CN106459904A - 用于生成内皮集落形成细胞状细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开一般涉及可用于细胞和组织生物学和治疗的组合物和方法。具体地，提供了用于将多潜能细胞分化成内皮集落形成细胞‑状细胞(ECFC‑状细胞)的体外方法。提供了纯化的NRP‑1+CD31+ECFC‑状细胞的人细胞群，其中群中的至少一些细胞具有高增殖潜力。提供了使用本公开的细胞群治疗和测试试剂筛选方法。

Description

用于生成内皮集落形成细胞状细胞的方法
在先申请的交叉引用
本申请要求2014年3月11日提交的美国临时专利申请序列号61/951,103的优先权，通过引用将该申请全文纳入本文。
技术领域
本公开涉及细胞和组织生物学领域。更具体地，本公开涉及将多潜能干细胞谱系特异性地分化成内皮集落形成细胞状细胞(ECFC-状细胞)。
发明背景
内皮集落形成细胞(ECFC)是罕见循环内皮细胞，在脐带血中特别丰富，具有增殖潜力和固有的体内血管形成能力1-6。ECFC，也称为血液生长内皮细胞(BOEC)7，已经显示在性别不匹配的人类骨髓移植患者中可直接移植，最有增殖性的循环BOEC显示供体骨髓的遗传标志物7,8。还未理解供体骨髓内哪种类型的细胞产生ECFC。当培养的ECFC静脉内注射到临床前啮齿动物血管损伤模型中时，它们从血管损伤或组织缺血位置处快速招募以协调血管生成响应9-11。已经报道了人ECFC在心肌梗塞12,13、中风9、缺血性视网膜病变14,15、缺血性肢体损伤10,11,16,17之后增强血管修复并改善血流，并且植入并再内皮化裸露的血管区段或植入的移植物18。在患有外周动脉疾病(PAD)和重症肢体缺血(CLI)的对象和老年患者中，循环或残留ECFC可能变得易于复制衰老(即，ECFC可能缺少增殖潜力)，因此使得它们对自体血管修复无能为力。至少出于这些原因，需要寻找一种可用于血管修复的ECFC的替代来源。
人多潜能干细胞(人胚胎干细胞和诱导的多潜能干细胞，统称hPSC)实际上显示出在动物体内无限自我更新的能力以及分化成任意细胞类型的能力19-21。人多潜能干细胞已经报告分化成内皮细胞谱系的细胞22-31。然而，体外hPSC-衍生的内皮细胞是不稳定的(例如，报道偏移成多种非内皮表型24,32)，显示低增殖潜力和在5-7次传代内达到复制衰老的倾向26,27,32，和/或缺少在没有支持细胞共移植的情况下体内形成血管的能力51。还没有公开的证据显示从hPSC体外衍生的内皮细胞具有等于或大于脐带血ECFC(CB-ECFC)的增殖潜力，并且具有在没有共培养或共移植细胞的情况下体内形成血管的能力。
需要减轻和/或消除上述缺陷中的一种或多种。
发明内容
本公开广义归纳为涉及用于从hPSC生成内皮集落形成细胞状细胞(ECFC-状细胞)的方法。本文提供了可重复地将hPSC分化成具有与CB-ECFC相似的分子、形态和功能性质的ECFC-状细胞群的方案。
在本公开的一个方面中，提供了一种用于从人多潜能干细胞生成人内皮集落形成细胞状细胞(ECFC-状细胞)的分离群的方法，该方法包括：
a)提供多潜能干细胞；
b)诱导多潜能干细胞经过内皮分化，其中诱导包括：
i)在包含激活素A、BMP-4、VEGF和FGF-2的内皮分化培养基中培养多潜能干细胞约24小时；并且
ii)此后约每1或2天用包含BMP-4、VEGF和FGF-2的内皮分化培养基替换步骤i)的培养基；并且
c)从经诱导以经过分化的细胞中分离ECFC-状细胞，其中ECFC-状细胞是CD31+NRP-1+并且显示出鹅卵石的形态。
在本公开的另一个方面中，提供了人NRP-1+CD31+内皮集落形成细胞状细胞(ECFC-状细胞)的分离群，其中分离的ECFC-状细胞具在没有共移植细胞的情况下植入哺乳动物时有形成血管的能力，并且其中分离的ECFC-状细胞在体外衍生自人多潜能细胞。
在本公开的另一个方面中，提供了按照本文所述的方法获得的人NRP-1+CD31+内皮集落形成细胞状细胞(ECFC-状细胞)的分离群。
在本公开的另一个方面中，提供了用于在有此需要的对象中进行移植的方法，所述方法包括向该对象提供本文所述的细胞的分离群。
在本公开的另一个方面中，提供了治疗需要内皮修复的对象的方法，所述方法包括向该对象提供治疗有效量的本文所述的细胞的群。
在本公开的另一个方面中，提供了包含按照本文所述的方法获得的内皮集落形成细胞状细胞(ECFC-状细胞)的药物组合物。
在本公开的另一个方面中，提供了检验测试试剂调节细胞活性的能力的方法，该方法包括：
-使本文所述的细胞群的细胞中的至少一个接触测试试剂，并且；
-观察该测试试剂对细胞生长和细胞活力之一或多个的影响。
附图的简要说明
本专利或申请文件包含至少一幅彩色附图。本专利或专利申请公开与彩色附图的副本将根据要求，在支付所需的费用之后由政府机关提供。
参照附图，在详述中，对本发明的特征进行更明显的描述，在附图中：
图1A-E显示了通过将hES和hiPS细胞与OP9体细胞体外共培养对衍生自hES和hiPS细胞的内皮细胞的形态、内皮抗原表达、集落增殖潜力、以及体外和体内血管形成潜力的检验。
图1A显示了在与OP9细胞共培养中经过内皮细胞谱系分化后8天时的hES和hiPS细胞(顶部组图)；在P1和P4时的分离的细胞培养物(中间组图)；和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)对照细胞的特征性鹅卵石内皮表型的代表性相衬显微照片。所有实验一式两份重复进行5次；比例尺，100μm。
图1B显示了用针对人CD31、CD144和CD146的单克隆抗体染色的从与OP9共培养的细胞获得的hiPS和hES-衍生细胞(P4)。顶部等值线图中的百分比显示CD144和CD31双阳性细胞，底部等值线图中的百分比显示CD144和CD146双阳性细胞。所有实验一式两份重复进行4次；显示每组的代表性等值线图。
图1C显示了OP9共培养的hiPS和hES-衍生的细胞(P4)的代表性显微照片，其已经在MatrigelTM上形成了一些毛细管状网络的大分支。所有实验一式两份重复5次进行。比例尺为100μm。
图1D是显示与CB-ECFC对照相比OP9共培养hES-衍生的细胞(P3到P4)的集落增殖分析的柱形图。所有实验一式三份重复进行4次；值表示平均±SD。斯氏t检验：**p<0.01和***p<0.001。比例尺为100μm。
图1E显示了在植入后没有在体内形成小鼠血红细胞填充的功能性人血管的OP9共培养hiPS和hES-衍生的细胞(P4)的代表性显微照片。所有实验一式两份重复5次进行。比例尺为100μm。
图2A-E显示了对从hES和hiPS细胞的EB-介导的内皮细胞谱系分化获得的内皮细胞的形态、内皮抗原表达、克隆增殖潜力、以及体外和体内血管形成潜力的检验。
图2A显示了在EB-介导的内皮细胞谱系分化后7天时的hES和hiPS-衍生的EB(顶部组图)；在P1和P4时的分离的细胞培养物(中间组图)；和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的特征性鹅卵石内皮表型(底部组图)的代表性相衬显微照片。所有实验一式两份重复5次进行。比例尺为100μm。
图2B显示了用针对人CD31、CD144和CD146的单克隆抗体染色的从基于EB的方案获得的hiPS和hES-衍生细胞(P4)。顶部等值线图中的百分比显示CD144和CD31双阳性细胞，并且底部等值线图中的百分比显示CD144和CD146双阳性细胞。所有实验一式两份重复4次进行。
图2C显示了形成在MatrigelTM上有多个较小不完整分支的毛细管状网络的基于EB的hiPS和hES-衍生的细胞(P4)的代表性显微照片。所有实验一式两份重复5次进行。比例尺为100μm。
图2D是显示与CB-ECFC对照细胞相比基于EB的hES-衍生的细胞(P3到P4)的集落增殖分析的柱形图。所有实验一式三份重复进行4次；值表示平均±SD。斯氏t检验：**p<0.01和***p<0.001。
图2E显示了在植入后没有在体内形成小鼠血红细胞填充的功能性人血管的基于EB的hiPS和hES-衍生的细胞(P4)的代表性显微照片。所有实验一式两份重复5次进行。比例尺为100μm。
图3A-E显示了对从hES细胞的基于EB加上2D的内皮细胞谱系分化(在TGF-β抑制剂存在下)获得的内皮细胞的形态、内皮抗原表达、克隆增殖潜力、以及体外MatrigelTM网络形成潜力的检验。
图3A是基于EB加上2D的分化中hES细胞的内皮细胞谱系分化的示意图，如前所述24。
图3B显示了在基于EB加上2D的分化方案中不同天时经过内皮细胞谱系分化的hES细胞的代表性相衬显微照片。所有实验一式两份重复5次进行。比例尺为100μm。
图3C显示了在基于EB加上2D的分化方案中不同天时经历内皮细胞谱系分化的hES细胞的代表性等值线图。在经过14天的内皮细胞谱系分化时，在不同时间点用针对各种人内皮抗原的单克隆抗体染色细胞。等值线图中的百分比表示NRP-1和CD31双阳性细胞。所有实验一式两份重复5次进行。
图3D显示了在基于EB加上2D的分化方案中在第14天从经历内皮细胞谱系分化的hES细胞衍生的分选细胞的不同亚组(NRP-1+CD31+、NRP-1+CD31-、NRP-1-CD31+和CD144+CD146+)的代表性相衬显微照片。所有实验一式两份重复5次进行。比例尺为100μm。
图3E是显示与CB-ECFC对照相比的基于EB-2D的hES-衍生的各种亚组(P3到P4)的克隆增殖分析结果的柱状图。所有实验一式三份重复进行4次；值表示平均±SD。
图4A-G显示了本文提供的一步2D无血清内皮细胞谱系分化方案，其并不需要形成EB或者TGF-β并且产生与CB-ECFC相似的ECFC-状细胞。
图4A是用于在61天内从104个hES或hiPS细胞开始将hES和hiPS细胞分化成超过1万亿ECFC-状细胞的内皮细胞谱系分化方案的示意图，如本文所述。左侧显示了在12天内生成3x104个hPS细胞。代表性的流式细胞等值线图(底部)显示了在第12天分化的细胞的NRP-1和CD31的表达百分比。第12天NRP-1+CD31+细胞产生经过广泛扩增的稳定ECFC-状细胞克隆。
图4B是显示第12天针对NRP-1+CD31+和NRP-1-CD31+细胞组分分选并在转变培养基中培养用于内皮生长的分化细胞。所有实验一式三份重复进行6次并且值表示平均±SD。斯氏t检验：***p<0.001。
图4C是从NRP-1+CD31+细胞组分获得的ECFC-状细胞集落的代表性显微照片，其显示出特征性鹅卵石形态并且各集落内含有内皮细胞均一群。实验一式两份重复8次进行。比例尺为50μm。
图4D显示在细胞表面显示典型内皮标记物CD31、CD144和NRP-1而没有显示非内皮标记物α-SMA的ECFC-状细胞的代表性免疫荧光显微照片。在左侧组图中，NRP-1表达表示成绿色；CD31表达表示成红色。在右侧组图中，α-SMA表达表示成绿色；CD144表达表示成红色。使用DAPI来将核染色成蓝色。所有实验一式两份重复3次进行。
图4E是表示与CB-ECFC对照相比hES-和hiPS-衍生的ECFC-状细胞的克隆增殖分析的柱形图。所有实验一式三份重复进行4次并且值表示平均±SD。
图4F是显示iPS-衍生的ECFC-状细胞显示特征性鹅卵石形态并在MatrigelTM上形成完全毛细管状网络的代表性相衬显微照片，与CB-ECFC所示相似。所有实验一式两份重复5次进行。比例尺为100μm。
图4G显示ECFC-状细胞在免疫缺陷小鼠中形成持久且功能性的体内人血管。代表性显微照片中的箭头显示抗-人CD31+染色的功能性人血管，其灌注了循环宿主鼠血红细胞。比例尺为50μm。柱形图(底部)显示对每组中每mm2上计数的功能性hCD31+血管的定量。所有实验一式三份重复进行6次并且值表示平均±SD。斯氏t检验：p＝ns。比例尺为50μm。
图5显示了在ECFC-状细胞方案中从分化hES和hiPS细胞出现的NRP-1+CD31+细胞的动力学分析。所有实验一式两份重复进行4次；值表示平均±SD。
图6A-E显示NRP-1-CD31+细胞并不显示出ECFC性质。
图6A显示了从显示均一形态的NRP-1-CD31+细胞获得的内皮集落的代表性显微照片。实验一式两份重复8次进行。比例尺为100μm。
图6B是显示主要表达非内皮标记物α-SMA且很少细胞表达内皮表面标记物CD144的NRP-1-CD31+细胞的代表性免疫荧光显微图。CD144表达表示成红色；α-SMA表达表示成绿色；并且DAPI用于将核染色成蓝色。实验一式两份重复4次进行。比例尺为100μm。
图6C是显示无法在移植后体内形成鼠血红细胞填充的功能性人血管的NRP-1-CD31+细胞的代表性显微照片。相反，NRP-1-CD31+细胞形成没有RBC的小腔(由箭头表示)，表明连接中的缺陷。所有实验一式两份重复5次进行。比例尺为100μm。
图6D是显示在MatrigelTM上形成不完整毛细管状网络的NRP-1-CD31+细胞的代表性相衬显微照片。所有实验一式两份重复5次进行。比例尺为100μm。
图6E是显示与单一接种的CB-ECFC对照相比，hiPS-衍生的NRP-1-CD31+和NRP-1+CD31+细胞的克隆增殖分析结果的柱形图。所有实验一式三份重复进行4次；值表示平均±SD。斯氏t检验：***p<0.001。
图7A-D显示产生稳定的ECFC-状表型的NRP-1+CD31+细胞在分化的第9天开始出现，并且产生稳定的ECFC-状表型的NRP-1+CD31+细胞在分化的第12天显著增加。
图7A是显示在分化的第6、9和12天使用ECFC-状细胞方案从人iPS细胞衍生的出现的NRP-1+CD31+细胞的百分比的柱形图。所有实验一式两份重复4次进行。值表示为平均值±SD。斯氏t检验：***p<0.001。
图7B显示了在分化的第6、9和12天时检验的hiPS-衍生的NRP-1+CD31+细胞获得的内皮集落的代表性显微照片。第12天衍生的NRP-1+CD31+细胞显示出鹅卵石形态并且每个集落内含有内皮细胞的均一群。所有实验一式两份重复8次进行。比例尺为50μm。
图7C是在分化的第6、9和12天使用本文所述的ECFC-状细胞方案获得的hiPS-衍生的NRP-1+CD31+细胞组分的代表性等值线图。等值线图中显示的百分比表示CD144和CD31双阳性细胞。所有实验一式两份重复4次进行。
图7D是显示MatrigelTM网络形成潜力的代表性相衬显微照片。所有实验一式两份重复5次进行。比例尺为100μm。
图8A-E显示了从本文所述的ECFC-状细胞分化方案中获得的hES-衍生的内皮细胞的形态、内皮抗原表达、和体外MatrigelTM网络形成潜力的检验。
图8A是在本文所述的ECFC-状细胞分化方案中不同天时经历内皮细胞谱系分化的hiPS细胞的代表性相衬显微照片。2D培养中的人iPS细胞生长至形成具有内皮状形态的细胞的集落(在第6天和第9天)并且在第12天融合。实验一式两份重复8次进行。比例尺为100μm。
图8B显示在不同天在细胞表面显示典型内皮标记物CD31、CD144和NRP-1而没有显示非内皮标记物α-SMA的经历ECFC-状细胞分化的细胞的代表性免疫荧光显微照片。在第12天，NRP-1+CD31+细胞以大量分化细胞中细胞簇出现并且完全没有α-SMA表达。NRP-1表达表示成绿色；CD31表达表示成红色；α-SMA表达表示成绿色；CD144表达表示成红色；并且DAPI用于将核染色成蓝色。实验一式两份重复4次进行。比例尺为50μm。
图8C显示了在第6、9和12天时检验的hiPS-衍生的NRP-1+CD31+细胞组分获得的内皮集落的代表性显微照片。第12天衍生的NRP-1+CD31+细胞显示出特征性鹅卵石形态且每个集落内含有内皮细胞的均一群。所有实验一式两份重复8次进行。比例尺为50μm。
图8D是在第6、9和12天使用ECFC-状细胞方案获得的hiPS-衍生的NRP-1+CD31+细胞组分的代表性等值线图。在不同天衍生的NRP-1+CD31+细胞在内皮生长培养基中培养并且形成细胞的融合单层。这些细胞再次用针对人CD31和CD144内皮抗原的单克隆抗体染色以检验典型内皮基因共表达。等值线图中显示的百分比表示CD144和CD31双阳性细胞。共表达CD144和CD31的细胞的最高百分比来自在第12天衍生的NRP-1+CD31+细胞。所有实验一式两份重复5次进行。
图8E是显示MatrigelTM网络形成潜力的代表性相衬显微照片。在ECFC-状细胞分化方案的第6、9和12天时使用ECFC-状细胞获得人iPS-衍生的NRP-1+CD31+细胞组分。在这些天的培养和增殖NRP-1+CD31+细胞之后，在MatrigelTM被覆的皿上进行体外毛细管状网络形成试验。第6天衍生的细胞在接种到MatrigelTM上形成不完整毛细管状网络，第9天和第12天衍生的细胞形成完整毛细管状网络。所有实验一式两份重复4次进行。比例尺为100μm。
图9A-E显示了从本文所述的ECFC-状细胞分化方案中获得的hES-衍生的内皮细胞的形态、内皮抗原表达、和体外MatrigelTM网络形成潜力的检验。
图9A是在ECFC-状细胞分化方案中不同天时经历内皮细胞谱系分化的hES细胞的代表性相衬显微照片。所有实验一式两份重复8次进行。比例尺为100μm。
图9B显示在不同天在细胞表面显示典型内皮标记物CD31、CD144和NRP-1而没有显示非内皮标记物α-SMA的经历ECFC-状细胞分化的细胞的代表性免疫荧光显微照片。在第12天，NRP-1+CD31+细胞以大量分化细胞中细胞簇出现并且完全没有α-SMA表达。NRP-1表达表示成绿色；CD31表达表示成红色；α-SMA表达表示成绿色；CD144表达表示成红色；并且DAPI用于将核染色成蓝色。所有实验一式两份重复4次进行。比例尺为100μm。
图9C显示了在分化的第6、9和12天时检验的hES-衍生的NRP-1+CD31+细胞获得的内皮集落的代表性显微照片。所有实验一式两份重复8次进行。比例尺为50μm。
图9D是在第6、9和12天使用ECFC-状细胞方案获得的hES-衍生的NRP-1+CD31+细胞组分的代表性等值线图。在不同天衍生的NRP-1+CD31+细胞在内皮生长培养基中培养并且形成细胞的融合单层。等值线图中的百分比表示CD144和CD31双阳性细胞。所有实验一式两份重复4次进行。
图9E是显示MatrigelTM网络形成潜力的代表性相衬显微照片。所有实验一式两份重复5次进行。比例尺为100μm。
图10A-F显示了在人疾病的临床前动物模型中，hiPSC-衍生的ECFC-状细胞如何导致缺血性视网膜和肢体的血管修复。
图10A是用载剂(左)或hiPSC-衍生的ECFC-状细胞(右)注射的C57/BL6小鼠的代表性平面固定的视网膜。用凝集素B4将视网膜血管染成绿色。由白线表示无血管区域。所有实验进行≥4次并且计算无血管区域的百分比。比例尺，1mm。
图10B是用载剂(左)或hiPSC-EBT-CD144+EC(右)注射的C57/BL6小鼠的代表性平面固定的视网膜。用凝集素B4将视网膜血管染成绿色。由白线表示无血管区域。所有实验进行≥4次并且计算无血管区域的百分比。比例尺，1mm。
图10C是用载剂(左)或hiPSC-衍生的ECFC-状细胞(右)注射的C57/BL6小鼠的代表性病理性视网膜前血管新生。当与对侧hiPSC-衍生的ECFC-状细胞–注射的眼比较时，视网膜前新血管簇主要在载剂注射的眼中观察到。箭头表示视网膜前新血管簇。所有实验进行≥4次。比例尺为200μm。
图10D是显示无胸腺裸小鼠中hiPSC-衍生的ECFC-状细胞的治疗性血管新生的代表性激光Doppler灌注成像。与载剂或hiPSC-EBT-CD144+EC-注射组相比，在接受hiPSC衍生的ECFC-状细胞或CB-ECFC移植的小鼠的缺血性肢体中(箭头)观察到肢体血液灌注的更大增加。所有实验进行≥10次。
图10E是显示在载剂、hiPSC-衍生的ECFC-状细胞、hiPSC-EBT-CD144+EC或CB-ECFC移植后第28天时测试的缺血性肢体的生理状态的百分比分布的叠加柱形图。所有实验进行≥10次。
图10F是显示在载剂、hiPSC-衍生的ECFC-状细胞、hiPSC-EBT-CD144+EC或CB-ECFC移植后第28天时测试的缺血性肢体的生理状态的表格。所有实验进行≥10次并且值表示肢体康复、坏死或失去的百分比。参数Х2检验：*P<0.05。
图11A-B显示了hiPSC-衍生的ECFC-状细胞在体内迁移到缺血性视网膜血管中。
图11A显示了hiPSC-衍生的ECFC-状细胞(右上)或hiPSC-EBT-CD144+EC(左上)，其用量子点标记成红色并且注射到缺血性视网膜中，并随后纳入定位的血管中(用凝集素B4染成绿色)。当与hiPSC-EBT-CD144+EC比较时，hiPSC-衍生的ECFC-状细胞在宿主视网膜中以更高数量整合并有更广泛分布。所有实验进行≥4次。比例尺为50μm。
图11B显示了红色量子点标记的hiPSC-衍生的ECFC-状细胞，其以与宿主血管紧密结合的单细胞存在，并且也似乎在表面视网膜丛中形成血管状结构。所有实验进行≥4次。比例尺为25μm。
图12A-D显示了hiPS-衍生的CD31+NRP-1+ECFC-状细胞经过广泛增殖，保持稳定的内皮表型，并且通过在长期培养之后最终变得沉默显示出原代细胞的特征。
图12A是显示β-半乳糖苷酶染色的CB-ECFC的代表性相衬显微照片。按照生产商的说明用β-半乳糖苷酶对CB-ECFC进行染色。在P7处CB-ECFC显示出很少的β-半乳糖苷酶阳性蓝色细胞(由圆圈表示)，但是在P18处几乎所有这些细胞对于β-半乳糖苷酶蓝色染色显示出阳性。所有实验一式两份重复8次进行。比例尺为50μm。
图12B是显示β-半乳糖苷酶染色的hiPS-衍生的ECFC-状细胞的代表性相衬显微照片。按照生产商的说明用β-半乳糖苷酶对hiPS ECFC-状细胞进行染色。在P7处hiPS-衍生的ECFC-状细胞显示出很少的β-半乳糖苷酶阳性蓝色细胞(由圆圈表示)，但是在P18处几乎所有这些细胞对于β-半乳糖苷酶蓝色染色显示出阳性。所有实验一式两份重复4次进行。比例尺为50μm。
图12C是显示来自不同代的CB-ECFC和hiPS-衍生的ECFC-状细胞中β-半乳糖苷酶阳性细胞的百分比的柱形图。所有实验一式三份重复进行4次；值表示平均±SD。斯氏t检验：***p<0.001。
图12D显示在细胞表面显示内皮标记物CD31、CD144和NRP-1而没有显示非内皮标记物α-SMA的hiPS-衍生的ECFC-状细胞的代表性免疫荧光显微照片。在顶部组图中，NRP-1表达表示成绿色；CD31表达表示成红色。在底部组图中，α-SMA表达表示成绿色；CD144表达表示成红色。使用DAPI来将核染色成蓝色。所有实验一式两份重复3次进行。比例尺为100μm。
图13A-B显示NRP-1+CD31+ECFC-状细胞显示出与CB-ECFC相似的分子标识。
图13A显示了定义单独胚层和特定谱系的选择组的基因相对转录水平的热图。
图13B显示了一个选择组的血管、血管生长和非血管基因的相对转录水平的热图，如前所述32。人iPS-衍生的ECFC-状细胞和hES-衍生的ECFC-状细胞显示出对于许多血管(顶部组图)和血管生长(中间组图)基因的高表达概况以及非血管基因(底部组图)的降低表达，与CB-ECFC所显示的相似。
图14A-E是显示KDR、p130Cas和Pyk磷酸化的全长Western印迹。
图14A是首先用磷酸-KDR抗体准备以鉴定磷酸化的KDR的Western印迹。
图14B是首先用磷酸-KDR抗体准备然后剥离与总KDR抗体孵育的Western印迹。
图14C是用磷酸-p130Cas准备的Western印迹。
图14D是首先用磷酸-p130Cas抗体准备然后剥离与磷酸-Pyk2抗体再孵育的Western印迹。
图14E是首先用磷酸-p130Cas抗体准备然后剥离与总磷酸-Pyk2抗体再孵育的Western印迹。
图15A-C显示NRP-1对于ECFC-状细胞从hiPS细胞出现而言是关键的。
图15A是用于检验NRP-1在ECFC-状细胞从hiPS细胞出现中起到的作用的治疗策略的示意图。
图15B是表示在用对照(蓝色)、Fc-NRP-1(红色)和NRP-b(绿色)处理4和6天之后NRP-1+CD31+(双)阳性细胞的出现百分比的定量的线图。在插图中，流式细胞等值线图显示了分化细胞在第6天时的KDR和NPR-1的表达百分比，显示丰富KDR表达和降低的NRP-1表达。所有实验一式三份重复进行6次；值表示平均±SD。斯氏t检验：**p<0.01和***p<0.001。
图15C是显示KDR、p130Cas和Pyk2磷酸化的Western印迹。所有实验一式两份重复4次进行。
图16A-I显示NRP-1对于保持ECFC-状细胞增殖潜力而言是关键的。
图16A显示了来自不同代(P4、P14和P18)的hiPS-衍生的ECFC-状细胞，其用针对CD31、CD144和NRP-1的单克隆抗体染色。各等值线图中的百分比表示CD31和CD144双阳性细胞(左侧组图)，而右侧等值线图中的百分比表示CD31和NRP-1双阳性细胞。所有实验一式两份重复4次进行。
图16B显示了不同代(P4、P14和P18)在7天培养之后计数时hiPS-衍生的ECFC-状细胞的倍数增殖。所有实验一式三份重复进行3次；值表示平均±SD。斯氏t检验：***p<0.001。
图16C显示了第14代hiPS-衍生的ECFC-状细胞，其用针对KDR和NRP-1的单克隆抗体染色。各等值线图中的百分比表示NRP-1和KDR阳性细胞。所有实验一式两份重复4次进行。
图16D显示了用对照、Fc-NRP-1和NRP-1-B处理的晚代(P14)hiPS-衍生的ECFC-状细胞以检验3或7天处理后的倍数增殖。柱形图表示在用对照、Fc-NRP-1和NRP-1-B处理3天(左侧柱形图)和7天(右侧柱形图)后的(P14)hiPS-衍生的ECFC-状细胞的倍数增殖。所有实验一式三份重复进行5次；值表示平均±SD。斯氏t检验：*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001。
图16E显示了用对照、Fc-NRP-1和NRP-1-B处理7天并用β-半乳糖苷酶染色(按照生产商的说明)的晚代(P14)hiPS-衍生的ECFC-状细胞。圆圈表示β-半乳糖苷酶阳性染色的细胞。与对照处理的细胞相比，Fc-NRP-1处理减少了β-半乳糖苷酶阳性蓝色细胞(虚线圆圈)的数量。与对照相比，NRP-1-B处理增加了蓝色细胞的数量。所有实验一式三份重复4次进行。比例尺为50μm。
图16F显示了表示用对照、Fc-NRP-1和NRP-1-B持续7天处理晚代(P14)hiPS-ECFC状细胞后β-半乳糖苷酶阳性蓝色细胞的百分比的柱形图。所有实验一式三份重复进行4次；值表示平均±SD。斯氏t检验：**p<0.01和***p<0.001。
图16G显示了在含有VEGF165的常规EGM-2培养基和含有VEGF121的EGM-2培养基中培养并且用对照、Fc-NRP-1和NRP-1-B处理7天的晚代(P14)hiPS-衍生的ECFC-状细胞。在7天后，对细胞进行收集、计数并用碘化丙啶和膜联蛋白V染色以检验这些处理组中各自的活细胞、促凋亡细胞和死细胞。柱形图表示在用对照、Fc-NRP-1和NRP-1-B处理7天后含有VEGF165和VEGF121的培养基中促凋亡细胞的百分比。与在VEGF121存在下培养的细胞相比，在含有VEGF165的培养基中培养的细胞中的Fc-NRP-1和NRP-1-B处理组中同时观察到促凋亡细胞的百分比显著降低。所有实验一式三份重复进行4次；值表示平均±SD。斯氏t检验：**p<0.01。
图16H显示在EGM-2培养基中培养的晚代(P14)hiPS-衍生的ECFC-状细胞，其中用VEGF121代替常规VEGF165。这些细胞用对照、Fc-NRP-1或NRP-1-B处理7天。柱形图表示在用对照、Fc-NRP-1和NRP-1-B处理7天后VEGF121处理培养基中P14hiPS-衍生的ECFC-状细胞的倍数增殖。与VEGF121存在下的对照相比，在这些细胞中，Fc-NRP-1或NRP-1-B处理并不导致倍数增殖的显著变化。所有实验一式三份重复进行4次；值表示平均±SD。
图16I显示在含VEGF165的常规EGM-2培养基和含VEGF121的EGM-2培养基中培养的晚代(P14)hiPS-衍生的ECFC-状细胞。这些细胞用对照、Fc-NRP-1和NRP-1-B处理7天。在7天后，对细胞进行收集、计数并用碘化丙啶和膜联蛋白V染色以检验这些处理组中各自的活细胞、促凋亡细胞和死细胞。各等值线图中的百分比表示在VEGF121(上排组图)或VEGF165(下排组图)存在下对照(左侧组图)、Fc-NRP-1(中间组图)和NRP-B(右侧组图)处理的细胞中的活细胞、促凋亡细胞和死细胞。在VEGF121-处理的细胞中，与对照相比，Fc-NRP-1和NRP-1-B都增加了死细胞和促凋亡细胞的百分比。然而，在VEGF165-处理的细胞中，与对照相比，Fc-NRP-1降低了死细胞和促凋亡细胞的百分比并增加了活细胞的百分比，与对照相比，NRP-1-B增加了死细胞和促凋亡细胞的百分比并降低了活细胞的百分比。所有实验一式三份重复进行4次；显示每组的代表性等值线图。
图17A-N显示了PAD患者衍生的EC具有降低的NRP-1表达、经过早细胞衰老、无法显示出完整等级的克隆增殖潜力并具有体内血管形成能力缺陷，然而，在PAD EC中的外源性NRP-1处理减少细胞衰老、减少多核细胞形成并且拯救PAD-EC增殖潜力。
图17A显示了动脉和外周血EC，其衍生自经过下肢截肢的患有外周血管疾病的患者。代表性的相衬显微照片显示从患有PAD和CLI的患者获得的PB(左侧组图)和动脉(右侧组图)的内皮细胞的均一特征性鹅卵石形态。所有实验一式两份重复6次进行。比例尺为50μm。
图17B显示了来自PAD患者的EC，其经过流式细胞术分析以确定典型内皮标记物的表达。用针对人CD31、CD144、KDR和NRP-1的单克隆抗体对PAD患者动脉或PB衍生的内皮细胞进行染色。右上象限中显示的百分比表示CD31和CD144双阳性细胞(左等值线图)。右等值线图中的百分比表示共表达NRP-1和KDR(右上)；NRP-1表达(左上)；KDR表达(右下)的细胞的百分比。虽然所有这些细胞保持高水平的CD31和CD144共表达并且超过60％的细胞显示KDR表达，但不到10％的细胞显示NRP-1表达。所有实验一式三份重复5次进行。
图17C显示在表面表达内皮标记物CD31、CD144、NRP-1和非内皮标记物α-SMA的hiPS-衍生的ECFC-状细胞和PAD动脉EC的代表性免疫荧光显微照片。在顶部组图中，NRP-1表达表示成绿色；CD31表达表示成红色。在底部组图中，α-SMA表达表示成绿色；CD144表达表示成红色。使用DAPI来将核染色成蓝色。虽然hiPS ECFC-状细胞显示NRP-1和CD31共表达，对CD144染色为阳性并且完全没有α-SMA表达，PAD-动脉-EC并没有显示出NRP-1和CD31共表达，然而，它们对于CD31和CD144染色为阳性，并且完全没有a-SMA表达。所有实验一式两份重复4次进行。比例尺为100μm。
图17D显示了经过单细胞增殖潜力试验的CB-ECFC、hiPS-衍生的ECFC-状细胞和衍生自PAD患者的EC。来自这些组的单细胞接种在96-孔平板中并在接种14天后评分。来自PAD患者的内皮细胞显示出弱的增殖性能，约70％的定位血管壁(动脉)和超过30％的PB衍生的内皮细胞保持单一无分裂细胞。相反，在CB-ECFC和hiPS-衍生的ECFC-状细胞群中仅2％的单一接种的细胞在14天培养之后仍然是无分裂细胞。这些大部分分裂的PAD衍生的细胞形成内皮簇(28％PAD-动脉-EC和60％PAD-PB-EC)，少数形成LPP-ECFC(0.5％PAD-动脉-EC和4％PAD-PB-EC)并且没有一个产生HPP-ECFC。然而，来自分化的CB-ECFC和hiPS-衍生的ECFC-状细胞群的细胞形成很少的内皮聚簇，并且大部分形成LPP-ECFC(44.3％CB-ECFC和44.7％hiPS ECFC-状细胞)和HPP-ECFC(35％CB-ECFC和43％hiPS-衍生的ECFC-状细胞)。所有实验一式三份重复4次进行。斯氏t检验：***p<0.001。
图17E显示了来自动脉和外周血的PAD患者衍生的EC的代表性相衬显微照片，其证明了在MatrigelTM上形成毛细管状网络的能力。所有实验一式两份重复5次进行。比例尺为100μm。
图17F显示了植入免疫缺陷型小鼠中的衍生自PAD患者的EC。凝胶在14天的移植之后回收、固定、透化并且用不与小鼠宿主细胞交叉反应的特异性抗-人CD31抗体染色。代表性显微照片中显示的箭头鉴定了一些小的抗-人CD31+血管，其用循环宿主血红细胞灌注。所有实验一式三份重复5次进行。比例尺为50μm。
图17G是显示对每组中每mm2上计数的功能性hCD31+血管的定量的柱形图。与CB-ECFC对照相比，衍生自PAD患者的EC显示出明显减少数量的功能性hCD31+血管。所有实验一式三份重复进行5次；值表示平均±SD。斯氏t检验：***p<0.001。
图17H显示了按照生产商的说明用β-半乳糖苷酶染色的PAD-EC和hiPS-衍生的ECFC-状细胞(P7)。在PAD-EC组中，几乎所有的细胞是β-半乳糖苷酶阳性蓝色细胞，而在hiPS-衍生的ECFC-状细胞组中很少有细胞(由圆圈表示)是β-半乳糖苷酶阳性。所有实验一式三份重复4次进行。比例尺为50μm。
图17I是显示与hiPS-衍生的ECFC-状细胞相比，β-半乳糖苷酶阳性PADEC的百分比的柱形图。与hiPS-衍生的ECFC-状细胞相比，在PAD-EC中观察到明显较高百分比的β-半乳糖苷酶阳性蓝色细胞。所有实验一式三份重复进行4次；值表示平均±SD。斯氏t检验：***p<0.001。
图17J显示了用对照、Fc-NRP-1和NRP-1-B处理7天的PAD-动脉EC(P7)。柱形图显示了在用对照、Fc-NRP-1和NRP-1-B处理7天后PAD-动脉EC的倍数增殖。虽然与对照相比在Fc-NRP-1处理的组中观察到明显较高的倍数增殖，但与对照组相比在NRP-1-B处理的组中观察到明显减少的增殖。所有实验一式三份重复进行4次；值表示平均±SD。斯氏t检验：**p<0.01和***p<0.001。
图17K显示了用对照、Fc-NRP-1和NRP-1-B处理7天并用β-半乳糖苷酶染色(按照生产商的说明)的PAD-动脉EC(P7)。在对照和NRP-1-B处理的组中，几乎所有的细胞对于β-半乳糖苷酶染色为阳性，而Fc-NRP-1处理组中的一些细胞对于β-半乳糖苷酶染色并不是阳性(由圆圈表示)。所有实验一式三份重复4次进行。比例尺为50μm。
图17L显示了表示用对照、Fc-NRP-1和NRP-1-B处理7天后β-半乳糖苷酶阳性细胞的百分比的柱形图。与对照处理的细胞相比，在Fc-NRP-1处理的细胞中观察到明显减少的β-半乳糖苷酶阳性蓝色细胞。所有实验一式三份重复进行4次；值表示平均±SD。斯氏t检验：*p<0.05和***p<0.001。
图17N显示了用对照和Fc-NRP-1处理7天的PAD-动脉EC(P7)以及获得的细胞显微照片以对处理的细胞中的核数量进行计数。代表性的显微照片中，箭头表示对照中的多核蓝色细胞(左侧组图)并且圆圈表示具有单核的非看色细胞(右侧组图)。所有实验一式三份重复4次进行。比例尺为25μm。
图17N是显示与Fc-NRP-1处理的细胞相比对照中多核PAD EC的百分比的柱形图。与对照处理的细胞相比，在Fc-NRP-1处理的细胞中观察到明显减少的多核细胞百分比。所有实验一式三份重复进行4次；值表示平均±SD。斯氏t检验：***p<0.001。
图18是显示使用本公开的ECFC-状细胞分化方案从104个hES或hiPS细胞开始在83天中超过一万亿个细胞的估计后代的示意图。第12天衍生的NRP-1+CD31+细胞产生稳定的ECFC-状细胞集落，其经过广泛增殖以产生超过一万亿个细胞。在两种情况中，用1hES系和3hiPS系来进行该研究。
发明详述
本发明一般涉及多潜能细胞，例如，人胚胎干细胞(hESC)或诱导的多潜能干细胞(iPSC)(统称为人多潜能干细胞(hPSC))体外分化成内皮集落形成细胞状细胞(ECFC-状细胞)的方法。在本文提供的方法的多个实施方式中，多潜能细胞可在限定条件下维持、增殖和分化，其中不需要使用饲养细胞和/或血清。在一个实施方式中，在没有共培养和/或共移植细胞的情况中，所得的ECFC-状细胞可进一步生长成血管。
在多个实施方式中，相对于通过与细胞如OP9共培养或拟胚体(EB)形成从hES或hiPS细胞体外衍生的内皮细胞(EC)，使用本文所述的方法生成的ECFC-状细胞具有高增殖潜力(HPP)。在一个实施方式中，使用本文所述的方法生成的ECFC-状细胞具有大于或等于从人脐带血中分离的ECFC的增殖潜力。在一个实施方式中，本文所述的方法可用于从各计算的干细胞重复生成至少1x108个ECFC-状细胞。
I：定义
下文提供了本说明书中使用的某些术语的定义。除非另有说明，本文所用的所有科技术语具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的含义。
本文所用的“内皮集落形成细胞”和“ECFC”是指在血液中发现的原代内皮细胞，其显示出从单细胞增殖并形成内皮集落的潜力，并具有在没有共移植或共培养细胞的情况下体内形成血管的能力。
本文所用的“脐带血ECFC”和“CB-ECFC”是指衍生自脐带血的原代ECFC。
本文所用的“内皮集落形成细胞状细胞”和“ECFC-状细胞”是指在体外从人多潜能干细胞(hPSC)生成的非原代内皮细胞。ECFC-状细胞具有ECFC的各种特征，至少包括从单细胞增殖并形成内皮集落的潜力，并具有在没有共移植或共培养细胞的情况下体内形成血管的能力。
本文所用术语“增殖性潜力”和“增殖潜力”是指细胞在提供合适生长促进信号时分裂的能力。
本文所用术语“高增殖性潜力”、“高增殖潜力”和“HPP”是指单细胞在14天细胞培养中分裂成超过约2000个细胞的能力。优选地，HPP细胞具有自我补充的能力。例如，本文提供的HPP-ECFC-状细胞具有自我补充的能力，意味着HPP-ECFC-状细胞在体外再接种时可在次生HPP-ECFC-状集落内产生一个或多个HPP-ECFC-状细胞。在一些实施方式中，HPP-ECFC-状细胞也可具有在体外再接种时在次生HPP-ECFC-状集落内产生一个或多个LPP-ECFC-状细胞和ECFC-状细胞簇的能力。
本文所用术语“低增殖性潜力”、“低增殖潜力”和“LPP”是指单细胞在14天细胞培养中分裂成约51-2000个细胞的能力。在一些实施方式中，LPP-ECFC-状细胞也具有产生ECFC-状细胞簇的能力。然而，LPP-ECFC-状细胞并没有产生次生LPP-ECFC-状细胞或HPP-ECFC-状细胞的能力。
本文所用术语“ECFC-状簇”是指具有在14天细胞培养中分裂成约2-50个细胞的能力的ECFC-状细胞的簇。
本文所用的“多潜能细胞”是指具有分化成任意细胞类型的潜力的细胞，例如，三个胚层中任意一个的细胞：内胚层、中胚层或外胚层。
本文所用的“胚胎干细胞”、“ES细胞”或“ESC”是指衍生自早期胚胎的多潜能干细胞。
本文所用的“诱导的多潜能干细胞”、“iPS细胞”或“iPSC”是指一种类型的多潜能干细胞，其已通过导入非多潜能细胞或使非多潜能细胞与一种或多种重编程因子接触从非多潜能细胞制备，例如，成年体细胞，或最终分化的细胞，例如，成纤维细胞、造血细胞、肌细胞、神经元、表皮细胞等。
本文所用的“内皮分化培养基”是指支持和/或增强多潜能细胞分化成内皮细胞谱系的细胞的任何营养培养基。
本文所用的“内皮生长培养基”是指适于维持内皮细胞系的细胞的任何培养基。
II：将多潜能细胞分化成内皮集落形成细胞状细胞(ECFC-状细胞)的方法。
在一个方面中，本文所述的方法包括至少三个步骤：
A：提供多潜能干细胞；
B：诱导多潜能干细胞分化成内皮细胞谱系的细胞；和
C：从内皮细胞谱系的分化细胞中分离ECFC-状细胞。
在多个实施方式中，所述方法还包括以下步骤：
D.增殖分离的ECFC-状细胞。
上述方法中的各步骤在本文下文中进一步描述。本文所述的方法的各种实施方式可指代“ECFC-状方案”、“ECFC-状细胞方案”、“hESC-衍生的ECFC-状细胞方案”或“hiPSC-衍生的ECFC-状细胞方案”。
A.多潜能干细胞培养
在一个方面中，提供了用于在体外从多潜能细胞生成ECFC的分离群的方法。可通过多种来源获得适用于本公开的方法的多潜能细胞。例如，一种类型的合适多潜能细胞是衍生自胚泡的内细胞物质的胚胎干细胞(ES)。获得各种类型，如小鼠、猕猴、绒猴、和人的ES细胞的方法是熟知的。用于方法中的ES细胞的来源可以是，例如，一种或多种建立的ES细胞系。各种ES细胞系是已知的并且已经限定了其生长和繁殖条件。本文考虑实际上任何ES细胞或ES细胞系可用于本文公开的方法。在一个实施方式中，多潜能细胞是通过重编程体细胞衍生的诱导的多潜能干细胞(iPS)。已经通过多种已知的方法获得了诱导的多潜能干细胞。本文考虑实际上任何iPS细胞或细胞系可用于本文公开的方法。在其他实施方式中，多潜能细胞是通过体细胞核转移衍生的胚胎细胞，其中供体核转移到没有纺锤体的卵母细胞中。通过核转移产生干细胞的各种方法是已知的。本文考虑实际上任何由体细胞核转移衍生的ES细胞或细胞系可用于本文公开的方法。
在一个实施方式中，在适于将多潜能细胞维持在未分化状态的条件下培养多潜能细胞。将多潜能细胞体外维持在未分化状态的方法是熟知的。在一个实施方式中，在适于将多潜能细胞维持在未分化状态的条件下培养多潜能细胞约2天。例如，在下面的实施例中，hES和hiPS细胞在37℃和5％CO2下在10cm2组织培养皿中维持在MatrigelTM上的mTeSR1完全培养基中。
可使用用于培养和/或维持多潜能细胞的其他和/或替代方法。例如，作为基础培养基，TeSR、mTeSR1alpha.MEM、BME、BGJb、CMRL 1066、DMEM、伊格尔MEM、费歇尔培养基、Glasgow MEM、Ham、IMDM、改良MEM Zinc Option、Medium 199和RPMI 1640中的任意或其组合可用于培养和/或维持多潜能细胞。
使用的多潜能细胞培养基可含有血清或其可以无血清。无血清是指不含未经处理或未纯化的血清的培养基。无血清培养基可包括纯化的血液衍生组分或动物组织衍生组分，例如，生长因子。使用的多潜能细胞培养基可含有一种或多种血清替代物，例如，敲除血清替换(KSR)、化学限定的脂质浓缩(吉布可公司(Gibco))或glutamax(吉布可公司)。
裂解或传代多潜能细胞的方法是熟知的。例如，在下面的实施例中，在接种多潜能细胞之后，在第2天、第3天和第4天改变培养基，并且细胞在第5天传代。一般而言，一旦填满培养容器(即，70-100％融合)，通过任意合适的解离方法将细胞物质分裂成聚集的细胞或单细胞，并且聚集的细胞或单细胞转移到新培养容器中用于传代。细胞“传代”或“分裂”是为了保持细胞活力并使细胞体外生长延长时间的熟知技术。
B.多潜能细胞定向分化成内皮细胞谱系的细胞
在公开的方法的一个方面中，体外诱导多潜能细胞经过内皮分化。用于诱导多潜能细胞分化成内皮细胞谱系的细胞的各种方法，包括培养条件是本领域已知的。在本文提供的ECFC-状细胞方案中，优选在化学限定的培养基中诱导多潜能细胞的分化。例如，Stemline II无血清造血扩增培养基可用作基础内皮分化培养基。在本文提供的ECFC-状细胞方案中，使用各种生长因子来促进多潜能细胞分化成内皮细胞谱系的细胞，包括ECFC-状细胞。例如，在化学限定的分化培养基中包含激活素A，血管内皮生长因子(VEGF)、基础成纤维细胞生长因子(FGF-2)和骨形态发生蛋白4(BMP-4)以诱导多潜能细胞分化成内皮细胞谱系的细胞，包括ECFC-状细胞。
在本文提供的ECFC-状细胞方案的一个实施方式中，在基础培养基(例如，mTeSR1)中培养2天后(-D2)，多潜能细胞的分化通过使细胞接触包含有效量的激活素A、BMP-4、VEGF和FGF-2的内皮分化培养基24小时来导向内皮细胞谱系。在24小时的分化后，通过用包含有效量的BMP-4、VEGF和FGF-2的内皮分化培养基替换内皮分化培养基来从培养中去除激活素A。“有效量”表示有效促进多潜能细胞分化成内皮细胞谱系的细胞，包括ECFC-状细胞的量。可每1-2天用包含有效量的BMP-4、VEGF和FGF-2的内皮分化培养基进一步替换。
激活素A是TGF-B超家族的成员，其已知通过多种途径激活细胞分化。激活素A促进激活中胚层特化，但对于内胚层特化和后续的内皮扩增而言不重要。在一个实施方式中，内皮分化培养基包含浓度为约5-25ng/mL的激活素A。在一个优选的实施方式中，内皮分化培养基包含浓度为约10ng/mL的激活素A。
骨形态发生蛋白-4(BMP-4)是腹侧中胚层诱导剂，其在成人骨髓(BM)中表达并且参与调节造血前体细胞的增殖和分化潜力(Bhardwaj等，2001；Bhatia等，1999；Chadwick2003)。另外，BMP-4可调节人胎儿、新生儿和成人造血前体细胞中的早期造血细胞发育(Davidson和Zon,2000；Huber等，1998；Marshall等，2000)。在一个实施方式中，内皮分化培养基包含浓度为约5-25ng/mL的BMP-4。在一个优选实施方式中，内皮分化培养基包含浓度为约10ng/mL的BMP-4。
血管内皮生长因子(VEGF)是参与胚胎循环系统形成和血管形成的信号转导蛋白。在体外，VEGF可刺激内皮细胞有丝分裂和细胞迁移。在一个实施方式中，内皮分化培养基包含浓度为约5-50ng/mL的VEGF。在一个优选的实施方式中，内皮分化培养基包含浓度为约10ng/mL的VEGF。在一个特别优选的实施方式中，内皮分化培养基包含浓度为约10ng/mL的VEGF165。
基础成纤维细胞生长因子，也称为bFGF或FGF-2，已经涉及多种生物过程，包括肢体和神经系统发育、伤口愈合和肿瘤生长。bFGF已经用于支持人胚胎干细胞的饲养-依赖性生长。在一个实施方式中，内皮分化培养基包含浓度为约5-25ng/mL的FGF-2。在一个优选实施方式中，内皮分化培养基包含浓度为约10ng/mL的FGF-2。
与用于从hPSC生成EC的在先方案相反，本文所述的方法并不需要与支持细胞共培养，例如OP9体细胞。
与用于从hPSC生成EC的在先方案相反，本文所述的方法并不需要拟胚体(EB)形成。
与用于从hPSC生成EC的在先方案相反，本文所述的方法并不需要外源性TGF-β抑制。
C.从分化的内皮细胞分离ECFC-状细胞
在本文公开的方法的一个实施方式中，从经历内皮分化的细胞群中选择并分离CD31+NRP-1+细胞。用于选择具有一种或多种特异性分析标记物的细胞的方法是本领域已知的。例如，可通过流式细胞术，包括荧光活化细胞分选或磁性活化细胞分选基于各种转录本的表达选择细胞。
在一个实施方式中，在分化的第10天、第11天或第12天，从经历内皮分化的细胞群中选择CD31+NRP-1+细胞，如本文所述。在一个优选实施方式中，在分化的第12天，从经历内皮分化的细胞群选择CD31+NRP-1+细胞。发明人已经发现，相对于在分化的其他天时存在的细胞群，第12天的经历内皮分化的细胞群含有较高的NRP-1+细胞百分比。
在下面的实施例中，在分化的第12天之后收获粘附EC并且制成单细胞悬浮物。细胞经计数，并准备用于用抗-人CD31、CD144和NRP-1的抗体染色。使用流式细胞术分选并选择CD31+CD144+NRP-1+细胞。
在一个实施方式中，选择的细胞显示出鹅卵石形态，这对于EC，包括ECFC而言是典型的。
在一个实施方式中，选择的细胞具有在MatrigelTM-被覆的皿上形成毛细管状网络的能力，这对于EC，包括ECFC而言是典型的。
在一个实施方式中，选择的细胞具有在没有共培养和/或共移植细胞的情况下体内形成血管的能力，这对于ECFC而言是典型的。
在一个实施方式中，选择的细胞显示出等于或大于CB-ECFC且大于使用已知方案体外衍生的EC的克隆增殖潜力。
在一个实施方式中，选择的细胞显示出高克隆增殖潜力。例如，在一个实施方式中，约95％或更多的分离的单ECFC-状细胞增殖并且至少约35-50％的分离的单ECFC-状细胞是HPP-ECFC-状细胞，其具有自我补充的能力，从而产生其他HPP-ECFC-状细胞。
D.增殖分离的ECFC-状细胞。
在各种实施方式中，分离的CD31+NRP-1+ECFC-状细胞在适于内皮生长的条件下增殖。在一个实施方式中，本领域已知的内皮细胞生长的培养条件可用于扩增分离的CD31+NRP-1+ECFC-状细胞。在一个实施方式中，如下文进一步所述，用1型胶原被覆培养皿作为细胞粘附基质。纤连蛋白、基质胶或其他细胞基质也可用于促进细胞对培养皿的粘附。在一个实施方式中，如下文进一步所述，可使用内皮生长培养基2(EGM2)加VEGF、IGF1、EGF和FGF2、维生素C、氢化可的松、和胎牛血清来增殖分离的CD31+NRP-1+ECFC-状细胞。
在下文的实施例中，CD31+NRP-1+分离的ECFC-状细胞经离心并在1:1内皮生长培养基和内皮分化培养基中重悬。为了从选择的细胞群中生成ECFC-状细胞，将约2500个选择的细胞/孔接种到胶原被覆的12孔板上。在2天后，用3:1比率的内皮生长培养基和内皮分化培养基替换培养基。ECFC-状集落以紧密粘附的细胞出现并且在扩增的第7天时显示出鹅卵石形态。
在下文的实施例中，克隆ECFC-状细胞簇以分离基本纯的HPP-ECFC-状细胞群。“纯”或“基本纯”表示相对于组成总细胞群的HPP-ECFC-状细胞至少约75％(例如，至少约75％、85％、90％、95％、98％、99％或更高)纯的细胞群。换而言之，术语“基本纯”是指本文提供的ECFC-状细胞群，其在引导分化以获得内皮细胞谱系的细胞时含有少于约25％、20％、约10％、或约5％的非-ECFC-状细胞。术语“基本纯”也指本文提供的ECFC-状细胞群，其在任何富集、扩增步骤或分化步骤之前的分离群中含有少于约25％、20％、约10％、或约5％的非-ECFC-状细胞。在一些情况中，按照本文提供的方法生成的ECFC-状细胞的基本纯的分离群相对于组成总细胞群的内皮细胞的细胞是至少约95％纯(例如，至少约95％、96％、97％、98％、99％)。本领域已知的克隆技术可用于本文公开的方法。
在下面的实施例中，通过以10000个细胞/cm2的接种密度接种并将ECFC-状细胞维持在完全内皮生长培养基(胶原被覆的平板和cEGM-2介质)中并每隔一天更换培养基来使融合的ECFC-状细胞传代。本领域已知的细胞传代技术可用于本文公开的方法。
在一个实施方式中，使用本文提供的方法生成的ECFC-状细胞可在包含内皮生长培养基的组合物中扩增并传代高达18次，同时保持稳定的ECFC-状细胞表型。“稳定ECFC-状细胞表型”表示显示鹅卵石形态，表达细胞表面抗原CD31和CD144，并且具有在没有共培养和/或共移植细胞的情况下在体内形成血管的能力的细胞。在优选的实施方式中，具有稳定表型的ECFC-状细胞也表达CD144和KDR，但不表达α-SMA(α-平滑肌肌动蛋白)。
III.ECFC-状细胞的分离群
在一个实施方式中，提供了人NRP-1+/CD31+ECFC-状细胞的分离群。在一个实施方式中，使用本文公开的用于从hPSC生成ECFC-状细胞的体外方法来生成提供的NRP-1+/CD31+ECFC-状细胞的纯化人细胞群。
在下面的实施例中，使用本文公开的方法来生成NRP-1+和CD31+ECFC-状细胞的纯化人细胞群。该群的分离的ECFC-状细胞显示出鹅卵石形态并且具有在没有共培养和/或共移植细胞的情况下体内形成血管的能力。在一个实施方式中，该群的ECFC-状细胞进一步由CD144+、KDR+和α-SMA-中的一种或多种来表征。
在一个实施方式中，群中的ECFC-状细胞的至少一些具有大于或等于CB-ECFC的增殖潜力并且大于使用其他已知方案体外生成的EC的增殖潜力的高增殖潜力。在一个优选的实施方式中，ECFC-状细胞群包含具有增殖潜力的HPP-ECFC以从单个起始多潜能细胞生成至少1万亿个ECFC-状细胞。
在一个优选的实施方式中，分离的ECFC-状细胞群是基本纯的。
在一个优选的实施方式中，本文提供的分离的ECFC-状细胞群含有至少约35-50％的具有以下特征的ECFC-状细胞：
A.特征性ECFC-状分子表型；
B.在MatirgelTM上体外形成毛细管网络的能力；
C.高增殖潜力；
D.自我补充潜力；
E.在没有共培养细胞的情况下体内形成血管的能力；和
F.增加细胞活力和/或减少衰老。
在本文下文中进一步描述了各前述ECFC-状特征。
A.ECFC-状细胞分子表型
内皮细胞谱系的细胞具有特征性分子标记物，包括，例如，CD31、CD144、KDR和NRP-1。脐带血EC已知表达各种内皮标记物，包括CD31、CD144、KDR和NRP-1。现在，发明人并不清楚区分CB-ECFC和任何其他衍生自血管的EC的特异性标记物。已知测量EC，包括ECFC中的分子表达模式的方法。例如，各种已知的用于在使用本公开的方法生成的细胞中评价各种标记物表达的免疫细胞化学技术。
在本文的实施例中，ECFC-状细胞是CD31+/NRP-1+。在一个优选的实施方式中，使用本文提供的方法衍生的ECFC-状细胞也表达CD144和KDR，并且不表达α-SMA。相反，使用需要与OP9细胞共培养或EB发育的方案在体外从hPSC产生的EC通常表达α-SMA。
B.在Matirgel TM 上体外形成毛细管网络的能力
像各种其他EC那样，衍生自脐带血的ECFC可在MatrigelTM上体外培养时形成毛细管状网络。
在一个实施方式中，使用本文提供的方法在体外从hPSC生成的ECFC-状细胞和群具有在MatrigelTM上体外培养时形成毛细管状网络的能力。
C.高增殖潜力
在体外使用各种不同方案衍生自hPSC的内皮细胞(EC)具有相对于CB-ECFC不同的增殖潜力。例如，如本文的实施例中所示，大约45％的单细胞CB-ECFC具有低增殖潜力(LPP)并且约37％的单细胞CB-ECFC具有高增殖潜力(HPP)。如本文实施例中所示，在本文提供的分离的ECFC-状细胞群中至少约35％的ECFC-状细胞是HPP-ECFC-状细胞。在一个优选的实施方式中，在本文提供的分离的ECFC-状细胞群中至少约50％的ECFC-状细胞是HPP-ECFC-状细胞。
相反，在体外使用包括将细胞与OP9细胞共培养的方案产生的EC(例如，Choi等，Stem Cells 2009)显示出克隆增殖潜力，其中少于3％的细胞产生HPP-EC。在体外使用包括EB形成的方案产生的内皮细胞(例如，Cimato等，Circulation 2009)显示出克隆增殖潜力，其中少于3％的细胞产生HPP-EC。使用体外方案产生的内皮细胞，其包括外源性TGF-β抑制(例如，James等，2010)显示出克隆增殖潜力，其中约30％的细胞产生HPP-EC，但是仅在TGF-β抑制持续存在下发生(，即，如果从该方案中除去外源性TGF-β抑制，则EC丧失其前部HPP活性)。
用于测量细胞的增殖潜力的各种技术为本领域已知并且可用于本文提供的方法以确认ECFC-状细胞的增殖潜力。在本文的实施例中，使用单细胞试验来评价CB-ECFC、iPS衍生的-ECFC-状细胞、EB-衍生的EC和外周动脉疾病(PAD)-衍生的EC的克隆原性增殖潜力。简言之，CB-ECFC、ECFC-状细胞和EC经处理以获得单细胞悬浮。悬浮的细胞经计数、稀释，并且单细胞在96孔平板的各孔中培养。在几天的培养之后，检查各孔以对细胞数进行定量。含有2个或更多个细胞的那些孔被鉴定为增殖阳性。EC计数为1的孔被分类为非分裂，具有2-50的EC计数的孔被分类为内皮细胞簇(ECC)，具有51-500或501-2000的EC计数的孔被分类为低增殖潜力(LPP)细胞并且具有≥2001的EC计数的孔被分类为高增殖潜力(HPP)孔。
D.自我补充潜力
使用各种不同方案衍生的内皮细胞具有不同的自我补充能力。自我补充表示分裂成相似细胞的能力。例如，本文提供的HPP-ECFC-状细胞具有在体外再接种时在次生HPP-ECFC-状集落内产生一个或单个HPP-ECFC-状细胞的能力。在一个实施方式中，自我补充HPP-ECFC-状细胞适用于细胞疗法，至少是因为可使用本文提供的方法体外生成治疗上充足数量的HPP-ECFC-状细胞。
E.在没有共培养细胞的情况下体内形成血管的能力
使用各种不同方案衍生的内皮集落形成细胞具有不同的在体内形成血管的能力。例如，CB-ECFC可在体内植入哺乳动物，例如，小鼠时形成血管。
相反，使用Choi等，(2009)的方案产生的EC并不在体内植入哺乳动物时形成宿主鼠血红细胞(RBC)填充的功能性人血管，该方案包括将细胞与OP9细胞共培养来生成EC。使用Cimato等，(2009)的方案产生的EC并不在体内植入哺乳动物时形成宿主RBC填充的功能性人血管，该方案包括EB形成来生成EC。使用James等，(2010)的方案产生的EC在体内植入哺乳动物时形成明显更少(即，比现在公开的方案的细胞少15倍)的功能性人血管，该方案包括TGF-β抑制来生成EC。另外，James等的细胞可能只能在体内植入哺乳动物时在培养持续含有TGF-β下形成功能性人血管；如果除去TGF-β，细胞完全丧失了形成RBC-填充的人血管的能力。使用(Sameul等，PNAS 2013)的方案产生的EC(其缺少选择第12天CD31+NRP1+的步骤)仅在EC与支持细胞(即，间充质前体细胞)一起植入时可在体内植入哺乳动物时形成血管，。
与上述现有技术的方法相反，在本文的实施例中，ECFC-状细胞群中的细胞可在体内植入哺乳动物时形成血管，即便在没有支持细胞的情况下。
用于测量体内血管形成的各种技术已知并且可使用。在本文的实施例中，通过向三维(3D)细胞化胶原基质加入使用本公开的方法生成的ECFC-状细胞来评价体内血管形成。含有ECFC-状细胞悬浮物的胶原混合物允许在组织培养皿中聚合以形成凝胶。然后将细胞化的凝胶移植到6或12周龄的NOD/SCID小鼠的肋部。在移植后2周，回收凝胶并且检查用小鼠血红细胞灌注的人内皮细胞谱系血管。
在没有外源性支持细胞的情况下体内形成血管的能力是使用本文公开的方法产生的细胞为ECFC的一个指标。
F.增加细胞活力和/或减少衰老
使用各种不同方案衍生的内皮细胞相对于CB-ECFC具有不同的细胞活力和/或衰老水平。例如，在本文的实施例中，活性CB-ECFC可传代至18次。
相反，使用Choi等(2009)的方案(其包括将细胞与OP9细胞共培养来生成EC)产生的EC细胞具有6次传代的活力。使用Cimato等(2009)的方案(其包括EB形成用于生成EC)产生的EC具有7次传代的活力。使用James等(2010)的方案(其包括外源性TGF-β抑制来生成内皮细胞)产生的EC具有9次传代的活力，并且在没有TGF-β抑制的情况下，James等的EC转化成间充质细胞类型，从而丧失其内皮特性。使用Samuel等的方案(其缺少选择第12天的CD31+NRP-1+细胞的步骤)产生的EC可扩增至15代。
与用于体外生成EC的上述方法相反，在本文的实施例中，ECFC-状细胞群中的活细胞可扩增至18代。CB-ECFC可传导15-18次。
用于测量细胞活力和衰老的各种技术为本领域已知并且可用于本公开。在本文的实施例中，通过台盼蓝排除法来评价细胞活力并且使用衰老试验试剂盒(百信公司(Biovision))来评价细胞衰老。其他评价细胞活力和/或衰老的方法为本领域已知并可使用。
IV.本文公开的ECFC-状细胞的用途
与原代细胞的ECFC相反，使用本文公开的方法生成的ECFC-状细胞可在体外在一定体积中生成，其可用于各种临床引用，如下所述。
A.治疗
在一个方面中，本文提供可适于细胞移植、细胞补充、和/或组织替换的方法、细胞和组合物。该方法可包括向有此需要的对象提供治疗有效量的按照本文提供的方法衍生的ECFC-状细胞，从而提供治疗对象的ECFC-状细胞。“治疗有效量”表示有效治疗需要内皮修复的对象的量。本文提供的细胞和/或组合物可以允许ECFC-状细胞移植或迁移至针对的组织部位并且重建或再生功能缺陷区域的方式给予对象。
适于接受使用本文提供的ECFC-状细胞的疗法的对象包括具有内皮功能障碍和/或各种类型破坏的那些。例如，患有心血管疾病、心肌梗塞、心源性卒中或外周动脉疾病(PAD)的对象可以是接受使用本公开的ECFC-状细胞的疗法的合适对象。患有肺或肾疾病或损伤的对象可以是适于接受使用本公开的ECFC-状细胞的疗法的合适对象。在优选的实施方式中，发生重症肢体缺血的PAD患者是适于接受使用本公开的ECFC-状细胞的疗法的合适对象。
在一个实施方式中，可以适于人类给药的药物组合物的形式向对象提供ECFC-状细胞。例如，该组合物可包含一种或多种药学上可接受的运载体、缓冲剂或赋形剂。该组合物还可包含一种或多种促进移植ECFC-状细胞的成分，或与这些成分一起提供给对象。例如，药物组合物也可包含一种或多种促进移植细胞的存活和/或移植、促进血管生成、调节胞外或间质基质的组成、和/或将其他细胞类型招募至移植位点的生长因子或细胞因子(例如，血管原性细胞因子)，或与这些成分一起提供给对象。
在一个实施方式中，可按照提供合适无菌性和稳定性的标准方案配制、产生并储存药物组合物。
例如，在一个实施方式中，本文提供的ECFC-状细胞可直接注射到缺少充足血流的组织(由医师确定)中。在一个实施方式中，本文提供的ECFC-状细胞可在包含胶原、纤连蛋白或合成材料的基质中悬浮并且这种ECFC-状细胞的凝胶状悬浮物可直接注射到缺少充足血流的组织中。注射到组织中的ECFC-状细胞的浓度可变化，例如，约10000至约100000个细胞/微升的递送载剂或基质材料。在一些组织中，细胞可在具有充足血流回收的单个位置上递送，而其他组织可能需要随时间的多次注射和后续注射以拯救充足血流。
在向对象给予ECFC-状细胞之后，可在需要时评价治疗方法的效果并且可根据需要重复治疗。可通过本领域已知的临床上接受的标准来监测治疗功效，例如，疤痕组织占据的面积减少、疤痕组织血管再生、心绞痛的频率和严重性；发展压、收缩压、末端舒张压、对象行动和/或生活质量的改善。
ECFC细胞可将眼从缺氧和新血管形成中拯救出来。因此，本文考虑本文提供的ECFC-状细胞用于治疗各种眼疾病，其中出现缺氧和新血管形成，例如，早熟性视网膜病、糖尿病视网膜病、中央静脉阻塞或黄斑变性。
还考虑本文提供的ECFC-状细胞可用于被覆血管支架内侧的至少一部分和任选的在支架替换期间没有内皮细胞的血管任意区域。在这种情况中，静脉内注射的ECFC-状细胞可结合至损伤区域并且使血管再内皮化以防止其中已经放置支架的血管区域中形成血栓和/或再狭窄。
已知将人类静脉(隐静脉或脐带静脉)作为移植物放到具有狭窄区域和血流堵塞的患者动脉中具有后续狭窄和堵塞血流的高发生率。这与在体内血管重塑过程中早期的血管内皮细胞的损失相关。本文考虑本文提供的ECFC-状细胞可静脉内注射到这种患者的血管中以使植入的移植物再内皮化并保留患者的血管功能。
B.测试试剂筛选
本文公开的ECFC-状细胞可用于筛选影响ECFC-状细胞特性和从中发育的任何组织的因素(如溶剂、小分子药物、肽、寡核苷酸)或环境条件(如培养条件或操作)。在一个实施方式中，可使用本公开的ECFC-状细胞来筛选测试试剂，例如，药物组合物以确定其对内皮健康和/或修复的效果。例如，可由于化合物设计成对内皮细胞有药物效果，或由于设计成对其他部分有影响的化合物可能对内皮细胞有意料之外的副作用进行筛选。在各种实施方式中，本文的ECFC-状细胞可特别用于测试试剂筛选，至少因为它们在体外从培养的多潜能细胞分化。相反，CB-ECFC是从患者血液中获得的原代细胞。筛选测试试剂化合物的各种方法是本领域已知的并且可与本文公开的ECFC-状细胞联用。
例如，筛选测试试剂的活性可包括：i)将本文公开的ECFC-状细胞与测试试剂单独合并或以其他试剂一起合并；ii)确定可能归因于测试试剂的ECFC-状细胞的形态、分子表型和/或功能活性相对于未处理细胞或用对照试剂处理的细胞的变化；和iii)将测试试剂的效果与观察到的变化关联。
在一个实施方式中，可通过测试试剂对ECFC-状细胞活力、存活、形态和分子表型和/或受体中一种或多种的影响来确定该试剂对本文提供的ECFC-状细胞的细胞毒性。
在一个实施方式中，可使用标准试验观察ECFC-状细胞的表型或活性来评价ECFC-状细胞功能。例如，可使用本文公开的ECFC-状细胞来评价细胞培养或体内的分子表达、受体结合中的一种或多种。
C.试剂盒
在一个实施方式中，考虑了用于本文公开的细胞和方法的试剂盒。在一个实施方式中，试剂盒可包含在一个或多个密封瓶中的分化和/或生长培养基，如本文所述。在一个实施方式中，试剂盒可包含一种或多种细胞，如多潜能细胞和/或ECFC-状细胞，如本文所述。在一个实施方式中，试剂盒可包括用于从多潜能细胞生成ECFC-状细胞的说明书。在一个实施方式中，试剂盒可包含在合适容器和包装材料中的用于本发明的各种试剂。
在考虑以下非限制性实施例的基础上，能够更完整地理解本公开。
实施例
实施例1：材料和方法
hES和hiPS细胞的培养：人胚胎干细胞(hESC)系H947和成纤维细胞衍生的人iPS细胞系(DF19-9-11T)48购自WiCell研究所(WiCell Research Institute)(威斯康星州麦迪逊)。也使用在布鲁克斯梅尔和尤德实验室(Broxmeyer and Yoder laboratories)中衍生的几种其他hiPS细胞系(FCB-iPS-1和FCB-iPS-2)来生成ECFCs20,21(表1)。在37℃和5％CO2下，hESC和hiPSC在10cm2培养皿中在MatrigelTM上保持在mTeSR1完全培养基(干细胞技术公司(Stem Cell Technologies))中。在接种细胞后，在第2天、第3天和第4天改变培养基。细胞在第5天传代。吸出培养基并且向各平板中加入4-5mL含有分散酶(2mg/mL，吉布可公司(Gibco))的培养基，其然后在37℃下孵育3-5分钟或直至集落边缘从平板上掀起。从平板中吸出含分散酶的培养基并且用DMEM-F12(吉布可公司)温和清洗细胞三次以去除任何残留的酶。然后用强力洗涤并用5mL移液管刮擦，小心避免气泡来用新鲜培养基从平板收集集落。收集的集落在300x g下离心5分钟。吸出上清并且团块在mTeSR1完全培养基中重悬。在传代之前，用MatrigelTM被覆10cm2培养皿持续30分钟。从培养皿中去除未粘附的MatrigelTM并且将7mL的mTeSR1完全培养基中加入皿中。将均匀分布在TeSR1培养基中的集落加入各平板中。然后使用多次左右摇晃动作使细胞在皿内扩散开同时避免涡旋。在第2天检查培养物的生长质量和形态。进行畸胎瘤形成试验，如之前所述20。
表1：本文实施例中使用的hES和hiPS细胞系。
hES和hiPSC引导分化成EC细胞系，包括ECFC-状细胞：在mTeSR1培养基中培养2天后(-D2)，通过在FGF-2、VEGF165和BMP4(10ng/mL)存在下加入激活素A(10ng/mL)持续24小时来引导指向中胚层细胞系。第二天，去除含激活素-A的培养基并且用8mL含FGF-2(Stemgent)、VEGF165(R&D)和BMP4(R&D)的Stemline II完全培养基(西格玛公司(Sigma))替换。在第3天、第5天、第7天和第8天用8ml的新鲜Stemline II分化培养基来替换培养基。在第9天和之后，用10mL的Stemline II分化培养基来更换培养基。
流式细胞术：在分化后第12天，使用TrypleE来收获粘附细胞并且在EGM-2培养基中制成单细胞悬浮物。对细胞计数并且制备细胞悬浮物用于抗体染色。加入FcR阻断试剂(美天旎生物技术公司，目录号120-000-442)来防止抗体的非特异性结合。以使用前滴定的浓度使用抗-人CD31(CD31-FITC，来自BD法敏进公司(BD Pharmingen)的克隆WM59，目录号555445)、CD144(CD144-PE，来自ebioscience公司的克隆16B1，目录号12-1449-82)和NRP-1(NRP-1-APC，来自美天旎生物技术公司的克隆AD5-176，目录号130-090-900)抗体。向细胞悬浮物中加入碘化丙啶(PI，西格玛公司)来进行死细胞染色。分别在LSR II和FACS Aria(BD公司(Becton Dickinson))上进行细胞表面抗原的流式细胞术检测和细胞分选。使用脐带血衍生的ECFC通过但阳性对照来设定补偿。基于对各荧光颜色的荧光减一(FMO)对照来确定靶向细胞群的门选。
分选细胞的细胞培养：CD31+、CD144+或KDR+和NRP-1+分选的细胞在300X g下离心5分钟，然后在50％EGM-2和50％完全Stemline II分化培养基中重悬。为了从分选群中生成ECFC，每孔2500个细胞接种在大鼠尾部I型胶原被覆的12孔板上。在2天后，吸出培养基并且向培养物中加入3份EGM-2和1份分化培养基。ECFC-状细胞集落以紧密粘附的细胞出现并且在第7天时显示出鹅卵石形态。有时，使用集落圆筒来从异质细胞群中分离ECFC-状细胞集落。进行内皮细胞簇的克隆以分离高增殖性内皮细胞的纯化群，如前所述1,2,49。通过以10000个细胞/cm2的接种密度接种并将ECFC-状细胞维持在完全内皮生长培养基(胶原被覆的平板和cEGM-2介质)中并每隔一天更换培养基来使融合的ECFC-状细胞传代，如前所述1,2,49。
在MatrigelTM上的体外毛细管状网络形成试验：来自各种不同方案的内皮细胞用胰蛋白酶消化并在EGM-2培养基中重悬。细胞以1.0×104个细胞/孔的密度一式三份接种在用50μL减生长因子MatrigelTM(BD生命科学公司)被覆的96孔板中。37℃孵育平板过夜。在8-16小时的孵育之后，使用带10×CP-ACHROMAT/0.12NA物镜的Zeiss Axiovert 25CFL倒置显微镜在10倍放大下拍摄每孔的显微照片。使用生产商的软件用SPOT RT颜色照相机(诊断设备公司(Diagnostic Instruments))来获取图像。用空气物镜获取相衬图像。
免疫化学：ECFC-状细胞用4％(w/v)多聚甲醛固定30分钟并且用含0.1％(v/v)曲通X-100的PBS透化5分钟。在用10％(v/v)山羊血清封闭30分钟之后，在4℃下用以下一抗过夜孵育细胞：抗-CD31(圣克鲁兹公司(Santa Cruz)、抗-CD144(ebioscience公司)、抗-NRP-1(圣克鲁兹公司)和抗-a-SMA(开米康公司(Chemicon))。细胞用PBS洗涤，然后用与Alexa-488或Alexa-565(分子探针公司(Molecular Probe))偶联的二抗孵育，并在用2g/ml DAPI(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))复染之后通过共聚焦显微分析来观察。用使用Olympus uplanSApo 60xW/1.2NA/eus物镜的Olympus FV1000mpE共聚焦显微镜来获取共聚焦图像。所有图像以Z-堆栈拍摄，在室温下有单独的10μ厚切片，并且使用FV10-ASW3.0Viewer来分析图像。
单细胞试验：CB-ECFC或iPS衍生的-ECFC-状细胞或EB-衍生的EC和PAD-衍生的EC经过单细胞试验来评价克隆原性增殖潜力。简言之，用trypLE Express(英杰公司(Invitrogen))处理EC来获得单细胞悬浮物。进行细胞计数和连续稀释以在96-孔培养平板的单个孔中获得每孔0.68个细胞的浓度。在接种后的一天检查孔以确保每孔存在单细胞。在第4、8和12天改变培养基。在培养的第14天，用Sytox试剂(英杰公司)对细胞进行染色，并且通过荧光显微镜检查各孔以对细胞数进行定量(10倍放大；带10倍CP-ACHROMAT/0.12NA物镜的Zeiss Axiovert 25CFL倒置显微镜)。含有2个或更多个细胞的孔被鉴定为增殖阳性(10倍放大；带10倍CP-ACHROMAT/0.12NA物镜的Zeiss Axiovert 25 CFL倒置显微镜)。EC计数为1的孔被分类为非分裂，具有2-50的EC计数的孔被分类为内皮细胞簇(ECC)，具有51-500或501-2000的EC计数的孔被分类为低增殖潜力(LPP)细胞并且具有≥2001的EC计数的孔被分类为高增殖潜力(HPP)孔，如前所述1,2,49。
细胞活力、衰老和细胞增殖试验：内皮细胞分别以5×104每孔或1×105每孔的密度接种到I型胶原被覆的12孔和6孔板上。在24小时后，用含Fc-对照、Fc-NRP-1二聚体(R&D系统公司)或NRP-1封闭抗体的EGM-2培养基替换生长培养基7天，并且每隔一天替换培养基。由基因泰克公司(Genentech)慷慨提供NRP-1A和NRP-1B抗体42。通过台盼蓝排除法来评价细胞活力和增殖，并且在相显微镜下一式三份对每种条件的无染料细胞的数量进行计数。
衰老试验试剂盒购自百信公司(Biovision)(目录号K320-250)并且按照生产商的说明进行试验。简言之，内皮细胞接种到12孔平板中过夜培养以形成单层。第二天，细胞在室温下在0.5ml的市售固定溶液中固定10-15分钟。细胞用1ml的1XPBS洗涤两次并且在37℃下用0.5ml的市售染色溶液染色。细胞在显微镜下观察以显示蓝色。使用带10倍CP-ACHROMAT/0.12NA物镜的Zeiss Axiovert 25CFL倒置显微镜在10倍放大下拍摄每孔的显微照片。使用生产商的软件用SPOT RT颜色照相机(诊断设备公司(DiagnosticInstruments))来获取图像。用空气物镜获取相衬图像。
小鼠：所有动物方案按照实验室动物护理和使用指南进行并且得到印第安纳大学医学院(印第安纳州印第安纳波利斯)的动物护理和使用委员会(IACUC)的批准。所有动物研究使用6-12周龄的雄性和雌性NOD/SCID小鼠(T-和B-细胞缺陷型，受损补体)。NOD-SCID小鼠维持在印第安纳大学实验室动物资源中心(LARC)中在无特定病原体的条件下。使用该动物模型的现有工作来确定需要获得统计学显著结果的动物的最小数量1,50。之前的研究已经显示10的接种的基质(一个动物接受2个基质)中的8个与宿主血管紧密结合并且出于统计学显著性，每组需要这8个具有功能性血管的基质(4个动物)1,50。不使用随机化的方法同时将样品和动物分配到各实验组中。同时，研究者在实验期间和评价结果时知晓组分配。
体内血管形成试验：使用猪皮I型胶原来生成三维(3D)细胞化胶原基质，如前所述4,50。简言之，通过将0.01N HCL中的冰冷猪皮胶原溶液混合，并用磷酸盐缓冲盐水和0.1NNaOH中和达到中性pH(7.4)来制备I型胶原凝胶混合物。在通过在37℃，5％CO2下升温诱导聚合之前，将中和的凝胶混合物(约1.5mg/mL)保持在冰上。将培养的CB-ECFC或ECFC-状细胞或EC添加到胶原混合物上直至两百万个细胞/ml胶原的终浓度。向48孔组织培养皿中加入含有胶原混合物(250μL)的细胞悬浮物并且通过在37℃下在CO2中持续30分钟允许聚合形成凝胶。然后在37℃下在5％CO2中过夜用500μl培养基覆盖凝胶。
在18小时的离体培养之后，细胞化的凝胶接种到6至12周龄NOD/SCID小鼠的肋部(靠近宿主血管的前腹壁的钝性切口的皮下囊)，如前所述1,49。在麻醉和持续供氧下进行移植胶原凝胶的手术过程。缝合切口并监测小鼠恢复情况。移植后2周，通过在已经按照批准的IACUC方案人道处死的动物中切下移植物来回收凝胶。如前所述用H&E和抗-人CD31染色来进行免疫组化来检验凝胶中小鼠血红细胞灌注的人内皮细胞系血管。使用带附属Spot-KE数字显微镜(密歇根州斯特灵海茨的诊断设备公司(Diagnostic Instruments))的LeicaDM 4000B显微镜(美国伊利诺伊州班纳克伯恩的莱卡微系统公司(Leica Microsystems))来对各移植物的hCD31+血管进行成像。只有在其含有至少一个小鼠红细胞的情况下对功能性血管进行计数。
氧诱导的视网膜病模型：所有试验按照眼科和视觉研究中动物使用的ARVO声明和英国内政部规定进行。在C57/BL6野生型小鼠中诱导氧诱导的视网膜病，如前所述2。简言之，出生后第(P)7天的新生小鼠及其护理围栏接触75％氧(Pro-Ox 110室控制器；Biospherix，纽约州雷德菲尔德)持续5天。在P12时，它们转移回室内空气。在P13，小鼠接受1μl含1×105的之前已经标记的hiPSC-ECFC-状细胞、hiPSC-EBT-CD144+EC或CB-ECFC的玻璃体内注射物(Qtracker 655；英杰公司)。使用没有生长因子和血清的无酚红DMEM作为载剂并且注射到每只小动物的左眼作为对照。虽有小动物在72小时后用戊巴比妥钠处死并且眼固定在4％多聚甲醛中。用凝集素B4(西格玛公司)和链霉素-AlexaFlour488(英杰公司(Invitrogen))对视网膜平面固定物进行染色，并且使用共聚焦显微镜对染色的视网膜进行观察和成像。由三名独立不知情的研究人员使用ImageJ软件进行区域定量，如前所述2。
小鼠后肢缺血模型：如前所述进行后肢缺血实验24。简言之，用龙朋(rompun)(20mg/kg)和氯胺酮(100mg/kg)麻醉6周龄的无胸腺雄性裸鼠(体重25-30g；韩国首尔的东方生物动物公司(Orient bioAnimal Inc.))通过皮肤切口用6-0丝(爱惜康公司(Ethicon))来连接股动脉及其分支。然后连接髂外动脉和其上的所有动脉。从作为髂外动脉分支的近端来源到分成隐动脉和膝后窝动脉的地方的远端点切除股动脉。在动脉切除之后，立刻将无胸腺小鼠随机分入4个实验组中的一个。在缺血手术之后，hiPSC-ECFC-状细胞或CB-ECFC或hiPS-EBT-CD144+EC(1.0×106个细胞/小鼠)在200μl的EGM-2中悬浮，并且这些细胞或载剂对照用29-规格的结核菌素注射器肌肉内注射到股内侧的股薄肌的6个位点。使用激光Doppler灌注成像仪(摩尔仪器公司(Moor instruments))来测量处理后第0天和第28天的后肢中的血流，如前所述24。分析数码颜色编码图像来从自膝关节至脚趾的区域中的血流进行定量，并且计算平均灌注值。在CHA大学的动物护理委员会的批准下进行后肢缺血实验的所有动物护理和实验过程(IACUC编号130024)。
从外周血管疾病(PAD)的患者中分离动脉EC：经知情同意，并且使用由印第安纳大学人类IRB组批准的方案从经过下肢截肢的外周血管疾病患者中获得带病动脉(DA)EC。由于高风险酵母污染，本研究中不使用患有活性蜂窝织炎、排脓或湿性坏疽的患者。类似地，本研究排除患有乙肝或丙肝的患者，以及患有HIV的患者。在横切之后，立即在操作室中在与操作现场分开的无菌台上的探究断开的腿的合适动脉试样。认为合适的样品置于充满汉克斯平衡盐溶液(HBSS；英杰公司)的容器中并且带至实验室中用于加工。在无菌条件下，血管在组织培养皿中在长度上打开并且浸入EGM-2培养基(隆萨公司(Lonza))中。用细胞刮(瑞士苏黎世的TPP)刮下各血管的内膜并用DMEM洗涤。洗涤留下的细胞组分在1620rpm下离心10分钟，之后将其接种到大鼠尾部I型胶原被覆的6孔平板上。在几天后，可通过光学显微镜观察生长的内皮集落，并且用克隆圆筒分离这些集落，用胰蛋白酶消化并再接种到新6孔平板上以防止间充质细胞污染。纯化的EC再传代1-2次，然后在冷冻保存之前在T-75组织培养烧瓶(TPP)中扩增。
从PAD患者的外周血培养内皮细胞：将从各患者的外周血或脐带血分离的单核细胞接种到用I型大鼠尾部胶原被覆的6孔组织培养平板上，并且在补充10％FBS，2％青霉素-链霉素的完全内皮生长培养基(EGM-2)中培养。细胞维持在37℃，5％CO2潮湿孵育器中，并且隔天改变培养基持续2-3周或直至出现鹅卵石的内皮集落。在开始出现集落之后，细胞转移至6孔平板的新孔中并且在25-cm2烧瓶中进一步传代，并且在传代时处于85-95％融合。在所有研究中使用在传代3-7次时处于70％融合的PAD细胞。
Western印迹分析：通过在裂解缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.5，150mM NaCl，10％甘油，1％曲通X-100，2mM EDTA，1mM Na3VO4，抑肽酶和亮肽素各1ug/ml)中重悬细胞之后在冰上孵育20分钟来制备细胞裂解物。通过在12,000Xg下离心15分钟来去除不溶性组分。使用蛋白质试验试剂盒(伯乐公司(Bio-rad))来确定蛋白质浓度。蛋白质通过在4-20％的Tris-甘氨酸微型胶上电泳分离，然后转移到immobilon-FL PVDF膜(密理博公司(Millipore))上。用封闭缓冲液在室温下1小时来封闭非特异性结合，并且在4℃下用含针对磷酸-PYK2(1:1,000；细胞信号公司(Cell Signaling))和磷酸-p130Cas(1:1,000；细胞信号公司)的一抗的Odyssey封闭缓冲液过夜孵育。用含0.1％吐温20的PBS洗涤印迹，之后在室温下用抗-兔抗体(1:10,000；LI-COR)孵育1小时。使用Odyssey红外成像仪(LI-COR)来监测免疫反应条带。
RNA序列文库构建、测序和分析：使用Trizol试剂(英杰公司(Invitrogen))从样品分离总RNA并且如前所述对RNA的量进行检查32。使用1μg高质量总RNA来生成RNA序列文库并且使用Illumina HiSeq2000测序仪来进行测序，如前所述32。对从hiPSC-分化第0天，hiPSC-衍生的细胞-分化第3天、hiPS-衍生的ECFC-状细胞-分化第12天、hES-衍生的ECFC-状细胞和CB-ECFC中分离的总RNA进行RNA-序列分析。使用默认参数的TopHat，所得的序列读数可映射到人基因组(hg18)上。并且使用CuffLinks对RefSeq(2010年6月)转录本水平(FPKM)进行定量。然后通过使用heatmap.2的R统计学软件包从RNA-seq数据的红到绿标尺作图来分析属于单独胚层和谱系的选择转录本的热图。
对转录本表达的进一步分析以检测相对于CB-ECFC在hiPS-ECFC-状细胞中差异表达的基因包括(1)使用STAR的读数映射(Dobin等，(2012)Bioinformatics,doi:10.1093/bioinformatics/bts635)(2)使用HTseq的表达估计(Anders等，(2014)Bioinformatics,doi:10.1093/bioinformatics/btu638)，和(3)使用DESeq的差异分析(Anders和Huber(2010)Genome Biology 11:R106)。首先，基于特定基因模型将RNA-Seq读数映射至参照基因组，即基因组上外显子和连接位点的位置。STAR使用参照基因组、GTF文件、和RNA-Seq读数作为其输入，并且使用未压缩的后缀数组用于分选序列来检测已知连接(已知同种型的连接)，从头检测规范连接(已知外显子之间的连接)，不规范接头和嵌合转录本如融合。具体地，STAR 2.4.0与使用Ensembl版本70基因模型的Human Genome GRCH37一起运行。基于映射结果，使用HTseq 0.6.1来将对与各基因重叠的映射数量计数成组2(hiPSC-衍生的细胞D3分化)、3(hiPSC-衍生的ECFC-状细胞)和4(CB-ECFC)的表达值。一旦获得读数计数，考虑在组2中未表达但至少在组3或4中表达的基因。然后，使用DESeq来检测与这些候选物中差异表达的基因。在DESeq模型中，通过负二项(NB)分布来对样品中的数据进行计数以结果传统泊松模型中过度分散的问题(即，可能低估变化)。DESeq也包括来自其他组的几个模型以改善数据拟合，使得即使重复的数量不够高(在这种情况中是三次重复)，该模型估计对于检测差异而言仍然是稳健的。
统计学分析：所有实验一式三份进行≥3次，并且数据表示成平均值±SD用于统计学比较。使用95％置信区间的功效分析来计算获取统计学上显著的结果所需的样品尺寸。使用的取样数量给出正态分布。使用双尾斯氏t检验评估差异显著性。
实施例2：使用现有技术方案生成的hES和hiPS-衍生的EC缺少脐带血ECFC的性质。
人内皮细胞之前已经通过与OP9体细胞共培养22,25,30,31或通过拟胚体(EB)形成23,24,26-29，之后施加各种生长因子和/或受体信号转导通路抑制剂来促进内皮细胞分化衍生自人多潜能干细胞。
在该研究中，hES或hiPS在OP9共培养或EB条件下持续1周分化，然后在内皮培养基中扩增细胞(分别为图1a和2a)。
OP9共培养的分化(图1)：在第8天时OP9共培养分化的细胞显示出具有内皮状形态的细胞的区域(图1a顶部组图)。在内皮培养基中分离和培养之后，OP9共培养分化的细胞在P1初始显示出内皮鹅卵石状形态(图1a，上部中间组图)，并且在P4之前逐渐变成具有少数显示出内皮鹅卵石形态的细胞的细胞异质群，并且大部分细胞包含成纤维细胞状外观(图1a，下部中间组图)。P4的细胞包含CD31、CD144和CD146表达的异质特征，仅一部分细胞表达所有这些抗原(图1b)。当接种在MatrigelTM上时，OP9-共培养细胞形成具有以下大分支的血管状网络(图1c)。在P3或P4，接种单细胞用于克隆增殖潜力分析，并且结果评为以下：不分裂或分裂形成2-50的集落(EC簇)、51-500(低增殖潜力EC；LPP-ECFC)、501-2000(LPP-EC)、或≥2000个细胞(高增殖潜力-ECFC；HPP-EC)的单细胞，如前所述1,2。由OP9共培养的hES-衍生的克隆细胞形成的HPP-EC和LPP-EC集落的分布特征明显不同于由CB-ECFC克隆显示的分布特征(图1d)。
不到2％的衍生自OP9共培养细胞的EC产生HPP-EC，实际上，大部分OP9-共培养衍生的EC并不分裂或产生EC簇(图1d)。EC集落形成的这些特征明显不同于由CB-ECFC衍生的单EC显示的特征(图1d)。由于复制衰老，OP9共表达衍生的EC的增殖不可能超过P7(图1e)。另外，P5时的EC无法在移植后在体内产生人血管。
EB-分化的细胞(图2)：在内皮培养基中分离和培养之后的KDR+NRP-1+细胞显示出细胞形态的异质群，其中仅一部分细胞显示内皮特征(图2a，上部中间组图)。在进一步表达之后(P4)，这些细胞主要由包括具有成纤维细胞状外观和少数内皮鹅卵石形态的细胞(图2a，下部中间组图)。在hiPS和hES衍生的EC细胞中，显示了CD31、CD144和CD146表达的异质特征，仅一部分细胞表达所有这些抗原(图2b)和具有多个较小不完整萌芽状分支的EB-培养的细胞形成的血管状网络(图2c)。在P3或P4，接种单细胞用于克隆增殖潜力分析，并且结果评为以下：不分裂或分裂形成2-50的集落(EC簇)、51-500(低增殖潜力EC；LPP-EC)、501-2000(LPP-EC)、或≥2000个细胞(高增殖潜力-ECFC；HPP-EC)的单细胞，如前所述1,2。由基于EB的hES-衍生的细胞形成的HPP-EC和LPP-EC衍生的集落的分布特征明显不同于由CB-ECFC克隆显示的分布特征。不到2％的衍生自EB-衍生的细胞的EC产生HPP-EC，实际上，大部分EB-衍生的EC并不分裂或产生EC簇(图2d)。EC集落形成的这些特征明显不同于由CB-ECFC衍生的单内皮细胞显示的特征(图2d)。由于复制衰老，EB-衍生的内皮细胞的增殖不可能超过P7(图2e)。另外，P5时的内皮细胞无法在移植后在体内产生人血管。
在外源性TGF-β抑制剂存在下分化的细胞(图3)：测试了包括初始EB形成，之后2D粘附细胞培养(额外生长因子)的替代性2-步内皮分化方案以确定hES和/或hiPS细胞是否可用于生成具有ECFC-状性质的细胞。基于血管内皮生长因子(VEGF)信号转导通路在hES细胞的内皮细胞谱系分化23和发育33,34期间的内皮细胞出现中的重要性，使用神经毡蛋白-1(NRP-1)作为标记物来鉴定ECFC-状细胞的出现。NRP-1是一种VEGF共受体和脑信号蛋白3A结合多功能蛋白，其在包括内皮细胞、血管平滑肌细胞和淋巴细胞的各种组织中表达35。虽然NRP-1在血管发生中的作用未知，但是小鼠中NRP-1和NRP-2的双敲除导致与VEGFR-2敲除的小鼠相似的胚胎致死表型35,36。在悬浮培养4天中生成hES(H9系)和hiPS细胞-衍生的(DF19-9-11T，FCB-iPS-1和FCB-iPS-2)EB，并且将它们接种到MatrigelTM被覆的皿中持续10天24(图3a，b)。这种方案需要将分化内皮细胞从第7天开始连续接触TGFβ抑制(图3a)。当EB(图3b，左侧第二组图)在第4天粘附至MatrigelTM被覆的平板时，在2D培养中的EB-衍生的细胞粘附并生长以形成具有内皮状形态(在第6天和第9天)的区域并且在第14天之前变得融合。
共表达NRP-1和CD31的细胞(NRP-1+CD31+细胞)在第3天出现(0.17％)并且随着时间增加，在第14天达到顶峰(1.6％)(图3c)。分选的细胞的不同亚组随后在补充TGF-β抑制剂(10μM SB431542)的内皮生长(EGM-2)培养基中培养2周，因为已经报道了TGF-β促进从hES或hiPS细胞分化内皮细胞谱系并且防止细胞转化成间充质细胞24。NRP-1+CD31+亚组产生具有与CB-ECFC所示相似的特征性内皮鹅卵石形态的细胞(图3d，顶部组图)。虽然大多数hES-衍生的细胞亚组在接种到MatrigelTM中之后形成毛细管状网络，NRP-1+CD31+细胞形成与CB-衍生的ECFC所示相似的完整结构(图3d)。由NRP-1+CD31-、NRP-1-CD31+和CD144+CD146+亚组形成的HPP-EC和LPP-EC集落的分布特征明显不同于由CB-ECFC显示的特征(图3e)。然而，由单NRP-1+CD31+细胞形成的HPP-EC和LPP-EC集落的分布特征与由CB-ECFC克隆显示的特征相似(图3e)。在克隆水平上，所有单个NRP-1+CD31+接种的细胞分裂并且许多克隆(37％)形成HPP-EC，而很少NRP-1+CD31-或NRP-1-CD31+细胞形成HPP-EC(图3e)。因此，在经历内皮分化的hES-衍生的细胞中NRP-1和CD31的共表达(EB加2D方案)鉴定产生具有高克隆增殖潜力和血管原性活性的EC，但仅在TGF-β抑制的连续存在下培养时发生(除去TGF-β抑制剂与降低的增殖潜力、丧失内皮形态、和增加的α-平滑肌肌动蛋白[α-SMA]的表达相关，如前所述24)。
总结，上述测试的方法都无法促进具有与脐带血ECFC相似性质的稳定EC的出现。
实施例3：用于从hES和hiPS细胞生成稳定NRP-1+CD31+ECFC-状细胞的方案。
发明人致力于开发一种内皮细胞谱系分化方案，其促进产生具有ECFC-状性质的NRP-1+CD31+细胞，但并不需要TGF-β抑制，产量足够大以支持细胞增殖成临床有用体积的细胞。
人多潜能细胞在mTeSR1培养基中MatrigelTM-包覆的平板上培养2天37。为了诱导内皮细胞谱系分化，在分化的第0天用补充了10ng/mL激活素-A、BMP4、VEGF165和FGF-2的Stemline II培养基替换mTeSR1培养基。在第二天用补充选择的生长因子的新鲜StemlineII培养基来替换组织培养基直至第12天，此时分析培养物中共表达CD31和NRP-1抗原的细胞(图4A)。使用这种方案，可能分别从hiPS和hES细胞中收获平均4.5％和2％NRP-1+CD31+细胞。与7天培养中的NRP-1-CD31+细胞相比，NRP-1+CD31+细胞产生60％更多的内皮集落(图4B，左图)和多15倍的总内皮细胞(图4B，右图)。NRP-1+CD31+后代是同源的并且显示出鹅卵石外观(图4c和4f)，其中，集落内的异质细胞群发现获自NRP-1-CD31+细胞(图6a)。与NRP-1-CD31+细胞相比，NRP-1+CD31+细胞开始的7天增殖培养中发现总细胞数的显著增加(15倍)(图4b)。另外，从NRP-1+CD31+分选的组分生长的细胞显示出CD31和NRP-1的表面共表达(图4d)以及CD144的均一表达，但是完全没有α-SMA表达(图4d)，与NRP-1-CD31+后代相反(图6b)。仅2％的NRP-1+CD31+细胞亚组无法分裂并且48％形成HPP-ECFC(图4e和图6e)，其具有与脐带血ECFC非常相似的分布特征(图4e)，但是非常不同于NRP-1-CD31+亚组。此外，当接种到MatrigelTM上时，NRP-1+CD31+细胞形成高度分支化的毛细管状结果(图4f)，NRP-1-CD31+细胞在接种到MatrigelTM上时不会形成这种结构(图6d)。
在麻醉下，置于细胞化胶原凝胶中的ECFC(CB-ECFC和hiPS-衍生的ECFC-状细胞)植入免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠的皮下囊中。在植入后14天人道处死小鼠之后回收凝胶。凝胶用不与小鼠宿主细胞交叉反应的特异性抗-人CD31抗体固定、透化和染色，如前所述1,49。hES和hiPS-衍生的NRP-1+CD31+细胞产生具有强健体内血管形成能力的EC，其与宿主鼠血管紧密结合(图4g和f)，与前述的CB-ECFC的情况相似1。在超过24只动物中，在植入免疫缺陷小鼠中超过3个月之后，NRP-1+CD31+细胞并不诱导畸胎瘤形成(数据未显示)。然而，NRP-1-CD31+细胞无法生成功能性人血管(图6c)。总体来说，ECFC-状细胞方案第12天衍生的NRP-1+CD31+细胞显示出基本纯的鹅卵石形态，表达典型内皮抗原，在体外在MatrigelTM上形成毛细管状网络，显示高克隆增殖潜力，并产生填充宿主鼠血管的血红细胞的体内人体血管。因此，第12天分化的hES和hiPS衍生的NRP-1+CD31+细胞组分产生具有与CB-ECFC相似的多种性质的内皮细胞。这类细胞在本文中称为ECFC-状细胞。
确定了第1天分化的hES和hiPS细胞不共表达CD31和NRP-1(图5)，但是NRP-1+CD31+细胞逐渐增加并且在培养的第12天达到最高水平(图5；图7a)。经历ECFC分化的hES和hiPS细胞在第9天和第12天显示出现鹅卵石状形态(图7b和图8a和9a)，并且观察NRP-1+CD31+细胞的集落在其他分化的细胞之间出现(图8b和9b)。共表达CD144和CD31的细胞的最高百分比来自在第12天衍生的NRP-1+CD31+细胞(图7c；图9d)。第6天衍生的细胞在接种到MatrigelTM上之后形成不完整的毛细管状网络(图9e)。第9天和第12天衍生的细胞形成完整毛细管状网络(图9e)。总之，在第12天衍生的NRP-1+CD31+EC产生ECFC-状细胞，其显示出最高频率的典型内皮抗原的共表达，而不表达间充质抗原α-SMA(图8和9)，并且用于进一步研究。
除了上述的皮下移植方法以外，使用2个其他模型来测试hiPSC-ECFC-状细胞的内皮功能。制备可以下三个研究组：(i)hiPSC-ECFC-状细胞，(ii)hiPSC-拟胚体-衍生的TGFβ-抑制的CD144+内皮细胞(hiPSC-EBT-CD144+EC)(James等，2010)和(iii)CB-ECFC(Yoder等，2007；和Ingram等，2004)。
在第一模型中，测量了在接触高氧浓度的新生小鼠中的血管形成拯救和新生血管簇减少(Medina等，2010)。在新生小动物中的氧诱导的视网膜病(OIR)来自缺氧诱导的视网膜血管丧失，之后是过度增生的视网膜缺氧响应。接受hiPSC-ECFC-状细胞的视网膜(≥36％减少；**P<0.01)而不是接受hiPSC-EBT-CD144+EC的视网膜(无血管面积减少≤14％；P＝不显著(ns))中出现的损伤后无血管区域的明显减少(图10a，b)。另外，只有hiPSC-ECFC-状细胞显著减少了视网膜前新血管簇(图10c；hiPSC-EBT-CD144+EC结果未显示)。用Qdots655预标记细胞并且在细胞递送后72小时成像，显示与hiPSC-EBT-CD144+EC相比，hiPSC-ECFC-状细胞以更高的数量和更广泛的分布整合到宿主视网膜组织中(图11a)。hiPSC-ECFC-状细胞，而不是hiPSC-EBT-CD144+EC，似乎在表面视网膜丛中形成血管状结构(图11b)。
也研究了裸小鼠中后肢股血管去除的第二模型24。与hiPSC-EBT-CD144+EC相比，hiPSC-ECFC-状细胞显著改善了血流和缺血肢体康复(P<0.05；图10d–f并且数据未显示)。在这些试验中，hiPSC-ECFC-状细胞的功能与CB-ECFC相似。
原代细胞不能长期增殖，但是相反，在长期体外培养之后经过衰老38。可能扩增hiPS-ECFC-状细胞和CB-ECFC至P18，而没有丧失典型的内皮细胞特征(图12a，b)。人iPS-ECFC-状细胞显示与CB-ECFC对照相似的均一鹅卵石内皮单层(图12a)。CB-ECFC和hiPS-ECFC-状细胞成功地扩增至P18(图12b)。只有3％的hiPS-ECFC-状细胞在P7显示出细胞衰老标记物β-半乳糖苷酶的表达并且80％或更多的细胞在P18之前显示出复制衰老，这与CB-ECFC对照细胞显示的衰老概况相似(图12c)。重要的是，虽然大部分的hiPS-ECFC-状和CB-ECFC在P18时衰老并且显示非永生的原代细胞特征18，但是它们仍然维持内皮鹅卵石形态和内皮抗原CD31、NRP-1和CD144的表达而非α-SMA表达(在这些细胞中完全没有α-SMA表达；图12d)。因此，hiPS-衍生的ECFC-状细胞在长期扩增培养期间维持稳定内皮表型。
实施例4：NRP-1+CD31+ECFC-状细胞显示相对于CB-ECFC有相似性和差异的分子概 况。
为了进行对各种EC亚组的更复杂分子比较，进行全转录组测序(RNA-seq)分析来鉴定并比较以下的分子概况：i)未分化的hiPS细胞(hiPS-第0天)；ii)第3天-分化的hiPS细胞(hiPS-第3天)；iii)第12天hiPS-衍生的NRP-1+CD31+ECFC-状细胞(hiPS-ECFC-状细胞)；iv)第12天hES-衍生的NRP-1+CD31+ECFC-状细胞(hES-ECFC-状细胞)；和v)CB-ECFC，如前所述32。
人iPS-ECFC-状细胞和hES-ECFC-状细胞显示与CB-ECFC所展示的那些相似的相对基因表达概况(图13a)。人iPS-第0天显示多潜能细胞的转录组概况特征，其具有一般在分化的细胞中看到的转录本有限表达(图13a)。然而，hiPS-第3天细胞显示多谱系特异性基因(原始条痕板、内胚层、中胚层、造血和软骨-骨-脂肪生成基因)的增加表达，包括多潜能细胞分化开始(图13a)。hiPS-和hES-衍生的ECFC-状细胞都显示减少的多潜能和非内皮细胞谱系特异性基因转录本表达(图13a)但是增加的内皮基因转录本表达(图13a和b)，与CB-ECFC相似。
也在hiPS-衍生的ECFC-状细胞中鉴定到转录本表达相对于脐带血衍生的ECFC的各种差异(表2)。例如，相对于脐带血衍生的ECFC，以下基因在hiPS-衍生的ECFC-状细胞中过表达：假拟蛋白LOC100132288，CUB和Sushi多结构域1，淋巴-限制膜蛋白，芳基乙酰胺去乙酰化酶(酯酶)，滤泡抑素-状5，ENSG00000215262，假拟LOC84856，鸟苷酸环化酶激活剂2B(尿鸟苷素)，角蛋白75，成纤维细胞活化蛋白，α(FAP)，染色体22开放阅读框34，GSDM蛋白(gasdermin)C，ENSG00000222954，羟基类固醇(11-β)脱氢酶1，吲哚胺2,3-双加氧酶2和Zic家族成员4。相对于脐带血衍生的ECFC，以下基因在hiPS衍生的ECFC-状细胞中欠表达：受体(化学感受性)转运蛋白4，染色体X开放阅读框61，酰基-CoA合成酶中等链家族成员2A，丝抑蛋白肽酶抑制剂，进化支A(α-1抗蛋白酶，抗胰蛋白酶)，成员3，ENSG00000218052，趋化因子(C-C基序)配体23，含卷曲螺旋结构域48和RAS(RAD和GEM)-状GTP-结合1。
表2：相对于CB-ECFC在hiPS ECFC-状细胞中差异表达的转录本。
实施例5：NRP-1强化ECFC-状细胞出现期间必需的KDR-介导的信号转导。
虽然，NRP-1在心血管发育和血管生成中的作用已知35,36,39，还未完全理解NRP-1在EC中发挥功能的机制。已经提出EC表面上存在的NRP-1结合至VEGF165作为共受体并且与VEGF受体2(KDR)40形成信号转导复合物。NRP-1具有小的胞质结构域，其没有确定的固有激酶活性。KDR具有固有激酶活性并且NRP-1-VEGF165-KDR信号转导复合物的形成增强了VEGF-KDR-介导的信号转导活性和生物学功能40-43。NRP-1看似不是通过KDR42-44介导VEGF165信号转导所必需的，但是，已经清楚地显示是最大KDR活性和/或KDR酪氨酸磷酸化所需的35,40-43并且通过内皮细胞中p130Cas/Pyk2激活43,44选择性介导VEGF-KDR信号转导。已经使用了二聚体Fc-NRP-1，一种膜NRP-1的替代物45，和阻断NRP-1与VEGF结合(NRP-1-B)42的特异性单克隆抗体来分别增强并阻断NRP-1-介导的活性。虽然Fc-NRP-1作用是天然寡聚膜NRP-1的代表物45，但是NRP-1-B特异性阻断VEGF165与NRP-1的结合42。由于本文提供的数据表明第6天分化的hiPS细胞在KDR表达上显示丰富的上调，但是有限的NRP-1表达(图15b的插图)，发明人假设增加的NRP-1活性可能增强KDR激活。进行时间和剂量响应实验来鉴定对于持续给予可重复结果的治疗所需的特定剂量(对于Fc-NRP-1二聚体为3.3nM，并且对于NRP-1-B为500ng/mL)和时间长度(4-6天)(数据未显示，图15a)，如前所述42,45。在4天的治疗之后，在FC-NRP-1二聚体处理的细胞中发现明显增加的NRP-1+CD31+细胞生成(图15b)并且阻断抗体NRP-1-B明显减少了NRP-1+CD31+细胞的生成(图15b)。这种效果在第12天进一步强化(图15b)。
参考图15c，在顶部印迹中，用Fc-对照(3.3nM)、Fc-NRP-1二聚体(3.3nM)或NRP-1-B(500ng/mL)处理经历ECFC-状细胞分化的hiPS细胞，如图13A所述。细胞饥饿处理5.5小时并且用VEGF165(30ng/mL)刺激5分钟。细胞裂解物经过使用针对磷酸-KDR和总KDR的抗体的Western印迹分析。箭头显示NRP-1二聚体和NRP-1-B处理的hiPS细胞中磷酸-KDR的表达。在底部组图中，每行显示总KDR水平。
在VEGF刺激的组中观察到KDR磷酸化并且与对照处理的细胞相比，Fc-NRP-1二聚体处理增加了KDR的磷酸化。然而，在NRP-1-B处理的细胞(n＝3)中观察到降低的磷酸化。在底部印迹中，用所示浓度的Fc-对照、Fc-NRP-1二聚体或NRP-1-B来处理经历ECFC-状细胞分化的hiPS细胞。细胞经饥饿处理并且用VEGF165(30ng/mL)刺激5分钟。细胞裂解物经过使用针对磷酸-p130Cas、磷酸-Pyk2和总Pyk2的抗体的Western印迹分析。上图箭头显示磷酸-p130Cas的表达，并且中图箭头显示磷酸-Pyk2表达；下图显示Fc-对照(C；3.3nM)，Fc-NRP-1二聚体和NRP-1-B处理的iPS细胞中的总pyk2。下图显示各行中的总KDR水平。与对照处理的细胞相比，在Fc-NRP-1二聚体处理的组中观察到以剂量依赖方式增加的P-130Cas和Pyk2磷酸化。然而，与对照处理的细胞相比，在NRP-1-B处理的细胞中观察到减少的P-130Cas和Pyk2磷酸化。我们也发现Fc-NRP-1二聚体处理的细胞中增加的KDR激活和p130Cas激活，其是一种已知NRP-1-介导的KDR40,44激活特异性激活的下游分子(图15c)。相反，NRP-1-B处理的细胞显示出减少的KDR磷酸化和减少的下游分子激活(图15c)。这些数据表明NRP-1强化了通过增强KDR信号转导从人多潜能干细胞生成ECFC-状细胞。
接着，发明人假设NRP-1也可能参与培养的ECFC-状细胞的增殖潜力维持。发现NRP-1表达在晚代hiPS-ECFC-状细胞中逐渐下调，并且与降低的总增殖潜力相关(图16a和b)。对晚代(P14)EC中KDR表达的分析显示40-50％的KDR表达(图16c)。然而，当在Fc-NRP-1存在下培养7天时，与对照和NRP-1-B处理的组相比，P14EC显示明显增加的扩增，但是减少的β-半乳糖苷酶表达(衰老标记物)(图16d-f)。
与对照处理的细胞相比，Fc-NRP-1处理的P14EC的促凋亡细胞百分比显著减少，如在晚代(P14)hiPS-ECFC-状细胞中看到的那样，该细胞在含有VEGF165的常规EGM-2培养基以及含有VEGF121的EGM-2培养基中表达并且用对照、Fc-NRP-1和NRP-1-B处理7天(图16g)。在7天后，对细胞进行收集、计数并用碘化丙啶和膜联蛋白V染色以检验各处理组中的活细胞、促凋亡细胞和死细胞。与在VEGF121存在下培养的细胞相比，在含VEGF165的培养基中培养的细胞中，用对照、Fc-NRP-1和NRP-1-B处理7天后的含VEGF165和VEGF121的培养基中促凋亡细胞的百分比显著降低。
已经确认Fc-NRP-1对KDR激活的影响依赖于VEGF165的存在，因为VEGF121无法促进Fc-NRP-1与含有KDR的P14ECFC-状细胞之间的相互作用(图16g-i)。因此，Fc-NRP-1通过VEGF165激活KDR在近衰老的hiPS-衍生的ECFC-状细胞中拯救增殖以及降低衰老标记物的表达和促凋亡行为上起作用。
在初步研究中，确定衍生自PAD和CLI患者的原代EC显示低水平的NRP-1表达，具有低临床增殖潜力，显示衰老标记物并且在植入免疫缺陷小鼠之后不形成强健体内血管(图17a-g)。然而，Fc-NRP-1处理促进了从PAD和CLI患者分离的循环和固定动脉衍生的内皮细胞的增殖、存活和略微降低的衰老迹象(图17h-n)。因此，晚代近衰老的hiPS-ECFC-状细胞和患者衍生的PAD-EC的Fc-NRP-1治疗以VEGF165依赖方式增加了增殖潜力，降低凋亡，和减少衰老标记物。
实施例6：讨论。
在上述实施例中，已经提供并测试了用于重复衍生和分离基本纯和稳定的具有脐带血ECFC-状性质的EC，在此称为ECFC-状细胞的群的方法。
ECFC-状细胞具有与CB-ECFC相似的性质：NRP-1+CD31+细胞形成具有特征鹅卵石外观的均一单层，显示高克隆增殖潜力，在MatrigelTM上培养时通过形成完全毛细管状结构证明血管原性性质，并且在没有共移植细胞的情况下植入免疫缺陷小鼠时形成强健体内紧密结合的血管。这些人多潜能干细胞-衍生的ECFC-状细胞是稳定的并且不在长期培养(18代)中转化成非内皮细胞并且可在不到3个月内从单个起始多潜能细胞扩增至超过1万亿EC(图18)。与原代CB-ECFC不同，本文提供的ECFC-状细胞显示稳定的ECFC特征并且具有扩增成适用于各种临床应用的细胞体积的潜力。另外，本文提供的ECFC-状细胞可以是患者特异性的，例如，如果它们衍生自来自患者的iPSC。
ECFC-状细胞具有与使用已知方案体外生成的EC不同的性质：从ECFC-状细胞高效输出功能性EC(即，在不到3个月内超过1万亿EC)与使用其他公开的方案从hPSC衍生的0.622、7.424和11.646EC的报告产量形成反差。另外，使用其他公开的方案从hPSC衍生的EC并没有在没有共移植细胞存在的情况下体内植入时形成血管的能力。
已经发现NRP-1-VEGF165-KDR-介导的KDR激活及其下游信号转导分子是从hPSC出现并衍生ECFC-状细胞，和强化晚代近衰老hPSC-衍生的ECFC-状细胞和患者-衍生的近衰老ECFC存活和增殖潜力的机制。本文提供的结果表明，可考虑使用患者衍生的ECFC-状细胞作为治疗患有心血管疾病患者的疗法。
虽然已经参照某些具体实施方式描述了本公开，但是其各种修饰将对于本领域技术人员而言是显而易见的而不偏离所附权利要求中所列的本公开的范围和目的。本文提供的任何实施例仅包括用于显示本公开的目的而非以任何方式限制本公开。本文提供的任何附图仅用于显示本公开的各方面的目的而并不旨在以任何方式约束或限制本公开。本文引用的全部现有技术的公开内容通过引用全文纳入本文。
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Claims (32)

1.一种用于从人多潜能干细胞生成人内皮集落形成细胞-状细胞(ECFC-状细胞)的分离群的方法，所述方法包括：
a)提供多潜能干细胞；
b)诱导所述多潜能干细胞经过内皮分化，其中诱导包括：
i)在包含激活素A、BMP-4、VEGF和FGF-2的内皮分化培养基中培养所述多潜能干细胞约24小时；并且
ii)此后约每1或2天用包含BMP-4、VEGF和FGF-2的内皮分化培养基替换步骤i)的培养基；并且
c)从经诱导以经过分化的细胞中分离ECFC-状细胞，其中ECFC-状细胞是CD31+NRP-1+并且显示出鹅卵石的形态。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分离的ECFC-状细胞的特征还在于CD144+、KDR+和α-SMA-表达中的一种或多种。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，以约5-25ng/mL的浓度提供激活素A、BMP-4和FGF-2中的一种或多种。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，以约5-50ng/mL的浓度提供VEGF。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述诱导步骤在没有以下中的一种或多种的情况下进行：共培养细胞、拟胚体形成和外源性TGF-β抑制。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述分离步骤在分化的第10、11或12天进行。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述分离步骤在分化的第12天进行。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，通过流式细胞术或磁性活化细胞分选来进行所述细胞分离。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述分离的ECFC-状细胞具有在没有共移植细胞的情况下植入哺乳动物时形成血管的能力。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，在分离的ECFC-状细胞群中至少约95％的ECFC-状细胞增殖。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其特征在于，在分离的ECFC-状细胞群中至少约35-50％的ECFC是高增殖潜力(HPP)ECFC-状细胞。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述HPP ECFC-状细胞具有每个起始细胞产生至少约2001个细胞的能力。
13.如权利要求11或12所述的方法，其特征在于，所述HPP-ECFC-状细胞具有自我补充的能力。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
d)在包含内皮生长培养基的组合物中扩增分离的ECFC。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，还包括：
e)使扩增的细胞传代高至18次。
16.如权利要求14或15所述的方法，其特征在于，所述分离的细胞在不到约3个月内扩增成至少约1万亿个细胞的群。
17.一种人NRP-1+CD31+内皮集落形成细胞状细胞(ECFC-状细胞)的分离群，其中分离的ECFC-状细胞具有在没有共移植细胞的情况下植入哺乳动物时形成血管的能力，并且其中所述分离的ECFC-状细胞在体外衍生自人多潜能细胞。
18.如权利要求17所述的分离群，其特征在于，至少约35％的ECFC-状细胞是高增殖潜力(HPP)ECFC-状细胞。
19.如权利要求18所述的分离群，其特征在于，至少约50％的ECFC-状细胞是HPP ECFC-状细胞。
20.如权利要求17所述的分离群，其特征在于，所述HPP ECFC-状细胞具有每个起始细胞产生至少约2001个细胞的能力并且具有自我补充的能力。
21.如权利要求17-20中任一项所述的分离群，其特征在于，所述分离群中的ECFC-状细胞的特征还在于CD144+、KDR+和α-SMA-中的一种或多种。
22.如权利要求17-21中任一项所述的分离群，其特征在于，所述分离群中的ECFC-状细胞显示鹅卵石形态。
23.如权利要求17-22中任一项所述的分离群，其特征在于，所述分离群中的ECFC-状细胞在Matrigel上培养时可形成毛细管状网络。
24.如权利要求17-23中任一项所述的分离群，其特征在于，所述分离群中的ECFC-状细胞可在体外传代高至18次。
25.如权利要求17-24中任一项所述的分离群，其特征在于，相对于脐带血ECFC，所述ECFC-状细胞显示出以下基因中的一种或多种的较高表达：假拟蛋白LOC100132288，CUB和Sushi多结构域1，淋巴-限制膜蛋白，芳基乙酰胺去乙酰化酶(酯酶)，滤泡抑素-状5，ENSG00000215262，假拟LOC84856，鸟苷酸环化酶激活剂2B(尿鸟苷素)，角蛋白75，成纤维细胞活化蛋白，α(FAP)，染色体22开放阅读框34，GSDM蛋白C，ENSG00000222954，羟基类固醇(11-β)脱氢酶1，吲哚胺2,3-双加氧酶2和Zic家族成员4。
26.如权利要求17-25中任一项所述的分离群，其特征在于，相对于脐带血ECFC，所述ECFC-状细胞显示出以下基因中的一种或多种的较低表达：受体(化学感受性)转运蛋白4，染色体X开放阅读框61，酰基-CoA合成酶中等链家族成员2A，丝抑蛋白肽酶抑制剂，进化支A(α-1抗蛋白酶，抗胰蛋白酶)，成员3，ENSG00000218052，趋化因子(C-C基序)配体23，含卷曲螺旋结构域48和RAS(RAD和GEM)-状GTP-结合1。
27.一种人NRP-1+CD31+内皮集落形成细胞-状细胞(ECFC-状细胞)的分离群，其按照权利要求1-16中任一项所述的方法获得。
28.如权利要求27所述的分离群，其特征在于，所述群中至少约95％的细胞是ECFC-状细胞并且是NRP-1+CD31+。
29.一种用于在有需要的对象中进行移植的方法，所述方法包括：
-向所述对象提供权利要求17-28中任一项所述的细胞分离群。
30.一种治疗需要内皮修复的对象的方法，所述方法包括；
-向所述对象提供治疗有效量的权利要求17-28中任一项所述的细胞群。
31.一种包含内皮集落形成细胞-状细胞(ECFC-状细胞)的药物组合物，所述细胞通过权利要求1-16中任一项所述的方法获得。
32.一种检验测试试剂调节细胞活力的能力的方法，所述方法包括：
-使权利要求17-28中任一项所述的细胞群的细胞中的至少一个接触测试试剂，并且；
-观察该测试试剂对细胞生长和细胞活力之一或多个的影响。
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