CN110656089A - 一种将iPS细胞定向诱导分化到成熟神经元的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种将iPS细胞定向诱导分化到成熟神经元的方法，包括如下步骤：人iPS细胞的无异源成份培养方式培养；iPS细胞定向诱导分化到成熟神经元。本发明提供的将iPS细胞定向诱导分化到成熟神经元的方法，安全、无病毒处理、无外源血清成分干扰，并且可以从iPS细胞起始，在体外培养中简便、快速、高效的诱导分化到成熟神经元；而且在形成神经球之前有一次6倍的细胞扩增，最终可以获取大量的成熟神经元，为进一步研究和治疗神经系统疾病提供了一种有效的细胞模型。

Description

一种将iPS细胞定向诱导分化到成熟神经元的方法

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及神经元的快速、大量获取方法，尤其是涉及一种安全可靠的将iPS细胞定向诱导分化到成熟神经元的方法。

背景技术

人诱导多能干细胞(hiPSCs)是人的体细胞被转入“Yamanaka因子”(Sox2,Oct4,Klf4和c-myc)后，表达特异基因，逆转回到胚胎干细胞样状态的去分化细胞。hiPSCs与人胚胎干细胞(hESCs)非常类似，有类似的基因和蛋白表达、DNA甲基化模式，自我更新能力和多向分化潜能，理论上可以分化成为人体各种细胞类型。hiPSCs由于克服了hESCs临床应用中会存在的免疫排斥及伦理问题而具有更重要的临床应用价值。如果hiPSCs来源于基因突变病人的体细胞，hiPSCs会携带相应的突变。因此，hiPSCs在疾病建模、机制研究、药物筛选和再生医学等方面展现出巨大优势。

人类的各种类型神经系统疾病，其本质是神经元损伤。运动和交通意外容易导致脑和脊髓损伤；随着人类寿命的延长，各种神经退行性病(阿尔茨海默病、帕金森病等)和脑血管意外导致的神经元受累发病率增加。人类神经元损伤后不可再生，现阶段的神经系统疾病的治疗基本是对症和保守治疗。多能干细胞(hiPSCs/hESCs)诱导分化来的神经元是人神经再生的关键。找到一系列体外诱导多能干细胞定向分化的模式，诱导其分化为神经细胞，达到神经修复和细胞治疗的目的是当今神经科学界的研究热点之一。

目前已经可以将iPS细胞诱导分化到神经元，如EB分化的方法和小分子化合物的方法等(Chambers SM,Fasano CA,Papapetrou EP,Tomishima M,Sadelain M,StuderL.Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dualinhibition of SMAD signaling[J].Nature biotechnology.2009；27(3):275-80.Hu BY,Weick JP,Yu J,Ma LX,Zhang XQ,Thomson JA,et al.Neural differentiation of humaninduced pluripotent stem cells follows developmental principles but withvariable potency[J].Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of theUnited States of America.2010；107(9):4335-40.)。这些方法逐渐在向更确定的成分和更便捷的方法发展。但是总的来说神经元诱导分化的过程长，操作繁琐，不能得到大量神经元。这些缺点限制了诱导分化的神经元在疾病模拟、机制研究以及药物筛选等方面的应用。

神经元诱导分化过程中，通过抑制TGF-β/Activin/Nodal通路、BMP通路和Wnt通路，抑制iPS细胞向中、内胚层分化，得到神经外胚层细胞。加入这些通路的小分子抑制剂，可以得到的这些神经外胚层细胞具有神经干细胞特征，可以在分化过程中实现细胞扩增，实现一次分化收获大量神经元。

发明内容

针对目前现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种将人源诱导多能干细胞定向诱导分化到成熟神经元的方法。该方法在分化过程中可以实现细胞扩增，实现一次分化收获大量成熟神经元，且分化的神经元具体电生理功能。

为了达成上述的目的，具体技术方案如下：

一种将iPS细胞定向诱导分化到成熟神经元的方法，包括如下步骤：

S0，使用mTeSR1细胞培养液培养iPS细胞至60％～80％的密度后进行细胞传代，此时仍用mTeSR1细胞培养液培养；

S1，iPS细胞传代第二天将mTeSR1细胞培养液更换为含有小分子化合物组合1的神经分化培养液，培养6-7天；

S2，分散酶将细胞消化并按1孔传代6孔的比例转至基质胶包被处理过的孔板内，更换培养液为含有小分子化合物组合2的神经分化培养液，培养6天；

S3，分散酶将细胞消化并悬浮培养于神经分化培养液中10-12天；

S4，Accutase细胞消化液将细胞消化3～8分钟后贴壁，神经元贴壁培养液中培养7-8天可以得到成熟的神经元。

进一步地，其中步骤S1中，所述神经分化培养液为混合成分，其含有1:1(v/v)的DMEM/F12和Neurobasal培养基、0.5×N2细胞添加剂、0.5×B27细胞添加剂、1×GlutaMax细胞添加剂及小分子化合物组合1。

进一步地，其中步骤S1中，所述小分子化合物组合1的组成及浓度分别为：CHIR99021 3μM，SB 431542 2μM，LDN 193189 200nM。

进一步地，其中步骤S2中，所述神经分化培养液为混合成分，其含有1:1(v/v)的DMEM/F12和Neurobasal培养基、0.5×N2细胞添加剂、0.5×B27细胞添加剂、1×GlutaMax细胞添加剂及小分子化合物组合2。

进一步地，其中步骤S2中，所述小分子化合物组合2的组成及浓度分别为：CHIR99021 1μM，SB 431542 2μM，LDN 193189200nM。

进一步地，其中步骤S3中，步骤S1中，所述神经分化培养液为混合成分，其含有1:1(v/v)的DMEM/F12和Neurobasal培养基、0.5×N2细胞添加剂、0.5×B27细胞添加剂、1×GlutaMax细胞添加剂。

进一步地，其中步骤S4中，所述细胞球用Accutase细胞消化液消化5分钟后，再将神经球贴到经基质胶包被处理过的孔板或玻片上，用神经元贴壁培养液培养。

进一步地，其中步骤S4中，所述神经元贴壁培养液为混合成分，分别含有Neurobasal培养基、1×N2细胞添加剂、1×B27细胞添加剂、脑源性神经营养因子10ng/ml、神经胶质细胞源性神经营养因子10ng/ml、环磷酸腺苷1μM、L-抗坏血酸200μM。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的将iPS细胞定向诱导分化到成熟神经元的方法，安全、无病毒处理、无外源血清成分干扰，并且可以从iPS细胞起始，在体外培养中简便、快速、高效的诱导分化到成熟神经元；而且在形成神经球之前有一次6倍的细胞扩增，最终可以获取大量的成熟神经元，为进一步研究和治疗神经系统疾病提供了一种有效的细胞模型。

附图说明

图1为人iPS细胞在无异源成份培养方式中培养的形态。标尺：100微米。

图2为人iPS细胞向神经元定向诱导分化的流程示意图。

图3为人iPS细胞向神经元定向诱导分化的各时期的形态照片。其中A为分化第1天的细胞形态；B为分化第6天的细胞形态；C为分化第12天的细胞形态；D为分化第20天的细胞形态；E为分化第28天的细胞形态。

图4为人iPS细胞向神经元定向诱导分化第12天神经干细胞标志蛋白免疫荧光染色；其中A为神经干细胞标志蛋白Musashi1染色；B为DAPI细胞核染色；C为Musashi1和DAPI共定位；D为神经干细胞标志蛋白Nestin染色；E为DAPI细胞核染色；F为Nestin和DAPI共定位。

图5为iPS细胞向神经元定向诱导分化第28天的细胞神经元标志蛋白的免疫荧光染色；其中A为神经元标志蛋白TUJ1和DAPI的共染色；B为成熟神经元标志物MAP2和DAPI的共染色。神经元突起交织成网状结构；C为神经元标志蛋白NeuN和DAPI的共染色。

图6为iPS细胞向神经元定向诱导分化第28天的神经元突触标志蛋白Synaptophysin的免疫荧光染色。

图7为iPS细胞向神经元定向诱导分化第28天的神经元在全细胞膜片钳记录模式下的细胞电生理特性；其中A为被玻璃电极钳夹胞体记录电生理特性的分化神经元；B为施加电流刺激后神经元发放动作电位；C为在施加35pA的电流刺激下神经元发放4个动作电位；D为电压钳记录到内向的钠离子通道电流和外向钾离子通道电流。

具体实施方式

为了对本发明有更进一步的了解，以下列举说明书附图和实施例进行说明。

以下材料或试剂，若非特别说明，均为市购。

实施例1人iPS细胞培养(S0)

人iPS细胞(购自中国科学院干细胞库)被贴壁培养在基质胶(BD公司)包被过的6孔板上(如图1)，所用培养液为mTeSR1培养液。细胞传代时，需要用0.5mM EDTA对细胞进行消化。当培养皿中的细胞克隆变大且融合度达到60％～80％时，就可以对细胞进行传代。

细胞传代具体步骤如下：

1)六孔板包被：向六孔板中每孔加入1.5mL基质胶工作液(基质胶用DMEM/F12(赛默飞世尔科技有限公司)稀释60倍，体积比)，然后置于37℃恒温箱中孵育至少1小时，使用前吸弃基质胶工作液；

2)人iPS细胞在六孔板中达到60％～80％密度后，吸弃mTeSR1培养液，每孔中加入1mL0.5 mM EDTA，在37℃孵育3～8分钟进行消化；

3)消化完成后吸弃EDTA，并在每孔中加入2DMEM/F12重悬细胞，并转移至15mL离心管，300g常温离心5分钟；

4)离心后，吸弃上清，细胞沉淀用mTeSR1培养液重悬，细胞计数，按照1x10⁶每板的细胞数量接种于事前包被好基质胶的六孔板中培养，每天更换mTeSR1培养液并观察细胞状态。

实施例2人iPS细胞快速高效诱导分化成为神经元

人iPS细胞诱导分化成为成熟神经元共需要三大步骤，流程见图2，具体步骤分别如下：

1)人iPS细胞向神经干细胞样细胞分化(S1与S2)：mTeSR1培养液中培养的人iPS细胞正常传代，传代第二天，细胞融合度达到10-20％时，将mTeSR1细胞培养液(STEMCELL公司)更换为含有小分子化合物组合1的神经分化培液，此时记为神经元分化第0天(day 0)，继续培养6天(S1)；分散酶(赛默飞世尔科技有限公司)将细胞消化并按1孔传代6孔的比例转至基质胶包被处理过的孔板内(包被方法同人iPS细胞培养)，再更换为含有小分子化合物组合2的神经分化培液，培养6天(S2)，得到神经干细胞样细胞。

其中，神经分化培养液为混合成分，含有1:1(体积：体积)的DMEM/F12和Neurobasal培养基(赛默飞世尔科技有限公司)、0.5×N2细胞添加剂(赛默飞世尔科技有限公司)、0.5×B27细胞添加剂(赛默飞世尔科技有限公司)、1×GlutaMax细胞添加剂(赛默飞世尔科技有限公司)；所述神经分化培养液中的小分子化合物组合1的组分(浓度)为：CHIR99021(3μM)，SB431542(2μM)，LDN193189(200nM)；所述神经分化培养液中的小分子化合物组合2组分(浓度)分别为：CHIR99021(1μM)，SB431542(2μM)，LDN193189(200nM)。

2)神经干细胞样细胞扩增、分化成神经前体细胞(S3)：得到神经干细胞样细胞后，吸弃六孔板中的培养液，每孔中加入1.5mL分散酶，放置37℃孵育5～10分钟，进行消化，消化后吸弃分散酶，每孔添加2mL神经分化培液重悬，并转换至非贴壁六孔板中继续培液10天，形成神经球，成为神经前体细胞状态。

3)神经元迁移和成熟(S4)：收集培养好的神经球于15mL离心管，吸弃培养液，加入2mL Accutase消化液静置37℃孵育5分钟后，吸弃Accutase消化液，并加入2mL神经元贴壁培液重悬神经球，并转移至基质胶包被好的六孔板(包被方法同前)中进行贴壁培养，每2天更换2mL新鲜的神经元贴壁培液，神经元会在贴壁后逐渐迁出神经球并产生突起形成网络状，在神经元贴壁培液中培养7天后可以得到成熟的神经元。

分化结果如图3所示，其中A为分化第1天的细胞形态，细胞仍然和iPS细胞克隆类似；B为分化第6天的细胞形态，细胞不再保持克隆状生长，出现生长差异，细胞急速增长形成小片突起，细胞折光性更强；C为分化第12天的细胞形态，后续的免疫荧光鉴定证实此时的细胞具有神经干细胞样特性；D为分化第20天的细胞形态，此时分化细胞形成神经球，在分化培养液中悬浮培养；E为分化第28天的细胞形态，此时神经球贴壁后有神经元样形态的细胞爬出，突起向外辐射状生长，同时胞体向外迁移。

实施例3免疫荧光实验鉴定人iPS细胞诱导分化成为神经元过程中的蛋白标记(神经干细胞与成熟神经元细胞标志蛋白的免疫荧光染色)

分别取人iPS细胞诱导分化成为神经元过程中第12天的神经干细胞和第28天的成熟神经元细胞，作为两种材料进行如下免疫荧光染色鉴定：

1)培养细胞吸弃培养液，加入2mL PBS，孵育10分钟；

2)吸弃PBS，加入2mL，4℃的多聚甲醛，室温放置固定20分钟；

3)吸弃多聚甲醛，加入2mL PBS；

4)加入含有10％(v/v)驴血清，0.2％(v/v)Triton X-100的孵育液2mL，室温孵育1小时；

5)一抗用含有5％(v/v)驴血清的PBS按相应体积比进行稀释，具体数见表1；

6)加入稀释后的一抗；

7)4℃孵育过夜；

8)吸弃一抗，加入2mL PBS洗涤5遍，每次10分钟；

9)二抗用含有5％(v/v)驴血清的PBS稀释；

10)加入稀释后的二抗和1μL DAPI；

11)避光，室温孵育2小时；

12)吸弃二抗，加入2mL PBS洗5遍，每次10分钟，注意避光；

13)封片；

14)荧光显微镜观察，拍照。

免疫荧光鉴定结果见图4，图5和图6。图4为分化至第12天的细胞，其表达神经干细胞标志蛋白Nestin和Musashi1，提示在分化至12天时，得到了神经干细胞样细胞。图5与图6为分化至第28天的细胞，表达神经元标志蛋白TUJ1、NeuN和成熟神经元标志蛋白Map2(图5)，提示分化第28天时已经分化到了成熟的神经元。并且图6中突触标志蛋白Synaptophysin表达阳性，提示此时分化得到的成熟神经元已经彼此形成功能突触。

表1免疫荧光染色所使用的抗体

实施例4全细胞膜片钳实验检测人iPS细胞诱导分化的神经元的电生理功能

取人iPS细胞诱导分化第28天的成熟神经元进行全细胞膜片钳技术检测，具体步骤如下：

1)玻璃微电极的制备

取外径1.50mm、内径0.89mm的普通硬质硅酸盐玻璃微电极(VitalSenseScientific Instruments,China)经P-97(Sutter，USA)拉制仪四步拉制而成，充灌电极内液后，电极阻抗为4-6ΜΩ。

2)全细胞记录

在室温(20-25℃)下，用Axon 700B(MD，USA)膜片钳放大器进行全细胞膜片钳记录。实验参数设置、数据采集和刺激方案施加均通过采样软件pClamp10.7(MD,USA)来控制。并记录全细胞电压依赖电流(钠/钾电流)和动作电位。

(1)全细胞电压依赖电流的记录(钠/钾电流记录)

电压钳下，钳制电压-70mV,给予-90～+50mV，时程100ms，步幅10mV的去极化步阶电压刺激记录不同电压下的全细胞电流。

(2)动作电位的记录

电流钳下，钳制电流0pA，给予-10pA～+40pA，时程500ms，步幅5pA的去极化步阶电流刺激记录不同刺激强度下的动作电位。

人iPS细胞诱导分化的神经元电生理检测结果如图7所示，其中A图为被玻璃电极钳夹胞体记录电生理特性的分化神经元；B与C图显示诱导分化的神经元可以记录到动作电位，提示诱导分化的神经元具体正常神经元的动作电位发放电生理特性；D图显示诱导分化的神经元可以记录到内向的钠离子通道电流和外向钾离子通道电流，提示诱导分化的神经元已经具有成熟的钠离子通道与钾离子通道。这些结果提示人iPS细胞诱导分化的神经元在第28天时已经成熟，且具有神经元所特有的电生理特性。

综上结果显示，本发明建立了一种安全、高效并且能得到大量神经元的诱导分化方案。整个诱导分化过程中都是在无血清的培养条件下完成，不会存在其它异源性物质的影响；在形成神经球之前有一次6倍的细胞扩增，为后续获取大量的成熟神经元奠定了基础；并且免疫荧光和全细胞膜片钳检测都显示诱导分化的神经元已经成熟且具有正常功能。可以为遗传性疾病的疾病模拟、机制研究以及将来的细胞治疗临床应用提供一种完美的细胞模型。

上述内容已经描述了许多本发明的具体实施方式，但本发明不应该被认为局限于这些具体实施方式。除非另有说明，这里所提供的任何或所有的实例、或典型的术语都仅仅是出于更好地说明本发明的目的，而并不限制本发明的范围。不过，应该理解，在不偏离本发明的精神和范围的前提下，可以作出很多不同的修改。因此，应该明了，本发明不限于具体描述的实施方式，而仅由权利要求的范围所限定。

Claims (8)

1.一种将iPS细胞定向诱导分化到成熟神经元的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S0，使用mTeSR1细胞培养液培养iPS细胞至60％～80％的密度后进行细胞传代，此时仍用mTeSR1细胞培养液培养；

S1，iPS细胞传代第二天将mTeSR1细胞培养液更换为含有小分子化合物组合1的神经分化培养液，培养6-7天；

S2，分散酶将细胞消化并按1孔传代6孔的比例转至基质胶包被处理过的孔板内，更换培养液为含有小分子化合物组合2的神经分化培养液，培养6天；

S3，分散酶将细胞消化并悬浮培养于神经分化培养液中10-12天；

S4，Accutase细胞消化液将细胞消化3～8分钟后贴壁，神经元贴壁培养液中培养7-8天可以得到成熟的神经元。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述神经分化培养液为混合成分，其含有1:1(v/v)的DMEM/F12和Neurobasal培养基、0.5×N2细胞添加剂、0.5×B27细胞添加剂、1×GlutaMax细胞添加剂及小分子化合物组合1。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述小分子化合物组合1的组成及浓度分别为：CHIR 99021 3μM，SB 431542 2μM，LDN 193189 200nM。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述神经分化培养液为混合成分，其含有1:1(v/v)的DMEM/F12和Neurobasal培养基、0.5×N2细胞添加剂、0.5×B27细胞添加剂、1×GlutaMax细胞添加剂及小分子化合物组合2。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述小分子化合物组合2的组成及浓度分别为：CHIR 99021 1μM，SB 431542 2μM，LDN 193189 200nM。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3中，步骤S1中，所述神经分化培养液为混合成分，其含有1:1(v/v)的DMEM/F12和Neurobasal培养基、0.5×N2细胞添加剂、0.5×B27细胞添加剂、1×GlutaMax细胞添加剂。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S4中，所述细胞球用Accutase细胞消化液消化5分钟后，再将神经球贴到经基质胶包被处理过的孔板或玻片上，用神经元贴壁培养液培养。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S4中，所述神经元贴壁培养液为混合成分，分别含有Neurobasal培养基、1×N2细胞添加剂、1×B27细胞添加剂、脑源性神经营养因子10ng/ml、神经胶质细胞源性神经营养因子10ng/ml、环磷酸腺苷1μM、L-抗坏血酸200μM。

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