSC 버전 hg38)에 정렬하였다. 각 유전자에 대해, FeatureCounts를 사용하여 매핑된 판독수를 세었다. 원시 카운트를 정규화하고 log2CPM 값으로 변환하였다. Z-스케일 정규화 행렬을 사용하여 유클리드 거리 클러스터링 알고리즘을 적용한 R의 히트맵 함수에 의해 히트맵을 생성하였다. biomaRT(v2.24)를 사용하여 Ensembl 전사 길이를 기반으로 RPKM(Reads Per Kilobase per Million per Million mapping reads)을 계산하였다.
EHM 생성 및 분석
EHM 생성은 [Tiburcy et al. (2017)]에 자세히 기술되어 있다. 간략하게, iPSC 유래 심근 세포의 EHM 생성 단일 세포 현탁액을 위해, 본원에 기재된 방법에 의해 수득된 바와 같은 일차 심장 섬유아세포 및 심장 간질 세포를 준비하였다. 동일 부피의 콜라겐(0.9 mg/ml) 및 농축된 무혈청 배지(2x RPMI, 인슐린이 없는 8% B27, 200 U/ml 페니실린 및 200 mg/ml 스트렙토마이신)를 얼음 위에서 혼합하였다. 0.1N NaOH를 적가하여 pH를 중화시킨 후, 본원에 기재된 방법에 의해 수득된 바와 같은 0.5x10E6 일차 심장 섬유아세포(Lonza)를 갖는 1x10E6 심근 세포 또는 0,5x10E6 심장 간질 세포를 갖는 1x10E6 심근 세포를 콜라겐 믹스에 적가하였다. 37℃에서 60분의 하이드로겔 형성 후, EHM 배양 배지를 첨가하였다: 인슐린이 없는 4% B27, 1% 비필수 아미노산, 2 mmol/l 글루타민, 300 μmol/l 아스코르브산, 100 ng/ml IGF1(AF-100-11), 10 ng/ml, FGF-2(AF-100-18B), 5 ng/ml VEGF165(AF-100-20), 5 ng/ml TGF-β1(AF-100-21C), 및 P/S가 첨가된 Iscove's 배지(모든 성장 인자는 PeproTech에서 입수함).
가요성 포스트에서 4주간의 EHM 성숙 후, EHM을 37℃에서 5% CO2 및 95% O2로 일정한 버블링하에 Tyrode 용액(mmol/L: 120 NaCl, 1 MgCl2, 0.2 CaCl2, 5.4 KCl, 22.6 NaHCO3, 4.2 NaH2PO4, 5.6 글루코스, 및 0.56 아스코르베이트)이 채워진 기관조(Foehr Medical Instruments)에 등측적으로 현탁시켰다. 5 ms 제곱 펄스(150 mA) 및 2 mM 세포외 칼슘 농도에서 1.5Hz 전기장 자극으로 수축력 측정을 수행하였다.
ECT 생성 및 분석
일반적으로, ECT를 이전에 [Santos et al. 2019]에 기술되고 자세히 설명한 바와 같이 생성하였다. 간략하게, hECT를 생성하기 위해, 0.3 mg 소 콜라겐 I형(Collagen Solutions LLC)을 0.1N NaOH로 중화하고, 2x DMEM으로 완충한 다음 조직당 본원에 기술된 바와 같은 심장 간질 세포 0.75x106와 혼합하였다(Santos et al. 2019). 혼합물을 각각 2개의 가요성 폴(발명자의 특허 2016060314484000DE에 따라 TPK-Kunststofftechnik GmbH에서 생산함)을 포함하는 48개의 웰이 있는 폴리스티렌 세포 배양 플레이트에 캐스팅하고 37℃ 및 5% CO2의 가습 인큐베이터에서 1시간 동안 겔화되도록 두었다. 배양 동안 ECT는 가요성 폴 주위에 응축되어 그 사이에 현탁된 상태로 유지된다. ECT를 5일 동안 5 ng/ml TGFb1 부재(대조군) 또는 존재 하에 처리하였다. RSA-G2 레오미터(TA Instruments)를 사용하여 파괴 인장 응력 시험으로 강성을 측정하고 응력-변형 곡선의 기울기에서 영률로 계산하였다(kPa의 E로 보고됨; Santos et al. 2019). 간단히, 조작된 조직을 가요성 폴에서 37℃에서 PBS가 포함된 장기조로 옮기고 두 개의 맞춤형 후크 사이에 고정하였다. 그런 다음 조직을 인간 조직에 대해 파열 지점까지 0.03 mm/s의 일정한 선형 속도로 늘렸다.
웨스턴 블롯 분석
단백질 추출을 위해, 완전한 프로테아제 억제제 칵테일 및 PhosStop 포스파타제 억제제 칵테일(Merck)을 포함하는 CytoBuster(Merck Millipore)에서 10분 동안 얼음 위에서 세포 용해를 수행하였다. 4℃에서 12,000g로 30분 동안 원심분리한 후, 상층액에 4x SDS 함유 Laemmli 완충액을 보충하였다. 샘플을 변성시키고 10% 폴리아크릴아미드 겔에서 SDS-PAGE를 수행한 후, Amersham Protran 니트로셀룰로스 멤브레인(GE Healthcare)으로 옮겼다. 특이 단백질의 분자량에 따라 멤브레인을 절단하고 실온에서 1시간 동안 1x Rotiblock(Carl Roth)으로 차단한 후, TBST(10 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20)로 세척 단계를 거친 다음, 4℃에서 밤새 일차 항체로 멤브레인을 프로빙하였다. 일차 항체는 프로-콜라겐-1(Santa Cruz Biotechnologies), 알파-튜불린(Sigma-Aldrich), 평활근 액틴(Sigma-Aldrich), 페리오스틴(Santa Cruz Biotechnologies) 및 CTGF(Santa Cruz Biotechnologies)였다. 실온에서 1시간 동안 적절한 이차 퍼옥시다제-결합 항체(Sigma-Aldrich)와 인큐베이션한 다음, TBST로 3회 세척 단계를 수행하였다. 마지막으로, SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate(Thermo Scientific) 및 ChemiDoc MP Imaging System(Bio-Rad)을 사용하여 이차 항체를 검출하였다.
표
표 1a: 무혈청 보충제 'B27 마이너스 인슐린'의 조성(50x 농도, 액체)
500 ml 배지당 10 ml 'B27 마이너스 인슐린'은 2% B27 마이너스 인슐린(v/v)에 상응하고; 'B27 마이너스 인슐린'은 'B27'과 동일한 성분을 함유하고 있지만 인간 인슐린이 없다.
Figure pct00006
표 1b: 무혈청 보충제 B27 (50% 농도, 액체)의 조성
500 ml 배지당 10 ml의 (50%-)B27은 2% B27 (v/v)에 상응한다;
Figure pct00007
표 2: ECCM 보충제의 조성(100%)
Figure pct00008
참고문헌 목록
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012

Claims (16)

  1. 만능 줄기 세포로부터 심장 간질 세포의 집단을 생산하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:
    i. 만능 줄기 세포의 분화에 의해 수득된 윌름스 종양 항원(WT-1)을 발현하는 심외막 세포의 상피-중간엽 전이(epithelial-mesenchymal transition)를 유도하는 단계 - 여기서 상피-중간엽 전이를 유도함으로써 심외막 세포(epicardial cell)가 심장 간질 세포(cardiac stromal cell)로 분화되고, 여기서 상피-중간엽 전이를 유도하는 것은 a1) 상기 심외막 세포를 무혈청 기본 배지에서 제1 세포외 기질 단백질의 존재하에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계; 이어서 a2) 단계 (i) a1)의 세포를 무혈청 기본 배지에서 제2 세포외 기질 단백질의 존재하에 적합한 조건 하에 배양하는 단계를 포함하고; 여기에서 수득된 심장 간질 세포 집단의 세포 중 적어도 약 80%는 CD90, CD73 및 CD44를 발현함 -; 및
    ii. 상기 단계 (i)의 심장 간질 세포 집단을 무혈청 기본 배지에서 적어도 하나의 제3 세포외 기질 단백질의 존재하에 배양함으로써 상기 심장 간질 세포의 수를 증폭시키는 단계 - 상기 심장 간질 세포 집단의 세포 중 적어도 약 80%는 CD90, CD73 및 CD44의 발현을 유지함 -.
  2. 제1항에 있어서, 단계 (ii)는 유세포 분석법으로 측정하여 CD90, CD73 및 CD44의 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 81%, 보다 바람직하게는 적어도 82%, 보다 더 바람직하게는 적어도 83%, 보다 더 바람직하게는 적어도 84%, 보다 더 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 86%, 보다 더 바람직하게는 적어도 87%, 보다 더 바람직하게는 적어도 88%, 보다 더 바람직하게는 적어도 89%, 및 가장 바람직하게는 적어도 90%의 발현 유지로 결정되는 바와 같이 심장 간질 세포의 집단을 안정적으로 증폭시키는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 다음 단계를 포함하는 방법:
    i. 만능 줄기 세포의 분화에 의해 수득된 윌름스 종양 항원(WT-1)을 발현하는 심외막 세포의 상피-중간엽 전이를 유도하는 단계 - 여기서 상피-중간엽 전이를 유도함으로써 심외막 세포가 심장 간질 세포로 분화되고, 여기서 상피-중간엽 전이를 유도하는 것은
    a1) 상기 심외막 세포를 유효량의 (a) FGF2, (b) 혈관 내피 성장 인자(VEGF), (c) 글루타민 및 (d) GSK-3 억제제를 포함하는 무혈청 기본 배지에서 제1 세포외 기질 단백질의 존재하에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계 - 여기서 상기 양은 단계 (i) a1)에 의해 수득된 세포의 적어도 50%에서 CD90의 발현, 단계 (i) a1)에 의해 수득된 세포의 최대 50%에서 CD73의 발현, 및 단계 (i) a1)에 의해 수득된 세포의 최대 30%에서 CD44의 발현을 초래함 -; 이어서
    a2) 단계 (i) a1)의 세포를 유효량의 (a) FGF2, (b) VEGF 및 (c) 글루타민을 포함하는 무혈청 기본 배지에서 제2 세포외 기질 단백질의 존재하에 적합한 조건 하에 배양하는 단계 - 여기서 상기 양은 상기 수득된 심장 간질 세포 집단의 적어도 80%에서 CD90, CD73 및 CD44의 발현을 초래함 -를 포함하고;
    ii. 상기 단계 (i)의 심장 간질 세포 집단을 유효량의 (a) FGF2, (b) VEGF, 및 (c) 글루타민을 포함하는 무혈청 기본 배지에서 적어도 하나의 제3 세포외 기질 단백질의 존재하에 배양함으로써 상기 심장 간질 세포의 수를 증폭시키는 단계 - 상기 양은 단계 (ii)에 의해 수득된 상기 심장 간질 세포 집단의 적어도 80%에서 CD90, CD73 및 CD44의 유지된 발현을 초래함 -.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (i) a1)에서 무혈청 기본 배지는 10-200 ng/ml FGF2, 바람직하게는 15-100 ng/ml, 보다 바람직하게는 20-80 ng/ml, 보다 더 바람직하게는 30-70 ng/ml, 가장 바람직하게는 40-60 ng/ml, 및 가장 바람직하게는 약 50 ng/ml FGF2의 최종 농도를 포함하고;
    단계 (i) a1)에서 무혈청 기본 배지는 5-100 ng/ml VEGF, 바람직하게는 7-50 ng/ml, 보다 바람직하게는 10-40 ng/ml, 보다 더 바람직하게는 15-35 ng/ml, 가장 바람직하게는 20-30 ng/ml, 및 가장 바람직하게는 약 25 ng/ml VEGF의 최종 농도를 포함하고;
    단계 (i) a1)에서 무혈청 기본 배지는 0.2-20 mM 글루타민, 바람직하게는, 0.5-10 mM 글루타민, 보다 바람직하게는 0.75-5 mM 글루타민, 보다 바람직하게는 1-3 mM 글루타민, 보다 바람직하게는 1.5-2.5 mM 글루타민, 보다 더 바람직하게는 약 2 mM 글루타민의 최종 농도를 포함하고, 가장 바람직하게는 글루타민은 L-알라닌-L-글루타민 디펩티드로서 존재하고/거나;
    단계 (i) a1)에서 기본 배지는 0.1-10 μM CHIR99021, 바람직하게는 0.2-9 μM, 보다 바람직하게는 0.3-8 μM, 보다 더 바람직하게는 0.4-7 μM, 보다 더욱 바람직하게는 0.5-6 μM, 보다 바람직하게는 0.6-5 μM, 보다 바람직하게는 0.7-4 μM, 보다 바람직하게는 0.8-3 μM, 가장 바람직하게는 0.9-2 μM, 및 보다 가장 바람직하게는 약 1 μM CHIR99021의 최종 농도를 포함하는,
    방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (i) a2)에서 무혈청 기본 배지는 10-200 ng/ml FGF2, 바람직하게는 15-100 ng/ml, 보다 바람직하게는 20-80 ng/ml, 보다 더 바람직하게는 30-70 ng/ml, 가장 바람직하게는 40-60 ng/ml, 및 가장 바람직하게는 약 50 ng/ml FGF2의 최종 농도를 포함하고;
    단계 (i) a2)에서 무혈청 기본 배지는 5-100 ng/ml VEGF, 바람직하게는 7-50 ng/ml, 보다 바람직하게는 10-40 ng/ml, 보다 더 바람직하게는 15-35 ng/ml, 가장 바람직하게는 20-30 ng/ml, 및 가장 바람직하게는 약 25 ng/ml VEGF의 최종 농도를 포함하고/거나;
    단계 (i) a2)에서 무혈청 기본 배지는 0.2-20 mM 글루타민, 바람직하게는, 0.5-10 mM 글루타민, 보다 바람직하게는 0.75-5 mM 글루타민, 보다 바람직하게는 1-3 mM 글루타민, 보다 바람직하게는 1.5-2.5 mM 글루타민, 보다 더 바람직하게는 약 2 mM 글루타민의 최종 농도를 포함하고; 가장 바람직하게는 글루타민은 L-알라닌-L-글루타민 디펩티드로서 존재하는,
    방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ii)에서 무혈청 기본 배지는 10-200 ng/ml FGF2, 바람직하게는 15-100 ng/ml, 보다 바람직하게는 20-80 ng/ml, 보다 더 바람직하게는 30-70 ng/ml, 가장 바람직하게는 40-60 ng/ml, 및 가장 바람직하게는 약 50 ng/ml FGF2의 최종 농도를 포함하고;
    단계 (ii)에서 무혈청 기본 배지는 5-100 ng/ml VEGF, 바람직하게는 7-50 ng/ml, 보다 바람직하게는 10-40 ng/ml, 보다 더 바람직하게는 15-35 ng/ml, 가장 바람직하게는 20-30 ng/ml, 및 가장 바람직하게는 약 25 ng/ml VEGF의 최종 농도를 포함하고/거나;
    단계 (ii)에서 무혈청 기본 배지는 0.2-20 mM 글루타민, 바람직하게는, 0.5-10 mM 글루타민, 보다 바람직하게는 0.75-5 mM 글루타민, 보다 바람직하게는 1-3 mM 글루타민, 보다 바람직하게는 1.5-2.5 mM 글루타민, 보다 더 바람직하게는 약 2 mM 글루타민의 최종 농도를 포함하고, 가장 바람직하게는 글루타민은 L-알라닌-L-글루타민 디펩티드로서 존재하는,
    방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 세포외 기질 단백질은 라미닌, 비트로넥틴, 콜라겐, 특히 젤라틴, 피브로넥틴, 엘라스틴을 포함하고, 바람직하게는 제1 세포외 기질 단백질은 라미닌을 포함하고, 보다 바람직하게는 제1 세포외 기질 단백질은 라미닌이고, 가장 바람직하게는 라미닌은 라미닌-521이고;
    제2 세포외 기질 단백질은 제1 세포외 기질 단백질과 상이하고 비트로넥틴, 라미닌, 콜라겐, 특히 젤라틴, 피브로넥틴 및 엘라스틴을 포함하고, 바람직하게는 제2 세포외 기질 단백질은 비트로넥틴이고/거나;
    적어도 하나의 제3 세포외 기질 단백질은 비트로넥틴, 라미닌, 콜라겐, 특히 젤라틴, 피브로넥틴 및 엘라스틴으로부터 선택되고, 바람직하게는 제3 세포외 기질 단백질은 비트로넥틴인,
    방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 심외막 세포는 형광 현미경에 의해 결정된 바와 같이 윌름스 종양 항원 1(WT-1)을 발현하고;
    심외막 세포는 qRT-PCR에 의해 결정된 바와 같이 TBP(TATA-결합 단백질)보다 적어도 2배, 바람직하게는 3배, 보다 바람직하게는 4배, 보다 더 바람직하게는 적어도 5배, 가장 바람직하게는 적어도 6배; 및 최대 15배 더 윌름스 종양 항원 1(WT-1) RNA를 발현하고/거나;
    심외막 세포는 [Schlick (2018), Doctoral Thesis, November 2018, University of Goettingen, Witty et al. Nat Biotechnology 32, 1026-1035 (2014)]에 기술된 바와 같이, 또는 심외막 세포를 제공하기 위한 기타 적절한 방법으로 수득되는,
    방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 다음 단계를 포함하는 방법:
    i*. 상기 만능 줄기 세포를 유효량의 a) 골형성 단백질 4(BMP4), (b) 액티빈 A(ActA), (c) GSK-3 억제제, (d) 염기성 섬유아세포 성장 인자(FGF2), (e) 글루타민, 및 (f) 알부민, 트랜스페린, 에탄올 아민, 셀레늄 또는 이의 생체이용가능 염, L-카르니틴, 지방산 보충제, 및 트리오도-L-티로닌(T3)을 포함하는 무혈청 보충제를 포함하는 무혈청 기본 배지에서 라미닌 코팅된 기질 상에서 적합한 조건 하에 배양함으로써 중배엽 분화를 유도하는 단계 - 여기서 상기 양은 유세포 측정법에 의해 결정된 바와 같이 단계 (i*)에 의해 수득된 세포의 적어도 90%에서 CD90 발현, 단계 (i*)에 의해 수득된 세포의 최대 10%에서 CD73 발현 및 단계 (i*)에 의해 수득된 세포의 최대 10%에서 CD44 발현을 초래함 -;
    i**. 단계 (i*)의 세포를 유효량의 (a) BMP4, (b) 레티노산(RA), (c) GSK-3 억제제, (d) 인슐린, (e) 글루타민 및 (f) (i)에서와 같은 무혈청 보충제를 포함하는 무혈청 기본 배지에서 라미닌 코팅된 기질 상에서 적합한 조건 하에 배양함으로써 심외막 분화를 유도하는 단계 - 여기서 수득된 세포는 형광 현미경에 의해 결정된 바와 같이 윌름스 종양 항원 1(WT-1)을 발현함 -;,
    i. 단계 (i**)의 세포를 유효량의 (a) FGF2, (b) 혈관 내피 성장 인자(VEGF), (c) 글루타민 및 (d) GSK-3 억제제를 포함하는 무혈청 기본 배지에서 제1 세포외 기질 단백질의 존재하에 적합한 조건 하에 배양함으로써 상피-중간엽 전이를 유도하는 단계 - 여기서 상기 양은 단계 (i) a1)에 의해 수득된 세포의 적어도 50%에서 CD90 발현, 단계 (i) a1)에 의해 수득된 세포의 최대 50%에서 CD73 발현 및 단계 (i) a1)에 의해 수득된 세포의 최대 30%에서 CD44 발현을 초래함 -;
    a2) 이어서 단계 (i) a1)의 세포를 유효량의 (a) FGF2, (b) VEGF, 및 (c) 글루타민을 포함하는 무혈청 기본 배지에서 제2 세포외 기질 단백질 기질의 존재하에 적합한 조건 하에 배양하는 단계 - 여기서 상기 양은 수득된 심장 간질 세포 집단의 적어도 약 80%에서 CD90, CD73 및 CD44 발현을 초래함; 및
    ii. 단계 (i)의 상기 심장 간질 세포 집단을 유효량의 (a) FGF2, (b) VEGF, 및 (c) 글루타민을 포함하는 무혈청 기본 배지에서 적어도 하나의 제3 세포외 기질 단백질 기질의 존재하에 배양함으로써 상기 심장 간질 세포의 수를 증폭시키는 단계 - 여기서 상기 양은 상기 심장 간질 세포 집단의 적어도 약 80%에서 CD90, CD73 및 CD44의 발현 유지로 이어짐 -.
  10. 단리된 심장 간질 세포의 집단으로서, 여기서 심장 간질 세포는 만능 줄기 세포의 분화에 의해 얻어지며, 심장 간질 세포 집단의 세포 중 적어도 약 80%가 CD90, CD73 및 CD44를 발현하는, 단리된 심장 간질 세포 집단.
  11. 제10항에 정의된 바와 같은 심장 간질 세포의 집단을 포함하는 조작된 기관 조직.
  12. 약물 스크리닝을 위한 시험관내 모델, 바람직하게는 약물 효능 스크리닝을 위한 시험관내 모델 또는 약물 독성 스크리닝을 위한 시험관내 모델에서의 제1항 내지 제9항 및 제16항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득되거나, 제10항에 정의된 바와 같은 심장 간질 세포 집단(cStC)의 용도, 또는 제11항에 정의된 바와 같은 조작된 기관 조직의 용도.
  13. 기관 조직, 바람직하게는 인간의 조작된 기관 조직의 시험관내 생산에서 제1항 내지 제9항 및 제16항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득되거나, 제10항에 정의된 바와 같은 심장 간질 세포 집단(cStC)의 용도로서, 보다 바람직하게는 조작된 인간 기관 조직은 조작된 인간 심근 또는 조작된 인간 결합 조직인, 용도.
  14. 기관 복구, 바람직하게는 심장 복구 또는 연조직 복구에 사용하기 위한, 제1항 내지 제9항 및 제16항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득되거나, 제10항에 정의된 바와 같은 심장 간질 세포(cStC) 집단.
  15. (a) 무혈청 기본 배지, (b) 10-200 ng/ml FGF2, (c) 5-100 ng/ml VEGF, (d) 0.2-20 mM 글루타민, 및 (e) 6.6-165 μg/ml 아스코르브산, 2-50 μg/ml 인슐린, 1.1-27.5 μg/ml 트랜스페린, 1660-41500 μg/ml 알부민, 및 11-145 nM 셀레늄을 포함하는 진핵 세포 배양 배지 보충제를 포함하는, 심장 간질 세포의 증폭에 적합한 무혈청 배양 배지.
  16. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (i) a2) 및/또는 단계 (ii)에서의 무혈청 기본 배지는 유효량의 TGF베타 억제제를 추가로 포함하는, 방법.
KR1020237006980A 2020-07-29 2021-07-28 인간 만능 줄기 세포 유래 심장 간질 세포의 대량 생산 KR20230042365A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP20188364.2A EP3945133A1 (en) 2020-07-29 2020-07-29 Mass production of human pluripotent stem cell derived cardiac stromal cell
EP20188364.2 2020-07-29
PCT/EP2021/071220 WO2022023451A1 (en) 2020-07-29 2021-07-28 Mass production of human pluripotent stem cell derived cardiac stromal cell

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230042365A true KR20230042365A (ko) 2023-03-28

Family

ID=71846273

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237006980A KR20230042365A (ko) 2020-07-29 2021-07-28 인간 만능 줄기 세포 유래 심장 간질 세포의 대량 생산

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20230279357A1 (ko)
EP (1) EP3945133A1 (ko)
JP (1) JP2023535479A (ko)
KR (1) KR20230042365A (ko)
CN (1) CN116323918A (ko)
AU (1) AU2021314957A1 (ko)
CA (1) CA3186397A1 (ko)
IL (1) IL300250A (ko)
WO (1) WO2022023451A1 (ko)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023151475A1 (en) * 2022-02-10 2023-08-17 The University Of Hong Kong A method of derivation of mesenchymal stem cells from mammalian pluripotent stem cells
WO2024008773A1 (en) 2022-07-05 2024-01-11 Repairon Gmbh Differentiation of ipscs in bioreactors
WO2024020402A1 (en) * 2022-07-19 2024-01-25 Lung Biotechnology Pbc Methods for differentiating stromal cells or pericytes
EP4386384A1 (en) 2022-12-15 2024-06-19 Georg-August-Universität Göttingen Stiftung Öffentlichen Rechts, Universitätsmedizin Potency assay for pharmaceutical products
CN115975907A (zh) * 2022-12-16 2023-04-18 北京镁伽机器人科技有限公司 培养基及其应用以及培养心脏类器官的方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU5734998A (en) 1997-01-10 1998-08-03 Life Technologies, Inc. Embryonic stem cell serum replacement
US7148959B2 (en) 2002-11-01 2006-12-12 Asml Netherlands B.V. Test pattern, inspection method, and device manufacturing method
CN108478599B (zh) * 2011-11-30 2022-08-02 安斯泰来再生医药协会 间充质基质细胞及其相关用途
DK2840132T3 (en) * 2013-08-22 2017-02-20 Georg-August-Universität Göttingen Stiftung Öffenlichen Rechts Universitätsmedizin Method of Manufacturing Constructed Heart Muscle (EHM)
DK3047019T3 (da) 2013-09-20 2019-08-26 Georg August Univ Goettingen Stiftung Oeffentlichen Rechts Univsmedizin Fremgangsmåde til at lede differentiering af pluripotente stamceller til funktionel hjertemuskel
JP7059481B2 (ja) * 2016-06-23 2022-04-26 国立大学法人京都大学 Ｃｄ４ｃｄ８両陽性ｔ細胞の製造方法
US11072780B2 (en) 2016-09-30 2021-07-27 Wisconsin Alumni Research Foundation Method of differentiating human pluripotent cells into cardiac fibroblasts

Also Published As

Publication number Publication date
AU2021314957A1 (en) 2023-02-09
CA3186397A1 (en) 2022-02-03
JP2023535479A (ja) 2023-08-17
IL300250A (en) 2023-03-01
CN116323918A (zh) 2023-06-23
EP3945133A1 (en) 2022-02-02
US20230279357A1 (en) 2023-09-07
EP3945133A8 (en) 2023-04-12
WO2022023451A1 (en) 2022-02-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20230042365A (ko) 인간 만능 줄기 세포 유래 심장 간질 세포의 대량 생산
AU2002317039B2 (en) Methods of inducing differentiation of stem cells
JP5631210B2 (ja) 多能性幹細胞からのニューロン細胞の生成
ES2688019T3 (es) Métodos y composiciones para la producción acelerada de células epiteliales pigmentadas retinianas a partir de células pluripotentes
US20210079351A1 (en) Tissue-specific differentiation matrices and uses thereof
AU2009228756B2 (en) Methods for producing hair microfollicles and de novo papillae and their use for in vitro tests and in vivo implantations
AU2002317039A1 (en) Methods of inducing differentiation of stem cells
US20080254003A1 (en) Differentiation of Human Embryonic Stem Cells and Cardiomyocytes and Cardiomyocyte Progenitors Derived Therefrom
JP7225096B2 (ja) ヒト心室前駆細胞を単離するための方法
EP3882341A1 (en) Heart tissue model
US20200283735A1 (en) Organoid and method for producing the same
JP2017525393A (ja) ヒト心室前駆体細胞を単離するための細胞表面マーカーとしてのＪａｇｇｅｄ１／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４の使用
US20140329311A1 (en) Induction of human embryonic stem cell derived cardiac pacemaker or chamber-type cardiomyocytes by manipulation of neuregulin signaling
KR20160131096A (ko) 내피 집락 형성 세포­유사 세포를 생성하는 방법
AU2004320333B2 (en) Improved cardiomyocyte differentiation
CA2917743A1 (en) Derivation and self-renewal of isl1+ cells and uses thereof
CN112538458A (zh) 用于重编程细胞的方法
AU2005318931A1 (en) Differentiation of human embryonic stem cells and cardiomyocytes and cardiomyocyte progenitors derived therefrom

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination