KR20160131096A - 내피 집락 형성 세포­유사 세포를 생성하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 일반적으로 세포 및 조직 생물학 및 치료제에 유용한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 특히, 다능성 세포를 내피 집락 형성 세포-유사 세포 (ECFC-유사 세포)로 분화시키기 위한 시험관내 방법이 제공된다. NRP-1+CD31+ ECFC-유사 세포의 정제된 인간 세포 집단이 제공되며, 집단에서 세포의 적어도 일부는 높은 증식 가능성을 갖는다. 본 발명의 세포 집단을 이용하기 위한 치료제 및 시험 작용제 스크리닝 방법이 제공된다.

Description

내피 집락 형성 세포­유사 세포를 생성하는 방법{METHOD FOR GENERATING ENDOTHELIAL COLONY FORMING CELL-LIKE CELLS}
종래 출원의 전후 참조
본 출원은 2014년 3월 11일 출원된 미국 가특허출원 61/951,103호의 우선권을 주장하고, 그 전문은 개시된 바와 같이 본원에 참조로서 포함된다.
기술 분야
본 발명은 세포 및 조직 생물학의 분야에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 다능성 줄기 세포의 내피 집락 형성 세포-유사 세포 (ECFC-유사 세포)로의 계통-특이적 분화에 관한 것이다.
내피 집락 형성 세포 (ECFC)는 클론 증식 잠재력과 고유한 생체내 혈관 형성 능력을 지니는, 특히 제대혈에 풍부한 희귀한 순환 내피 세포이다 1 - 6 . 혈액 생성 내피 세포 (BOEC) 7 로도 불리는 ECFC는 성별-불일치 인간 골수 이식 환자에서 직접 이식가능한 것으로 밝혀졌고, 대부분의 증식성 순환 BOEC는 공여체 골수의 유전 표지(genetic marking)를 나타낸다7 , 8. 공여체 골수 내의 어떤 유형의 세포가 ECFC를 발생시키는 지는 알려져 있지 않다. 배양된 ECFC가 임상-전 설치류 혈관 손상 모델에 정맥내 주입될 때, 이들은 혈관형성 반응의 개시를 조율하기 위해 혈관 손상 또는 조직 허혈 부위로 빠르게 동원된다 9 - 11 . 인간 ECFC는 심근경색증12 , 13, 뇌졸중 9 , 허혈 망막병증14, 15, 허혈 사지 손상 10 , 11, 16, 17 이후에 혈관 복구를 향상시키고 혈류를 개선시키며, 벗겨진(denuded) 혈관 세그먼트 또는 이식된 이식편을 접합시키고 재-내피화하는 것으로 보고되었다 18 . 말초 동맥 질환 (PAD) 및 중증 사지 허혈 (CLI)을 갖는 노인 환자 및 대상체에서, 순환 또는 상주 ECFC는 복제성 노화되는 경향이 있을 수 있으므로 (즉, ECFC는 증식 잠재력이 부족할 수 있다), 이들을 자가 혈관 복구에 중요하게 만든다. 적어도 이러한 이유로, 혈관 복구에 이용될 수 있는 ECFC의 대안적인 공급원을 찾는 것이 바람직할 수 있다.
인간 다능성 세포 (인간 배아 줄기 세포 및 유도된 다능성 줄기 세포, 총괄적으로 hPSC)는 동물체에서 임의의 세포 유형으로 분화되기 위해 실제로 비제한적인 자가-재생능 및 능력을 나타낸다19 - 21. 인간 다능성 줄기 세포는 내피 계통의 세포로 분화되는 것으로 보고되었다 22 - 31 . 그러나, 시험관내 hPSC-유래된 내피 세포는 불안정하고 (예컨대, 다양한 비-내피 표현형으로 이동하는 것이 보고됨24 , 32), 5-7회 계대 내에서 복제성 노화에 도달하는 성향을 지닌 낮은 증식 가능성을 나타내고 26 , 27, 32 , 및/또는 지지 세포의 공동-이식의 부재 하에 생체내 혈관 형성 능력이 부족하다51. 제대혈 ECFC (CB-ECFC)와 동일하거나 더 큰 증식 가능성을 갖고 공동-배양되거나 공동-이식된 세포의 부재 하에 생체내 혈관을 형성하는 능력을 지닌 내피 세포의 hPSC로부터의 시험관내 유도에 대한 공개된 증거는 없다 (본 발명자들의 증거 외에).
상기 결함 중 하나 이상을 완화하고/거나 회피하는 것이 바람직하다.
발명의 개요
본 발명은 hPSC로부터 내피 집락 형성 세포-유사 세포 (ECFC-유사 세포)를 생성하는 방법에 관해 광범하게 요약된다. hPSC를 CB-ECFC와 유사한 분자적, 형태학적 및 기능적 특성을 갖는 ECFC-유사 세포의 집단으로 재현가능하게 분화시키기 위한 프로토콜이 본원에 제공된다.
본 발명의 양태에서, 인간 다능성 줄기 세포로부터 인간 내피 집락 형성 세포-유사 세포 (ECFC-유사 세포)의 분리된 집단을 생성하는 방법이 제공되고, 상기 방법은,
a) 다능성 줄기 세포를 제공하는 단계;
b) 다능성 줄기 세포가 내피 분화를 겪도록 유도하는 단계로서, 상기 유도가,
i) 다능성 줄기 세포를 약 24시간 동안 액티빈 A, BMP-4, VEGF 및 FGF-2를 포함하는 내피 분화 배지에서 배양시키고;
ii) 단계 i)의 배지를 그 후 대략 하루 또는 이틀마다 BMP-4, VEGF 및 FGF-2를 포함하는 내피 분화 배지로 대체시키는 것을 포함하는, 단계; 및
c) 분화를 겪도록 유도된 세포로부터 ECFC-유사 세포를 분리하는 단계로서, ECFC-유사 세포가 CD31+NRP-1+이고 조약돌 형태를 나타내는, 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 인간 NRP-1+CD31+ 내피 집락 형성 세포-유사 세포 (ECFC-유사 세포)의 분리된 집단이 제공되고, 여기서 분리된 ECFC-유사 세포는 공동-이식된 세포의 부재 하에 포유동물에 이식시 혈관을 형성하는 능력을 지니고 분리된 ECFC-유사 세포는 인간 다능성 세포로부터 시험관내 유래되었다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본원에 기재된 방법에 따라 수득된 인간 NRP-1+CD31+ 내피 집락 형성 세포-유사 세포 (ECFC-유사 세포)의 분리된 집단이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본원에 기재된 세포의 분리된 집단을 대상체에 제공하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 이식을 위한 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 치료적 유효량의 본원에 기재된 세포 집단을 대상체에 제공하는 것을 포함하는, 상피 복구를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 수득된 내피 집락 형성 세포-유사 세포 (ECFC-유사 세포)를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 세포의 활성을 개질시키는 능력에 대해 시험 작용제를 조사하는 방법이 제공되고, 상기 방법은,
- 본원에 기재된 세포 집단의 세포 중 적어도 하나를 시험 작용제에 노출시키는 단계; 및
- 세포 성장 및 세포 생육성 중 하나 이상에 대한 시험 작용제의 효과를 관찰하는 단계를 포함한다.
본 특허 또는 출원 파일은 적어도 하나의 컬러 도면을 포함한다. 컬러 도면을 지닌 이러한 특허 또는 특허 출원 공보의 사본은 요청 및 필요한 수수료의 지불시 청에 의해 제공될 것이다.
본 발명의 특징은 첨부된 도면을 참조로 하는 하기 상세한 설명으로 더욱 자명해질 것이다.
도 1a-e는 hES 및 hiPS 세포를 OP9 기질 세포와 함께 시험관내 공동-배양시킴에 의해 분화된 hES 및 hiPS 세포로부터 유래된 내피 세포의 형태, 내피 항원 발현, 클론 증식 가능성, 및 시험관내 및 생체내 혈관 형성 가능성의 조사를 예시한다.
도 1a는 OP9 세포와의 공동-배양에서 내피 계통 분화를 겪은 지 8일 후에 hES 및 hiPS 세포의 대표적인 위상차 현미경사진 (상부 패널); P1 및 P4에서 분리된 세포의 배양 (중간 패널); 및 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC) 대조군 세포에서 특징적인 조약돌 내피 표현형을 묘사한다. 모든 실험은 이중으로 5회 수행되었다; 눈금 바, 100 μm.
도 1b는 세포와 OP9의 공동-배양으로부터 수득된 hiPS 및 hES-유래된 세포 (P4)가 인간 CD31, CD144 및 CD146에 대한 모노클로날 항체로 염색되었음을 묘사한다. 상부 패널 윤곽 플롯에서의 백분율은 CD144 및 CD31 이중 양성 세포를 나타내고, 하부 패널 윤곽 플롯에서의 백분율은 CD144 및 CD146 이중 양성 세포를 나타낸다. 모든 실험은 이중으로 4회 수행되었다; 대표적인 윤곽 플롯이 각 그룹에 대해 도시된다.
도 1c는 Matrigel™ 상에 모세관-유사 네트워크의 몇 개의 큰 가지를 형성한, OP9 공동-배양된 hiPS 및 hES-유래된 세포 (P4)의 대표적인 현미경사진을 묘사한다. 모든 실험은 이중으로 5회 수행되었다. 눈금 바, 100 μm.
도 1d는 CB-ECFC 대조군에 비해 OP9 공동-배양된 hES-유래된 세포 (P3 내지 P4)의 클론 증식 분석을 나타내는 막대 그래프를 묘사한다. 모든 실험은 삼중으로 4회 수행되었다; 값은 평균 ± SD를 나타낸다. 스튜던트 t-테스트: **p<0.01 및 ***p<0.001. 눈금 바, 100 μm.
도 1e는 생체내 이식시 마우스 적혈구-충전된 기능성 인간 혈관을 형성하는데 실패한 OP9 공동-배양된 hiPS 및 hES-유래된 세포 (P4)의 대표적인 현미경사진을 묘사한다. 모든 실험은 이중으로 5회 수행되었다. 눈금 바, 100 μm.
도 2a-e는 hES 및 hiPS 세포의 EB-매개된 내피 계통 분화로부터 수득된 내피 세포의 형태, 내피 항원 발현, 클론 증식 가능성, 및 시험관내 및 생체내 혈관 형성 가능성의 조사를 예시한다.
도 2a는 EB-매개된 내피 계통 분화 7일에 hES 및 hiPS-유래된 EB의 대표적인 위상차 현미경사진 (상부 패널); P1 및 P4에서 분리된 세포의 배양 (중간 패널); 및 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC: 하부 패널)에서 특징적인 조약돌 내피 표현형을 묘사한다. 모든 실험은 이중으로 5회 수행되었다. 눈금 바, 100 μm.
도 2b는 EB-기반 프로토콜로부터 수득된 hiPS 및 hES-유래된 세포 (P4)가 인간 CD31, CD144 및 CD146에 대한 모노클로날 항체로 염색되었음을 묘사한다. 상부 패널 윤곽 플롯에서의 백분율은 CD144 및 CD31 이중 양성 세포를 나타내고, 하부 패널 윤곽 플롯에서의 백분율은 CD144 및 CD146 이중 양성 세포를 나타낸다. 모든 실험은 이중으로 4회 수행되었다.
도 2c는 Matrigel™ 상에 다수의 작은 불완전 가지를 지니는 모세관-유사 네트워크를 형성한 EB-기반 hiPS 및 hES-유래된 세포 (P4)의 대표적인 현미경사진을 묘사한다. 모든 실험은 이중으로 5회 수행되었다. 눈금 바, 100 μm.
도 2d는 CB-ECFC 대조군 세포에 비해 EB-기반 hES-유래된 세포 (P3 내지 P4)의 클론 증식 분석을 나타내는 막대 그래프를 묘사한다. 모든 실험은 삼중으로 4회 수행되었다; 값은 평균 ± SD를 나타낸다. 스튜던트 t-테스트: **p<0.01 및 ***p<0.001.
도 2e는 생체내 이식시 마우스 적혈구-충전된 기능성 인간 혈관을 형성하는데 실패한 EB-기반 hiPS 및 hES-유래된 세포 (P4)의 대표적인 현미경사진을 묘사한다. 모든 실험은 이중으로 5회 수행되었다. 눈금 바, 100 μm.
도 3a-e는 hES 세포의 EB 플러스 2D-기반 내피 계통 분화 (TGF-베타 억제제의 존재 하에)로부터 수득된 내피 세포의 형태, 내피 항원 발현, 클론 증식 가능성, 및 시험관내 Matrigel™ 네트워크 형성 가능성의 조사를 예시한다.
도 3a는 종래에 기재된 대로, EB 플러스 2D-기반 분화 프로토콜에서 hES 세포의 내피 계통 분화의 개략도이다24.
3b는 EB 플러스 2D-기반 분화 프로토콜에서 상이한 날에 내피 계통 분화를 겪은 hES 세포의 대표적인 위상차 현미경사진을 묘사한다. 모든 실험은 이중으로 5회 수행되었다. 눈금 바, 100 μm.
도 3c는 EB 플러스 2D-기반 분화 프로토콜에서 상이한 날에 내피 계통 분화를 겪은 hES 세포의 대표적인 윤곽 플롯을 묘사한다. 세포를 14일의 내피 계통 분화를 겪는 동안 상이한 시점에 다양한 인간 내피 항원에 대한 모노클로날 항체로 염색하였다. 윤곽 플롯에서의 백분율은 NRP-1 및 CD31 이중 양성 세포를 나타낸다. 모든 실험은 이중으로 5회 수행되었다.
도 3d는 EB 플러스 2D-기반 분화 프로토콜에서 내피 계통 분화를 겪은 hES 세포로부터 14일에 유래된 분류된 세포의 상이한 서브세트 (NRP-1+CD31+, NRP-1+CD31-, NRP-1-CD31+ 및 CD144+CD146+)의 대표적인 위상차 현미경사진을 묘사한다. 모든 실험은 이중으로 5회 수행되었다. 눈금 바, 100 μm.
도 3e는 CB-ECFC 대조군에 비해 EB-2D-기반 hES-유래된 다양한 서브세트 (P3 내지 P4)의 클론 증식 분석의 결과를 도시하는 막대 그래프를 묘사한다. 모든 실험은 삼중으로 4회 수행되었다; 값은 평균 ± SD를 나타낸다.
도 4a-g는 EB 형성 또는 TGF-β 억제를 요구하지 않고 CB-ECFC와 유사한 ECFC-유사 세포를 산출하는 본원에 제공된 1-단계 2D 혈청-비함유 내피 계통 분화 프로토콜을 예시한다.
도 4a는 본원에 제공된 대로, 104 hES 또는 hiPS 세포로부터 출발하여 61일에 1조개 이상의 ECFC-유사 세포로 hES 및 hiPS 세포를 분화시키기 위한 내피 계통 분화 프로토콜의 개략도이다. 12일에 3 x 104개 hPS 세포의 생성이 좌측에 도시된다. 대표적인 유세포 측정법 윤곽 플롯 (하부)은 12일 분화된 세포에서 NRP-1 및 CD31의 발현 퍼센트를 나타낸다. 12일 NRP-1+CD31+ 세포는 광범한 증식을 거쳐 안정한 ECFC-유사 세포 집락을 발생시킨다.
도 4b는 12일 분화된 세포가 NRP-1+CD31+ 및 NRP-1-CD31+ 세포 분획에 대해 분류되고 내피 성장을 위해 전이 배지에서 배양되었음을 도시하는 막대 그래프를 묘사한다. 모든 실험은 삼중으로 6회 수행되었고 값은 평균 ± SD를 나타낸다. 스튜던트 t-테스트: ***p<0.001.
도 4c는 특징적인 조약돌 형태를 나타내는 NRP-1+CD31+ 세포 분획으로부터 수득되고 각 집락 내에 내피 세포의 동종 집단을 함유한 ECFC-유사 세포 집락의 대표적인 현미경사진이다. 실험은 이중으로 8회 수행되었다. 눈금 바, 50 μm.
도 4d는 전형적인 내피 마커 CD31, CD144 및 NRP-1에 대해 세포 표면 발현을 나타내고 비-내피 마커 α-SMA에 대해서는 나타내지 않는 ECFC-유사 세포의 대표적인 면역형광 현미경사진을 묘사한다. 좌측 패널에서, NRP-1 발현은 녹색으로 표시되고; CD31 발현은 적색으로 표시된다. 우측 패널에서, α-SMA 발현은 녹색으로 표시되고; CD144 발현은 적색으로 표시된다. DAPI를 이용하여 핵을 청색으로 염색하였다. 모든 실험은 이중으로 3회 수행되었다.
도 4e는 CB-ECFC 대조군에 비해 hES- 및 hiPS-유래된 ECFC-유사 세포의 클론 증식 분석을 나타내는 막대 그래프이다. 모든 실험은 삼중으로 4회 수행되었고 값은 평균 ± SD를 나타낸다.
도 4f는 CB-ECFC에 의해 나타난 것과 유사하게, 특징적인 조약돌 형태를 나타내고 Matrigel™ 상에 완전 모세관-유사 네트워크를 형성하는 iPS-유래된 ECFC-유사 세포의 능력을 예시하는 대표적인 위상차 현미경사진을 묘사한다. 모든 실험은 이중으로 5회 수행되었다. 눈금 바, 100 μm.
도 4g는 ECFC-유사 세포가 면역결핍 마우스에서 지속적이고 기능성인 생체내 인간 혈관을 형성함을 예시한다. 대표적인 현미경사진의 화살표는 순환하는 숙주 뮤린 적혈구로 관류된 항-인간 CD31+ 염색된 기능성 인간 혈관을 묘사한다. 눈금 바, 50 μm. 막대 그래프 (하부)는 각 그룹에서 mm2에 대해 계수된 기능성 hCD31+ 혈관의 정량을 나타낸다. 모든 실험은 삼중으로 6회 수행되었고 값은 평균 ± SD를 나타낸다. 스튜던트 t-테스트: p = ns. 눈금 바, 50 μm.
도 5는 ECFC-유사 세포 프로토콜에서 분화하는 hES 및 hiPS 세포로부터 NRP-1+CD31+ 세포 출현의 동역학 분석을 예시한다. 모든 실험은 이중으로 4회 수행되었다; 값은 평균 ± SD를 나타낸다.
도 6a-e는 NRP-1-CD31+ 세포가 ECFC 특성을 나타내지 않음을 예시한다.
도 6a는 이종성 형태를 나타내는 NRP-1-CD31+ 세포로부터 수득된 내피 집락의 대표적인 현미경사진을 묘사한다. 실험은 이중으로 8회 수행되었다. 눈금 바, 100 μm.
도 6b는 비-내피 마커 α-SMA의 우세한 발현을 나타내고 내피 표면 마커 CD144를 발현시키는 세포는 많지 않은 NRP-1-CD31+ 세포의 대표적인 면역형광 현미경사진을 묘사한다. CD144 발현은 적색으로 표시되고; α-SMA 발현은 녹색으로 표시되고; DAPI를 이용하여 핵을 청색으로 염색하였다. 실험은 이중으로 4회 수행되었다. 눈금 바, 100 μm.
도 6c는 생체내 이식시 뮤린 적혈구-충전된 기능성 인간 혈관을 형성할 수 없는 NRP-1-CD31+ 세포의 대표적인 현미경사진을 묘사한다. 대신, NRP-1-CD31+ 세포는 RBC가 없는 작은 루멘을 형성하였는데 (화살표로 표시됨), 이는 혈관개통의 결함을 시사한다. 모든 실험은 이중으로 5회 수행되었다. 눈금 바, 100 μm.
도 6d는 Matrigel™ 상에 불완전 모세관-유사 네트워크의 형성을 나타내는 NRP-1-CD31+ 세포의 대표적인 위상차 현미경사진을 묘사한다. 모든 실험은 이중으로 5회 수행되었다. 눈금 바, 100 μm.
도 6e는 플레이팅된 단일 CB-ECFC 대조군에 비해 hiPS-유래된 NRP-1-CD31+ 및 NRP-1+CD31+ 세포의 클론 증식 분석의 결과를 도시하는 막대 그래프를 묘사한다. 모든 실험은 삼중으로 4회 수행되었다; 값은 평균 ± SD를 나타낸다. 스튜던트 t-테스트: ***p<0.001.
도 7a-d는 안정한 ECFC-유사 표현형을 발생시키는 NRP-1+CD31+ 세포가 분화 9일에 나타나기 시작하고 안정한 ECFC-유사 세포를 발생시키는 NRP-1+CD31+ 세포의 출현에서의 현저한 증가가 분화 12일에 발생함을 예시한다.
도 7a는 분화 6일, 9일 및 12일에 본원에 제공된 ECFC-유사 세포 프로토콜을 이용하여 인간 iPS 세포로부터 유래된 출현한 NRP-1+CD31+ 세포의 백분율을 예시하는 막대 도표를 묘사한다. 모든 실험은 이중으로 4회 수행되었다. 값은 평균 ± SD를 나타낸다. 스튜던트 t-테스트: ***p<0.001.
도 7b는 분화 6일, 9일 및 12일에 조사된 hiPS-유래된 NRP-1+CD31+ 세포로부터 수득된 내피 집락의 대표적인 현미경사진을 묘사한다. 12일-유래된 NRP-1+CD31+ 세포는 조약돌 형태를 나타내었고 각 집락 내에 내피 세포의 동종 집단을 함유하였다. 모든 실험은 이중으로 8회 수행되었다. 눈금 바, 50 μm.
도 7c는 분화 6일, 9일 및 12일에 본원에 제공된 ECFC-유사 세포 프로토콜을 이용하여 수득된 hiPS-유래된 NRP-1+CD31+ 세포 분획의 대표적인 윤곽 플롯을 묘사한다. 윤곽 플롯에 도시된 백분율은 CD144 및 CD31 이중 양성 세포를 나타낸다. 모든 실험은 이중으로 4회 수행되었다.
도 7d는 Matrigel™ 네트워크 형성 가능성을 도시하는 대표적인 위상차 현미경사진을 묘사한다. 모든 실험은 이중으로 5회 수행되었다. 눈금 바, 100 μm.
도 8a-e는 본원에 제공된 ECFC-유사 세포 분화 프로토콜로부터 수득된 hES-유래된 내피 세포의 형태, 내피 항원 발현, 및 시험관내 Matrigel™ 네트워크 형성 가능성의 조사를 예시한다.
도 8a는 본원에 제공된 ECFC-유사 세포 분화 프로토콜에서 상이한 날에 내피 계통 분화를 겪은 hiPS 세포의 대표적인 위상차 현미경사진을 묘사한다. 2D 배양에서 인간 iPS 세포는 성장하여 내피 유사 형태를 지닌 세포 집락을 형성하였고 (6일 및 9일에) 12일에 컨플루언트(confluent)되었다. 실험은 이중으로 8회 수행되었다. 눈금 바, 100 μm.
도 8b는 전형적인 내피 마커 CD31, CD144 및 NRP-1에 대해 세포 표면 발현을 나타내고 비-내피 마커 α-SMA에 대해서는 나타내지 않은 상이한 날에 ECFC-유사 세포 분화를 겪은 세포의 대표적인 면역형광 현미경사진을 묘사한다. NRP-1+CD31+ 세포는 분화하는 세포의 덩어리 내에 세포 클러스터로서 나타났고 12일에 α-SMA 발현은 전혀 없었다. NRP-1 발현은 녹색으로 표시되고; CD31 발현은 적색으로 표시되고; α-SMA 발현은 녹색으로 표시되고; CD144 발현은 적색으로 표시되고; DAPI을 이용하여 핵을 청색으로 염색하였다. 실험은 이중으로 4회 수행되었다. 눈금 바, 50 μm.
도 8c는 6일, 9일 및 12일에 조사된 hiPS-유래된 NRP-1+CD31+ 세포 분획으로부터 수득된 내피 집락의 대표적인 현미경사진을 묘사한다. 12일-유래된 NRP-1+CD31+ 세포는 각 집락 내에 내피 세포의 동종 집단을 함유하는 특징적인 조약돌 형태를 나타내었다. 모든 실험은 이중으로 8회 수행되었다. 눈금 바, 50 μm.
도 8d는 6일, 9일 및 12일에 ECFC-유사 세포 프로토콜을 이용하여 수득된 hiPS-유래된 NRP-1+CD31+ 세포 분획의 대표적인 윤곽 플롯을 묘사한다. 상이한 날에 유래된 NRP-1+CD31+ 세포를 내피 성장 배지에서 배양하였고 이것은 세포의 컨플루언트 단층을 형성하였다. 이러한 세포를 인간 CD31 및 CD144 내피 항원에 대한 모노클로날 항체로 염색하여 전형적인 내피 유전자 공동-발현에 대해 조사하였다. 윤곽 플롯에서의 지시된 백분율은 CD144 및 CD31 이중 양성 세포를 나타낸다. CD144 및 CD31을 공동-발현시키는 세포의 가장 높은 백분율은 12일에 유래된 NRP-1+CD31+ 세포에서 나타났다. 모든 실험은 이중으로 5회 수행되었다.
도 8e는 Matrigel™ 네트워크 형성 가능성을 나타내는 대표적인 위상차 현미경사진을 묘사한다. 인간 iPS-유래된 NRP-1+CD31+ 세포 분획을 ECFC-유사 세포 분화 프로토콜의 6일, 9일 및 12일에 ECFC-유사 세포 프로토콜을 이용하여 수득하였다. 상기 날들 각각으로부터 NRP-1+CD31+ 세포를 배양하고 증식시킨 후, 시험관내 모세관-유사 네트워크 형성 검정을 Matrigel™ 코팅된 디쉬 상에서 수행하였다. 6일-유래된 세포는 Matrigel™ 상에 플레이팅시 불완전 모세관-유사 네트워크를 형성하였으나, 9일 및 12일-유래된 세포는 완전 모세관-유사 네트워크를 형성하였다. 모든 실험은 이중으로 4회 수행되었다. 눈금 바, 100 μm.
도 9a-e는 본원에 제공된 ECFC-유사 세포 분화 프로토콜로부터 수득된 hES-유래된 내피 세포의 형태, 내피 항원 발현, 및 시험관내 Matrigel™ 네트워크 형성 가능성의 조사를 예시한다.
도 9a는 ECFC-유사 세포 분화 프로토콜에서 상이한 날에 내피 계통 분화를 겪은 hES 세포의 대표적인 위상차 현미경사진을 묘사한다. 모든 실험은 이중으로 8회 수행되었다. 눈금 바, 100 μm.
도 9b는 전형적인 내피 마커 CD31, CD144 및 NRP-1에 대해 세포 표면 발현을 나타내고 비-내피 마커 α-SMA에 대해서는 나타내지 않은 상이한 날에 ECFC-유사 세포 분화를 겪은 세포의 대표적인 면역형광 현미경사진을 묘사한다. NRP-1+CD31+ 세포는 분화하는 세포의 덩어리 내에 세포 클러스터로서 나타났고 12일에 α-SMA 발현은 전혀 없었다. NRP-1 발현은 녹색으로 표시되고; CD31 발현은 적색으로 표시되고; α-SMA 발현은 녹색으로 표시되고; CD144 발현은 적색으로 표시되고; DAPI을 이용하여 핵을 청색으로 염색하였다. 모든 실험은 이중으로 4회 수행되었다. 눈금 바, 100 μm.
도 9c는 분화 6일, 9일 및 12일에 조사된 hiPS-유래된 NRP-1+CD31+ 세포로부터 수득된 내피 집락의 대표적인 현미경사진을 묘사한다. 모든 실험은 이중으로 8회 수행되었다. 눈금 바, 50 μm.
도 9d는 6일, 9일 및 12일에 ECFC-유사 세포 프로토콜을 이용하여 수득된 hES-유래된 NRP-1+CD31+ 세포 분획의 대표적인 윤곽 플롯을 묘사한다. 상이한 날에 유래된 NRP-1+CD31+ 세포를 내피 성장 배지에서 배양하였고 이것은 세포의 컨플루언트 단층을 형성하였다. 윤곽 플롯에서의 지시된 백분율은 CD144 및 CD31 이중 양성 세포를 나타낸다. 모든 실험은 이중으로 4회 수행되었다.
도 9e는 Matrigel™ 네트워크 형성 가능성을 나타내는 대표적인 위상차 현미경사진을 묘사한다. 모든 실험은 이중으로 5회 수행되었다. 눈금 바, 100 μm.
도 10a-f는 인간 질환의 임상전 동물 모델에서 hiPSC-유래된 ECFC-유사 세포가 허혈 망막 및 사지 둘 모두의 혈관 복구에 어떻게 기여하는 지를 묘사한다.
도 10a는 비히클 (좌측) 또는 hiPSC-유래된 ECFC-유사 세포 (우측)가 주입된 C57/BL6 마우스의 대표적인 플랫-마운티드(flat-mounted) 망막을 묘사한다. 망막 혈관계는 이소렉틴 B4로 녹색으로 염색되었다. 무혈관 부위는 흰색 선으로 표시된다. 모든 실험은 ≥4회 수행되었고 무혈관 부위의 백분율이 계산되었다. 눈금 바, 1 mm.
도 10b는 비히클 (좌측) 또는 hiPSC-EBT-CD144+ EC (우측)가 주입된 C57/BL6 마우스의 대표적인 플랫-마운티드 망막을 묘사한다. 망막 혈관계는 이소렉틴 B4로 녹색으로 염색되었다. 무혈관 부위는 흰색 선으로 표시된다. 모든 실험은 ≥4회 수행되었고 무혈관 부위의 백분율이 계산되었다. 눈금 바, 1 mm.
도 10c는 비히클 (좌측) 또는 hiPSC-유래된 ECFC-유사 세포 (우측)가 주입된 C57/BL6 마우스의 대표적인 병리학적 망막앞 신생혈관화를 묘사한다. 망막앞 신생혈관 뭉치는 반대쪽 hiPSC-유래된 ECFC-유사 세포-주입된 눈과 비교할 때 비히클-주입된 눈에서 주로 나타났다. 화살표는 망막앞 신생혈관 뭉치를 나타낸다. 모든 실험은 ≥4회 수행되었다. 눈금 바, 200 μm.
도 10d는 무흉선 누드 마우스에서 hiPSC-유래된 ECFC-유사 세포에 의한 치료적 신생혈관화를 도시하는 대표적인 레이저 도플러 관류 이미징을 묘사한다. 사지혈 관류에서의 더 큰 증가가 비히클 또는 hiPSC-EBT-CD144+ EC-주입 그룹보다 hiPSC 유래된 ECFC-유사 세포 또는 CB-ECFC 이식을 받은 마우스의 허혈 사지 (화살표)에서 관찰되었다. 모든 실험은 ≥10회 수행되었다.
도 10e는 누적된 막대 그래프가 비히클, hiPSC-유래된 ECFC-유사 세포, hiPSC-EBT-CD144+ EC 또는 CB-ECFC 이식 후 28일에 계측된 허혈 사지의 생리적 상태의 분포 백분율을 나타냄을 묘사한다. 모든 실험은 ≥10회 수행되었다.
도 10f는 비히클, hiPSC-유래된 ECFC-유사 세포, hiPSC-EBT-CD144+ EC 또는 CB-ECFC 이식 후 28일에 허혈 사지의 생리적 상태를 나타내는 표를 묘사한다. 모든 실험은 ≥10회 수행되었고 값은 사지 구제, 괴사 또는 손실 백분율을 나타낸다. 모수적 카이-제곱 테스트: *P < 0.05.
도 11a-b는 허혈 망막 혈관계로의 생체내 hiPSC-유래된 ECFC-유사 세포 통합을 묘사한다.
도 11a는 양자점에 의해 적색으로 표지되고 허혈 망막에 주입된 다음 상주 혈관계에 통합된 (이소렉틴 B4에 의해 녹색 염색됨) hiPSC-유래된 ECFC-유사 세포 (상부 우측) 또는 hiPSC-EBT-CD144+EC (상부 좌측)를 묘사한다. hiPSC-유래된 ECFC-유사 세포는 hiPSC-EBT-CD144+EC에 비해 숙주 망막에 더 높은 수 및 넓은 분포로 통합된다. 모든 실험은 ≥ 4회 수행되었다. 눈금 바, 50 μm.
도 11b는 단일 세포로서 숙주 혈관계와 밀접하게 연관되어 존재하고 또한 얕은 망막 얼기에서 혈관 튜브 유사 구조를 형성하는 것으로 보이는 적색 양자점 표지된 hiPSC-유래된 ECFC-유사 세포를 묘사한다. 모든 실험은 ≥ 4회 수행되었다. 눈금 바, 25 μm.
도 12a-d는 hiPS-유래된 CD31+NRP-1+ ECFC-유사 세포가 광범한 증식을 겪고, 안정한 내피 표현형을 유지하며, 장기간 배양 후에 궁극적으로 노화됨에 의해 일차 세포의 특징을 나타냄을 예시한다.
도 12a는 β-갈락토시다제 염색을 나타내는 CB-ECFC의 대표적인 위상차 현미경사진을 묘사한다. CB-ECFC는 제조업체의 지시에 따라 β-갈락토시다제로 염색되었다. CB-ECFC는 P7에서 β-갈락토시다제 양성 청색 세포 (원으로 표시됨)를 거의 나타내지 않았으나 P18까지 이러한 세포의 거의 전부는 β-갈락토시다제 청색 염색에 대해 양성이었다. 모든 실험은 이중으로 8회 수행되었다. 눈금 바, 50 μm.
도 12b는 β-갈락토시다제 염색을 나타내는 hiPS-유래된 ECFC-유사 세포의 대표적인 위상차 현미경사진을 묘사한다. hiPS ECFC-유사 세포는 제조업체의 지시에 따라 β-갈락토시다제로 염색되었다. hiPS-유래된 ECFC-유사 세포는 P7에서 β-갈락토시다제 양성 청색 세포 (원으로 표시됨)를 거의 나타내지 않았으나 P18까지 이러한 세포의 거의 전부는 β-갈락토시다제 청색 염색에 대해 양성이었다. 모든 실험은 이중으로 4회 수행되었다. 눈금 바, 50 μm.
도 12c는 상이한 계대로부터의 CB-ECFC 및 hiPS-유래된 ECFC-유사 세포에서 β-갈락토시다제 양성 세포의 백분율을 나타내는 막대 그래프를 묘사한다. 모든 실험은 삼중으로 4회 수행되었다; 값은 평균 ± SD를 나타낸다. 스튜던트 t-테스트: ***p<0.001.
도 12d는 내피 마커 CD31, CD144 및 NRP-1의 발현은 나타내지만 비-내피 마커 α-SMA의 발현은 나타내지 않는 hiPS-유래된 ECFC-유사 세포의 대표적인 면역형광 현미경사진을 묘사한다. 상부 패널에서, NRP-1 발현은 녹색으로 표시되고; CD31 발현은 적색으로 표시된다. 하부 패널에서, α-SMA 발현은 녹색으로 표시되고; CD144 발현은 적색으로 표시된다. DAPI를 이용하여 핵을 청색으로 염색하였다. 모든 실험은 이중으로 3회 수행되었다. 눈금 바, 100 μm.
도 13a-b는 NRP-1+CD31+ ECFC-유사 세포가 CB-ECFC와 유사한 분자 사인을 나타냄을 예시한다.
도 13a는 개별 배엽층 및 특수한 계통을 규정하는 유전자의 선택 그룹에 대한 상대적 전사 수준의 히트맵을 묘사한다.
도 13b는 종래에 기재된 대로, 혈관, 앤지오크린, 및 비-혈관 유전자의 선택 그룹에 대한 상대적 전사 수준의 히트맵을 묘사한다32. 인간 iPS-유래된 ECFC-유사 세포 및 hES-유래된 ECFC-유사 세포는 CB-ECFC에 의해 나타난 것과 유사하게, 많은 혈관 (상부 패널) 및 앤지오크린 (중간 패널) 유전자에 대해 높은 발현 프로필 및 비-혈관 유전자 (하부 패널)에 대해 감소된 발현을 나타내었다.
도 14a-e는 KDR, p130Cas 및 Pyk 인산화를 도시하는 전장 웨스턴 블롯을 묘사한다.
도 14a는 인산화된 KDR을 확인하기 위해 먼저 포스포-KDR 항체로 제조된 웨스턴 블롯을 묘사한다.
도 14b는 먼저 포스포-KDR 항체로 제조되고 이어서 전체 KDR 항체와 인큐베이션하기 위해 스트리핑된 웨스턴 블롯을 묘사한다.
도 14c는 포스포-p130Cas로 제조된 웨스턴 블롯을 묘사한다.
도 14d는 먼저 포스포-p130Cas로 제조되고 포스포-Pyk2 항체와 재인큐베이션하기 위해 스트리핑된 웨스턴 블롯을 묘사한다.
도 14e는 먼저 포스포-p130Cas로 제조되고 전체 포스포-Pyk2 항체와 재인큐베이션하기 위해 스트리핑된 웨스턴 블롯을 묘사한다.
도 15a-c는 NRP-1이 hiPS 세포로부터 ECFC-유사 세포의 출현에 중요함을 예시한다.
도 15a는 hiPS 세포로부터 ECFC-유사 세포의 출현에서 NRP-1의 역할을 조사하기 위해 이용된 처리 전략의 개략도이다.
도 15b는 처리한 지 4 및 6일 후에 대조군 (청색), Fc-NRP-1 (적색) 및 NRP-b (녹색)으로 처리한 후 NRP-1+CD31+ (이중) 양성 세포의 출현 백분율의 정량을 나타내는 선 그래프이다. 삽입에서, 유세포 측정법 윤곽 플롯은 풍부한 KDR 발현 및 감소된 NRP-1 발현을 나타내는 6일 분화된 세포에서의 KDR 및 NRP-1의 발현 퍼센트를 나타낸다. 모든 실험은 삼중으로 6회 수행되었다; 값은 평균 ± SD를 나타낸다. 스튜던트 t-테스트: **p<0.01 및 ***p<0.001.
도 15c는 KDR, p130Cas 및 Pyk2 인산화를 도시하는 웨스턴 블롯을 묘사한다. 모든 실험은 이중으로 4회 수행되었다.
도 16a-i는 NRP-1이 ECFC-유사 세포 증식 가능성의 유지에 중요함을 예시한다.
도 16a는 CD31, CD144 및 NRP-1에 대한 모노클로날 항체로 염색된 상이한 계대 (P4, P14 및 P18)로부터의 hiPS-유래된 ECFC-유사 세포를 묘사한다. 각각의 윤곽 플롯에서의 백분율은 CD31 및 CD144 이중 양성 세포를 나타내나 (좌측 패널), 우측 패널 윤곽 플롯에서의 백분율은 CD31 및 NRP-1 이중 양성 세포를 나타낸다. 모든 실험은 이중으로 4회 수행되었다.
도 16b는 배양 7일 후에 상이한 계대 (P4, P14 및 P18)에서 계수된 hiPS-유래된 ECFC-유사 세포의 증식 배수를 묘사한다. 모든 실험은 삼중으로 3회 수행되었다; 값은 평균 ± SD를 나타낸다. 스튜던트 t-테스트: ***p<0.001.
도 16c는 KDR 및 NRP-1에 대한 모노클로날 항체로 염색된 14회 계대 hiPS-유래된 ECFC-유사 세포를 묘사한다. 각각의 윤곽 플롯에서의 백분율은 NRP-1 및 KDR 양성 세포를 나타낸다. 모든 실험은 이중으로 4회 수행되었다.
도 16d는 처리한 지 3일 또는 7일 후에 증식 배수를 조사하기 위해 대조군, Fc-NRP-1 및 NRP-1-B로 처리된 후기 계대 (P14) hiPS-유래된 ECFC-유사 세포를 묘사한다. 막대 그래프는 대조군, Fc-NRP-1 및 NRP-1-B로 처리한 지 3일 (좌측 막대 그래프) 및 7일 (우측 막대 그래프) 후에 (P14) hiPS-유래된 ECFC-유사 세포의 증식 배수를 나타낸다. 모든 실험은 삼중으로 5회 수행되었다; 값은 평균 ± SD를 나타낸다. 스튜던트 t-테스트: *p<0.05, **p<0.01 및 ***p<0.001.
도 16e는 7일 동안 대조군, Fc-NRP-1 및 NRP-1-B로 처리되고 제조업체의 지시에 따라 β-갈락토시다제로 염색된 후기 계대 (P14) hiPS-유래된 ECFC-유사 세포를 묘사한다. 원은 β-갈락토시다제 양성으로 염색된 세포를 나타낸다. Fc-NRP-1 처리는 대조군-처리된 세포에 비해 β-갈락토시다제 양성 청색 세포 (점으로 표시된 원)의 수를 감소시켰다. NRP-1-B 처리는 대조군에 비해 청색 세포의 수를 증가시켰다. 모든 실험은 삼중으로 4회 수행되었다. 눈금 바, 50 μm.
도 16f는 후기 계대 (P14) hiPS-ECFC 유사 세포를 7일 동안 대조군, Fc-NRP-1 및 NRP-1-B로 처리한 후 β-갈락토시다제 양성 청색 세포의 백분율을 나타내는 막대 그래프를 묘사한다. 모든 실험은 삼중으로 4회 수행되었다; 값은 평균 ± SD를 나타낸다. 스튜던트 t-테스트: **p<0.01 및 ***p<0.001.
도 16g는 VEGF165를 함유하는 정규 EGM-2 배지 및 VEGF121을 지닌 EGM-2 배지에서 배양되고 대조군, Fc-NRP-1 및 NRP-1-B로 7일 동안 처리된 후기 계대 (P14) hiPS-유래된 ECFC-유사 세포를 묘사한다. 7일 후에, 세포를 수집하고, 계수하고, 프로피듐 아이오다이드 및 아넥신 V로 염색하여, 이러한 처리 그룹 각각에서 살아 있는 세포, 프로아폽토틱 세포, 및 죽은 세포를 조사하였다. 막대 그래프는 대조군, Fc-NRP-1 및 NRP-1-B로 처리한 지 7일 후 VEGF165 및 VEGF121 함유 배지에서 프로아폽토틱 세포의 백분율을 나타낸다. VEGF121의 존재 하에 배양된 세포에 비해 VEGF165 함유 배지에서 배양된 세포에서 Fc-NRP-1 및 NRP-1-B 처리된 그룹 둘 모두에서 현저하게 감소된 백분율의 프로아폽토틱 세포가 관찰되었다. 모든 실험은 삼중으로 4회 수행되었다; 값은 평균 ± SD를 나타낸다. 스튜던트 t-테스트: **p<0.01.
도 16h는 정규 VEGF165가 VEGF121로 대체된 EGM-2 배지에서 배양된 후기 계대 (P14) hiPS-유래된 ECFC-유사 세포를 묘사한다. 이러한 세포를 대조군, Fc-NRP-1 또는 NRP-1-B로 7일 동안 처리하였다. 막대 그래프는 대조군, Fc-NRP-1 및 NRP-1-B로 처리한 지 7일 후에 VEGF121 처리된 배지에서 P14 hiPS-유래된 ECFC-유사 세포의 증식 배수를 나타낸다. Fc-NRP-1 또는 NRP-1-B 처리는 VEGF121의 존재 하에 대조군에 비해 이러한 세포에서 증식 배수에서의 현저한 변동을 초래하지 않았다. 모든 실험은 삼중으로 4회 수행되었다; 값은 평균 ± SD를 나타낸다.
도 16i는 VEGF165를 함유하는 정규 EGM-2 배지 및 VEGF121을 함유하는 EGM-2 배지에서 배양된 후기 계대 (P14) hiPS-유래된 ECFC-유사 세포를 묘사한다. 이러한 세포를 대조군, Fc-NRP-1 또는 NRP-1-B로 7일 동안 처리하였다. 7일 후에, 세포를 수집하고, 계수하고, 프로피듐 아이오다이드 및 아넥신 V로 염색하여 이러한 치료 그룹의 각각에서 살아 있는 세포, 프로아폽토틱 세포, 및 죽은 세포를 조사하였다. 각각의 윤곽 플롯에서의 백분율은 VEGF121 (상부열의 패널) 또는 VEGF165 (하부열의 패널)의 존재 하에 대조군 (좌측 패널), Fc-NRP-1 (중간 패널) 및 NRP-B (우측 패널) 처리된 세포에서 살아 있는 세포, 프로아폽토틱 세포, 및 죽은 세포를 나타낸다. VEGF121-처리된 세포에서, Fc-NRP-1 및 NRP-1-B 둘 모두는 대조군에 비해 죽은 세포 및 프로아폽토틱 세포의 백분율을 증가시켰다. 그러나, VEGF165-처리된 세포에서, Fc-NRP-1은 대조군에 비해 죽은 세포 및 프로아폽토틱 세포 둘 모두의 백분율을 감소시키고 살아 있는 세포의 백분율을 증가시켰으나, NRP-1-B는 대조군에 비해 죽은 세포 및 프로아폽토틱 세포 둘 모두의 백분율을 증가시키고 살아 있는 세포의 백분율을 감소시켰다. 모든 실험은 삼중으로 4회 수행되었다; 대표적인 윤곽 플롯이 각 그룹에 대해 도시된다.
도 17a-n은 PAD 환자 유래된 EC가 감소된 NRP-1 발현을 지니고, 초기 세포 노화를 겪으며, 클론 증식 가능성의 완전 계층을 나타내는데 실패하고, 생체내 혈관 형성 능력이 부족하지만, PAD EC의 외인성 NRP-1 처리는 세포 노화를 감소시키고, 다중 핵 세포 형성을 감소시키고 PAD-EC 증식 가능성을 구제함을 예시한다.
도 17a는 하지 절단을 겪은 말초 혈관 질환을 지닌 환자로부터 유래된 동맥 및 말초혈 EC를 묘사한다. 대표적인 위상차 현미경사진은 PAD 및 CLI를 지닌 환자로부터 수득된 PB (좌측 패널) 및 동맥 (우측 패널)으로부터 유래된 내피 세포의 동종의 특징적인 조약돌 형태를 나타낸다. 모든 실험은 이중으로 6회 수행되었다. 눈금 바, 50 μm.
도 17b는 전형적인 내피 마커의 발현을 결정하기 위해 유세포 측정 분석으로 처리된 PAD 환자로부터 유래된 EC를 묘사한다. PAD 환자 동맥 또는 PB 유래된 내피 세포를 인간 CD31, CD144, KDR 및 NRP-1에 대한 모노클로날 항체로 염색하였다. 윤곽 플롯의 우측 상단 사분면에 표시된 백분율은 CD31 및 CD144 이중 양성 세포를 나타낸다 (좌측 윤곽 플롯). 우측 윤곽 플롯에서의 백분율은 NRP-1 및 KDR을 공동-발현시키는 세포 (상단 우측); NRP-1 발현 (상단 좌측); 하단 우측에는 KDR을 발현시키는 세포의 백분율을 나타낸다. 이러한 모든 세포는 CD31 및 CD144에 대한 높은 수준의 공동-발현을 유지하였고, 60%를 초과하는 세포는 KDR 발현을 나타내었고, 10% 미만의 세포는 NRP-1 발현을 나타내었다. 모든 실험은 삼중으로 5회 수행되었다.
도 17c는 내피 마커 CD31, CD144, NRP-1 및 비-내피 마커 α-SMA에 대한 표면 발현을 나타내는 hiPS-유래된 ECFC-유사 세포 및 PAD 동맥 EC의 대표적인 면역형광 현미경사진을 묘사한다. 상부 패널에서, NRP-1 발현은 녹색으로 표시되고; CD31 발현은 적색으로 표시된다. 하부 패널에서, α-SMA 발현은 녹색으로 표시되고; CD144 발현은 적색으로 표시된다. DAPI를 이용하여 핵을 청색으로 염색하였다. hiPS ECFC-유사 세포는 NRP-1 및 CD31 공동-발현을 나타내고, CD144에 대해 양성으로 염색되며, α-SMA 발현은 완전히 결여되어 있었지만, PAD-동맥-EC는 NRP-1 및 CD31 공동-발현을 나타내지 않았고, 그러나, 이들은 CD31 및 CD144에 대해 양성으로 염색되었고, α-SMA 발현은 완전히 결여되어 있었다. 모든 실험은 이중으로 4회 수행되었다. 눈금 바, 100 μm.
도 17d는 단일 세포 증식 가능성 검정으로 처리된 CB-ECFC, hiPS-유래된 ECFC-유사 세포 및 PAD 환자로부터 유래된 EC를 묘사한다. 이러한 그룹 각각으로부터의 단일 세포를 96-웰 플레이트에 플레이팅하고 플레이팅한 지 14일 후에 채점하였다. PAD 환자로부터 내피 세포는 상주 혈관 벽 (동맥)의 약 70%로서 불충분한 증식 거동을 나타내었고 PB 유래된 내피 세포의 30% 초과는 분열되지 않은 단일 세포로서 유지되었다. 대조적으로 CB-ECFC 및 hiPS-유래된 ECFC-유사 세포 그룹에서 단일 플레이팅된 세포의 2%만이 14일 배양 후에 비-분열된 세포로서 유지되었다. 분열된 그러한 PAD 유래된 세포는 주로 내피 클러스터를 형성하였고 (28% PAD-동맥-EC 및 60% PAD-PB-EC), LPP-ECFC (0.5% PAD-동맥-EC 및 4% PAD-PB-EC)를 거의 형성하지 않았고, 이들 중 어떤 것도 HPP-ECFC를 생성하지 않았다. 그러나, CB-ECFC로부터의 세포 및 분열된 hiPS-유래된 ECFC-유사 세포 그룹은 내피 클러스터를 거의 형성하지 않았고, LPP-ECFC (44.3% CB-ECFC 및 44.7% hiPS ECFC-유사 세포) 및 HPP-ECFC (35% CB-ECFC 및 43% hiPS-유래된 ECFC-유사 세포)를 주로 형성하였다. 모든 실험은 삼중으로 4회 수행되었다. 스튜던트 t-테스트: ***p<0.001.
도 17e는 Matrigel™ 상에 모세관-유사 네트워크를 형성하는 능력을 입증하는, 동맥 및 말초혈로부터 PAD 환자 유래된 EC의 대표적인 위상차 현미경사진을 묘사한다. 모든 실험은 이중으로 5회 수행되었다. 눈금 바, 100 μm.
도 17f는 면역결핍 마우스에 이식된 PAD 환자로부터 유래된 EC를 묘사한다. 겔을 이식 14일 후에 회수하고, 고정시키고, 투과시키고, 마우스 숙주 세포와 교차 반응하지 않는 특이적 항-인간 CD31 항체로 염색하였다. 대표적인 현미경사진에 표시된 화살표는 순환하는 숙주 적혈구로 관류된 몇몇 작은 항-인간 CD31+ 혈관을 확인한다. 모든 실험은 삼중으로 5회 수행되었다. 눈금 바, 50 μm.
도 17g는 각 그룹에서 mm2에 대해 계수된 기능성 hCD31+ 혈관의 정량을 나타내는 막대 그래프를 묘사한다. PAD 환자로부터 유래된 EC는 CB-ECFC 대조군에 비해 현저하게 감소된 수의 기능성 hCD31+ 혈관을 나타내었다. 모든 실험은 삼중으로 5회 수행되었다; 값은 평균 ± SD를 나타낸다. 스튜던트 t-테스트: ***p<0.001.
도 17h는 제조업체의 지시에 따라 β-갈락토시다제로 염색된 PAD-EC 및 hiPS-유래된 ECFC-유사 세포 (P7)를 묘사한다. 거의 모든 세포가 PAD-EC 그룹에서 β-갈락토시다제 양성 청색 세포인 반면, hiPS-유래된 ECFC-유사 세포 그룹에서 더 적은 세포 (원으로 표시됨)가 β-갈락토시다제 양성이었다. 모든 실험은 삼중으로 4회 수행되었다. 눈금 바, 50 μm.
도 17i는 hiPS-유래된 ECFC-유사 세포에 비해 β-갈락토시다제 양성 PAD EC의 백분율을 도시하는 막대 그래프를 묘사한다. 현저하게 높은 비율의 β-갈락토시다제 양성 청색 세포가 hiPS-유래된 ECFC-유사 세포에 비해 PAD-EC에서 관찰되었다. 모든 실험은 삼중으로 4회 수행되었다; 값은 평균 ± SD를 나타낸다. 스튜던트 t-테스트: ***p<0.001.
도 17j는 7일 동안 대조군, Fc-NRP-1 및 NRP-1-B로 처리된 PAD-동맥 EC (P7)를 묘사한다. 막대 그래프는 대조군, Fc-NRP-1 및 NRP-1-B로 처리한 지 7일 후에 PAD-동맥 EC의 증식 배수를 나타낸다. 대조군에 비해 Fc-NRP-1 처리된 그룹에서 현저하게 높은 증식 배수가 관찰되었으나, NRP-1-B 처리된 그룹에서는 대조군에 비해 현저하게 감소된 증식이 관찰되었다. 모든 실험은 삼중으로 4회 수행되었다; 값은 평균 ± SD를 나타낸다. 스튜던트 t-테스트: **p<0.01 및 ***p<0.001.
도 17k PAD-동맥 EC (P7)를 대조군, Fc-NRP-1 및 NRP-1-B로 7일 동안 처리하고 제조업체의 지시에 따라 β-갈락토시다제로 염색하였다. 거의 모든 세포가 대조군 및 NRP-1-B 처리된 그룹에서 β-갈락토시다제 염색에 대해 양성으로 염색된 반면, Fc-NRP-1 처리된 그룹의 일부 세포는 β-갈락토시다제 염색에 대해 양성으로 염색되지 않았다 (원으로 표시됨). 모든 실험은 삼중으로 4회 수행되었다. 눈금 바, 50 μm.
도 17l은 PAD-동맥 내피 세포를 7일 동안 대조군, Fc-NRP-1 및 NRP-1-B로 처리한 후에 β-갈락토시다제 양성 세포의 백분율을 나타내는 막대 그래프를 묘사한다. 현저하게 감소된 β-갈락토시다제 양성 청색 세포가 대조군 처리된 세포에 비해 Fc-NRP-1 처리된 세포에서 관찰되었다. 모든 실험은 삼중으로 4회 수행되었다; 값은 평균 ± SD를 나타낸다. 스튜던트 t-테스트: *p<0.05 및 ***p<0.001.
도 17m은 7일 동안 대조군 및 Fc-NRP-1으로 처리된 PAD-동맥 EC (P7) 및 처리된 세포에서 핵 수를 계수하기 위해 수득된 세포의 현미경사진을 묘사한다. 대표적인 현미경사진에서 화살표는 대조군에서 다중핵화된 청색 세포를 가리키고 (좌측 패널) 원은 단일 핵을 지닌 비-청색 세포를 가리킨다 (우측 패널). 모든 실험은 삼중으로 4회 수행되었다. 눈금 바, 25 μm.
도 17n은 Fc-NRP-1 처리된 세포에 비해 대조군에서 다중핵화된 PAD EC의 백분율을 나타내는 막대 그래프를 묘사한다. 현저하게 감소된 비율의 다중핵화된 세포가 대조군 처리된 세포에 비해 Fc-NRP-1 처리된 세포에서 관찰되었다. 모든 실험은 삼중으로 4회 수행되었다; 값은 평균 ± SD를 나타낸다. 스튜던트 t-테스트: ***p<0.001.
도 18은 본 발명의 ECFC-유사 세포 분화 프로토콜을 이용하여 104 hES 또는 hiPS 세포로부터 출발시, 83일에 1조개 이상으로 추정되는 세포의 생성을 도시하는 개략도이다. 12일 유래된 NRP-1+CD31+ 세포는 광범한 증식을 겪은 안정한 ECFC-유사 세포 집락을 발생시켜 1조개 초과의 세포를 생성하였다. 본 연구는 두 차례에 걸쳐 1 hES 주 및 3 hiPS 주로 수행되었다.
본 발명은 일반적으로 다능성 세포, 예컨대, 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포 (hESC) 또는 유도된 다능성 줄기 세포 (iPSC) (총괄적으로, 인간 다능성 줄기 세포 (hPSC))의 내피 집락 형성 세포-유사 세포 (ECFC-유사 세포)로의 시험관내 분화를 위한 방법에 관한 것이다. 본원에 기재된 방법의 다양한 구체예에서, 다능성 세포는 규정된 조건 하에 유지, 증식, 및 분화될 수 있고, 공급자 세포 및/또는 혈청의 이용은 필요하지 않다. 한 구체예에서, 생성된 ECFC-유사 세포는 공동-배양 및/또는 공동-이식 세포의 부재 하에 생체내 혈관으로 추가로 성장할 수 있다.
다양한 구체예에서, 본원에 기재된 방법을 이용하여 생성된 ECFC-유사 세포는 OP9와 같은 세포와의 공동-배양, 또는 배양체 (EB) 형성을 통해 hES 또는 hiPS 세포로부터 시험관내 유래된 내피 세포 (EC)에 비해 높은 증식 가능성 (HPP)을 갖는다. 한 구체예에서, 본원에 기재된 방법을 이용하여 생성된 ECFC-유사 세포는 인간 제대혈로부터 분리된 ECFC의 증식 가능성과 동일하거나 더 큰 증식 가능성을 갖는다. 한 구체예에서, 본원에 기재된 방법을 이용하여 각각의 계산된 줄기 세포로부터 적어도 1 x108개 ECFC-유사 세포를 재현가능하게 생성할 수 있다.
I: 정의
본 명세서에서 이용된 특정 용어의 정의가 하기에 제공된다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 이용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 일반적으로 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 같은 의미를 갖는다.
본원에서 사용되는 "내피 집락 형성 세포" 및 "ECFC"는 단일 세포로부터 내피 집락을 증식 및 형성하는 잠재력을 나타내고 공동-이식되거나 공동-배양된 세포의 부재 하에 생체내 혈관을 형성하는 능력을 지니는 혈관에서 발견되는 일차 내피 세포를 의미한다.
본원에서 사용되는 "제대혈 ECFC" 및 "CB-ECFC"는 제대혈로부터 유래된 일차 ECFC를 의미한다.
본원에서 사용되는 "내피 집락 형성 세포-유사 세포" 및 "ECFC-유사 세포"는 인간 다능성 줄기 세포 (hPSC)로부터 시험관내 생성된 비-일차 내피 세포를 의미한다. ECFC-유사 세포는, 단일 세포로부터 내피 집락을 증식 및 형성하고 공동-이식되거나 공동-배양된 세포의 부재 하에 생체내 혈관을 형성하는 능력을 지닐 가능성을 적어도 포함하는, ECFC의 다양한 특징을 갖는다.
본원에서 사용되는 용어 "증식 잠재력" 및 "증식 가능성"은 적절한 성장 촉진 신호가 제공될 때 세포가 분열하는 능력을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "높은 증식 잠재력", "높은 증식 가능성" 및 "HPP"는 14일 세포 배양 후에 약 2000개 초과의 세포로 분열되는 단일 세포의 능력을 의미한다. 바람직하게는, HPP 세포는 자가-보충(replenish)하는 능력을 갖는다. 예를 들어, 본원에 제공된 HPP-ECFC-유사 세포는 자가-보충하는 능력을 갖는데, 이는 HPP-ECFC-유사 세포가 시험관내 재플레이팅될 때 이차 HPP-ECFC-유사 집락 내에서 하나 이상의 HPP-ECFC-유사 세포를 발생시킬 수 있음을 의미한다. 일부 구체예에서, HPP-ECFC-유사 세포는 또한 시험관내 재플레이팅될 때 이차 HPP-ECFC-유사 집락 내에서 LPP-ECFC-유사 세포 및 ECFC-유사 세포 클러스터 중 하나 이상을 발생시키는 능력을 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "낮은 증식 잠재력", "낮은 증식 가능성" 및 "LPP"는 14일 세포 배양 후에 약 51-2000개 세포로 분열되는 단일 세포의 능력을 의미한다. 일부 구체예에서, LPP-ECFC-유사 세포는 또한 ECFC-유사 세포 클러스터를 발생시키는 능력을 지닐 수 있다. 그러나, LPP-ECFC-유사 세포는 이차 LPP-ECFC-유사 세포 또는 HPP-ECFC-유사 세포를 발생시키는 능력을 갖지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "ECFC-유사 클러스터"는 14일 세포 배양 후에 약 2-50개 세포로 분열되는 능력을 갖는 ECFC-유사 세포의 클러스터를 의미한다.
본원에서 사용되는 "다능성 세포"는 임의의 세포 유형, 예를 들어, 3개의 배엽층: 내배엽, 중배엽, 또는 외배엽 중 어느 하나의 세포로 분화될 가능성을 지니는 세포를 의미한다.
본원에서 사용되는 "배아 줄기 세포", "ES 세포" 또는 "ESC"는 초기 배아로부터 유래된 다능성 줄기 세포를 의미한다.
본원에서 사용되는 "유도된 다능성 줄기 세포," "iPS 세포" 또는 "iPSC"는 비-다능성 세포에 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 도입하거나 이를 비-다능성 세포와 접촉시킴에 의해, 비-다능성 세포, 예컨대, 예를 들어, 성체 체세포, 또는 최종 분화 세포, 예컨대, 예를 들어, 섬유모세포, 조혈 세포, 근세포, 신경세포, 표피 세포 등으로부터 제조된 다능성 줄기 세포의 유형을 의미한다.
본원에서 사용되는 "내피 분화 배지"는 내피 계통의 세포로의 다능성 세포의 분화를 지지하고/거나 향상시키는 임의의 영양 배지를 의미한다.
본원에서 사용되는 "내피 성장 배지"는 내피 계통의 세포를 유지하는데 적합한 임의의 배지를 의미한다.
II: 다능성 세포를 내피 집락 형성 세포-유사 세포 (ECFC-유사 세포)로 분화시키는 방법.
한 양태에서, 본원에 제공된 방법은 하기의 적어도 3 단계를 포함하였다:
A: 다능성 줄기 세포를 제공하는 단계;
B: 내피 계통의 세포로 다능성 줄기 세포의 분화를 유도하는 단계; 및
C: 내피 계통의 분화된 세포로부터 ECFC-유사 세포를 분리시키는 단계.
다양한 구체예에서, 상기 방법은,
D. 분리된 ECFC-유사 세포를 증식시키는 추가 단계를 포함한다.
상기 언급된 방법의 각 단계는 하기 본원에서 추가로 설명된다. 본원에 제공된 방법의 다양한 구체예는 "ECFC-유사 프로토콜", "ECFC-유사 세포 프로토콜", "hESC-유래된 ECFC-유사 세포 프로토콜" 또는 "hiPSC-유래된 ECFC-유사 세포 프로토콜"로서 언급될 수 있다.
A. 다능성 줄기 세포 배양
한 양태에서, 다능성 세포로부터 시험관내 ECFC의 분리된 집단을 생성하는 방법이 제공된다. 본 발명의 방법에 사용하기 적합한 다능성 세포는 다양한 공급원으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 적합한 다능성 세포의 한 유형은 주머니배의 내세포집단으로부터 유래된 배아 줄기 (ES) 세포이다. 마우스, 붉은털 원숭이, 비단 마모셋, 및 인간과 같은 다양한 유형의 ES 세포를 수득하는 방법은 잘 알려져 있다. 본 방법에 이용된 ES 세포의 공급원은, 예를 들어, 하나 이상의 확립된 ES 세포주일 수 있다. 다양한 ES 세포주가 공지되어 있고 이들의 성장 및 증식을 위한 조건이 확인되었다. 실제로 임의의 ES 세포 또는 ES 세포주가 본원에 기재된 방법에 이용될 수 있는 것으로 본원에서 고려된다. 한 구체예에서, 다능성 세포는 재프로그래밍 체세포에 의해 유래되는 유도된 다능성 줄기 (iPS) 세포이다. 유도된 다능성 줄기 세포는 다양한 공지된 방법에 의해 수득되었다. 실제로 임의의 iPS 세포 또는 세포주가 본원에 기재된 방법에 이용될 수 있는 것으로 본원에서 고려된다. 다른 구체예에서, 다능성 세포는 체세포 핵 이식에 의해 유래된 배아 줄기 세포이고, 여기서 공여체 핵은 방추-비함유 난모세포로 수송된다. 핵 이식에 의해 줄기 세포를 생성하는 다양한 방법이 공지되어 있다. 체세포 핵 이식에 의해 유래되는 실제로 임의의 ES 세포 또는 세포주가 본원에 기재된 방법에 이용될 수 있는 것으로 본원에서 고려된다.
한 구체예에서, 다능성 세포는 다능성 세포를 미분화된 상태로 유지하기에 적합한 조건 하에 배양된다. 시험관내 다능성 세포를, 즉 미분화된 상태로 유지하는 방법은 잘 알려져 있다. 한 구체예에서, 다능성 세포는 다능성 세포를 미분화된 상태로 유지하기에 적합한 조건 하에 약 2일 동안 배양된다. 예를 들어, 하기 실시예에서, hES 및 hiPS 세포는 10 cm2 조직 배양 디쉬의 Matrigel™ 상의 mTeSR1 완전 배지에서 37℃ 및 5% CO2에서 약 2일 동안 유지되었다.
다능성 세포를 배양 및/또는 유지하기 위한 추가적인 및/또는 대안적인 방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, 기본 배양 배지로서, TeSR, mTeSR1 알파.MEM, BME, BGJb, CMRL 1066, DMEM, 이글(Eagle) MEM, 피셔 배지(Fischer's media), 글라스고우(Glasgow) MEM, Ham, IMDM, 개선된 MEM 아연 옵션(Zinc Option), 배지 199 및 RPMI 1640 중 어느 하나, 또는 이의 조합물이 다능성 세포를 배양하고/거나 유지하는데 이용될 수 있다.
이용된 다능성 세포 배양 배지는 혈청을 함유할 수 있거나, 혈청-비함유일 수 있다. 혈청-비함유는 처리되지 않거나 정제되지 않은 혈청을 포함하지 않는 배지를 의미한다. 혈청-비함유 배지는 정제된 혈액-유래된 성분 또는 동물 조직-유래된 성분, 예컨대, 예를 들어, 성장 인자를 포함할 수 있다. 이용된 다능성 세포 배지는 혈청에 대한 하나 이상의 대용물, 예컨대, 예를 들어, 녹아웃 혈청 대체물(knockout Serum Replacement)(KSR), 화학적으로-정의된 지질 농축물 (Gibco) 또는 글루타맥스 (Gibco)를 함유할 수 있다.
다능성 세포를 분할하거나 계대시키는 방법은 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 하기 실시예에서, 다능성 세포를 플레이팅한 후에, 배지를 2일, 3일, 및 4일에 교환하고 세포를 5일에 계대시켰다. 일반적으로, 배양 컨테이너가 가득차면 (즉, 70-100% 컨플루언스), 컨테이너의 세포 집단을 분리에 적합한 임의의 방법에 의해 응집된 세포 또는 단일 세포로 분할하고 응집된 세포 또는 단일 세포를 계대를 위해 새로운 배양 컨테이너로 옮긴다. 세포 "계대" 또는 "분할"은 세포 생존을 유지하고 연장된 기간 동안 세포를 시험관내 성장시키는 널리 공지된 기법이다.
B. 다능성 세포의 내피 계통의 세포로의 유도된 분화
기재된 방법의 한 양태에서, 시험관내 다능성 세포는 내피 분화를 겪도록 유도된다. 내피 계통의 세포로 다능성 세포의 분화를 유도하기 위한 배양 조건을 포함하는 다양한 방법이 당 분야에 공지되어 있다. 본원에 제공된 ECFC-유사 세포 프로토콜에서, 다능성 세포의 분화를 화학적으로 정의된 배지에서 유도하는 것이 바람직하다. 예를 들어, Stemline II 혈청-비함유 조혈 증식 배지가 기본 내피 분화 배지로서 이용될 수 있다. 본원에 제공된 ECFC-유사 세포 프로토콜에서 다양한 성장 인자를 이용하여 ECFC-유사 세포를 포함하는 내피 계통의 세포로의 다능성 세포의 분화를 촉진한다. 예를 들어, 액티빈 A, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (FGF-2) 및 골 형태형성 단백질 4 (BMP-4)가 화학적으로 정의된 분화 배지에 포함되어 ECFC-유사 세포를 포함하는 내피 계통의 세포로의 다능성 세포의 분화를 유도한다.
본원에 제공된 ECFC-유사 세포 프로토콜의 한 구체예에서, 기본 배양 배지 (예컨대, mTeSR1)에서 2일 (-D2)의 배양 후에, 세포를 유효량의 액티빈 A, BMP-4, VEGF 및 FGF-2를 포함하는 내피 분화 배지와 24시간 동안 접촉시킴에 의해 내피 계통으로의 다능성 세포의 분화를 유도하였다. 24시간의 분화 후에, 상기 내피 분화 배지를 유효량의 BMP-4, VEGF 및 FGF-2를 포함하는 내피 분화 배지로 대체함에 의해 액티빈 A를 배양액으로부터 제거하였다. 본 발명자들에게 "유효량"이라 함은 ECFC-유사 세포를 포함하는 내피 계통의 세포로의 다능성 세포의 분화를 촉진하기에 효과적인 양을 의미한다. 추가로 유효량의 BMP-4, VEGF 및 FGF-2를 포함하는 내피 분화 배지의 대체는 1-2일마다 수행될 수 있다.
액티빈 A는 다중 경로를 통해 세포 분화를 활성화시키는 것으로 공지된 TGF-B 슈퍼패밀리의 구성원이다. 액티빈-A는 중배엽 선별(specification)의 활성화를 촉진하지만 내피 선별 및 후속 내피 증폭에는 중요하지 않다. 한 구체예에서, 내피 분화 배지는 액티빈 A를 약 5-25 ng/mL의 농도로 포함한다. 한 바람직한 구체예에서, 내피 분화 배지는 액티빈 A를 약 10ng/mL의 농도로 포함한다.
골 형태형성 단백질-4 (BMP-4)은 성인 골수 (BM)에서 발현되고 조혈 선조 세포의 증식 및 분화 가능성을 조절하는데 관여하는 배쪽 중배엽 유도인자이다 (Bhardwaj et al., 2001; Bhatia et al., 1999; Chadwick 2003). 추가로, BMP-4는 인간 태아, 신생아, 및 성인 조혈 선조 세포에서의 초기 조혈 세포 발생을 조절할 수 있다 (Davidson and Zon, 2000; Huber et al., 1998; Marshall et al., 2000). 한 구체예에서, 내피 분화 배지는 BMP-4를 약 5-25 ng/mL의 농도로 포함한다. 한 바람직한 구체예에서, 내피 분화 배지는 BMP-4를 약 10ng/mL의 농도로 포함한다.
혈관 내피 성장 인자 (VEGF)는 배아 순환계 형성 및 혈관형성에 관여하는 신호전달 단백질이다. 시험관내에서, VEGF는 내피 세포의 세포분열 및 세포 이동을 자극할 수 있다. 한 구체예에서, 내피 분화 배지는 VEGF를 약 5-50 ng/mL의 농도로 포함한다. 한 바람직한 구체예에서, 내피 분화 배지는 VEGF를 약 10ng/mL의 농도로 포함한다. 특히 바람직한 한 구체예에서, 내피 분화 배지는 VEGF165를 약 10ng/mL의 농도로 포함한다.
bFGF 또는 FGF-2로도 언급되는 염기성 섬유모세포 성장 인자는 사지 및 신경계 발생, 상처 치유, 및 종양 성장을 포함하는, 다양한 생물학적 과정에 관련되어 왔다. bFGF는 인간 배아 줄기 세포의 공급자-독립적 성장을 지지하는데 이용되어 왔다. 한 구체예에서, 내피 분화 배지는 FGF-2를 약 5-25 ng/mL의 농도로 포함한다. 한 바람직한 구체예에서, 내피 분화 배지는 FGF-2를 약 10ng/mL의 농도로 포함한다.
hPSC로부터 EC를 생성하는 종래의 프로토콜과 다르게, 본원에 기재된 방법은 예를 들어, OP9 기질 세포와 같은 지지 세포와의 공동-배양을 필요로 하지 않는다.
hPSC로부터 EC를 생성하는 종래의 프로토콜과 다르게, 본원에 기재된 방법은 배양체 (EB) 형성을 필요로 하지 않는다.
hPSC로부터 EC를 생성하는 종래의 프로토콜과 다르게, 본원에 기재된 방법은 외인성 TGF-β 억제를 필요로 하지 않는다.
C. 분화된 내피 세포로부터 ECFC -유사 세포의 분리
본원에 기재된 방법의 한 구체예에서, CD31+NRP-1+ 세포는 내피 분화를 겪은 세포의 집단으로부터 선택되고 분리된다. 하나 이상의 특이적 분자 마커를 지닌 세포를 선택하는 방법은 당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 세포는 형광-활성화 세포 분류, 또는 자기-활성화 세포 분류를 포함하는 유세포 측정법에 의해 다양한 전사체의 발현에 기반하여 선택될 수 있다.
한 구체예에서, CD31+NRP-1+ 세포는 분화 10일, 11일 또는 12일에, 본원에 기재된 대로, 내피 분화를 겪은 세포의 집단으로부터 선택된다. 한 바람직한 구체예에서, CD31+NRP-1+ 세포는 분화 12일에 내피 분화를 겪은 세포의 집단으로부터 선택된다. 본 발명자들은 내피 분화를 겪은 12일 세포 집단이 분화의 다른 날에 존재하는 세포 집단에 비해 높은 비율의 NRP-1+ 세포를 함유함을 발견하였다.
하기 실시예에서, 부착 EC를 분화 12일 후에 회수하고 단일 세포 현탁액으로 제조하였다. 세포를 계수하고 항-인간 CD31, CD144 및 NRP-1로의 항체 염색을 위해 준비하였다. CD31+CD144+NRP-1+ 세포를 분류하고 유세포 측정법을 이용하여 선택하였다.
한 구체예에서, 선택된 세포는 ECFC를 포함하는 EC에 전형적인 조약돌 형태를 나타낸다.
한 구체예에서, 선택된 세포는 ECFC를 포함하는 EC에 전형적인 Matrigel™-코팅된 디쉬 상에 모세관-유사 네트워크를 형성하는 능력을 갖는다.
한 구체예에서, 선택된 세포는 ECFC에 전형적인, 공동-배양 및/또는 공동-이식된 세포의 부재 하에 생체내 혈관 형성에 대한 능력을 갖는다.
한 구체예에서, 선택된 세포는 CB-ECFC와 같거나 더 크고 공지된 프로토콜을 이용하여 시험관내 유래된 EC보다 큰 클론 증식 가능성을 나타낸다.
한 구체예에서, 선택된 세포는 높은 클론 증식 가능성을 나타낸다. 예를 들어, 한 구체예에서, 분리된 단일 ECFC-유사 세포의 약 95% 이상이 증식하고 분리된 단일 ECFC-유사 세포의 적어도 약 35-50%가 자가-보충하는 능력을 갖는 HPP-ECFC-유사 세포이므로, 추가적인 HPP-ECFC-유사 세포를 발생시킨다.
D. 분리된 ECFC -유사 세포의 증식.
다양한 구체예에서, 분리된 CD31+NRP-1+ ECFC-유사 세포는 내피 성장에 적합한 조건 하에 증식한다. 한 구체예에서, 당 분야에 공지된 내피 세포 성장을 위한 배양 조건을 이용하여 분리된 CD31+NRP-1+ ECFC-유사 세포를 증식시킬 수 있다. 한 구체예에서, 하기에 추가로 논의된 대로, 배양 디쉬를 세포에 대한 매트릭스 부착제로서 타입 1 콜라겐으로 코팅시킨다. 섬유결합소, Matrigel 또는 다른 세포 매트릭스를 또한 이용하여 배양 디쉬로의 세포의 부착을 촉진시킬 수 있다. 하기에 추가로 논의되는 한 구체예에서, 내피 성장 배지 2 (EGM2) 및 VEGF, IGF1, EGF, 및 FGF2, 비타민 C, 하이드로코르티손, 및 우태아 혈청을 이용하여 분리된 CD31+NRP-1+ ECFC-유사 세포를 증식시킬 수 있다.
하기 실시예에서, 분리된 CD31+NRP-1+ ECFC-유사 세포를 원심분리하고 1:1 내피 성장 배지 및 내피 분화 배지에 재현탁시켰다. 세포의 선택된 집단으로부터 ECFC-유사 세포를 생성하기 위해, 웰 당 약 2500개의 선택된 세포를 콜라겐-코팅된 12-웰 플레이트에 시딩하였다. 2일 후, 배양 배지를 3:1 비의 내피 성장 배지 및 내피 분화 배지로 대체하였다. ECFC-유사 집락은 빽빽한 부착 세포로서 나타났고 증식 7일에 조약돌 형태를 나타내었다.
하기 실시예에서, HPP-ECFC-유사 세포의 실질적으로 순수한 집단을 분리하기 위해 ECFC-유사 세포 클러스터를 클로닝하였다. "순수한" 또는 "실질적으로 순수한"은 전체 세포 집단을 구성하는 HPP-ECFC-유사 세포에 관해, 적어도 약 75% (예컨대, 적어도 약 75%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 이상) 순수한 세포의 집단을 의미한다. 다시 말해, 용어 "실질적으로 순수한"은 내피 세포 계통의 세포를 수득하기 위해 분화를 유도할 때 약 25%, 20%, 약 10%, 또는 약 5% 미만의 비-ECFC-유사 세포를 함유하는, 본원에 제공된 바와 같은, ECFC-유사 세포의 집단을 의미한다. 용어 "실질적으로 순수한"은 또한 임의의 풍부화, 증식 단계, 또는 분화 단계 이전에 분리된 집단에서 약 25%, 20%, 약 10%, 또는 약 5% 미만의 비-ECFC-유사 세포를 함유하는, 본원에 제공된 바와 같은, ECFC-유사 세포의 집단을 의미한다. 일부 경우에, 본원에 제공된 방법에 따라 생성된 ECFC-유사 세포의 실질적으로 순수한 분리된 집단은 전체 세포 집단을 구성하는 내피 세포의 세포에 관해 적어도 약 95% 순수하다 (예컨대, 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%). 당 분야에 공지된 클로닝 기법이 본원에 기재된 방법에 이용될 수 있다.
하기 실시예에서, 시딩 밀도로서 cm2 당 10,000개 세포를 플레이팅하고 격일로 배지를 교환하면서 ECFC-유사 세포를 완전 내피 성장 배지 (콜라겐 코팅된 플레이트 및 cEGM-2 배지)에 유지시킴에 의해 컨플루언트 ECFC-유사 세포를 계대시켰다. 당 분야에 공지된 세포 계대 기술이 본원에 기재된 방법에 이용될 수 있다.
한 구체예에서, 본원에 제공된 방법을 이용하여 생성된 ECFC-유사 세포를 내피 성장 배지를 포함하는 조성물에서 증식시키고 안정한 ECFC-유사 세포 표현형을 유지하면서 최대 18회 계대시킬 수 있다. "안정한 ECFC-유사 세포 표현형"이라 함은 조약돌 형태를 나타내고, 세포 표면 항원 CD31 및 CD144를 발현시키며, 공동-배양 및/또는 공동-이식된 세포의 부재 하에 생체내 혈관을 형성하는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 바람직한 구체예에서, 안정한 표현형을 갖는 ECFC-유사 세포는 또한 CD144 및 KDR은 발현시키지만 α-SMA (알파-평활근 액틴)는 발현시키지 않는다.
III. ECFC -유사 세포의 분리된 집단
한 구체예에서, 인간 NRP-1+/CD31+ ECFC-유사 세포의 분리된 집단이 제공된다. 한 구체예에서, 본원에 기재된 hPSC로부터 ECFC-유사 세포를 생성하는 시험관내 방법을 이용하여 제공된 NRP-1+/CD31+ ECFC-유사 세포의 정제된 인간 세포 집단이 생성된다.
하기 실시예에서, 본원에 기재된 방법을 이용하여 NRP-1+ 및 CD31+ ECFC-유사 세포의 정제된 인간 세포 집단을 생성한다. 상기 집단의 분리된 ECFC-유사 세포는 조약돌 형태를 나타내고 공동-배양 및/또는 공동-이식된 세포 없이 생체내 혈관 형성을 위한 능력을 갖는다. 한 구체예에서, 상기 집단의 ECFC-유사 세포는 CD144+, KDR+ 및 α-SMA- 중 하나 이상에 의해 추가로 특성화된다.
한 구체예에서, 상기 집단에서 ECFC-유사 세포의 적어도 일부는 CB-ECFC의 증식 가능성과 같거나 더 크고 다른 공지된 프로토콜을 이용하여 시험관내 생성된 EC의 증식 가능성보다 큰 높은 증식 가능성을 갖는다. 한 바람직한 구체예에서, ECFC-유사 세포 집단은 단일한 출발 다능성 세포로부터 적어도 1조개의 ECFC-유사 세포를 생성하는 증식 가능성을 갖는 HPP-ECFC를 포함한다.
한 바람직한 구체예에서, 분리된 ECFC-유사 세포 집단은 실질적으로 순수하다.
한 바람직한 구체예에서, 본원에 제공된 분리된 ECFC-유사 세포 집단은 하기 특징을 갖는 적어도 약 35-50% ECFC-유사 세포를 함유한다:
A. 특징적인 ECFC-유사 분자 표현형;
B. Matirgel™ 상에 시험관내 모세관-유사 네트워크를 형성하는 능력;
C. 높은 증식 가능성;
D. 자가-보충 잠재력;
E. 공동-배양 세포 없이 생체내 혈관 형성을 위한 능력; 및
F. 증가된 세포 생육성 및/또는 감소된 노화.
상기 언급된 ECFC-유사 특징의 각각이 하기 본원에서 추가로 논의된다.
A. ECFC -유사 세포 분자 표현형
내피 계통의 세포는, 예를 들어, CD31, CD144, KDR 및 NRP-1을 포함하는 특징적인 분자 마커를 갖는다. 제대혈 EC는 CD31, CD144, KDR 및 NRP-1을 포함하는 다양한 내피 마커를 발현하는 것으로 공지되어 있다. 현재, 본 발명자들은 CB-ECFC를 혈관으로부터 유래된 임의의 다른 EC로부터 구별하는 특이적 마커를 알지 못한다. ECFC를 포함하는 EC에서 분자 발현 패턴을 측정하는 방법이 공지되어 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법을 이용하여 생성된 세포에서 다양한 마커의 발현을 평가하기 위한 다양한 공지된 면역세포화학 기법.
본원의 실시예에서, ECFC-유사 세포는 CD31+/NRP-1+이다. 한 바람직한 구체예에서, 본원에 제공된 방법을 이용하여 유래된 ECFC-유사 세포는 또한 CD144 및 KDR을 발현시키고 α-SMA는 발현시키지 않는다. 대조적으로, OP9 세포와의 공동-배양 또는 EB 발생을 필요로 하는 프로토콜을 이용하여 hPSC로부터 시험관내 생성된 EC는 종종 α-SMA를 발현시킨다.
B. Matrigel ™ 상에서 시험관내 모세관-유사 네트워크를 형성하는 능력
다양한 다른 EC와 같이, 제대혈로부터 유래된 ECFC는 Matrigel™ 상에서 시험관내 배양시 모세관-유사 네트워크를 형성할 수 있다.
한 구체예에서, 본원에 제공된 방법을 이용하여 hPSC로부터 시험관내 생성된 ECFC-유사 세포 및 집단은 Matrigel™ 상에서 시험관내 배양시 모세관-유사 네트워크를 형성하는 능력을 갖는다.
C. 높은 증식 가능성
다양한 상이한 프로토콜을 이용하여 hPSC로부터 시험관내 유래된 내피 세포 (EC)는 CB-ECFC에 비해 상이한 증식 가능성을 갖는다. 예를 들어, 본원의 실시예에 제시된 대로, 약 45%의 단일 세포 CB-ECFC는 낮은 증식 가능성 (LPP)을 갖고 단일 세포 CB-ECFC의 약 37%는 높은 증식 가능성 (HPP)을 갖는다. 본원의 실시예에 제시된 대로, 본원에서 제공된 분리된 ECFC-유사 세포 집단에서 ECFC-유사 세포의 적어도 약 35%는 HPP-ECFC-유사 세포이다. 바람직한 구체예에서, 본원에 제공된 분리된 ECFC-유사 세포 집단에서 ECFC-유사 세포의 적어도 약 50%는 HPP-ECFC-유사 세포이다.
대조적으로, 세포와 OP9 세포의 공동-배양을 포함하는 프로토콜을 이용하여 시험관내 생성된 EC (예컨대, Choi et al; Stem Cells 2009)는 클론 증식 가능성을 나타내고, 세포의 3% 미만은 HPP-EC를 발생시킨다. EB 형성을 포함하는 시험관내 프로토콜을 이용하여 생성된 내피 세포 (예컨대, Cimato et al. Circulation 2009)는 클론 증식 가능성을 나타내고, 세포의 3% 미만은 HPP-EC를 발생시킨다. 외인성 TGF-β 억제를 포함하는 시험관내 프로토콜을 이용하여 생성된 내피 세포 (예컨대, James et. al. 2010)는 클론 증식 가능성을 나타내고, 세포의 약 30%는 단지 TGF-β 억제의 지속적인 존재 하에 HPP-EC를 발생시킨다 (즉, 외인성 TGF-β 억제가 이러한 프로토콜로부터 제거된 경우 EC는 이들의 모든 HPP 활성을 잃는다).
세포의 증식 가능성을 측정하는 다양한 기법이 당 분야에 공지되어 있고 ECFC-유사 세포의 증식 가능성을 확인하기 위해 본원에 제공된 방법에 이용될 수 있다. 본원의 실시예에서, 단일 세포 검정을 이용하여 CB-ECFC, iPS 유래된-ECFC-유사 세포, EB-유래된 EC 및 말초 동맥 질환(PAD)-유래된 EC의 클론원성 증식 가능성을 평가하였다. 간단히 말해, 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 CB-ECFC, ECFC-유사 세포 및 EC를 처리하였다. 현탁된 세포를 계수하고, 희석시키고, 단일 세포를 96-웰 플레이트의 각각의 웰에서 배양시켰다. 여러 날 배양 후에, 각 웰을 조사하여 세포의 수를 정량하였다. 2개 이상의 세포를 함유하는 웰을 증식에 양성인 것으로서 확인하였다. 1의 EC 계수를 갖는 웰을 비-분열됨(non-diving)으로서 분류하고, 2-50의 EC 계수를 갖는 웰을 내피 세포 클러스터 (ECC)로서 분류하고, 51-500 또는 501-2000의 EC 계수를 갖는 웰을 낮은 증식 가능성 (LPP) 세포로서 분류하고 ≥ 2001의 EC 계수를 갖는 웰을 높은 증식 가능성 (HPP) 세포로서 분류하였다.
D. 자가-보충 잠재력
다양한 상이한 프로토콜을 이용하여 유래된 내피 세포는 자가-보충을 위한 상이한 능력을 지닌다. 자가-보충이라 함은 세포와 같이 분열하는 능력을 의미한다. 예를 들어, 본원에서 제공된 HPP-ECFC-유사 세포는 시험관내 재플레이팅될 때 이차 HPP-ECFC-유사 집락 내에 하나 이상의 HPP-ECFC-유사 세포를 발생시키는 능력을 갖는다. 한 구체예에서, 자가-보충 HPP-ECFC-유사 세포는, 적어도 치료적으로 충분한 수의 HPP-ECFC-유사 세포가 본원에 제공된 방법을 이용하여 시험관내 생성될 수 있으므로, 세포 요법에 이용하기 적합하다.
E. 공동-배양 세포 없이 생체내 혈관 형성을 위한 능력.
다양한 상이한 프로토콜을 이용하여 유래된 내피 집락 형성 세포는 생체내 혈관 형성을 위한 상이한 능력을 지닌다. 예를 들어, CB-ECFC는 예를 들어 마우스와 같은 포유동물에서 생체내 이식될 때 혈관을 형성할 수 있다.
대조적으로, EC의 생성을 위해 세포와 OP9 세포의 공동-배양을 포함하는 문헌[Choi et al (2009)]의 프로토콜을 이용하여 생성된 EC는 포유동물에서 생체내 이식될 때 숙주 뮤린 적혈구 (RBC) 충전된 기능성 인간 혈관을 형성하지 않는다. EC의 생성을 위해 EB 형성을 포함하는 문헌[Cimato et al. (2009)]의 프로토콜을 이용하여 생성된 EC는 포유동물에서 생체내 이식될 때 숙주 RBC 충전된 기능성 인간 혈관을 형성하지 않는다. EC의 생성을 위해 TGF-β 억제를 포함하는 문헌[James et. al. (2010)]의 프로토콜을 이용하여 생성된 EC는 포유동물에서 생체내 이식될 때 현저하게 적은 기능성 인간 혈관을 형성한다 (즉, 여기에 기재된 프로토콜로부터의 세포보다 15배 적음). 추가로 문헌[James et al.]의 세포는 포유동물에서 생체내 이식될 때 단지 배양액이 계속하여 TGF-베타를 함유하는 경우에만 기능성 인간 혈관을 형성할 수 있고; TGF-베타가 제거되는 경우 세포는 RBC-충전된 인간 혈관을 만드는 능력을 완전히 잃는다. 12일 CD31+NRP1+를 선택하는 단계가 결여된 (Sameul et al PNAS 2013)의 프로토콜을 이용하여 생성된 EC는 포유동물에서 생체내 이식될 때 단지 EC가 지지 세포 (즉, 중간엽 전구 세포)와 함께 이식된 경우에만 혈관을 형성할 수 있다.
상기 종래 기술의 방법과 대조적으로, 본원의 실시예에서, ECFC-유사 세포 집단의 세포는 포유동물에서 생체내 이식될 때, 심지어 지지 세포의 부재시에도 혈관을 형성할 수 있다.
생체내 혈관 형성을 측정하기 위한 다양한 기법이 공지되어 있고 이용될 수 있다. 본원의 실시예에서, 생체내 혈관 형성은 본 발명의 방법을 이용하여 생성된 3차원 (3D) 소구획식(cellularized) 콜라겐 매트릭스 ECFC-유사 세포를 첨가함에 의해 평가되었다. ECFC-유사 세포 현탁액을 함유하는 콜라겐 혼합물은 조직 배양 디쉬에서 중합되어 겔을 형성할 수 있다. 그 후 소구획식 겔은 6 내지 12주령 NOD/SCID 마우스의 옆구리에 이식되었다, 이식한 지 2주 후에, 겔을 회수하고 마우스 적혈구로 관류된 인간 내피-라이닝된 혈관에 대해 조사하였다.
외인성 지지 세포의 부재 하에 생체내 혈관을 형성하는 능력은 본원에 기재된 방법을 이용하여 생성된 세포가 ECFC라는 하나의 지시인자이다.
F. 증가된 세포 생육성 및/또는 감소된 노화
다양한 상이한 프로토콜을 이용하여 유래된 내피 세포는 CB-ECFC에 비해 상이한 수준의 세포 생육성 및/또는 노화 수준을 갖는다. 예를 들어, 본원의 실시예에서, 생육가능한 CB-ECFC는 최대 18회 계대될 수 있다.
대조적으로, EC의 생성을 위해 세포와 OP9 세포의 공동-배양을 포함하는 문헌[Choi et al (2009)]의 프로토콜을 이용하여 생성된 EC 세포는 6 계대의 생육성을 갖는다. EC의 생성을 위해 EB 형성을 포함하는 문헌[Cimato et al. (2009)]의 프로토콜을 이용하여 생성된 EC는 7 계대의 생육성을 갖는다. 내피 세포의 생성을 위해 외인성 TGF-β 억제를 포함하는 문헌[James et. al. (2010)]의 프로토콜을 이용하여 생성된 EC는 9 계대의 생육성을 갖고 TGF-β 억제의 부재 하에, 문헌[James et al.]의 EC는 중간엽 세포 유형으로 전이되어, 이들의 내피 특징을 잃는다. 12일 CD31+NRP-1+ 세포를 선택하는 단계가 결여된 문헌[Samuel et al.]의 프로토콜을 이용하여 생성된 EC는 최대 15회 계대 동안 증식할 수 있었다.
시험관내 EC를 생성하기 위한 상기 방법과 대조적으로, 본원의 실시예에서, ECFC-유사 세포 집단의 생육가능한 세포는 최대 18회 계대 동안 증식할 수 있었다. CB-ECFC는 15-18회 계대될 수 있다.
세포 생육성 및 노화를 측정하기 위한 다양한 기법이 당 분야에 공지되어 있고 본 발명에서 유용하다. 본원의 실시예에서, 세포 생육성은 트립판 블루 배제에 의해 평가되었고 세포 노화는 노화 검정 키트 (Biovision)를 이용하여 평가되었다. 세포 생육성 및/또는 노화를 평가하는 다른 방법이 당 분야에 공지되어 있고 이용될 수 있다.
IV. 본원에 기재된 ECFC -유사 세포의 이용
일차 세포인 ECFC와 대조적으로, 본원에 기재된 방법을 이용하여 생성된 ECFC-유사 세포는 하기 기재된 대로 다양한 임상 적용에 유용할 수 있는 부피로 시험관내 생성될 수 있다.
A. 요법
한 양태에서, 세포 이식, 세포 보충, 및/또는 세포 또는 조직 대체에 적합한 방법, 세포 및 조성물이 본원에 제공된다. 상기 방법은 본원에 제공된 방법에 따라 유래된 치료적 유효량의 ECFC-유사 세포를 이를 필요로 하는 대상체에 제공하여, 대상체에 ECFC-유사 세포 치료를 제공하는 것을 포함할 수 있다. "치료적 유효량"이라 함은 상피 복구를 필요로 하는 대상체를 치료하기에 효과적인 양을 의미한다. 본원에 제공된 세포 및/또는 조성물은 의도하는 조직 부위로 ECFC-유사 세포가 이식되거나 이동하고 기능적 결손 부위를 재구성하거나 재생시키는 것을 허용하는 방식으로 대상체에 투여될 수 있다.
본원에 제공된 ECFC-유사 세포를 이용한 요법을 수용하기 적합한 대상체는 내피 기능장애 및/또는 다양한 종류의 손상을 지니는 대상체를 포함한다. 예를 들어, 심혈관 질환, 심근경색증, 심장 뇌졸중, 또는 말초 동맥 질환 (PAD)을 지니는 대상체가 본 발명의 ECFC-유사 세포를 이용한 요법을 수용하기 적합한 대상체일 수 있다. 폐 또는 신장 질환 또는 손상을 지닌 대상체가 본 발명의 ECFC-유사 세포를 이용한 요법을 수용하기 적합한 대상체일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 중증 사지 허혈 (CLI)이 발생한 PAD 환자가 본 발명의 ECFC-유사 세포를 이용한 요법을 수용하기 적합한 대상체일 수 있다.
한 구체예에서, ECFC-유사 세포는 인간 투여에 적합한 약학적 조성물의 형태로 대상체에 제공될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 완충제, 또는 부형제를 포함할 수 있다. 조성물은 생착 ECFC-유사 세포를 촉진하는 하나 이상의 성분을 추가로 포함하거나 이와 함께 대상체에 제공될 수 있다. 예를 들어, 약학적 조성물은 이식된 세포의 생존 및/또는 생착을 촉진하고, 혈관형성을 촉진하고, 세포외 또는 사이질 매트릭스의 조성을 조절하고, 및/또는 이식 부위로 다른 세포 유형을 동원하는 하나 이상의 성장 인자 또는 사이토카인 (예컨대, 혈관형성 사이토카인)을 추가로 포함하거나 이들과 함께 대상체에 제공될 수 있다
한 구체예에서, 약학적 조성물은 적당한 멸균성 및 안정성을 제공하는 표준 방법에 따라 제형화되고, 생성되고, 저장될 수 있다.
예를 들어, 한 구체예에서, 본원에 제공된 ECFC-유사 세포는 적절한 혈류가 부족한 조직에 직접 주입될 수 있다 (의사에 의해 결정됨). 한 구체예에서, 본원에 제공된 ECFC-유사 세포는 콜라겐, 섬유결합소, 또는 합성 물질을 포함하는 매트릭스에 현탁될 수 있고 ECFC-유사 세포의 이러한 젤라틴성 현탁액은 적절한 혈류가 부족한 조직에 직접 주입될 수 있다. 조직에 주입된 ECFC-유사 세포의 농도는 예를 들어, 약 10,000 내지 약 100,000개 세포/전달 비히클 또는 매트릭스 물질의 마이크로리터로 다양할 수 있다. 일부 조직에서, 세포는 적절한 혈류의 회복에 의해 한 차례에 거쳐 전달될 수 있는 반면 다른 조직들은 적절한 혈류를 구제하기 위해 시간 경과에 따라 여러 번의 주입과 순차적인 주입을 필요로 할 수 있다.
ECFC-유사 세포를 대상체에 투여한 후에, 요망되는 경우, 치료 방법의 효과를 평가할 수 있고 필요 또는 요구에 따라 치료는 반복될 수 있다. 치료 효능은 예를 들어, 흉터 조직이 차지하는 면적의 감소, 흉터 조직의 재혈관화, 협심증의 빈도 및 중증도; 발생압, 수축기압, 확장말기압, 대상체 이동성 및/또는 삶의 질에서의 개선과 같은 당 분야에 공지된 임상적으로 허용되는 기준에 의해 모니터될 수 있다.
ECFC 세포는 저산소증 및 신생혈관화(neovascularization)로부터 눈을 보호할 수 있다. 따라서, 본원에 제공된 ECFC-유사 세포를 이용하여 예를 들어, 미숙아 망막병증, 당뇨 망막병증, 중심 정맥 폐색, 또는 황반 변성과 같은 저산소증 및 신생혈관화가 발생하는 다양한 안질환을 치료하는 것이 본원에서 고려된다.
혈관 스텐트 내부의 적어도 일부 및 임의로 스텐트 배치 동안 내피 세포가 벗겨진 혈관의 어떤 부분을 코팅하기 위해 본원에 제공된 ECFC-유사 세포를 이용할 수 있음이 또한 고려된다. 이러한 경우에, 정맥내 주입된 ECFC-유사 세포는 스텐트가 배치된 혈관 부위의 재협착 및/또는 혈병 형성을 방지하기 위해 손상 부위에 결합하여 혈관을 재내피화할 것이다.
혈류의 협착 및 차단 부위를 갖는 환자의 동맥으로 이식편으로서 인간 정맥 (복재 또는 제대)의 배치는 후속 협착 및 차단된 혈류의 높은 발생률을 지님이 공지되어 있다. 이는 생체내 혈관 재형성의 과정에서 초기에 혈관 내피 세포의 손실과 관련된다. 본원에 제공된 ECFC-유사 세포는 이식된 이식편을 재-내피화하고 환자에서 혈관의 기능을 보존하기 위해 그러한 환자의 혈관계에 정맥내 주입될 수 있는 것으로 고려된다.
B. 시험 작용제 스크리닝
본원에 기재된 ECFC-유사 세포는 ECFC-유사 세포 및 그로부터 발생한 임의의 조직의 특징에 영향을 주는 인자들 (예컨대, 용매, 소분자 약물, 펩티드, 올리고뉴클레오티드) 또는 환경 조건 (예컨대, 배양 조건 또는 조작)을 스크리닝하는데 이용될 수 있다. 한 구체예에서, 예를 들어, 약학적 화합물과 같은 시험 작용제는 내피 건강 및/또는 복구에 대한 이들의 효과를 결정하기 위해 본 발명의 ECFC-유사 세포를 이용하여 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 화합물이 내피 세포에 대한 약리적 효과를 갖도록 설계되거나, 다른 효과를 갖도록 설계된 화합물이 내피 세포에 대한 의도치 않은 부작용을 가질 수 있기 때문에 스크리닝이 수행될 수 있다. 다양한 구체예에서, 본원의 ECFC-유사 세포는 시험 작용제 스크리닝에 특히 유용한데, 그 이유는 적어도 이들이 배양된 다능성 세포로부터 시험관내 분화되기 때문이다. 대조적으로, CB-ECFC는 환자 혈액으로부터 수득된 일차 세포이다. 시험 작용제 화합물을 스크리닝하는 다양한 방법은 당 분야에 공지되어 있고 본원에 기재된 ECFC-유사 세포에 이용될 수 있다.
예를 들어, 시험 작용제의 활성을 스크리닝하는 것은 i) 본원에 기재된 ECFC-유사 세포를, 단독으로 또는 다른 작용제와 함께, 시험 작용제와 조합시키고; ii) 미처리된 세포 또는 대조 작용제로 처리된 세포에 비해, 시험 작용제에 기인할 수 있는 ECFC-유사 세포의 형태, 분자 표현형, 및/또는 기능적 활성에서의 변화를 측정하고; 그리고 iii) 시험 작용제의 효과와 관찰된 변화를 관련시키는 것을 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 본원에 제공된 ECFC-유사 세포에 대한 시험 작용제의 세포독성은 ECFC-유사 세포 생육성, 생존, 형태, 및 분자 표현형 및/또는 수용체 중 하나 이상에 대해 작용제가 갖는 효과에 의해 결정될 수 있다.
한 구체예에서, ECFC-유사 세포 기능은 ECFC-유사 세포의 표현형 또는 활성을 관찰하기 위한 표준 검정을 이용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 세포 배양액 또는 생체내에서 분자 발현, 수용체 결합 중 하나 이상이 본원에 기재된 ECFC-유사 세포를 이용하여 평가될 수 있다.
C. 키트
한 구체예에서, 본원에 기재된 방법 또는 세포에 이용하기 위한 키트가 고려된다. 한 구체예에서, 키트는 하나 이상의 밀봉된 바이알에 본원에 기재된 바와 같은 분화 및/또는 성장 배지를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 키트는 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 세포, 예컨대 다능성 세포 및/또는 ECFC-유사 세포를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 키트는 다능성 세포로부터 ECFC-유사 세포를 발생시키기 위한 지시서를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 키트는 적합한 컨테이너 및 포장 재료에 본 발명에 사용하기 위한 다양한 시약을 포함할 수 있다.
본 발명은 하기 비제한적인 실시예를 고려하여 더욱 충분히 이해될 것이다.
실시예
실시예 1: 물질 및 방법
hES 및 hiPS 세포의 배양: 인간 배아 줄기 세포 (hESC) 주 H947 및 섬유모세포-유래된 인간 iPS 세포주 (DF19-9-11T)48를 WiCell Research institute (Madison, Wisconsin)로부터 구입하였다. Broxmeyer 및 Yoder 실험실에서 유래된 여러 다른 hiPS 세포주 (FCB-iPS-1 및 FCB-iPS-2)를 또한 이용하여 ECFC를 생성하였다20 , 21 (표 1). hESC 및 hiPSC 둘 모두를 10 cm2 조직 배양 디쉬의 Matrigel™ 상의 mTeSR1 완전 배지 (Stem Cell Technologies)에 37℃ 및 5% CO2에서 유지시켰다. 세포를 플레이팅한 후에, 배지를 2일, 3일, 및 4일에 교환하였다. 세포를 5일에 계대시켰다. 배지를 흡인시키고 4-5 mL의 디스파제 (2 mg/mL, Gibco) 함유 배지를 각 플레이트에 첨가시킨 다음, 37℃에서 3-5분 동안 또는 집락의 가장자리가 플레이트로부터 들릴 때까지 인큐베이션하였다. 디스파제-함유 배지를 플레이트로부터 흡인시키고 세포를 DMEM-F12 (Gibco)로 부드럽게 3회 세척하여 임의의 남아 있는 효소를 제거하였다. 그 후 신선한 배지를 이용하여 플레이트로부터 강력한 세척을 이용하고 5 mL 일회용 피펫으로 스크레이핑하여, 거품이 생기지 않도록 조심하면서 집락을 수집하였다. 수집된 집락을 300 x g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 흡인시키고, 펠렛을 mTeSR1 완전 배지에 재현탁시켰다. 계대 전에, 10 cm2 조직 배양 디쉬를 Matrigel™로 30분 동안 코팅시켰다. 부착되지 않은 Matrigel™을 조직 배양 디쉬로부터 제거하고 7 mL의 mTeSR1 완전 배지를 디쉬에 첨가하였다. mTeSR1 배지에 균일하게 분포된 집락을 각 플레이트에 첨가하였다. 그 후 세포를, 소용돌이를 피하면서 디쉬 내에 여러 번의 좌우 쉐이킹 모션을 이용하여 스프레딩하였다. 2일에 성장 품질 및 형태에 대해 배양액을 조사하였다. 종래에 기재된 대로, 기형종 형성 검정을 수행하였다20.
표 1: 본원의 실시예에 사용된 hES 및 hiPS 세포주
Figure pct00001
ECFC -유사 세포를 포함하는 EC 계통으로의 hESC 및 hiPSC의 지시된 분화: mTeSR1 배지에서의 배양 2일 (-D2) 후에, FGF-2, VEGF165, 및 BMP4 (10 ng/mL)의 존재 하에 액티빈 A (10 ng/mL)를 첨가하여 중배엽 계통으로 24시간 동안 배양을 유도시켰다. 다음 날, 액티빈-A 함유 배지를 제거하고 FGF-2 (Stemgent), VEGF165 (R&D) 및 BMP4 (R&D)를 함유하는 8 mL의 Stemline II 완전 배지 (Sigma)로 대체하였다. 배지를 3일, 5일, 7일, 및 8일에 8 ml의 신선한 Stemline II 분화 배지로 대체하였다. 9일에 그리고 그 후에 배지를 10 mL의 Stemline II 분화 배지로 교환하였다.
유세포 측정법: 분화한 지 12일 후에, 부착 세포를 TrypleE 를 이용하여 회수하고 EGM-2 배지에서 단일 세포 현탁액으로 만들었다. 세포를 계수하고, 세포 현탁액의 분취량을 항체 염색을 위해 준비하였다. FcR 차단 시약 (Miltyni Biotech cat# 120-000-442)을 첨가하여 항체의 비특이적 결합을 방지하였다. 항-인간 CD31 (CD31-FITC, BD Pharmingen으로부터의 클론 WM59, Cat # 555445), CD144 (CD144-PE, ebioscience로부터의 클론 16B1, Cat # 12-1449-82) 및 NRP-1 (NRP-1-APC, Miltenyi Biotech로부터의 클론 AD5-176, Cat # 130-090-900) 항체를 사용 전에 적정된 농도로 이용하였다. 프로피듐 아이오다이드 (PI, Sigma)를 죽은 세포 염색을 위해 세포 현탁액에 첨가하였다. 세포 표면 항원의 유세포 측정 검출 및 세포 분류를 각각 LSR II 및 FACS Aria (Becton Dickinson) 상에서 수행하였다. 제대혈 유래된 ECFC를 이용한 단일 양성 대조군에 의해 보상이 설정되었다. 표적화된 세포 집단의 게이팅은 각 형광 컬러에 대한 FMO (fluorescent minus one) 대조군에 기반하여 결정되었다.
분류된 세포의 세포 배양: CD31+, CD144+ 또는 KDR+ 및 NRP-1+ 분류된 세포를 300 X g에서 5분 동안 원심분리시킨 다음 50% EGM-2 및 50% 완전 Stemline II 분화 배지에 재현탁시켰다. 분류된 집단으로부터 ECFC를 생성하기 위해, 웰 당 2500개 세포를 래트 꼬리 타입 I 콜라겐-코팅된 12웰 플레이트에 시딩하였다. 2일 후에, 배지를 흡인시키고 EGM-2의 세 부분 및 분화 배지의 한 부분을 배양액에 첨가하였다. ECFC-유사 세포 집락은 빽빽한 부착 세포로 나타났고 7일에 조약돌 형태를 나타내었다. 가끔, 클로닝 실린더를 이용하여 이종성 세포 집단으로부터 ECFC-유사 세포 집락을 분리하였다. 종래에 기재된 대로, 내피 세포 클러스터의 클로닝을 수행하여 고도 증식성 내피 세포의 순수한 집단을 분리하였다1 , 2, 49. 종래에 기재된 대로, cm2 당 10,000개 세포를 시딩 밀도로서 플레이팅함에 의해 컨플루언트 ECFC-유사 세포를 계대시키고 격일로 배지를 교환하면서 ECFC-유사 세포를 완전 내피 성장 배지에 유지시켰다 (콜라겐 코팅된 플레이트 및 cEGM-2 배지)1, 2, 49.
Matrigel ™ 상에서 시험관내 모세관-유사 네트워크 형성 검정: 다양한 상이한 프로토콜로부터 유래된 내피 세포를 트립신 처리하고 EGM-2 배지에 재현탁시켰다. 세포를 50 μL의 성장 인자-감소된 Matrigel™ (BD Biosciences)로 코팅된 96-웰 플레이트에서 삼중으로 웰 당 1.0×104개 세포의 밀도로 플레이팅하였다. 플레이트를 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 8-16시간의 인큐베이션 후에, 10× CP-ACHROMAT/0.12 NA 대물렌즈를 지닌 Zeiss Axiovert 25 CFL 도립 현미경을 이용하여 ×10 배율로 각 웰의 현미경사진을 찍었다. SPOT RT 컬러 카메라 (Diagnostic Instruments)를 이용하여 제조업체의 소프트웨어에 의해 이미지를 얻었다. 위상차 이미지를 공극형 대물렌즈(air objectives)로 촬영하였다.
면역화학: ECFC-유사 세포를 4% (w/v) 파라포름알데하이드로 30분 동안 고정시키고 PBS에서 0.1% (v/v) TritonX-100으로 5분 동안 투과시켰다. 10% (v/v) 염소 혈청으로 30분 동안 차단시킨 후에, 세포를 하기 일차 항체와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다: 항-CD31 (Santa Cruz), 항-CD144 (ebioscience), 항-NRP-1 (Santa Cruz) 및 항-a-SMA, (Chemicon). 세포를 PBS로 세척한 다음, Alexa-488 또는 Alexa-565 (Molecular Probe)와 컨쥬게이션된 이차 항체와 인큐베이션하고 2 g/ml DAPI (Sigma-Aldrich)에 의한 대조염색 후에 공초점 현미경에 의해 가시화하였다. 공초점 이미지를 Olympus uplanSApo 60xW/1.2NA/eus 대물렌즈로서 이용한 Olympus FV1000 mpE 공초점 현미경으로 수득하였다. 모든 이미지를 실온에서 개별 10μ 두께 섹션을 지닌 Z-스택으로서 촬영하였고 이미지를 FV10-ASW 3.0 뷰어를 이용하여 분석하였다.
단일 세포 검정: CB-ECFC 또는 iPS 유래된-ECFC-유사 세포 또는 EB-유래된 EC 및 PAD-유래된 EC를 클론원성 증식 가능성을 평가하기 위해 단일 세포 검정으로 처리하였다. 간단히 말해, EC를 trypLE Express (Invitrogen)로 처리하여 단일 세포 현탁액을 얻었다. 세포 계수 및 연속 희석을 수행하여 96-웰 배양 플레이트의 개별 웰에서 웰 당 0.68개 세포의 농도를 얻었다. 웰 당 단일 세포의 존재를 보장하기 위해 플레이팅한 다음 날 웰을 조사하였다. 배양 배지를 4일, 8일, 및 12일에 교환하였다. 배양 14일에, 세포를 Sytox 시약 (Invitrogen)으로 염색하고, 각 웰을 형광 현미경에 의해 조사하여 세포의 수를 정량하였다 (10x 배율; 10× CP-ACHROMAT/0.12 NA 대물렌즈를 지닌 Zeiss Axiovert 25 CFL 도립 현미경). 2개 이상의 세포를 함유하는 웰을 증식에 양성으로서 확인하였다 (10x 배율; 10× CP-ACHROMAT/0.12 NA 대물렌즈를 지닌 Zeiss Axiovert 25 CFL 도립 현미경). 종래에 기재된 대로, 1의 EC 계수를 갖는 웰을 비-분열됨(non-diving)으로서 분류하고, 2-50의 EC 계수를 갖는 웰을 내피 세포 클러스터 (ECC)로서 분류하고, 51-500 또는 501-2000의 EC 계수를 갖는 웰을 낮은 증식 가능성 (LPP) 세포로서 분류하고 ≥ 2001의 EC 계수를 갖는 웰을 높은 증식 가능성 (HPP) 세포로서 분류하였다1 , 2, 49.
세포 생육성 , 노화 및 세포 증식 검정: 내피 세포를 타입 I 콜라겐-코팅된 12-웰 및 6-웰 플레이트에 각각 웰 당 5 × 104 또는 웰 당 1 × 105의 밀도로 플레이팅하였다. 24시간 후에, 성장 배지를 Fc-대조군, Fc-NRP-1 다이머 (R&D Systems) 또는 NRP-1 차단 항체 함유 EGM-2 배지로 7일 동안 대체하고 배지를 격일마다 교체하였다. NRP-1A 및 NRP-1B 항체는 Genentech에 의해 충분히 제공되었다42. 세포 생육성 및 증식을 트립판 블루 배제에 의해 평가하고, 염료-비함유 세포의 수를 위상차 현미경 아래에서 조건 당 삼중으로 계수하였다.
노화 검정 키트를 Biovision (cat # K320-250)으로부터 구입하고 검정을 제조업체의 지시에 따라 수행하였다. 간단히 말해, 내피 세포를 밤새 배양을 위해 12웰 플레이트에 시딩하여 단층을 형성하였다. 다음 날, 세포를 실온에서 10-15분 동안 0.5 ml의 상업용 고정액에 고정시켰다. 세포를 1 ml의 1X PBS로 2회 세척하고 0.5 ml의 상업용 염색액으로 밤새 37℃에서 염색하였다. 블루 컬러의 발생에 대해 현미경 아래에서 세포를 관찰하였다. 10× CP-ACHROMAT/0.12 NA 대물렌즈를 지닌 Zeiss Axiovert 25 CFL 도립 현미경을 이용하여 10× 배율로 각 웰로부터 현미경사진을 찍었다. 이미지를 SPOT RT 컬러 카메라 (Diagnostic Instruments)를 이용하여 제조업체의 소프트웨어에 의해 획득하였다. 위상차 이미지를 공극형 대물렌즈로 촬영하였다.
마우스: 모든 동물 절차는 실험실 동물의 관리 및 이용에 대한 지침에 따라 수행되었고 Indiana University School of Medicine (Indianapolis, IN)에 있는 Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC)에 의해 승인되었다. 수컷 및 암컷 둘 모두의 6-12주령 NOD/SCID 마우스 (T- 및 B-세포 결핍, 손상된 보체)를 모든 동물 연구에 이용하였다. NOD-SCID 마우스를 Indiana University Laboratory Animal Resource Center (LARC)에서의 특이적-병원체-비함유 조건 하에 유지시켰다. 통계적으로 유의한 결과를 얻기 위해 필요한 동물의 최소 수를 결정하기 위해 이러한 동물 모델을 이용한 종래 연구를 이용하였다1 , 50. 종래 연구에서 이식된 10개 매트릭스 중 8개 (한 마리의 동물이 2개의 매트릭스를 수용함)가 숙주 혈관계와 접합되고 기능성 혈관을 지닌 그 8개 매트릭스 (4마리 동물)가 통계적 유의성을 위해 각 그룹에 필요한 것으로 나타났다1 , 50. 각 실험 그룹에 샘플 및 동물을 할당하는 동안 무작위 방법은 사용하지 않았다. 또한, 연구자들은 실험 동안 및 결과를 평가할 때 두 경우 모두에 그룹 할당에 대해 블라인딩되지 않았다.
생체내 혈관 형성 검정: 돼지 피부 타입 I 콜라겐을 이용하여, 종래에 기재된 대로 3차원 (3D) 소구획식 콜라겐 매트릭스를 생성하였다4 , 50. 간단히 말해, 얼음-냉각된 돼지 피부 콜라겐 용액을 0.01N HCL에서 함께 혼합시킴에 의해 타입 1 콜라겐 겔 혼합물을 제조하고, 포스페이트 완충된 염수 및 0.1N NaOH로 중화시켜 중성 pH (7.4)를 달성하였다. 중화된 겔 혼합물 (약 1.5 mg/mL)을 5% CO2에서 37℃로 가온시킴에 의해 중합반응을 유도하기 전에 얼음 위에 유지시켰다. 배양된 CB-ECFC 또는 ECFC-유사 세포 또는 EC를 2백만 개 세포/콜라겐 ml의 최종 농도로 콜라겐 혼합물에 첨가하였다. 콜라겐 혼합물 (250 μL) 함유 세포 현탁액을 48-웰 조직 배양 디쉬에 첨가하고 중합시켜 CO2에서 37℃로 30분 동안 인큐베이션시킴에 의해 겔을 형성하였다. 그 후 겔에 37℃로 5% CO2에서 500 μl의 배양 배지를 밤새도록 입혔다.
18시간의 생체외 배양 후에, 소구획식 겔을 종래에 공지된 대로 6 내지 12주령 NOD/SCID 마우스의 옆구리 (숙주 혈관계와 근접한 전방 복부벽의 뭉툭하게 절개된 피하 주머니)에 이식하였다1 , 49. 콜라겐 겔을 이식하기 위한 수술 절차는 마취 및 산소의 지속적인 공급 하에 수행되었다. 절개를 봉합하고 마우스의 회복을 모니터하였다. 이식한 지 2주 후에, 승인된 IACUC 프로토콜에 따라 인도적으로 희생된 동물에서 접목부를 절제함에 의해 겔을 회수하였다. 종래에 기재된 대로 마우스 적혈구로 관류된 인간 내피-라이닝된 혈관에 대해 겔을 조사하기 위해 H&E 및 항-인간 CD31 염색을 이용하여 면역조직화학을 수행하였다. Spot-KE 디지털 카메라 (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI)가 부착된 Leica DM 4000B 현미경 (Leica Microsystems, Bannockburn, IL)을 이용하여 hCD31+ 혈관을 각 체외이식편으로부터 이미지화하였다. 기능성 혈관이 적어도 1개의 마우스 적혈구를 함유한 경우에만 이를 계수하였다.
산소-유도된 망막병증 모델: 모든 실험은 ARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research 및 UK Home Office Regulations에 부합하게 수행되었다. 산소-유도된 망막병증은 종래 기재된 대로 C57/BL6 야생형 마우스에서 유도되었다2. 간단히 말해, 출생 후 (P) 7일의 신생 마우스 및 이들을 돌보는 어미를 75% 산소 (Pro-Ox 110 Chamber Controller; Biospherix, Redfield, NY)에 5 d 동안 노출시켰다. P12에 이들을 룸 공기로 다시 옮겼다. P13에, 마우스는 사전에 표지된 (Qtracker 655; Invitrogen) 1 × 105 hiPSC-ECFC-유사 세포, hiPSC-EBT-CD144+ EC 또는 CB-ECFC를 함유하는 1 μl의 유리체내 주사를 맞았다. 성장 인자 및 혈청이 없는 페놀 레드-비함유 DMEM을 비히클로서 이용하였고 대조군으로서 각 새끼의 왼쪽 눈에 주사하였다. 모든 새끼를 72시간 후에 소듐 펜토바르비탈로 안락사시키고 눈을 4% 파라포름알데하이드에 고정시켰다. 망막 플랫 마운트를 이소렉틴 B4 (Sigma) 및 스트렙타비딘-AlexaFlour488 (Invitrogen)로 염색하고, 염색된 결과를 공초점 현미경을 이용하여 가시화하고 이미지화하였다. 기재된 대로 3명의 독립적인 블라인딩된 조사자에 의해 ImageJ에 소프트웨어를 사용하여 면적 정량을 수행하였다2.
마우스 뒷다리 허혈 모델: 종래에 기재된 대로 뒷다리 허혈 실험을 수행하였다24. 간단히 말해, 6주령 수컷 무흉선 누드 마우스 (체중 25-30 g; Orient bioAnimal Inc., Seoul, Korea)를 럼푼 (20 mg/kg) 및 케타민 (100 mg/kg)으로 마취시켰다. 대퇴 동맥 및 그 가지를 6-0 실크 (Ethicon)에 의해 피부 절개를 통해 결찰시켰다. 그 후 외부 장골 동맥 및 그 위의 모든 동맥을 결찰시켰다. 대퇴 동맥을 이의 근위 원점으로부터 외부 장골 동맥의 가지로서 이것이 복재 및 오금 동맥으로 두 갈래로 나뉘는 원위 지점까지 절제하였다. 동맥 절개 직후에, 무흉선 마우스를 4개의 실험 그룹 중 하나로 무작위 할당하였다. 허혈 수술 후, hiPSC-ECFC-유사 세포 또는 CB-ECFC 또는 hiPS-EBT-CD144+ EC (마우스 당 1.0 × 106개 세포)를 200 μl의 EGM-2에 현탁시키고 이러한 세포 또는 비히클 대조군을 내측 넙다리의 박근의 6개 부위에 29-게이지 투베르쿨린 주사기에 의해 근내 주사하였다. 레이저 도플러 관류 이미저 (Moor Instruments)를 이용하여 종래에 기재된 대로 0일 및 치료 28일 후에 뒷다리에서 혈류를 측정하였다24. 디지털 컬러-코딩된 이미지를 분석하여 무릎 관절에서 발가락까지의 영역에서 혈류를 정량하고, 평균 관류 값을 계산하였다. 뒷다리 허혈 실험을 위한 모든 동물 관리 및 실험 절차는 CHA University (IACUC No. 130024)의 동물 관리 위원회의 승인 하에 수행되었다.
말초 혈관 질환 (PAD)을 지닌 환자로부터 동맥 EC의 분리: 질환 동맥 (DA) EC를 동의를 받고 Indiana University 인간 IRB 패널에 의해 승인된 프로토콜의 이용을 알린 후에 하지 절단술을 받은 말초 혈관 질환을 지닌 환자로부터 수득하였다. 활성 연조직염, 고름 배출 또는 습성 괴저가 있는 환자는 효모 오염의 높은 위험성으로 인해, 본 연구에 이용되지 않았다. 유사하게, B형 또는 C형 간염을 지닌 환자, 및 HIV를 지닌 환자를 본 연구에서 제외시켰다. 횡절단 후에, 절단된 다리는 즉시 수술대로부터 분리된 멸균 테이블 상에서 동맥의 적합한 견본에 대해 수술실에서 조사되었다. 적합한 것으로 간주된 샘플은 행크의 균형 염 용액 (HBSS; Invitrogen)으로 채워진 컨테이너에 놓여져 처리를 위해 실험실로 옮겨졌다. 멸균 조건 하에, 혈관을 조직 배양 디쉬에서 길이로 개방시키고 EGM-2 배양 배지 (Lonza)에 침지시켰다. 각 혈관의 내막을 세포 스크레이퍼 (TPP, Zurich, Switzerland)로 긁어내고 DMEM으로 세척하였다. 세척으로부터 남겨진 세포 분획을 1620 rpm에서 10분 동안 원심분리시킨 다음, 이것을 래트-꼬리 타입 I 콜라겐-코팅된 6-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 수 일 후에, 성장한 내피 집락을 광 현미경을 통해 볼 수 있었고, 이러한 집락을 클로닝 실린더에 의해 분리하고, 트립신화하고, 중간엽 세포 오염을 방지하기 위해 새로운 6웰 플레이트에 재플레이팅하였다. 정제된 EC를 1-2회 이상 계대시킨 다음, 냉동보존 전에 T-75 조직 배양 플라스크 (TPP)에서 증식시켰다.
PAD 환자의 말초혈로부터 내피 세포의 배양: 각 환자의 말초혈 또는 제대혈로부터 분리된 단핵 세포를 타입 I 래트 꼬리 콜라겐으로 미리-코팅된 6웰 조직 배양 플레이트에 시딩하고 10% FBS, 2% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 완전 내피 성장 배지 (EGM-2)에서 배양하였다. 세포를 37℃, 5% CO2 가습 인큐베이터에 유지시키고, 배지를 2-3주 동안 또는 조약돌-모양 내피 집락이 나타날 때까지 격일로 교환하였다. 집락의 초기 출현 이후, 세포를 6웰 플레이트의 새로운 웰로 옮기고 25-cm2 플라스크에서 85-95% 컨플루언스의 계대로 추가로 계대시켰다. 약 70% 컨플루언스의 3-7회 계대의 PAD 세포를 모든 연구에 이용하였다.
웨스턴 블롯 분석: 세포를 용해 완충제 (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 10% 글리세롤, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 1 mM Na3VO4, 각각 1ug/ml의 아프로티닌 및 류펩틴)에 재현탁시킨 다음 얼음 상에서 20분 동안 인큐베이션시켜 세포 용해물을 제조하였다. 불용성 성분을 12,000 X g에서 15분 동안의 원심분리에 의해 제거하였다. 단백질 농도를 단백질 검정 키트 (Bio-rad)에 의해 결정하였다. 단백질을 4-20% Tris-글리신 미니겔 상에서 전기영동에 의해 분리시킨 다음 immobilon-FL PVDF 막 (Millipore)으로 옮겼다. 차단 완충제에 의해 1시간 동안 실온에서 비특이적 결합을 차단하고 Odyssey 차단 완충제에서 포스포-PYK2 (1:1,000; Cell Signaling) 및 포스포-p130Cas (1:1,000; Cell Signaling)에 대한 일차 항체와 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 블롯을 0.1% Tween20을 함유하는 PBS로 세척한 다음, 항-토끼 항체 (1:10,000; LI-COR)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 면역반응 밴드를 Odyssey 적외선 이미저 (LI-COR)를 이용하여 검출하였다.
RNA 서열 라이브러리 작제 , 시퀀싱 및 분석: 종래에 기재된 대로, 전체 RNA를 Trizol 시약 (Invitrogen)을 이용하여 샘플로부터 분리하고 RNA 품질을 조사하였다32. 종래에 기재된 대로, RNA 서열 라이브러리를 1μg의 고 품질 전체 RNA를 이용하여 생성하고 Illumina HiSeq2000 시퀀서를 이용하여 시퀀싱을 수행하였다32. RNA-서열 분석을 hiPSC-분화 0일, hiPSC-유래된 세포-분화 3일, hiPS-유래된 ECFC-유사 세포-분화 12일, hES-유래된 ECFC-유사 세포 및 CB-ECFC로부터 분리된 전체 RNA에 대해 수행하였다. 생성된 서열 판독을 디폴트 파라미터를 지닌 TopHat을 이용하여 인간 유전체 (hg18)에 대해 맵핑하고, RefSeq (June 2010) 전사체 수준 (FPKM)을 CuffLinks를 이용하여 정량하였다. 그 후 RNA-seq 데이터로부터 heatmap.2의 R 통계적 소프트웨어 패키지를 이용하여 적색-내지-녹색 눈금을 이용한 플롯팅에 의해 개별 배엽층 및 계통에 속하는 선택 전사체의 히트맵을 분석하였다.
CB-ECFC에 비해 hiPS-ECFC-유사 세포에서 차등적으로 발현된 유전자를 검출하기 위한 전사체 발현의 추가 분석은 (1) STAR (Dobin et al. (2012) Bioinformatics, doi:10.1093/bioinformatics/bts635)를 이용한 판독 맵핑, (2) HTseq (Anders et al. (2014) Bioinformatics, doi: 10.1093/bioinformatics/btu638)를 이용한 발현 추정, 및 (3) DESeq (Anders and Huber (2010) Genome Biology 11:R106)를 이용한 차이 분석을 포함하였다. 먼저 RNA-Seq 판독을 특이적 유전자 모델, 즉 유전체 상의 엑손 및 연접 부위의 위치에 기반하여 참조 유전체에 맵핑하였다. STAR는 그 입력 데이터로서 참조 유전체, GTF 파일, 및 RNA-Seq 판독을 이용하고, 공지된 연접 (공지된 아이소형에서의 연접)을 검출하고, 정준 연접 (공지된 엑손 사이의 연접), 비-정준 스플라이스 및 키메라 전사체, 예컨대 융합물의 새로운 검출을 위한 서열을 저장하기 위해 압축되지 않은 접미사 어레이를 이용한다. 구체적으로, STAR 2.4.0을 Ensembl version 70 유전자 모델을 이용하여 Human Genome GRCH37에 따라 진행시켰다. 맵핑 결과에 기반하여, HTseq 0.6.1을 이용하여 그룹 2 (hiPSC-유래된 세포 D3 분화), 3 (hiPSC-유래된 ECFC-유사 세포), 및 4 (CB-ECFC)에서 발현 값으로서 각 유전자와 중복된 맵핑의 수를 계수하였다. 일단 판독 계수를 수득한 후에, 그룹 2에서는 발현되지 않았지만 적어도 그룹 3 또는 4에서 발현된 유전자가 고려되었다. 그 후 DESeq를 이용하여 이러한 후보로부터 차등적 발현된 유전자를 검출하였다. DESeq 모델에서 샘플에서의 데이터를 전통적인 Poisson 모델 (즉, 변동이 과소평가될 수 있음)에서의 과확산 문제를 해결하기 위한 음이항 (NB) 분포를 통해 계수하였다. DESeq는 또한 데이터 피팅을 개선시키기 위해 다른 그룹으로부터의 여러 모델을 포함하므로 심지어 복제 수가 높지 않고 (이 경우에 3회 복제), 모델 추정은 여전히 차이를 검출하기에 강력하다.
통계적 분석: 모든 실험은 삼중으로 ≥3회 수행되었고 데이터는 통계적 비교를 위해 평균 값 ± SD로서 표시된다. 95% 신뢰 구간을 지닌 분석력을 이용하여 통계적으로 유의한 결과를 수득하는데 필요한 샘플 크기를 계산하였다. 사용된 샘플링 수는 정상 분포를 제공하였다. 차이의 유의성은 투 테일드 스튜던트 t-테스트에 의해 평가되었다.
실시예 2: 종래 기술의 프로토콜을 이용하여 생성된 hES 및 hiPS - 유래된 EC는 제대혈 ECFC의 특성이 결여되어 있다.
인간 내피 세포는 인간 다능성 줄기 세포로부터 OP9 기질 세포와의 공동-배양을 통해22 , 25, 30, 31 또는 배양체 (EB) 형성을 통해23 , 24, 26-29 사전에 유래되었고 이어서 내피 세포 분화를 촉진하기 위해 다양한 성장 인자 및/또는 수용체 신호전달 경로 억제제가 적용되었다.
본 연구에서, hES 또는 hiPS 세포는 OP9 공동-배양으로 또는 EB 조건 하에 1주일 동안 분화된 다음 내피 배지에서 세포가 증식되었다 (각각 도 1a 및 2a).
OP9 공동-배양에 의한 분화 (도 1): 8일에 OP9-공동-배양 분화된 세포는 내피 유사 형태를 갖는 세포 부분을 나타내었다 (도 1a 상부 패널). 분리 및 내피 배양 배지에서의 배양시, OP9 공동-배양 분화된 세포는 초기에 P1에서 내피 조약돌-유사 형태를 나타내었고 (도 1a, 상부 중간 패널) 점진적으로 P4까지 내피 조약돌 형태를 나타내는 소수 세포를 지니고 대부분의 세포가 섬유모세포-유사 외형을 포함하는 세포의 이종성 집단이 되었다 (도 1a, 하부 중간 패널). P4에서의 세포는 CD31, CD144, 및 CD146 발현의 이종성 패턴을 포함하였고, 세포의 일부만이 이러한 항원의 각각을 발현시켰다 (도 1b). Matrigel™ 상에 플레이팅시, OP9-공동-배양된 세포는 몇 개의 큰 가지를 지닌 혈관-유사 네트워크를 형성하였다 (도 1c). 종래에 기재된 대로, P3 또는 P4에, 단일 세포를 클론 증식 가능성 분석을 위해 플레이팅하고 분열되지 않았거나 분열되어 2-50개 (EC 클러스터), 51-500개 (낮은 증식 가능성 EC; LPP-ECFC), 501-2000개 (LPP-EC), 또는 ≥2000개 세포 (높은 증식 가능성-ECFC; HPP-EC)의 집락을 형성하는 단일 세포로서 결과를 채점하였다1 , 2. OP9 공동-배양된 hES-유래된 클로닝된 세포에 의해 형성된 HPP-EC 및 LPP-EC 집락의 분포 패턴은 CB-ECFC 클론에 의해 나타난 분포 패턴과 현저하게 상이하였다 (도 1d).
OP9 공동-배양 세포로부터 유래된 EC의 2% 미만은 HPP-EC를 발생시키고, 사실상, OP9 공동-배양 유래된 EC의 대부분은 분열되지 않았거나 EC 클러스터를 발생시키지 않았다 (도 1d). EC 집락 형성의 이러한 패턴은 CB-ECFC로부터 유래된 단일 EC에 의해 나타난 패턴과 현저하게 상이하였다 (도 1d). OP9 공동-배양 유래된 EC의 증식은 복제성 노화로 인해 P7을 넘어서는 불가능했다 (도 1e). 추가로, P5에서의 EC는 이식시 생체내 인간 혈관을 발생하는데 실패했다.
EB -분화된 세포 (도 2): 분리 및 내피 배양 배지에서 배양시 KDR+NRP-1+ 세포는 세포 형태의 이종성 집단을 나타내었고, 단지 세포 일부만이 내피 특징을 나타내었다 (도 2a, 상부 중간 패널). 추가 증식시 (P4) 이러한 세포는 섬유모세포-유사 외형을 지니고 내피 조약돌 형태를 거의 갖지 않는 세포를 주로 포함하였다 (도 2a, 하부 중간 패널). hiPS 및 hES 둘 모두에서 유래된 EC 세포에서, CD31, CD144 및 CD146 발현의 이종성 패턴은 이러한 항원의 각각을 발현시키는 세포의 일부에서만 나타났고 (도 2b) EB-배양된 세포는 다수의 더 작은 불완전 발아-유사 가지를 지닌 혈관-유사 네트워크를 형성하였다 (도 2c). 종래에 기재된 대로, P3 또는 P4에, 단일 세포를 클론 증식 가능성 분석을 위해 플레이팅하고 분열되지 않았거나 분열되어 2-50개 (EC 클러스터), 51-500개 (낮은 증식 가능성 EC; LPP-ECFC), 501-2000개 (LPP-EC), 또는 ≥2000개 세포 (높은 증식 가능성-ECFC; HPP-EC)의 집락을 형성하는 단일 세포로서 결과를 채점하였다1 , 2. EB-기반 hES-유래된 세포에 의해 형성된 HPP-EC 및 LPP-EC 유래된 집락의 분포 패턴은 CB-ECFC 클론에 의해 나타난 분포 패턴과 현저하게 상이하였다. EB-유래된 세포로부터 유래된 EC의 2% 미만은 HPP-EC를 발생시키고, 사실상, EB-유래된 EC의 대부분은 분열되지 않았거나 EC 클러스터를 발생시키지 않았다 (도 2d). EC 집락 형성의 이러한 패턴은 CB-ECFC로부터 유래된 단일 내피 세포에 의해 나타난 패턴과 현저하게 상이하였다 (도 2d). EB-유래된 내피 세포의 증식은 복제성 노화로 인해 P7을 넘어서는 불가능했다 (도 2e). 추가로, P5에서의 내피 세포는 이식시 생체내 인간 혈관을 발생하는데 실패했다.
외인성 TGF -β 억제제의 존재 하에 분화된 세포 (도 3): 초기 EB 형성에 이어 2D 부착 세포 배양 (성장 인자 첨가됨)을 포함하는 대안적인 2-단계 내피 분화 프로토콜을 hES 및/또는 hiPS 세포가 ECFC-유사 특성을 지닌 세포를 생성하는데 사용할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 시험하였다. 발생 동안 내피 세포의 출현33 , 34 및 hES 세포의 내피 계통 분화23에 있어서 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 신호전달 경로의 공지된 중요성에 기반하여, 뉴로필린-1 (NRP-1)을 ECFC-유사 세포의 출현을 확인하기 위한 마커로서 이용하였다. NRP-1은 VEGF 공동-수용체이고 내피 세포, 혈관 평활근 세포 및 림프구를 포함하는 다양한 조직에서 발현되는 Semaphorin 3A 결합 다기능성 단백질이다35. 혈관형성에 있어서 NRP-1의 역할은 알려져 있지 않지만, 마우스에서 NRP-1 및 NRP-2의 중복 녹아웃은 VEGFR-2 녹아웃과 유사한 배아 치사 표현형을 발생시킨다35, 36. hES (H9 주) 및 hiPS 세포-유래된 (DF19-9-11T, FCB-iPS-1 및 FCB-iPS-2) EB가 4일 동안 현탁 배양액에서 생성되었고, 이들을 Matrigel™ 코팅된 디쉬에 10일 동안 시딩하였다24 ` (도 3a, b). 이러한 프로토콜은 7일에 시작하는 TGFβ 억제에 분화하는 내피 세포의 지속적인 노출을 필요로 하였다 (도 3a). EB (도 3b, 왼쪽에서 두 번째 패널)가 4일에 Matrigel™ 코팅된 플레이트에 부착될 때, 2D 배양액의 EB-유래된 세포는 부착되고 성장하여 내피-유사 형태를 지닌 세포 부분을 형성하였고 (6일 및 9일에) 14일에 컨플루언트되었다.
NRP-1 및 CD31을 공동-발현시키는 세포 (NRP-1+CD31+ 세포)는 3일에 출현하였고 (0.17%) 경시적으로 증가하여, 14일에 최고점이었다 (1.6%)(도 3c). 분류된 세포의 상이한 서브세트를 후속하여 TGF-β 억제제 (10 μM SB431542)가 보충된 내피 성장 (EGM-2) 배지에서 2주 동안 배양시켰는데, TGF-β 억제가 hES 또는 hiPS 세포로부터 내피 계통 분화를 촉진시키고 세포가 중간엽 세포로 전이되는 것을 방지한다고 보고되었기 때문이다24. NRP-1+CD31+ 서브세트는 CB-ECFC에 의해 나타난 것과 유사한 특징적인 내피 조약돌 형태를 갖는 세포를 발생시켰다 (도 3d, 상부 패널). 대부분의 hES-유래된 세포 서브세트가 Matrigel™에 플레이팅시 불완전 모세관-유사 네트워크를 형성하였으나, NRP-1+CD31+ 세포는 CB-유래된 ECFC에 의해 나타난 것과 유사한 완전 구조를 형성하였다 (도 3d). NRP-1+CD31-, NRP-1-CD31+ 및 CD144+CD146+ 서브세트에 의해 형성된 HPP-EC 및 LPP-EC 집락의 분포 패턴은 CB-ECFC에 의해 나타난 패턴과 현저하게 상이하였다 (도 3e). 그러나, 단일 NRP-1+CD31+ 세포에 의해 형성된 HPP-EC 및 LPP-EC 집락의 분포 패턴은 CB-ECFC 클론에 의해 나타난 패턴과 유사하였다 (도 3e). 클론 수준에서, 개별 NRP-1+CD31+ 플레이팅된 세포의 전부가 분열되었고 다수의 클론 (37%)이 HPP-EC를 형성하였으나, 소수의 NRP-1+CD31- 또는 NRP-1-CD31+ 세포가 HPP-EC를 형성하였다 (도 3e). 따라서, 내피 분화를 겪는 hES-유래된 세포에서 NRP-1 및 CD31의 공동-발현 (EB 플러스 2D 프로토콜)은 TGF-β 억제의 지속적인 존재 하에 배양된 경우에만 (TGF-β 억제제의 제거는 종래에 기재된 대로 감소된 증식 가능성, 내피 형태의 손실, 및 알파-평활근 액틴[α-SMA]의 증가된 발현과 관련되었다24) 높은 클론 증식 가능성 및 혈관형성 활성을 지닌 EC를 발생시키는 선조 서브세트를 확인하였다.
요약해 보면, 상기 시험된 모든 방법은 제대혈 ECFC와 유사한 특성을 지닌 안정한 EC의 출현을 촉진하는데 실패하였다.
실시예 3: hES 및 hiPS 세포 둘 모두로부터 안정한 NRP -1 + CD31 + ECFC -유사 세포를 생성하기 위한 프로토콜.
본 발명자들은 ECFC-유사 특성을 지닌 NRP-1+CD31+ 세포의 생산을 촉진하지만, TGF-β 억제를 필요로 하지 않는 내피 계통 분화 프로토콜을 개발하고자 하였고, 상기 생산은 임상적으로 유용한 부피의 세포로의 세포의 증식을 지지하기에 충분히 크다.
인간 다능성 세포를 Matrigel™-코팅된 플레이트의 mTeSR1 배지에서 2일 동안 배양하였다37. 내피 계통 분화를 유지하기 위해, mTeSR1 배지를 10 ng/mL 액티빈-A, BMP4, VEGF165 및 FGF-2가 보충된 Stemline II 배지로 분화 0일에 교체하였다. 다음 날 조직 배양 배지를 CD31 및 NRP-1 항원을 공동-발현시키는 세포에 대해 배양액을 분석한 12일까지 선택된 성장 인자가 보충된 신선한 Stemline II 배지로 교체하였다 (도 4a). 이러한 프로토콜을 이용하여, hiPS 및 hES 세포로부터 각각 평균 4.5% 및 2% NRP-1+CD31+ 세포를 회수할 수 있었다. NRP-1+CD31+ 세포는 7일 배양시 NRP-1-CD31+ 세포에 비해 60% 더 많은 내피 집락 (도 4b, 좌측 패널) 및 15배 더 많은 전체 내피 세포 (도 4b, 우측 패널)를 발생시켰다. NRP-1+CD31+ 자손은 동종이었고 조약돌 외형을 나타낸 반면 (도 4c 및 4f), 이종성 세포 집단은 NRP-1-CD31+ 세포로부터 수득된 집락 내에서 발견되었다 (도 6a). NRP-1+CD31+ 세포에 의해 개시된 7일 증식 배양액에서 NRP-1-CD31+ 세포에 비해 전체 세포 수에서의 현저한 (15배) 증가가 발견되었다 (도 4b). 추가로, NRP-1+CD31+ 분류된 분획으로부터 성장한 세포는 CD31 및 NRP-1의 표면 공동-발현 (도 4d) 및 CD144의 균일한 발현을 나타내었으나, NRP-1-CD31+ 자손 (도 6b)과 대조적으로 α-SMA의 발현 (도 4d)은 완전히 결여되어 있었다. NRP-1+CD31+ 세포 서브세트의 2%만이 분열에 실패하였고 48%는 제대혈 ECFC와 매우 유사한 분포 패턴을 지니지만 (도 4e) NRP-1-CD31+ 서브세트와 크게 상이한 HPP-ECFC를 형성하였다 (도 4e 및 도 6e). 더욱이, Matrigel™에 플레이팅시, NRP-1+CD31+ 세포는 NRP-1-CD31+ 세포가 Matrigel™에 플레이팅시 형성하지 않았던 (도 6d) 고도로 분지된 모세관-유사 구조를 형성하였다 (도 4f).
소구획식 콜라겐 겔에 배치된 ECFC (둘 모두의 CB-ECFC 및 hiPS-유래된 ECFC-유사 세포)를 마취 하에 면역결핍 (NOD/SCID) 마우스의 피하 주머니에 이식하였다. 이식한 지 14일 후에 마우스를 인도적으로 안락사시킨 후에 겔을 회수하였다. 종래 기재된 대로, 겔을 고정하고, 투과시키고, 마우스 숙주 세포와 교차 반응하지 않는 특이적 항-인간 CD31 항체로 염색하였다1 , 49. hES 및 hiPS-유래된 NRP-1+CD31+ 세포는 종래에 기재된 대로 CB-ECFC와 유사한 숙주 뮤린 혈관과 접합된 (도 4g 및 f) 강건한 생체내 혈관 형성 능력을 지니는 EC를 생성하였다1. NRP-1+CD31+ 세포는 24마리 초과의 동물에서 면역결핍 마우스로 이식한 지 3개월이 넘은 후에 기형종 형성을 유도하지 않았다 (데이터는 도시되지 않음). 그러나, NRP-1-CD31+ 세포는 기능성 인간 혈관을 생성하지 못했다 (도 6c). 총괄적으로, ECFC-유사 세포 프로토콜 12일-유래된 NRP-1+CD31+ 세포는 실질적으로 순수한 조약돌 형태를 나타내었고, 전형적인 내피 항원을 발현시켰고, Matrigel™ 상에서 시험관내 모세관-유사 네트워크를 형성하였고, 높은 클론 증식 가능성을 나타내었고, 숙주 뮤린 적혈구로 채워진 강건한 생체내 인간 혈관을 생성하였다. 따라서, 12일 분화된 hES 및 hiPS 유래된 NRP-1+CD31+ 세포 분획은 CB-ECFC와 유사한 수많은 특성을 지니는 내피 세포를 생성하였다. 그러한 세포를 본원에서 ECFC-유사 세포로서 언급한다.
1일 분화된 hES 및 hiPS 세포는 CD31 및 NRP-1을 공동-발현시키지 않았지만 (도 5), NRP-1+CD31+ 세포의 비율은 점진적으로 증가하여 배양 12일에 최고 수준에 도달한 것이 확인되었다 (도 5; 도 7a). ECFC 분화를 겪은 hES 및 hiPS 세포 둘 모두는 9일 및 12일에 조약돌 유사 형태의 출현을 나타내었고 (도 7b 및 도 8a 및 9a) NRP-1+CD31+ 세포의 집락은 다른 분화된 세포 중에 출현한 것이 관찰되었다 (도 8b 및 9b). CD144 및 CD31을 공동-발현시키는 세포의 최고 비율은 12일에 유래된 NRP-1+CD31+ 세포에서 나타났다 (도 7c; 도 9d). 6일-유래된 세포는 Matrigel™에 플레이팅시 불완전 모세관-유사 네트워크를 형성하였다 (도 9e). 9일 및 12일-유래된 세포는 완전 모세관-유사 네트워크를 형성하였다 (도 9e). 요약하면, 12일에 유래된 NRP-1+CD31+ EC는 중간엽 항원 α-SMA의 발현 없이 전형적인 내피 항원의 공동-발현의 최고 빈도를 나타내는 ECFC-유사 세포를 발생시켰고 (도 8 및 9) 추가 연구에 이용되었다.
두 추가 모델을 이용하여 상기 피하 이식 방법 외에 hiPSC-ECFC-유사 세포의 내피 기능을 시험하였다. 하기 3개의 연구 그룹을 비교하였다: (i) hiPSC-ECFC-유사 세포, (ii) hiPSC-배양체-유래된 TGFβ-억제된 CD144+ 내피 세포 (hiPSC-EBT-CD144+ EC) (James et al. 2010) 및 (iii) CB-ECFC (Yoder et al. 2007; and Ingram et al. 2004).
첫 번째 모델에서, 높은 산소 농도에 노출된 신생 마우스에서 혈관 형성의 구제 및 신생혈관 뭉치의 감소를 측정하였다 (Medina et al. 2010). 신생 새끼에서 산소-유도된 망막병증 (OIR)은 망막 혈관의 저산소증-유도된 손실에 이어 과-충만 망막 저산소 반응에 의해 초래된다. 손상후 무혈관 부위의 현저한 감소가 hiPSC-ECFC-유사 세포를 수용한 망막에서 발생하였으나 (≥36% 감소; **P < 0.01) hiPSC-EBT-CD144+ EC를 수용한 망막에서는 발생하지 않았다 (무혈관 부위에서 ≤14% 감소; P = 유의하지 않음 (ns)) (도 10a, b). 또한, hiPSC-ECFC-유사 세포만이 망막앞 신생혈관 뭉치를 현저하게 감소시켰다 (도 10c; hiPSC-EBT-CD144+ EC 결과는 도시되지 않음). 세포를 Qdots 655로 미리 표지시키고 세포 전달 72시간 후에 이미지화하여, hiPSC-ECFC-유사 세포가 hiPSC-EBT-CD144+ EC에 비해 숙주 망막 조직에 높은 수 및 더 넓은 분포로 통합되었음을 나타내었다 (도 11a). hiPSC-ECFC-유사 세포는 얕은 망막 얼기에서 혈관 튜브 구조를 형성하는 것으로 나타났으나 hiPSC-EBT-CD144+ EC는 그렇지 않았다 (도 11b).
누드 마우스에서 뒷다리 대퇴 혈관 제거의 두 번째 모델이 또한 연구되었다24. 허혈 사지 및 혈류의 구제는 hiPSC-EBT-CD144+ EC에 비해 hiPSC-ECFC-유사 세포에 의해 현저하게 개선되었다 (P < 0.05; 도 10d-f 및 데이터는 도시되지 않음). 이러한 검정에서, hiPSC-ECFC-유사 세포는 CB-ECFC와 유사하게 기능하였다.
일차 세포는 무기한 증식하지 않으나 대신 장기간 시험관내 배양 후에 노화를 겪는다38. hiPS-ECFC-유사 세포 및 CB-ECFC 둘 모두를 전형적인 내피 세포 특징의 손실 없이 P18까지 증식시킬 수 있었다 (도 12a, b). 인간 iPS-ECFC-유사 세포는 CB-ECFC 대조군과 유사한 동종 조약돌 내피 단층을 나타내었다 (도 12a). CB-ECFC 및 hiPS-ECFC-유사 세포는 P18까지 성공적으로 증식하였다 (도 12b). hiPS-ECFC-유사 세포의 3%만이 P7에 세포 노화 마커 β-갈락토시다제의 발현을 나타내었고 80% 이상의 세포는 P18까지 복제성 노화를 나타내었는데, 이는 CB-ECFC 대조군 세포에 의해 나타난 노화 프로필과 유사한 것이다 (도 12c). 중요하게는, hiPS-ECFC-유사 및 CB-ECFC의 대부분이 노화되어 P18에 치사성 일차 세포의 특징을 나타내는 동안38, 이들은 여전히 내피 조약돌 형태 및 내피 항원 CD31, NRP-1 및 CD144의 발현을 유지하였으나 α-SMA 발현은 유지하지 않았다 (α-SMA에 대한 발현은 이러한 세포에 전혀 존재하지 않는다; 도 12d). 따라서, hiPS-유래된 ECFC-유사 세포는 장기간 증식 배양을 통틀어 안정한 내피 표현형을 유지하였다.
실시예 4: NRP -1 + CD31 + ECFC -유사 세포는 CB- ECFC에 비해 유사성 및 차이를 갖는 분자 프로필을 나타낸다.
다양한 EC 서브세트의 더욱 복잡한 분자 비교를 수행하기 위해, 전체 전사체(transcriptome) 시퀀싱 (RNA-seq) 분석을 수행하여 종래에 기재된 대로 i) 분화되지 않은 hiPS 세포 (hiPS-0일); ii) 3일-분화된 hiPS 세포 (hiPS-3일); iii) 12일 hiPS-유래된 NRP-1+CD31+ ECFC-유사 세포 (hiPS-ECFC-유사 세포); iv) 12일 hES-유래된 NRP-1+CD31+ ECFC-유사 세포 (hES-ECFC-유사 세포); 및 v) CB-ECFC의 분자 프로필을 확인하고 비교하였다32.
인간 iPS-ECFC-유사 세포 및 hES-ECFC-유사 세포는 CB-ECFC에 의해 나타난 것과 유사한 상대적 유전자 발편 프로필을 나타내었다 (도 13a). 인간 iPS-0일 세포는 분화된 세포에서 전형적으로 보여지는 전사체 발현이 제한된 다능성 세포의 전사체 프로필 특징을 나타내었다 (도 13a). 그러나, hiPS-3일 세포는 여러 계통 특이적 유전자의 증가된 발현을 나타내었는데 (원시선, 내배엽, 중배엽, 조혈, 및 연골-골-지방생성 유전자), 이는 다능성 세포 분화의 개시를 나타낸다 (도 13a). 둘 모두의 hiPS- 및 hES-유래된 ECFC-유사 세포는 다능성 및 비-내피 계통 특이적 유전자 전사체에 대해 감소된 발현을 나타내었으나 (도 13a), CB-ECFC와 유사한 내피 유전자 전사체에 대해서는 증가된 발현을 나타내었다 (도 13a 및 b)
전사체 발현에서의 다양한 차이가 또한 제대혈-유래된 ECFC에 비해 hiPS-유래된 ECFC-유사 세포에서 확인되었다 (표 2). 예를 들어, 하기 유전자는 제대혈-유래된 ECFC에 비해 hiPS-유래된 ECFC-유사 세포에서 과발현되었다: 가상 단백질 LOC100132288, CUB 및 Sushi 다중 도메인 1, 림프모양-제한된 막 단백질, 아릴아세트아미드 데아세틸라제 (에스테라제), 폴리스타틴-유사 5, ENSG00000215262, 가상 LOC84856, 구아닐레이트 사이클라제 활성화제 2B (유로구아닐린), 케라틴 75, 섬유모세포 활성화 단백질, 알파 (FAP), 염색체 22 개방형 해독틀 34, 가스더민(gasdermin) C, ENSG00000222954, 하이드록시스테로이드 (11-베타) 데하이드로게나제 1, 인돌아민 2,3-디옥시게나제 2 및 Zic 패밀리 구성원 4. 하기 유전자는 제대혈-유래된 ECFC에 비해 hiPS 유래된 ECFC-유사 세포에서 하향발현되었다: 수용체 (화학감각) 전달체 단백질 4, 염색체 X 개방형 해독틀 61, 아실-CoA 합성효소 중간쇄 패밀리 구성원 2A, 세르핀 펩티다제 억제제, 클레드(clade) A (알파-1 항프로테이나제, 항트립신), 구성원 3, ENSG00000218052, 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 23, 코일드-코일 도메인 함유 48 및 RAS (RAD 및 GEM)-유사 GTP-결합 1.
표 2: CB-ECFC에 비해 hiPS ECFC-유사 세포에서 차등적으로 발현된 전사체.
Figure pct00002
실시예 5: NRP -1은 ECFC -유사 세포 출현 동안 필수적인 KDR - 매개된 신호전달을 증강시킨다.
심혈관 발생 및 혈관형성에서 NRP-1의 역할은 잘 알려져 있지만35 , 36, 39, NRP-1이 EC에서 기능하는 메커니즘은 충분히 이해되어 있지 않다. EC 표면에 존재하는 NRP-1은 공동-수용체로서 VEGF165에 결합하고 VEGF 수용체 2 (KDR)와 신호전달 복합체를 형성하는 것으로 제안되어 왔다40. NRP-1은 정의되지 않은 고유한 키나제 활성을 갖는 소형 세포질 도메인을 갖는다. KDR은 고유한 키나제 활성을 지니고 NRP-1-VEGF165-KDR 신호전달 복합체의 형성은 VEGF-KDR-매개된 신호전달 활성 및 생물학적 기능을 향상시킨다40 - 43. NRP-1은 KDR을 통해 VEGF165 신호전달을 매개하는데 반드시 필요한 것으로 보이지 않지만42 -44, 최대 KDR 활성 및/또는 KDR 티로신 인산화35, 40-43에 필요하고 내피 세포에서 p130Cas/Pyk2 활성화를 통해 VEGF-KDR 신호전달을 선택적으로 매개하는 것이 명백하게 밝혀졌다43 , 44. 다이머 Fc-NRP-1, 막 NRP-1에 대한 대용물45, 및 VEGF에 결합하는 NRP-1을 차단하는 특이적 모노클로날 항체(NRP-1-B)42는 각각 NRP-1-매개된 활성을 향상시키고 차단하는데 이용되어 왔다. Fc-NRP-1는 천연 올리고머화된 막 NRP-1에 대한 프록시로서 작용하고45, NRP-1-B는 NRP-1에 대한 VEGF165 결합을 특이적으로 차단한다42. 본원에서 제공된 데이터는 6일 분화된 hiPS 세포가 KDR 발현에서 풍부한 상향조절을 나타내었지만 제한된 NRP-1 발현을 나타냄을 제안하였기 때문에 (도 15b로부터의 삽입), 본 발명자들은 NRP-1 활성을 증대시키는 것이 KDR 활성화를 향상시킬 수 있다는 가설을 세웠다. 보고된 대로, 재현가능한 결과 (데이터는 도시되지 않음 및 도 15a)를 일관되게 제공한 처리에 대한 구체적인 용량 (Fc-NRP-1 다이머의 경우 3.3 nM 및 NRP-1-B의 경우 500ng/mL) 및 시간 길이 (4 내지 6일)를 확인하기 위해 시간 및 용량 반응 실험을 수행하였다42 , 45. 4일 처리 후에, FC-NRP-1 다이머 처리된 세포에서 NRP-1+CD31+ 세포의 생성이 현저하게 증가하였고 (도 15b) 항체 NRP-1-B의 차단이 NRP-1+CD31+ 세포의 생성을 현저하게 감소시켰음이 확인되었다 (도 15b). 이러한 효과는 12일에 추가로 강력해졌다 (도 15b).
도 15c를 참조하면, 상부 블롯에서, ECFC-유사 세포 분화를 겪은 hiPS 세포를 도 13a에 기재된 대로 Fc-대조군 (3.3 nM), Fc-NRP-1 다이머 (3.3 nM) 또는 NRP-1-B (500 ng/mL)로 처리하였다. 세포를 5.5시간 동안 굶기고 VEGF165 (30 ng/mL)로 5분 동안 자극하였다. 세포 용해물을 포스포-KDR 및 전체 KDR에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석으로 처리하였다. 화살표는 NRP-1 다이머 및 NRP-1-B 처리된 hiPS 세포에서 포스포-KDR의 발현을 나타낸다. 하부 패널에서 전체 KDR 수준은 각 레인에 묘사된다.
KDR 인산화는 VEGF 자극된 그룹에서 관찰되었고 Fc-NRP-1 다이머 처리는 대조군 처리된 세포에 비해 KDR의 인산화를 증가시켰다. 그러나, 감소된 인산화가 NRP-1-B 처리된 세포에서 관찰되었다 (n = 3). 하부 블롯에서, ECFC-유사 세포 분화를 겪은 hiPS 세포를 지시된 농도의 Fc-대조군, Fc-NRP-1 다이머 또는 NRP-1-B로 처리하였다. 세포를 굶기고 VEGF165 (30 ng/mL)로 5분 동안 자극하였다. 세포 용해물을 포스포-p130Cas, 포스포-Pyk2 및 전체 Pyk2에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석으로 처리하였다. 상부 패널 화살표는 포스포-p130Cas의 발현을 나타내고 중간 패널 화살표는 포스포-Pyk2 발현을 나타낸다; 하부 패널은 Fc-대조군 (C; 3.3 nM), Fc-NRP-1 다이머 및 NRP-1-B 처리된 iPS 세포에서 총 pyk2를 나타낸다. 하부 패널은 각 레인의 전체 KDR 수준을 나타낸다. 증가된 P-130Cas 및 Pyk2 인산화는 대조군 처리된 세포에 비해 Fc-NRP-1 다이머-처리된 그룹에서 용량 의존적인 방식으로 관찰되었다. 그러나, 대조군 처리된 세포에 비해 NRP-1-B 처리된 세포에서 감소된 P-130Cas 및 Pyk2 인산화가 관찰되었다. 본 발명자들은 또한 Fc-NRP-1 다이머 처리된 세포에서 증가된 KDR 활성화 및 KDR의 NRP-1-매개된 활성화에 의해 특이적으로 활성화되는 것으로 공지된40, 44 다운스트림 분자인 p130Cas의 활성화를 발견하였다 (도 15c). 반대로, NRP-1-B 처리된 세포는 감소된 KDR 인산화 및 다운스트림 분자의 감소된 활성화를 나타내었다 (도 15c). 이러한 데이터는 NRP-1이 KDR 신호전달을 증강시킴에 의해 인간 다능성 줄기 세포로부터 ECFC-유사 세포의 생성을 향상시킴을 제안하였다.
다음으로, 본 발명자들은 또한 NRP-1이 배양된 ECFC-유사 세포의 증식 가능성의 유지에 관여할 수 있다는 가설을 세웠다. NRP-1 발현은 후기 계대 hiPS-ECFC-유사 세포에서 점진적으로 하향조절되고 감소된 총 증식 가능성과 관련됨이 발견되었다 (도 16a 및 b). 후기 계대 (P14) EC에서 KDR 발현의 분석은 40-50% KDR 발현을 나타내었다 (도 16c). 그러나, Fc-NRP-1의 존재 하에 7일 동안 배양시, P14 EC는 대조군 및 NRP-1-B 처리된 그룹에 비해 현저하게 증가된 증식을 나타내었지만 β-갈락토시다제 발현 (노화 마커)은 감소되었다 (도 16d-f).
Fc-NRP-1 처리된 P14 EC는 VEGF165를 함유하는 정규 EGM-2 배지 및 VEGF121을 지닌 EGM-2 배지에서 배양되고 대조군, Fc-NRP-1 및 NRP-1-B로 7일 동안 처리된 후기 계대 (P14) hiPS-ECFC-유사 세포에서 보여진 대로, 대조군 처리된 세포에 비해 프로아폽토틱 세포 비율의 현저한 감소를 나타내었다 (도 16g). 7일 후에, 세포를 수집하고, 계수하고, 프로피듐 아이오다이드 및 아넥신 V로 염색하여, 각각의 처리 그룹에서 살아있는 세포, 프로아폽토틱 세포, 및 죽은 세포를 조사하였다. 대조군, Fc-NRP-1 및 NRP-1-B로 처리한 지 7일 후에 VEGF165 및 VEGF121 함유 배지에서 프로아폽토틱 세포의 비율은 VEGF121의 존재 하에 배양된 세포에 비해 VEGF165 함유 배지에서 배양된 세포에서 현저하게 감소되었다.
KDR 활성화에 대한 Fc-NRP-1의 효과는 VEGF165의 존재에 의존적인 것이 확인되었는데, 그 이유는 VEGF121이 Fc-NRP-1 및 KDR을 지닌 P14 ECFC-유사 세포 사이의 상호작용을 촉진하는데 실패하였기 때문이다 (도 16g-i). 따라서, VEGF165를 통한 KDR의 Fc-NRP-1 활성화는 노화에 가까운 hiPS-유래된 ECFC-유사 세포에서 증식의 구제 및 노화 마커의 감소된 발현 및 프로아폽토틱 거동에 있어서 역할을 담당한다.
예비 연구에서, PAD 및 CLI를 지닌 환자로부터 유래된 일차 EC는 낮은 NRP-1 발현 수준을 나타내고, 낮은 클론 증식 가능성을 지니며, 노화 마커를 나타내고, 면역결핍 마우스에 이식시 강건한 생체내 인간 혈관을 형성하지 않음이 확인되었다 (도 17a-g). 그러나, Fc-NRP-1 처리는 PAD 및 CLI를 지닌 환자로부터 분리된 순환 및 상주 동맥-유래된 내피 세포에서 증식, 생존을 촉진시키고, 노화 증거를 적당히 감소시켰다 (도 17h-n). 따라서, 노화에 가까운 후기 계대 hiPS-ECFC-유사 세포 및 환자-유래된 PAD-EC의 Fc-NRP-1 처리는 증식 가능성을 증가시키고, 아폽토시스를 감소시키고, VEGF165 의존적인 양상으로 노화 마커를 감소시킨다.
실시예 6: 논의.
상기 실시예에서, 본원에서 ECFC-유사 세포로서 언급되는, 제대혈 ECFC-유사 특성을 지니는 EC의 실질적으로 순수하고 안정한 집단을 재현가능하게 유도하고 분리시키기 위한 방법이 제공되고 시험되었다.
ECFC -유사 세포는 CB- ECFC와 유사한 특성을 지닌다 : NRP-1+CD31+ 세포는 특징적인 조약돌 외형을 지닌 동종 단층을 형성하고, 높은 클론 증식 가능성을 나타내며, Matrigel™ 상에서 배양시 완전 모세관 유사 구조를 형성함에 의해 혈관형성 거동을 입증하고, 공동-이식 세포의 부재 하에 면역결핍 마우스에 이식시 강건한 생체내 접합 혈관을 형성하였다. 이러한 인간 다능성 줄기 세포-유래된 ECFC-유사 세포는 안정하고, 장기적인 배양 동안 (18회 계대) 비-내피 세포로 전이되지 않으며, 단일 출발 다능성 세포로부터 3개월 이내에 1조개 이상의 EC로 증식할 수 있었다 (도 18). 일차 CB-ECFC와 달리, 본원에 제공된 ECFC-유사 세포는 안정한 ECFC 특징을 나타내고, 다양한 임상 적용에 사용하기 적합한 세포 부피로 증식될 가능성이 있다. 추가로, 본원에 제공된 ECFC-유사 세포는, 예를 들어, 이들이 환자로부터의 iPSC에서 유래되는 경우, 환자-특이적일 수 있다.
ECFC-유사 세포는 공지된 프로토콜을 이용하여 시험관내 생성된 EC와 상이한 특성을 지닌다: ECFC-유사 세포로부터 매우 효율적인 기능성 EC의 생산량 (즉, 3개월 이내에 1조개 이상의 EC)은 다른 공개된 프로토콜을 이용하여 hPSC로부터 유래된 0.622, 7.424 및 11.646 EC의 보고된 수율과 대조적이다. 추가로, 다른 공개된 프로토콜을 이용하여 hPSC로부터 유래된 EC는 공동-이식 세포의 부재 하에 생체내 이식시 혈관을 형성하는 능력을 갖지 않는다.
KDR 및 이의 다운스트림 신호전달 분자의 NRP-1-VEGF165-KDR-매개된 활성화는 hPSC로부터 ECFC-유사 세포의 출현 및 유도, 및 후기 계대, 노화에 가까운 hPSC-유래된 ECFC-유사 세포 및 환자-유래된 노화에 가까운 ECFC의 생존 및 증식 가능성을 향상시키기 위한 메커니즘임이 발견되었다. 본원에 제공된 결과는 심혈관 질환을 지닌 환자를 치료하기 위한 요법으로서 환자-유래된 ECFC-유사 세포의 사용을 고려하는 것이 가능함을 제안한다.
비록 본 발명이 구체적인 특정 구현예를 참조하여 기재되었으나, 이의 다양한 변형이 여기에 첨부된 청구범위에 개요된 본 발명의 목적 및 범위를 벗어나지 않으며 당업자에게 자명할 것이다. 본원에 제공된 임의의 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 포함되며 어떠한 방식으로든 본 발명을 제한하려는 것이 아니다. 본원에 제공된 모든 도면은 본 발명의 다양한 양태를 예시하려는 목적이며 일정한 비례로 그려지거나 어떠한 방식으로든 본 발명을 제한하려는 것이 아니다. 본원에 인용된 모든 종래 기술의 기재는 그 전문이 본원에 참조로서 포함된다.
참조문헌 목록
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007

Claims (32)

  1. 인간 다능성 줄기 세포로부터 인간 내피 집락 형성 세포-유사 세포 (ECFC-유사 세포)의 분리된 집단을 생성하는 방법으로서, 상기 방법이,
    a) 다능성 줄기 세포를 제공하는 단계;
    b) 다능성 줄기 세포가 내피 분화를 겪도록 유도하는 단계로서, 상기 유도가,
    i) 다능성 줄기 세포를 약 24시간 동안 액티빈 A, BMP-4, VEGF 및 FGF-2를 포함하는 내피 분화 배지에서 배양시키고;
    ii) 단계 i)의 배지를 그 후 대략 하루 또는 이틀마다 BMP-4, VEGF 및 FGF-2를 포함하는 내피 분화 배지로 대체시키는 것을 포함하는, 단계; 및
    c) 분화를 겪도록 유도된 세포로부터 ECFC-유사 세포를 분리하는 단계로서, ECFC-유사 세포가 CD31+NRP-1+이고 조약돌 형태를 나타내는, 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 분리된 ECFC-유사 세포가 추가로 CD144+, KDR+ 및 α-SMA- 발현 중 하나 이상을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 액티빈 A, BMP-4 및 FGF-2 중 하나 이상이 약 5-25 ng/mL의 농도로 제공되는 방법.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, VEGF가 약 5-50 ng/mL의 농도로 제공되는 방법.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 유도 단계가 공동-배양 세포, 배양체 형성 및 외인성 TGF-β 억제 중 하나 이상의 부재 하에 수행되는 방법.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 분리 단계가 분화 10일, 11일 또는 12일에 수행되는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 분리 단계가 분화 12일에 수행되는 방법.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 분리가 유세포 측정법 또는 자기 활성화 세포 분류에 의해 수행되는 방법.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 분리된 ECFC-유사 세포가 공동-이식된 세포의 부재 하에 포유동물에 이식시 혈관을 형성하는 능력을 갖는 방법.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, ECFC-유사 세포의 분리된 집단에서 ECFC-유사 세포의 적어도 약 95%가 증식하는 방법.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, ECFC-유사 세포의 분리된 집단에서 ECFC의 적어도 약 35-50%가 높은 증식 가능성 (HPP) ECFC-유사 세포인 방법.
  12. 제 11항에 있어서, HPP ECFC-유사 세포가 출발 세포 당 적어도 약 2001개 세포를 생산하는 능력을 갖는 방법.
  13. 제 11항 또는 제 12항에 있어서, HPP-ECFC-유사 세포가 자가-보충 능력을 갖는 방법.
  14. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서,
    d) 내피 성장 배지를 포함하는 조성물에서 분리된 ECFC를 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  15. 제 14항에 있어서,
    e) 증식된 세포를 18회까지 계대시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  16. 제 14항 또는 제 15항에 있어서, 분리된 세포가 약 3개월 이내에 적어도 약 1조개 세포의 집단으로 증식되는 방법.
  17. 인간 NRP-1+CD31+ 내피 집락 형성 세포-유사 세포 (ECFC-유사 세포)의 분리된 집단으로서, 분리된 ECFC-유사 세포가 공동-이식된 세포의 부재 하에 포유동물에 이식시 혈관을 형성하는 능력을 지니고 분리된 ECFC-유사 세포가 인간 다능성 세포로부터 시험관내 유래된 것인, 분리된 집단.
  18. 제 17항에 있어서, ECFC-유사 세포의 적어도 약 35%가 높은 증식 가능성 (HPP) ECFC-유사 세포인 분리된 집단.
  19. 제 18항에 있어서, ECFC-유사 세포의 적어도 약 50%가 HPP ECFC-유사 세포인 분리된 집단.
  20. 제 17항에 있어서, HPP ECFC-유사 세포가 출발 세포 당 적어도 약 2001개 세포를 생산하는 능력을 갖고 자가-보충 능력을 갖는 분리된 집단.
  21. 제 17항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 분리된 집단의 ECFC-유사 세포가 추가로 CD144+, KDR+ 및 α-SMA- 중 하나 이상을 특징으로 하는 분리된 집단.
  22. 제 17항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 분리된 집단의 ECFC-유사 세포가 조약돌 형태를 나타내는 분리된 집단.
  23. 제 17항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 분리된 집단의 ECFC-유사 세포가 Matrigel에서 배양시 모세관-유사 네트워크를 형성할 수 있는 분리된 집단.
  24. 제 17항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 분리된 집단의 ECFC-유사 세포가 18회까지 시험관내 계대될 수 있는 분리된 집단.
  25. 제 17항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 유전자 중 하나 이상의 높은 발현이 제대혈 ECFC에 비해 ECFC-유사 세포에 의해 나타나는 분리된 집단: 가상 단백질 LOC100132288, CUB 및 Sushi 다중 도메인 1, 림프모양-제한된 막 단백질, 아릴아세트아미드 데아세틸라제 (에스테라제), 폴리스타틴-유사 5, ENSG00000215262, 가상 LOC84856, 구아닐레이트 사이클라제 활성화제 2B (유로구아닐린), 케라틴 75, 섬유모세포 활성화 단백질, 알파 (FAP), 염색체 22 개방형 해독틀 34, 가스더민 C, ENSG00000222954, 하이드록시스테로이드 (11-베타) 데하이드로게나제 1, 인돌아민 2,3-디옥시게나제 2 및 Zic 패밀리 구성원 4.
  26. 제 17항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 유전자 중 하나 이상의 낮은 발현이 제대혈 ECFC에 비해 ECFC-유사 세포에 의해 나타나는 분리된 집단: 수용체 (화학감각) 전달체 단백질 4, 염색체 X 개방형 해독틀 61, 아실-CoA 합성효소 중간쇄 패밀리 구성원 2A, 세르핀 펩티다제 억제제, 클레드 A (알파-1 항프로테이나제, 항트립신), 구성원 3, ENSG00000218052, 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 23, 코일드-코일 도메인 함유 48 및 RAS (RAD 및 GEM)-유사 GTP-결합 1.
  27. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항의 방법에 따라 수득된 인간 NRP-1+CD31+ 내피 집락 형성 세포-유사 세포 (ECFC-유사 세포)의 분리된 집단.
  28. 제 27항에 있어서, 집단 내 세포의 적어도 약 95%가 ECFC-유사 세포이고 NRP-1+CD31+인 분리된 집단.
  29. 제 17항 내지 제 28항 중 어느 한 항의 세포의 분리된 집단을 대상체에 제공하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에 이식하는 방법.
  30. 제 17항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 따른 치료적 유효량의 세포 집단을 대상체에 제공하는 것을 포함하는, 상피 복구를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법.
  31. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득된 내피 집락 형성 세포-유사 세포 (ECFC-유사 세포)를 포함하는 약학적 조성물.
  32. 세포의 활성을 변형시키는 능력에 대해 시험 작용제를 조사하는 방법으로서,
    - 제 17항 내지 제 28항 중 어느 한 항의 세포 집단 중의 적어도 하나의 세포를 시험 작용제에 노출시키는 단계; 및
    - 세포 성장 및 세포 생육성 중 하나 이상에 대한 시험 작용제의 효과를 관찰하는 단계를 포함하는, 방법.
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