CN111417360A - 猪细胞的无支架3d生物打印 - Google Patents

猪细胞的无支架3d生物打印 Download PDF

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Abstract

本文提供包含猪细胞的合成三维(3D)生物打印的组织构建体及其生产和使用方法。通过在微针模具上生物打印包含猪细胞(包括基因工程改造的细胞)的球状体并将该球状体融合以形成工程改造的组织构建体，来制造合成3D生物打印组织构建体。还提供将无支架3D生物打印的组织构建体用于与药物筛选和毒性筛选有关的应用的方法。

Description

猪细胞的无支架3D生物打印
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年10月20日提交的美国临时申请第62/574,809号的优先权，其通过引用全文纳入本文。
关于联邦资助研究的声明
无。
背景技术
在美国，超过116,000名患者正在等待器官移植。尽管存在一些针对肾脏和心力衰竭的替代疗法，例如分别为透析和心室辅助设备，但肝移植仍是终末期肝病的唯一治疗选择。使用基因工程改造的猪器官进行跨物种移植或“异种移植”可以减少或消除供体器官的短缺。然而，异种移植受者由于物种特异性障碍而产生强烈的免疫反应和限制生存的血小板减少。此外，尽管基因工程取得了进步，并且有超过26种基因工程改造猪可供使用，但并不知道哪种基因组合最能减少移植后的免疫反应和凝血反应。由于这些障碍是发展的关键障碍，因此本领域仍然需要异种移植的高效、节约成本的替代方法。
发明内容
本文提供包含猪细胞的合成三维(3D)生物打印的组织构建体及其生产和使用方法。通过在微针模具上生物打印包含猪细胞的球状体并将该球状体融合以形成工程改造的组织构建体，来制造合成3D生物打印组织构建体。在一些情况下，至少一部分猪细胞是基因工程改造的细胞。还提供将无支架3D生物打印的组织构建体用于与药物筛选和毒性筛选有关的应用的方法。
在第一方面，本文提供一种制造合成三维(3D)猪组织构建体的方法。该方法可以包括以下步骤或基本上由以下步骤构成：提供预定的微针排列；以计算机控制的方式将细胞球状体添加到微针中，其中所述细胞球状体包含两种或更多种细胞类型的猪细胞，其中至少一部分猪细胞是基因工程改造的；以及将球状体在微针上培养约5天，从而使球状体融合形成包含基因工程改造的猪细胞的合成3D猪组织构建体。在一些情况下，该方法还包括将合成3D猪组织构建体从微针模具中移出，以获得包含基因工程改造的猪细胞的无支架合成3D猪组织构建体。细胞球状体可以包含选自下组的两种或更多种细胞类型的猪细胞：猪肝细胞、肝窦内皮细胞(LSEC)、星状细胞、库普弗细胞和成纤维细胞，并且在这种情况下，合成3D猪组织构建体是合成3D猪肝组织构建体。细胞球状体可以包含选自下组的两种或更多种细胞类型的猪细胞：猪肺血管内皮细胞(CD31+ve)、肺成纤维细胞、I型肺泡上皮细胞(pneumocyte)和II型肺泡上皮细胞，并且在这种情况下，合成3D猪组织构建体是合成3D猪肺组织构建体。细胞球状体可以包含选自下组的两种或更多种细胞类型的猪细胞：猪角膜内皮细胞、基质细胞和角膜上皮细胞，并且在这种情况下，合成3D猪组织构建体是合成3D猪角膜组织构建体。细胞球状体可以包含猪成纤维细胞和猪主动脉内皮细胞，并且在一些情况下，合成3D猪组织构建体是合成3D猪主动脉瓣组织构建体。细胞球状体可以包含选自下组的两种或更多种细胞类型的猪细胞：猪α细胞、β(胰岛)细胞、成纤维细胞和内皮细胞，并且在这种情况下，合成3D猪组织构建体是合成3D猪胰腺组织构建体。细胞球状体可以包含选自下组的两种或更多种细胞类型的猪细胞：猪成纤维细胞、内皮细胞和近端小管上皮细胞，并且其中，合成3D猪组织构建体是合成3D猪肾组织构建体。
在另一方面，本文提供根据本发明的任一种方法获得的合成3D猪组织构建体。
在又一方面，本文提供一种组合物，其包含根据以下步骤获得的3D无支架猪组织：将包含基因工程改造的猪细胞的细胞球状体生物打印到预定的微针排列上；将生物打印的细胞球状体培养约5天，从而使生物打印的细胞球状体融合形成三维猪组织构建体；以及将猪组织构建体从微针中移出，以获得3D无支架猪组织构建体。细胞球状体可以包含选自下组的两种或更多种细胞类型的多种猪细胞：猪肝细胞、猪肝窦内皮细胞(LSEC)和猪成纤维细胞，并且在这种情况下，3D无支架猪组织是3D无支架猪肝组织。细胞球状体可以包含选自下组的两种或更多种细胞类型的猪细胞：猪肺血管内皮细胞(CD31+ve)、肺成纤维细胞、I型肺泡上皮细胞和II型肺泡上皮细胞，并且在这种情况下，合成3D猪组织构建体是合成3D猪肺组织构建体。细胞球状体可以包含选自下组的两种或更多种细胞类型的猪细胞：猪角膜内皮细胞、基质细胞和角膜上皮细胞，并且在这种情况下，合成3D猪组织构建体是合成3D猪角膜组织构建体。细胞球状体可以包含猪成纤维细胞和猪主动脉内皮细胞，并且其中，合成3D猪组织构建体是合成3D猪主动脉瓣组织构建体。细胞球状体可以包含选自下组的两种或更多种细胞类型的猪细胞：猪α细胞、β(胰岛)细胞、成纤维细胞和内皮细胞，并且在这种情况下，合成3D猪组织构建体是合成3D猪胰腺组织构建体。细胞球状体可以包含选自下组的两种或更多种细胞类型的猪细胞：猪成纤维细胞、内皮细胞和近端小管上皮细胞，并且在这种情况下，合成3D猪组织构建体是合成3D猪肾组织构建体。
在另一方面，本文提供一种测试化合物的方法，该方法包括将该化合物用于根据本发明的任一种方法获得的3D无支架猪组织构建体，并检查该化合物对构建体中细胞的影响。
附图说明
本专利申请文件包含至少一幅彩色附图。带彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将根据要求，在支付所需的费用之后由政府机关提供。
当考虑以下的详细描述时，本发明将被更好地理解，并且除了上述内容之外的特征，方面和优点将变得显而易见。这样的具体实施方式参考了以下附图，其中：
图1A～1E展示示例性生物打印方法和Regenova生物打印机。A.包含Regenova机器人的无菌柜(位于印第安那波利斯的印第安纳大学-普渡大学，印第安纳大学医学院的3D生物打印核心)。B.仪器的机械臂和微针支架的实际图像(插入B：3D设计程序，举例说明分层细胞管的构造)。C.用于球状体偏斜的微针阵列(两种配置)。D.打印前，检查球状体的大小和核心处的凋亡(绿色荧光底物)。E.生物打印的肾小管组织构建体(参见万维网上的cyfusebio.com)。
图2A～2J展示无支架3D生物打印成纤维细胞和肝源性细胞(CD31+)。(A-E)显示从第1天到第5天，分别在微针上进行生物打印的组合的野生型猪成纤维细胞/含球状体的肝源性细胞及其融合制备3D构建体。(F)5天后的微针上的2个生物打印构建体。(G)移出微针的无支架3D生物打印构建体的显微镜照片。(H)肉眼所见的与图G相同的构建体。(I)如图F所示的两种3D构建体，均在第5天结束时从微针移出。在构建体中可见微孔。(J)图I所示的两种3D构建体的裸眼外观。
图3A～3D展示细胞球状体的形成和分析。A.非粘性平板中细胞聚集的原理和球状体的例子。B.IncuCyte ZOOM显微镜，能够分析球状体动力学。C.部分被球状体占据的96孔板中的荧光和相差下的球状体的实际图像以及一周内的记录(右列，来自空孔的图像)。D.绿色荧光蛋白(GFP)染色的肝源性细胞的3D成像及其在成纤维细胞的球状体形成中的排布。
图4A～4G展示无支架3D生物打印构建体的组织病理学图像。(a-b)生物打印后1周。可以看到包围3D构建体的被囊以及每个带有增殖细胞的球状体，放大倍率分别为5倍和10倍。黑色条表示100μm。(c-d)生物打印后2周。带有增殖细胞和活细胞的较厚的被囊，放大倍率分别为10倍和20倍。黑色条分别表示100μm和50μm。(E-F)生物打印后3周的3D构建体的组织病理学。10倍和20倍的放大倍率显示，包含增殖细胞的被囊比2周的3D构建体更厚，细胞迁移到中心。4G.生物打印后1周的3种细胞系(成纤维细胞/肝细胞和肝内皮细胞)的3D打印肝构建体的组织学。尽管存在中心坏死，但活细胞约占3D构建体的80％。放大倍率为10倍。
图5显示(上图)在96孔板内良好地形成的球状体和(下图)未能形成球状体的细胞聚集体的图像。在本例中，细胞是小鼠肝细胞。
图6是展示使用不同比例的成纤维细胞和肝源性细胞制备的球状体的特征的图。
图7展示包含生物打印的球状体的组织构建体的图像。(上图)以成纤维细胞比肝源性细胞为4:1的比例用32000个细胞打印的球状体。(下图)以成纤维细胞比肝源性细胞为10:1的比例用40000个细胞打印的球状体。
图8展示第1、2和5天的球状体形成(以2:1:0.1的比例包含成纤维细胞、肝细胞和肝源性细胞)的图像。
图9展示第1、2和5天的生物打印的三细胞球状体(以2:1:0.1的比例包含成纤维细胞、肝细胞和肝源性细胞)的图像。
图10A～10B.生物打印后1周的无支架3D生物打印的基因工程改造的猪肝模型。肉眼可见(A)，在显微镜下可见(B)。3D构建体上的小孔代表微针的孔。
图11展示(上图)放大50倍的分离的猪肝肝细胞和(下图)放大50倍的猪肝肝星状细胞。
图12A示出使用低亲和力U型底板、离心和时间从游离细胞形成球状体的示例性过程。使用(i)单独的肝细胞(HC)、(ii)单独的肝星状细胞(HSC)或(iii)HC和HSC的组合在低亲和力的U型底板中培养形成球状体。
图12B展示使用HC、HSC或其组合用40000个细胞随时间推移形成球状体。单独的HSC的球状体是均匀、圆润、光滑的。单独的HC的球状体未能聚结为可表征的球状体。
图13展示表征肝细胞和HSC组合球状体(比例为2:1)的图像和数据。图片展示球状体的形成，其中在每个孔的外围都有多个较小的球状体。在第6天进行球状体的表征。较小的球状体在所有参数上均活力较低。
图14A～14B.在48小时，肝细胞与HSC(比例为2.5:1)和HSC的仅40000个细胞的球状体的初步打印。以阶梯状图案打印的HSC球状体，这是由于它们的尺寸较大(约550μm)(a)。组合球状体在整个打印过程中都是松散的，不是圆形或规则的，这可以从它们在针头上的涂抹中看出(b)。两种构建体的顶部都具有突起，这是由于喷嘴将球状体部分吸入打印机臂内而导致的。停止打印，并保存球状体以进行功能分析。
图15示出打印后的肝细胞和HSC(比例为2∶1)的组合构建体。在第0天可见边界分明的球状体。从第1天开始，球状体相互融合并制造自己的细胞外基质。第1天的构建体中出现了缺口，球状体的边界不太清晰。到第3天，单个球状体融合，从而创建一个连续的组织。
图16A～16B展示由于球状体中HSC的支持，肝细胞仍具有代谢活性。HC:HSC(比例为2.5:1)、HSC的14天内的培养基样品中的尿素浓度(a)。球状体中的mRNA转录的实时PCR分析。组合球状体表达更高水平的两种标记物基因(b)。
图17展示显示刚生物打印后的无支架生物打印肺球状体的图像。
图18展示显示打印后第1、2、3、4和5天的肺球状体的无支架生物打印。
图19展示在打印后第5天(左图)和从支持物移出后(右图)的无支架生物打印肺构建体的图像。
图20展示在打印后第7天和从支持物移出后两天的无支架生物打印肺构建体的图像。
图21是H&E(苏木精和伊红)染色的生物打印肺构建体的图像。
图22展示H&E染色的生物打印肺构建体的图像。
尽管本发明可以进行大量的改变和采用替代形式，但在附图和以下详述中以示例的方式显示了本发明的示例性实施方式。但是应当理解，示例性实施方式的描述并不旨在将本发明的范围限制在所揭示的特定形式，反之，本发明应涵盖所附权利要求书所限定的本发明范围内的所有变化、等价形式和替代形式。
具体实施方式
说明书中所引用的所有出版物，包括但不限于专利和专利申请通过引用纳入本文，如同它们完全示于本申请中那样。
本文提供的方法和系统至少部分基于发明人对生物打印的猪组织结构的开发，该组织结构是用猪细胞生成的多细胞三维(3D)结构。生物打印的组织结构是通过3D生物打印包含猪细胞的球状体并将该球状体融合形成无支架工程改造结构而制成的。
在本文提供的方法和系统的优点中，本发明的无支架3D生物打印构建体提供了比标准体外模型更可靠的模型，并且消除了每种遗传修饰对猪克隆的需求，因而为异种移植的标准猪到人体内模型提供了更快速、更廉价的替代方法。实际上，本文所述的生物打印方法提供了改进的模型，其中以节省时间和预算的方式研究遗传修饰和组合。本文提供的3D生物打印组织构建体的示例性用途包括但不限于将猪组织概括为模型，用于研究人对猪到人异种移植的免疫反应和凝血反应。
因此，在第一方面，本文提供一种生物打印包含基因工程改造的猪细胞的合成三维(3D)无支架猪组织构建体的方法。如本文所用，术语“生物打印”是指通过与自动或半自动的计算机辅助的三维原型制作设备(例如生物打印机)兼容的方法，采用细胞(例如细胞溶液、含细胞的凝胶、细胞悬浮液、细胞浓缩物、多细胞聚集体、多细胞体等)的三维精确沉积。如本文所用，术语“无支架”旨在暗示在使用时没有支架(例如合成支架、非合成支架或任何类型的预制支架)形成工程改造组织的整体部分，或是已被除去，或是保留作为生物打印组织的惰性成分。术语“无支架”在本文中可与“没有支架”和“无预制支架”互换使用。合适的生物打印机包括但不限于Cysfuse Biomedical(日本东京)的Regenova无支架3D生物打印机。其它合适的生物打印机是市售的，例如Cellink(马萨诸塞州波士顿)的Bio X 3D生物打印机。
在某些实施方式中，用于制造工程改造的三维(3D)猪组织构建体的生物打印方法包括：提供预定的微针排列作为用于形成工程改造的三维猪组织的模板；以计算机控制的方式将猪细胞球状体添加到微针中，其中所述猪细胞球状体包含两种或更多种细胞类型；以及将球状体在微针模具上培养约5天，从而使球状体融合形成三维无支架猪肝组织。在某些实施方式中，至少一种猪细胞类型是基因工程改造的猪细胞。
在一些情况下，所述方法还包括将三维猪组织从微针中移出，以获得工程改造的无支架3D猪组织构建体。在一些情况下，机器人平台将球状体“生物打印”成预先设计的连续结构。当球状体融合入细胞聚集体并合成其自身的细胞外基质时，微针提供临时支持，从而获得所需的结构稳健性，以无支架组织构建体的形式从微针中移出。
球状体包含猪细胞。在一些情况下，球状体包含猪细胞的异源混合物。在一些情况下，猪细胞球状体包含两种或更多种细胞类型。在一些情况下，球状体包含两种猪细胞类型。在其它情况下，球状体包含三种或更多种猪细胞类型。适合于球状体的细胞类型基于要根据本发明的方法生产的组织类型而有所不同。例如，为了生产合成3D猪肝组织，细胞球状体优选包含诸如肝细胞、肝窦内皮细胞(LSEC)、肝星状细胞(HSC)、胆管细胞和成纤维细胞之类的猪肝细胞类型。为了生产合成3D角膜样组织，细胞球状体优选包含诸如角膜内皮细胞、基质细胞和角膜上皮细胞之类的猪细胞。为了生产合成3D主动脉瓣样组织，细胞球状体包含诸如猪成纤维细胞和猪主动脉内皮细胞之类的细胞类型。为了生产合成3D胰腺样组织，细胞球状体优选包含诸如猪α细胞、β(胰岛)细胞、成纤维细胞和内皮细胞之类的细胞。为了生产合成3D肾脏样组织，细胞球状体优选包含诸如猪成纤维细胞、内皮细胞、近端小管上皮细胞及其它肾细胞之类的细胞。为了生产合成3D肺样组织，细胞球状体优选包含猪肺血管内皮细胞(CD31+ve)、肺成纤维细胞和肺泡上皮细胞。
根据本文提供的方法使用的球状体可以通过聚集培养细胞的任何适当方法来生产。在某些实施方式中，在促进自发聚集成球状体的条件下，将细胞在低粘附性或非粘附性平板上培养。球状体的大小至少部分由细胞数量和培养时间决定。在一些情况下，每种类型的约10000至50000(例如约10000、约20000、约30000、约40000、约50000)个细胞用于制备直径约为400～600μm的球状体。在一些情况下，在促进自发聚集成球状体的条件下，将总共35000～40000个细胞接种在非粘附性培养板上。在另一些情况下，可以根据需要增加或减少每种类型的细胞数量，以在约两天至约三天的培养中产生直径约为400～600μm(例如约400、450、500、550、550、600μm，含端值)的球状体。
使用不同比例的两种、三种、四种或更多种细胞类型来制造球状体。例如，参照图6，可以使用比例为4:1、5:1或10:1的成纤维细胞:LSEC。参照图8和9，可以通过以2:1:0.1的比例接种成纤维细胞、肝细胞和肝源性细胞来生产包含三种猪肝细胞类型的球状体。本领域技术人员应理解，细胞类型的比例可以基于猪细胞类型的数量、培养条件、球状体大小、细胞活力及其它变量而变化。将两种、三种、四种或更多种细胞类型接种到培养板上后，需要孵育约48至约72小时，以形成适合生物打印的强健圆形球状体。参见例如图5和8中的示例性球状体。
如本文所用，术语“合成”和“工程改造”可互换使用，是指由人手工创建或修饰(例如以预定的排列生物打印细胞)的非天然存在的组织材料，或者用这类材料衍生(例如包含合成材料的移植物或其它设备)。在一些情况下，用于生产合成组织材料的细胞或细胞球状体是野生型细胞，或者可以包含一种或多种合成或基因工程改造的核酸(例如，相对于在其天然存在的对应序列中找到的序列，包含至少一种人工创建的插入、缺失、倒置或取代的核酸)。包含一种或多种合成或工程改造的核酸的细胞被视为工程改造细胞。如本文所用，术语“组织”和“组织构建体”是指细胞的聚集体。
在一些情况下，根据本文描述的方法生产的3D猪组织构建体可以包含重组或遗传修饰的细胞来代替未修饰的或野生型(“正常”)细胞，或者可以在未修饰的或野生型(“正常”)细胞之外还包含重组或遗传修饰的细胞。例如在某些情况下，包含重组/遗传修饰的细胞可能是有利的，所述细胞连续一定时间或根据需要(例如由于培养中存在的条件以生物、化学或热方式发出信号时)生产重组细胞产物、生长因子、激素、肽或蛋白质(例如可检测的报告蛋白)。生产遗传修饰的细胞的方法是本领域公知的，并且描述于Sambrook等人，分子克隆，实验室手册，冷泉港出版社，冷泉港，纽约(1989)，通过引用纳入本文。
在一些情况下，用于形成猪细胞球状体的至少一部分猪细胞是遗传修饰(基因工程改造)的猪细胞。如本文所用，术语“遗传修饰”及其语法等同物可以指核酸、例如生物体或其细胞的基因组内的核酸的一种或多种改变。例如，遗传修饰可以指基因的改变、添加和/或缺失。遗传修饰的细胞也可以指带有添加、缺失和/或改变的基因的细胞。在一些情况下，从野生型(非遗传修饰)的非人类动物(如猪或另一种哺乳动物)中分离的细胞经过遗传修饰，以供根据本文提供的方法使用。在一些情况下，遗传修饰的细胞是从遗传修饰的非人类动物(如遗传修饰的猪)中分离的细胞。来自遗传修饰的非人类动物的遗传修饰的细胞可以是从这种遗传修饰的非人类动物中分离的细胞。在一些情况下，非人类动物的遗传修饰的细胞可以包含与非遗传修饰的对应动物相比有所减少的一种或多种基因表达。非遗传修饰的对应动物可以是与遗传修饰的动物基本相同但在基因组中没有遗传修饰的动物。例如，非遗传修饰的对应动物可以是与遗传修饰的动物相同物种的野生型动物。
在一些情况下，遗传修饰是采用基因编辑的形式产生的。如本文所用，术语“基因编辑”及其语法等同物可以指在基因组中插入一个或多个核苷酸、将基因组中的一个或多个核苷酸取代、或者从基因组中移除一个或多个核苷酸。例如，基因编辑可以采用核酸酶(例如天然存在的核酸酶或人工改造的核酸酶)来实施。在一些情况下，基因编辑采用CRISPR/cas系统(例如II型CRISPR/cas系统)来实施。例如，CRISPR/cas系统可以用来减少球状体的细胞中的一种或多种基因的表达。在一些情况下，采用CRISPR/cas系统来减少一种或多种内源基因的蛋白质表达。在另一些情况下，可以采用CRISPR/cas系统来实施位点特异性插入。例如，可以通过CRISPR/cas在基因组的插入位点形成一个缺口，以促进转基因在插入位点的插入。适合用于根据本文提供的方法的遗传修饰的其它制备方法包括但不限于体细胞核转移(SCNT)和转基因的引入。如本文所用，术语“转基因”是指可以转移到生物体或其细胞中的基因或遗传物质。获得重组或遗传修饰的细胞的方法是本领域公知的，并且描述于Sambrook等人，分子克隆，实验室手册，冷泉港出版社，冷泉港，纽约(1989)，通过引用纳入本文。
为了研究各种遗传修饰对于人类对猪组织移植的反应的影响，在某些情况下，使用遗传修饰的细胞(其中，细胞经过修饰以减少异种反应性抗原的表达)将是有利的。例如，可以采用CRISPR/Cas系统对猪肝细胞类型(例如肝细胞、成纤维细胞、HSC、肝窦内皮细胞、胆管细胞)进行遗传修饰，以相对于非遗传修饰细胞选择性减少猪四跨膜蛋白pCD37和pCD81的表达。在一些情况下，与非遗传修饰的对应动物相比，采用CRISPR/Cas对细胞进行了遗传修饰，以减少一种或多种主要组织相容性复合物(MHC)分子(例如MHC I分子和/或MHC II分子)的表达。在一些情况下，对猪细胞进行工程改造，以遗传修饰(例如突变)或调节(例如增加、减少)诸如pGGTA1、pCMAH、pB4GalNT2、猪四跨膜蛋白pCD37、猪四跨膜蛋白pCD81、人(h)CD46、hCD55、人血栓调节蛋白、CD46(膜辅因子蛋白)、CD55(衰减加速因子)、CD59(保护素或反应性裂解的膜抑制剂)、人H转移酶(例如用于表达0血型抗原)、内切β-半乳糖苷酶C(例如用于减少Gal抗原表达)、α1,3-半乳糖基转移酶、胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)、β1,4-N-乙酰半乳糖胺基转移酶(β4GalNT2)(例如β4GalNT2敲除)、CIITA-DN(例如II类MHC反式激活子敲低，导致II类猪白细胞抗原敲低)、I类MHC敲除(MHC-IKO)、HLA-E/人β2-微球蛋白(例如抑制人自然杀伤细胞的细胞毒性)、人FAS配体(CD95L)、人N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶III(GnT-III)基因、猪CTLA4-Ig(细胞毒性T淋巴细胞抗原4或CD152)、人TRAIL(肿瘤坏死因子-α相关凋亡诱导配体)、血管性血友病因子(vWF)、人组织因子途径抑制剂(TFPI)、人内皮蛋白C受体(EPCR)、人外核苷三磷酸二磷酸水解酶-1(CD39)、人肿瘤坏死因子-α诱导蛋白3(A20)、人血红素加氧酶-1(HO-1)、人CD47(与SIRP-α的物种特异性相互作用抑制吞噬作用)、猪去唾液酸糖蛋白受体1(ASGR1)(例如减少血小板吞噬作用)、人信号调节蛋白-α(SIRPα)(例如通过“自我”识别来减少血小板、吞噬作用)之类的基因的表达。
用于球状体的细胞可以根据任何适当的方案来产生、收获和/或培养。在一些情况下，用于球状体的细胞可以从感兴趣的酶解离(例如胰蛋白酶处理)和/或机械解离的组织、细胞系或干细胞(例如干细胞定向分化为感兴趣的细胞类型)中产生。可以如WO/2014/066505中所述分离和/或培养猪成年肝源性细胞(LDC)。
可以采用任何合适的方法来测定球状体和3D无支架猪组织构建体的活力和组织特异性代谢活性。例如，可以测试包含肝细胞的肝组织构建体和球状体的尿素和白蛋白的产生。
可以采用任何一种或多种合适的方法来确认本文提供的3D猪组织构建体的均匀性以及某些成分的存在与否。用于检测生物标记物存在与否的合适方法是本领域众所周知的，并且包括但不限于免疫组织化学、qRT-PCR、RNA测序等用于在RNA水平上评估基因表达的方法。在一些情况下，采用诸如免疫组织化学之类的方法来检测和鉴别3D猪肝组织构建体中的细胞类型或生物分子。例如，可以通过免疫组织化学针对特异性分化标记物对整个猪肝组织构建体或其部分进行染色。在一些情况下，实施双标记免疫荧光来评估单个标记物蛋白的相对表达或检测构建体中的多种祖细胞或分化细胞类型将是有利的。合适的一抗和二抗是本领域技术人员已知的和可获得的。另外，微阵列技术或核酸测序(例如RNA测序)可用于获得合成3D猪肝组织构建体的基因表达谱。在细胞群体中在蛋白质水平上评估标志物表达的定量方法在本领域中也是已知的。例如，流式细胞术用于确定给定细胞群中表达或不表达感兴趣的生物标记物的细胞比例。
在一些情况下，本发明的3D猪组织构建体还包含分离的生物成分。如本文所用，“分离的”生物成分(例如蛋白质或细胞器)已与天然存在该成分的生物体的细胞中的其它生物成分(例如其它染色体和染色体外DNA和RNA、蛋白质和细胞器)基本上分离或纯化。如本文所用，术语“分离的蛋白质”包括经过标准纯化方法纯化的蛋白质。该术语也包括通过在宿主细胞中的重组表达而制备的蛋白质，以及化学合成的蛋白质或其片段。
在另一方面，本文提供本文所述的3D无支架猪组织在药物筛选、药物发现或药物反应中的用途。具体而言，本文提供一种方法，其中，将如本文所述获得的3D猪组织构建体用于筛选受试化合物的已知和未知毒性。例如，可以将3D猪肝组织构建体与受试化合物接触，并测定其对其中所含的任何细胞类型(例如肝细胞、LSEC、成纤维细胞)的任何影响。在某些实施方式中，筛选方法包括使一种或多种受试化合物与如本文所述获得的3D猪组织构建体接触，并检测生物学特性或活性的正或负变化，例如但不限于基因表达、蛋白质表达、细胞活力和细胞增殖。受试化合物对本发明的构建体的特定生物学活性产生影响的方式取决于受试化合物的性质、组织构建体的组成和所测定的特定生物学活性。然而，本发明的方法通常将包括以下步骤：(a)培养用受试化合物获得的3D猪组织构建体；(b)测定合成3D猪组织构建体的选定生物学活性；以及(c)将测定中确定的值与使用具有与受试化合物接触但在没有受试化合物的情况下(或在有对照的情况下)培养的构建体相同组成的合成3D猪组织构建体进行的相同测定的值进行比较。检测合成3D猪组织构建体的细胞的生物学特性或活性的正或负变化可以包括检测受试化合物对于所接触的组织构建体内的细胞或组织的形态或寿命的至少一种影响，从而将减少细胞或组织的寿命或者对细胞或组织的形态产生负面影响的受试化合物鉴定为对该组织有毒性。在一些情况下，检测包括实施诸如RNA测序、基因表达谱分析、转录组学分析、代谢组学分析、检测报告基因或传感器，蛋白质表达谱分析、福斯特共振能量转移(FRET)、代谢谱分析和微透析等方法。可以就对所接触的合成3D猪组织构建体中基因表达的影响对受试化合物进行筛选，其中，检测与未接触的合成组织构建体相比有差异的基因表达。
在一些情况下，在将合成3D猪组织构建体暴露于(例如接触)受试化合物后对至少一个基因的表达水平的正或负变化进行的检测和/或测量包括使用例如RNA测序的全转录组分析。在这种情况下，使用例如数据处理软件程序、如Light Cycle、RSEM(通过期望最大化进行的RNA测序)、Excel和Prism来计算基因表达。参见Stewart等人，PLoSComput.Biol.9:e1002936(2013)。在合适的情况下，可以采用ANOVA分析、使用Bonferroni校正的方差分析或双尾斯氏t检验来进行统计学比较，其中，当P<0.05时，值确定为显著。可以采用任何合适的方法从合成猪肝组织构建体中分离RNA或蛋白质。例如，可以分离并反转录总RNA以获得测序用的cDNA。
在另一方面，可以将上述材料以及其它材料以任何合适的组合包装在一起，作为可用于实施或帮助实施本文提供的方法的试剂盒。如果给定试剂盒中的试剂盒组件经过设计并适合在公开的方法中一起使用，则是有用的。例如，本文公开的是包含通过本文公开的方法生产的3D无支架合成猪组织的试剂盒。在另一例中，公开的是一种试剂盒，其包含一种或多种基因工程改造的猪细胞、包含基因工程改造的猪细胞的球状体、以及用于生物打印本文提供的猪组织的微针模具。在一些实施方式中，试剂盒也可以包含用于检测所得的3D无支架合成猪组织中的感兴趣的生物标记物、多肽或核酸的一种或多种培养基、标记和/或其它试剂。
如本文所用，“核酸”包括“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸分子”，并且通常是指DNA或RNA的聚合物，其可以是单链或双链的，合成或从天然来源获得(例如分离和/或纯化)的，其可以包含天然、非天然或改变的核苷酸，并且可以包含天然、非天然或改变的核苷酸间连接(例如氨基磷酸酯连接或硫代磷酸酯连接)来代替在未修饰的寡核苷酸的核苷酸之间存在的磷酸二酯。在一些实施方式中，核酸不包含任何插入、缺失、倒置和/或取代。然而，如本文所述，在一些情况下，对于核酸而言，包含一个或多个插入、缺失、倒置和/或取代可能是合适的。
核酸可以采用任何合适的方法获得，包括Maniatis等人，分子克隆：实验室手册，冷泉港，纽约，第280-281页(1982)中描述的那些。在一些方面，如美国专利申请公开号US2002/0190663中所述获得核酸。通常将从生物样品中获得的核酸片段化以产生合适的片段进行分析。
本发明的核酸和/或其它部分可以被分离。如本文所用，“分离”是指与通常与之相关联的至少一些成分分开，无论它是天然来源的还是全部或部分合成的。本发明的核酸和/或其它部分可以被纯化。如本文所用，“纯化”是指与大多数其它化合物或实体分开。化合物或部分可以被部分纯化或基本上纯化。纯度可以用通过重量测量得到的重量来表示，并且可以使用各种分析技术来确定，例如但不限于质谱、HPLC等。
在本说明书中引用的每个出版物在此通过引用全文纳入本文用于全部目的。尽管本文已经讨论了所公开主题的特定实施方式和示例，但是这些示例是说明性的而非限制性的。通过阅读本说明书和下面的权利要求书，许多变化对于本领域技术人员将变得显而易见。应当理解，在本公开中描述的本发明的某些改变对于本领域技术人员而言是常规优化的问题，并且可以在不脱离本发明的精神或所附权利要求书的范围的情况下实施。
因此，为了更容易理解本文提供的方法和系统，定义了某些术语：
在解释本公开时，应以与上下文一致的尽可能广泛的方式解释所有术语。术语“包括”的变体应被解释为以非排他性方式指代要素、组件或步骤，因此所引用的要素、组件或步骤可以与未明确引用的其它要素、组件或步骤组合。在本说明书和权利要求书中，术语“包括”和“包含”是开放式的术语，应被解释为表示“包括但不限于……”。这些术语涵盖了限定性更强的术语“主要由……组成”和“由……组成”。
术语“约”和“大约”通常是指在给定的测量性质或精度下所测得的量的可接受误差程度。典型的示例性误差程度在给定值或值范围的10％之内，优选在5％之内。或者，并且特别是在生物系统中，术语“约”和“大约”可以表示在给定值的一个数量级内的值，优选在给定值的5倍之内，更优选在给定值的2倍之内。除非另有说明，否则本文给出的数量是近似的，这意味着当没有明确说明时，可以推断出术语“约”或“大约”。
除非另外定义，否则本文中所使用的所有技术术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的同样含义。在本说明书和所附权利要求书中所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括多个指示物，除非上下文中有明显的表示。除非另有说明，否则本文中对“或”的任何引用旨在涵盖“和/或”。
除非另外指出，否则本发明的实施将采用本领域技术范围内的分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术。这些技术在文献中已有充分描述。例如参见分子克隆，实验室手册，第二版，Sambrook、Fritsch和Maniatis编(冷泉港实验室出版社：1989年)；DNA克隆，第I和第II卷(D.N.Glover编，1985年)；寡核苷酸合成(M.J.Gait编，1984)；Mullis等人，美国专利第4,683,195号；核酸杂交(B.D.Hames和S.J.Higgins编，1984)；转录和翻译(B.D.Hames和S.J.Higgins编，1984)；动物细胞培养(R.I.Freshney，艾伦·R·利斯公司(Alan R.Liss，Inc.)，1987)；固定化细胞和酶(IRL出版社，1986年)；B.Perbal，分子克隆实用指南(1984年)；专著《酶学方法》(美国纽约学术出版社)；哺乳动物细胞的基因转移载体(J.H.Miller和M.P.Calos编，1987，冷泉港实验室)；酶学方法，第154和155卷(Wu等人编)，细胞和分子生物学中的免疫化学方法(Mayer和Walker编，伦敦学术出版社，1987)；以及实验免疫学手册，第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell编，1986年)。
本发明组合物和方法的各种示例性实施方式在下面的非限制性实施例中描述。实施例仅提供用于说明目的，并非旨在以任何方式限制本发明的范围。实际上，本发明所示和描述以外的各种变化通过以上描述以及以下的实施例对本领域技术人员显而易见，所述变化也包括在所附权利要求书的范围之内。
实施例
实施例1—生成无支架3D生物组装的基因工程改造的猪组织/肝脏
最近，Cyfuse Biomedical(日本)已经开发出一种能够以高精度组装球状体的高通量仪器：Regenova生物打印机(图1)。通常，机器人平台可以使用微针排列作为支撑，将细胞球状体组装成亚毫米级三维(3D)精度的预先设计的连续结构。使用Regenova生物打印机，我们将使用野生型(WT)和基因工程改造的猪细胞的无支架3D构建体打印到Kenzan微针上。参见图2A～2J，我们对包含野生型猪成纤维细胞和肝源性细胞(LDC)的球状体进行了生物打印。生物打印的球状体在打印后的前五天内融合，在微针上形成细胞聚集体的三维构建体。在第5天，我们从微针上移出了3D构建体。在移出的3D构建体中可见微孔(图2I)。
为了确定可重现均匀的3D生物打印猪组织构建体的细胞球状体的大小和含量，我们研究了四个变量：(i)球状体的直径；(ii)球状体与每个孔中心的距离；(iii)球状体的光滑度；以及(iv)球状体的圆度。我们使用野生型和基因工程改造的猪细胞制备了大约400～600μm的细胞球状体，并在接种后第2、3、5和7天评估了球状体的大小(见图3C)。使用
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活细胞成像和分析系统，通过测量细胞覆盖面积百分比的动力学来评估球状体形成效率。
还实施了苏木精和伊红染色、免疫组织化学和共聚焦显微镜检查。组织病理学分析显示，在生物打印后1周，被囊包围了每个3D构建体，并且每个球状体均包含增殖细胞(图4A～4B)。生物打印后两周，可见包含增殖的活细胞的较厚被囊(图4C～4D)。生物打印后3周的3D构建体的组织病理学显示出包含增殖细胞的较厚的被囊(相对于2周的3D构建体而言)和细胞迁移到中心(图4E～4F)。从生物打印后1周的三细胞系(成纤维细胞、肝细胞和肝内皮细胞)3D生物打印肝构建体的组织学中，我们观察到一些中央坏死，但也观察到了约占合成构建体80％的活细胞(图4G)。
球状体形成：低结合微孔中的细胞将相互结合，从而形成细胞聚集球状体。球状体的大小部分由细胞数量和培养时间决定。观察到在每个球状体中，每种类型的10000至50000个细胞生成直径为400～500μm的细胞球状体。组装到Kenzan的Regenova生物打印机的合适尺寸约为500μm。该尺寸也近似于最大营养物扩散距离(从球状体周边到中心约200～250μm)，这意味着可以保持球状体核心中的细胞呼吸。球状体在2至3天内形成，取决于细胞类型。
打印：如上所述，在野生型(WT)皮肤成纤维细胞上打印有400～500μm的球状体，这些球状体在细胞接种2～3天后形成。尽管空心圆柱体设计是3D生物打印的首选，但WT皮肤成纤维细胞趋于融合，因此中心孔迅速闭合而无灌注。接下来，使用成纤维细胞、肝细胞和肝源性细胞(CD31+)的组合来形成球状体，并进行打印以获得猪肝模型(图3)。3D生物打印的肝构建体在培养基中成熟1、2和3周。使用原型生物反应器以设定的流速连续灌注一个3D生物打印的肝构建体一周。在3D生物打印的肝构建体上进行苏木精/伊红(H/E)染色以检测活细胞(图4A～4G)。
实施例2—肝模型的无支架3D生物打印
本实施例展示用于创建SF3DBP肝模型的肝细胞和肝星状细胞(HSC)球状体的生产和打印。简而言之，使用新鲜融化的原代猪肝细胞和永生化猪HSC来生成球状体，这些球状体具有(i)单独的肝细胞、(ii)单独的HSC或(iii)肝细胞和HSC的组合。使用低粘附力板形成球状体，然后表征距孔中心的距离、直径、圆度和光滑度。使用Regenova 3D生物打印机打印一列球状体。将剩余的松散球状体孵育两周以进行功能测定(白蛋白分泌、mRNA转录、尿素清除率)。
材料和方法
细胞培养：从4个月大的健康雄性猪的肝脏中分离肝细胞和HSC(图11)。使用SV40T慢病毒使HSC永生化。成功地培养了永生化HSC。
球状体形成：将先前分离的新鲜融化的肝细胞和永生化HSC(第6～9代)用于制备球状体。将细胞铺在Sbio低粘附力96孔U型底板上(美国新罕布什尔州)。
球状体表征和3D生物打印：使用Cysfuse Biomedical(日本东京)的Regenova无支架3D生物打印机，对球状体的直径、圆度和光滑度进行了表征。使用9×9Kenzan针阵列以3×3×6模式进行了SF3DBP。
样品采集：在第3、7、11和14天，收集培养基样品并为每个测试组采样至少3个球状体的mRNA。在第7和15天还收集了整个球状体，以将其固定来进行免疫组织化学测试。
白蛋白和尿素测试：测试了白蛋白(猪白蛋白Elisa试剂盒，艾博抗(abcam))和尿素浓度(QuantiChromTM尿素测定试剂盒，飞世尔(Fisher))。
实时PCR分析：使用Qiagen
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试剂盒来提取球状体mRNA。使用iScriptTMcDNA合成试剂盒(伯乐公司(Biorad))来合成cDNA。在Biorad CFX95TouchTM上进行实时PCR。
结果与讨论
如图12A～12B所示，肝细胞和HSC(比例为2.5:1)的组合产生了圆形且光滑的球状体，在6天后达到可打印的大小(450～550μm)。尺寸滴定表明，包含小于40000个细胞的球状体太小而无法打印。48小时后，仅成纤维细胞和仅HSC的球状体是均匀而光滑的球状体。直径从第2天的626.45±66.62μm减少到第6天的500.47±80.14μm。尽管在第3天和第6天的数个孔中观察到松散的细胞聚集体，但仅肝细胞的细胞未能聚结为可表征的球状体。到第2天，组合孔在96个孔中的42个孔内形成了松散的球状体，并在第3天形成了更紧密的“煎蛋”球状体。到第6天，组合球状体变成圆形，并且外围已经聚集形成几个较小的球状体。直径从第2天的880.57±100.15μm减少到第6天的506.09±118.90μm。通过改变球状体的离心和孵育时间，我们在第4天生产了包含肝细胞和HSC(2:1)的SF3DBP构建体。与第6天相比，能够在第4天打印出球状体，这增加了将来构建体在药理、免疫和肝毒性测试中的实用性。在48小时，肝细胞与HSC(比例为2.5:1)和仅HSC的40000个细胞的球状体的初步打印。
如图14A～14B所示，以阶梯状图案打印HSC球状体，这是由于它们的尺寸较大(550μm)(a)。组合球状体在整个打印过程中都是松散的，不是圆形或规则的，这可以从它们在针头上的涂抹中看出(b)。两种构建体的顶部都具有突起，这是由于喷嘴将球状体部分吸入打印机臂内而导致的。停止打印，并保存球状体以进行功能分析。
如图15所示，从第0天到第3天，在临时的微针支持物上生物打印出包含组合球状体的3D肝构建体。到第3天，球状体融合在一起，形成它们自身的细胞外基质。
如图16A～16B所示，由于球状体中HSC的支持，肝细胞仍具有代谢活性。72小时培养基样品的尿素测试显示，在2周内，组合肝细胞和HSC(比例为2.5:1)的球状体的尿素浓度显著下降(图16A)。到第14天，组合球状体的尿素清除率的值最低。
实时PCR展示了组合球状体中白蛋白mRNA表达的增加，显示了功能性的维持(图16B)。组合球状体中的CRBP-1表达也增加。肝细胞样品具有高Cq值，表明转录受限(图16B)。
在48小时，仅由HSC形成的球状体被证明太大，无法打印。到第6天，SF3DBP球状体(由肝细胞:HSC以2.5:1的比例形成)就可以存活。离心和孵育时间的优化使组合球状体(比例为2:1)可以更早地打印。与第6天相比，能够在第4天打印出球状体，这增加了将来构建体在药理、免疫和肝毒性测试中的实用性。基因表达和白蛋白分泌功能的维持强调了3D生物打印模型在14天内的实用性。采用包括HSC、肝细胞、肝窦内皮细胞、胆管细胞和成纤维细胞在内的不同的细胞比例对球状体进行进一步优化，这将可以生产和打印生理学上更加精确的肝模型。
实施例3—肺的无支架3D生物打印
使用三种类型的猪肺细胞来形成球状体：肺血管内皮细胞(CD31+ve)、肺成纤维细胞和II型肺泡上皮细胞。就形成球状体，测试了不同比例的肺血管内皮细胞、肺成纤维细胞和II型肺泡上皮细胞。最合适的球状体是使用比例分别为1:1:1/2的肺血管内皮细胞、肺成纤维细胞和II型肺泡上皮细胞而形成的。每个球状体的总细胞数量约为40000个细胞。球状体在96孔U型底板中成熟后2～3天进行生物打印。如图17所示，选择了特殊的空心模型计算机设计，将球状体生物打印在临时的微针上(图17)。从生物打印后的第1天开始，球状体开始融合，形成其自身的细胞外基质(图18)。到生物打印后第5天，形成了固态的融合3D肺构建体，并从具有自立式无支架3D生物打印肺模型的微针支持物中取出(图18～19)。
图20、21和22是移除支持物后2天(生物打印后7天)的自立式无支架3D生物打印肺模型的组织学图像(用H&E染色)。

Claims (17)

1.一种制造合成三维(3D)猪组织构建体的方法，其中，所述方法包括：
提供预定的微针排列；
以计算机控制的方式将细胞球状体添加到微针中，其中所述细胞球状体包含两种或更多种细胞类型的猪细胞，其中至少一部分猪细胞是基因工程改造的；以及
将球状体在微针上培养约5天，从而使球状体融合形成包含基因工程改造的猪细胞的合成3D猪组织构建体。
2.如权利要求1所述的方法，还包括将合成3D猪组织构建体从微针模具中移出，以获得包含基因工程改造的猪细胞的无支架合成3D猪组织构建体。
3.如权利要求1所述的方法，其中，细胞球状体包含选自下组的两种或更多种细胞类型的猪细胞：猪肝细胞、肝窦内皮细胞(LSEC)、星状细胞、库普弗细胞和成纤维细胞，并且其中，合成3D猪组织构建体是合成3D猪肝组织构建体。
4.如权利要求1所述的方法，其中，细胞球状体包含选自下组的两种或更多种细胞类型的猪细胞：猪肺血管内皮细胞(CD31+ve)、肺成纤维细胞、I型肺泡上皮细胞和II型肺泡上皮细胞，并且其中，合成3D猪组织构建体是合成3D猪肺组织构建体。
5.如权利要求1所述的方法，其中，细胞球状体包含选自下组的两种或更多种细胞类型的猪细胞：猪角膜内皮细胞、基质细胞和角膜上皮细胞，并且其中，合成3D猪组织构建体是合成3D猪角膜组织构建体。
6.如权利要求1所述的方法，其中，细胞球状体包含猪成纤维细胞和猪主动脉内皮细胞，并且其中，合成3D猪组织构建体是合成3D猪主动脉瓣组织构建体。
7.如权利要求1所述的方法，其中，细胞球状体包含选自下组的两种或更多种细胞类型的猪细胞：猪α细胞、β(胰岛)细胞、成纤维细胞和内皮细胞，并且其中，合成3D猪组织构建体是合成3D猪胰腺组织构建体。
8.如权利要求1所述的方法，其中，细胞球状体包含选自下组的两种或更多种细胞类型的猪细胞：猪成纤维细胞、内皮细胞和近端小管上皮细胞，并且其中，合成3D猪组织构建体是合成3D猪肾组织构建体。
9.一种合成三维(3D)猪组织构建体，根据权利要求1～8中任一项所述的方法获得。
10.一种组合物，其包含根据以下步骤获得的3D无支架猪组织：
将包含基因工程改造的猪细胞的细胞球状体生物打印到预定的微针排列上；
将生物打印的细胞球状体培养约5天，从而使生物打印的细胞球状体融合形成三维猪组织构建体；以及
将猪组织构建体从微针中移出，以获得3D无支架猪组织构建体。
11.如权利要求10所述的组合物，其中，细胞球状体包含选自下组的两种或更多种细胞类型的多种猪细胞：猪肝细胞、猪肝窦内皮细胞(LSEC)和猪成纤维细胞，并且其中，3D无支架猪组织是3D无支架猪肝组织。
12.如权利要求10所述的组合物，其中，细胞球状体包含选自下组的两种或更多种细胞类型的多种猪细胞：猪肺血管内皮细胞(CD31+ve)、肺成纤维细胞、I型肺泡上皮细胞和II型肺泡上皮细胞，并且其中，3D无支架猪组织是3D无支架猪肺组织。
13.如权利要求10所述的组合物，其中，细胞球状体包含选自下组的两种或更多种细胞类型的猪细胞：猪角膜内皮细胞、基质细胞和角膜上皮细胞，并且其中，合成3D猪组织构建体是合成3D猪角膜组织构建体。
14.如权利要求10所述的组合物，其中，细胞球状体包含猪成纤维细胞和猪主动脉内皮细胞，并且其中，合成3D猪组织构建体是合成3D猪主动脉瓣组织构建体。
15.如权利要求10所述的组合物，其中，细胞球状体包含选自下组的两种或更多种细胞类型的猪细胞：猪α细胞、β(胰岛)细胞、成纤维细胞和内皮细胞，并且其中，合成3D猪组织构建体是合成3D猪胰腺组织构建体。
16.如权利要求10所述的组合物，其中，细胞球状体包含选自下组的两种或更多种细胞类型的猪细胞：猪成纤维细胞、内皮细胞和近端小管上皮细胞，并且其中，合成3D猪组织构建体是合成3D猪肾组织构建体。
17.一种测试化合物的方法，所述方法包括将所述化合物用于根据权利要求1～8中任一项所述的方法获得的3D无支架猪组织构建体，并检查所述化合物对构建体中细胞的影响。
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