JP2023551851A - 胚性幹細胞または人工多能性幹細胞からの神経前駆細胞の作製 - Google Patents

胚性幹細胞または人工多能性幹細胞からの神経前駆細胞の作製 Download PDF

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Abstract

本出願は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）のいずれかから神経前駆細胞（ＮＰＣ）、特にヒト神経前駆細胞（ｈＮＰＣ）を作製するための方法および細胞培養培地を提供する。ＮＰＣは前臨床使用および臨床使用に特に適している。

Description

本出願は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）のいずれかから神経前駆細胞（ＮＰＣ）、特にヒト神経前駆細胞（ｈＮＰＣ）を作製するための方法、細胞培養培地およびそれらの組み合わせに関し、そのＮＰＣは前臨床使用および臨床使用に特に適している。
神経前駆細胞は、自己再生して、あらゆる種類の神経細胞に分化するだけでなく、中枢神経系の損傷部分に移動して統合することもできるため、細胞療法において特に有用である。一方、これらの移植されたＮＰＣは、様々な神経保護および血管新生のサイトカインおよびマイクロＲＮＡを分泌することができ、これによって、自己回復プロセスが強化される。したがって、多能性ＮＰＣを利用して脳や脊髄の損傷を修復することは、細胞置換療法において非常に有望となっている。
２００８年（非特許文献１）以降、ヒト神経細胞へのヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）またはヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）のインビトロ誘導分化、ならびに神経系疾患の研究、薬物スクリーニング、薬物神経毒性試験、移植研究、および他の態様におけるその使用は、科学研究および薬開発のホットスポットとなっている。神経分化を誘導するための既存の方法によって得られた神経幹細胞またはＮＰＣは、神経細胞の特定のサブタイプにさらに分化され得るだけであり、これは、概して、インビトロまたはインビボのいずれかで相対的に成熟した機能をほとんど有さず、生存期間および産生量が限られるというような問題もある。
２０１６年（非特許文献２）に、研究者らは多能性幹細胞からバッチで高純度のフォークヘッドボックスＧ１陽性（ＦＯＸＧ１+）ＮＰＣを作製し、これらを、成熟した電気生理学的機能およびインビトロでの長期生存を備えた、様々な興奮性および抑制性のニューロン、および星状膠細胞を含む、大脳皮質の適切な細胞型に典型的な神経細胞にさらに分化させることができる、新規の神経分化方法を提供した。しかし、この公開された方法では、動物由来の試薬および定義されていない成分が使用された。したがって、安定した品質を備え臨床使用に適した多能性幹細胞からＮＰＣを作製する確固たる方法を開発する必要性が強く存在する。
Dimos et al. 2008 Xu et al. Science Translational Medicine 2016
本出願の発明者らは、指向性分化を介してＥＳＣまたはｉＰＳＣから臨床使用および前臨床使用に適したＮＰＣを作製することができる方法論を確立し、したがって、上記で特定された必要性に対処して、本発明を完成させた。
したがって、第１の態様では、本出願は、ＥＳＣまたはｉＰＳＣからＮＰＣを作製する方法に関し、当該方法は、
（１）ヒト多能性幹細胞培地（ｈＰＳＣ培地）においてＥＳＣまたはｉＰＳＣを培養して胚様体（ＥＢ）を形成させる工程；
（２）工程（１）により形成されたＥＢを、基本培地およびサプリメントを含むＥＢ培地において培養する工程；
（３）工程（２）の後、神経誘導培地（ＮＩＭ）を用いる細胞外マトリックス（ＥＣＭ）コート培養表面上でＥＢを培養し、ロゼット神経凝集体（ＲＯＮＡ）を形成する工程であって、ここで、ＮＩＭが基本培地およびサプリメントを含む、工程；
（４）工程（３）により形成されたＲＯＮＡを培養し、神経スフェアを形成する工程；ならびに
（５）神経スフェアを単細胞に切り離し、そしてＮＰＣ培地を用いるＥＣＭコート培養表面上で培養し、単層ＮＰＣを形成する工程であって、ここでＮＰＣ培地が基本培地およびサプリメントを含む、工程
を含み；
ここで、ｈＰＳＣ培地、ならびにＥＢ培地、ＮＩＭ、およびＮＰＣ培地に含まれる基本培地およびサプリメントは臨床等級である。
さらなる実施形態では、ＥＢ培地、ＮＩＭおよびＮＰＣ培地における基本培地およびサプリメントの、１つまたはそれより多く、好ましくは全てが、ＧＭＰ等級、ｃＧＭＰ等級またはＣＴＳ（商標）等級である。より好ましくは、ｈＰＳＣ培地、ＥＢ培地、ＮＩＭおよびＮＰＣ培地の、１つまたはそれより多く、より好ましくは２つ、３つまたは４つが、ＧＭＰ等級、ｃＧＭＰ等級またはＣＴＳ（商標）等級である。
具体的な実施形態では、培養表面はプレートまたはフラスコである。
一実施形態では、ｈＰＳＣ培地は、臨床等級、好ましくはＧＭＰ等級、ｃＧＭＰ等級またはＣＴＳ（商標）等級である。具体的には、ｈＰＳＣ培地は、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）ｈＰＳＣ ＸＦ培地、ＣＴＳ（登録商標）Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）Ｂａｓｉｃ０３、ＳｔｅｍＭＡＣＳ（商標）ｉＰＳ－Ｂｒｅｗ、Ｓｔｅｍ－Ｐａｒｔｎｅｒ（登録商標）ＡＣＦ、ＴｅＳＲ（商標）－ＡＯＦおよびＴｅＳＲ２からなる群から選択される。好ましい実施形態では、ｈＰＳＣ培地はＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）ｈＰＳＣ ＸＦ培地である。
一実施形態では、ｈＰＳＣ培地は、ＲＯＣＫ阻害剤が補充されている。好ましい実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、臨床等級、好ましくはＧＭＰ等級、ｃＧＭＰ等級またはＣＴＳ（商標）等級である。
一実施形態では、ＥＢ培地は、
（ｉ）ａ）～ｃ）からなる群より選択される基本培地
ａ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地単独、
ｂ）Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地と組み合わせたＤＭＥＭ／Ｆ１２、
ｃ）Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地と組み合わせたＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地；および
（ii）ｄ）～ｅ）を含むまたはからなるサプリメント
ｄ）Ｎ－２サプリメントおよびＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）－Ｉサプリメント；
ｅ）Ｎ－２サプリメント、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）－Ｉサプリメント、およびＢ－２７（商標）サプリメント、マイナスビタミンＡ；ならびに
（iii）随意に阻害剤
を含む。
さらなる実施形態では、ＥＢ培地は、
（ｉ）ａ）～ｃ）からなる群より選択される基本培地
ａ）ＣＴＳ（商標）ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地単独、
ｂ）ＣＴＳ（商標）Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地と組み合わせたｃＧＭＰ等級のＤＭＥＭ／Ｆ１２、
ｃ）ＣＴＳ（商標）Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地と組み合わせたＣＴＳ（商標）ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地；および
（ii）ｄ）～ｅ）を含むまたはからなるサプリメント
ｄ）ＣＴＳ（商標）Ｎ－２サプリメントおよびＣＴＳ（商標）ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）－Ｉサプリメント；
ｅ）ＣＴＳ（商標）Ｎ－２サプリメント、ＣＴＳ（商標）ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）－Ｉサプリメント、およびｃＧＭＰ等級またはＣＴＳ（商標）等級のＢ－２７（商標）サプリメント、ＸｅｎｏＦｒｅｅ、マイナスビタミンＡ；ならびに
（iii）随意に阻害剤
を含む。
好ましい実施形態では、ＥＢ培地の基本培地がａ）である場合、サプリメントはｅ）を含むまたはからなる。具体的な実施形態では、ＥＢ培地のサプリメントは、ｄ）またはｅ）である。
好ましい実施形態では、ＥＢ培地は阻害剤を含む。具体的には、ＥＢ培地中の阻害剤は、ＢＭＰ阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、およびＡＬＫ阻害剤を含むまたはからなる。より具体的な実施形態では、阻害剤は、Ｎｏｇｇｉｎ、ＳＢ４３１５４２、ＬＤＮ－１９３１８９、ＤＭＨ－１およびドルソモルフィンの１つまたはそれより多くを含むまたはからなる。好ましくは、ＥＢ培地は、ＳＢ４３１５４２を、Ｎｏｇｇｉｎ、ＬＤＮ－１９３１８９、ＤＭＨ－１およびドルソモルフィンの任意の１つまたはそれより多く、例えば１つまたは２つと組み合わせて含む。具体的な実施形態では、ＥＢ培地は、Ｎｏｇｇｉｎ、ドルソモルフィンおよびＳＢ４３１５４２を含む。好ましい実施形態では、阻害剤の１つまたはそれより多く、好ましくは全ては、臨床等級、好ましくはＧＭＰ等級、ｃＧＭＰ等級またはＣＴＳ（商標）等級である。
一実施形態では、ＮＩＭは、
（ｉ）ａ）～ｃ）からなる群より選択される基本培地
ａ）ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地単独、
ｂ）Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地と組み合わせたＤＭＥＭ／Ｆ１２、
ｃ）Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地と組み合わせたＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地；および
（ii）ｄ）～ｅ）を含むまたはからなるサプリメント
ｄ）Ｎ－２サプリメントおよびＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）－Ｉサプリメント；
ｅ）Ｎ－２サプリメント、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）－Ｉサプリメント、およびＢ－２７（商標）サプリメント、マイナスビタミンＡ
を含む。
一実施形態では、ＮＩＭは、
（ｉ）ａ）～ｃ）からなる群より選択される基本培地
ａ）ＣＴＳ（商標）ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地単独、
ｂ）ＣＴＳ（商標）Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地と組み合わせたｃＧＭＰ等級のＤＭＥＭ／Ｆ１２、
ｃ）ＣＴＳ（商標）Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地と組み合わせたＣＴＳ（商標）ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地；および
（ii）ｄ）～ｅ）を含むまたはからなるサプリメント
ｄ）ＣＴＳ（商標）Ｎ－２サプリメントおよびＣＴＳ（商標）ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）－Ｉサプリメント；
ｅ）ＣＴＳ（商標）Ｎ－２サプリメント、ＣＴＳ（商標）ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）－Ｉサプリメント、およびｃＧＭＰ等級またはＣＴＳ（商標）等級のＢ－２７（商標）サプリメント、ＸｅｎｏＦｒｅｅ、マイナスビタミンＡ
を含む。
好ましい実施形態では、ＥＢ培地の基本培地がａ）である場合、サプリメントはｅ）を含むまたはからなる。具体的な実施形態では、ＥＢ培地のサプリメントは、ｄ）またはｅ）である。
工程（４）では、工程（４）の直前または直後の工程で使用される培地と同じ培地を使用することによって、ＲＯＮＡを培養して、神経スフェアを形成する。一実施形態では、工程（４）の直前の工程で使用される培地、具体的には工程（３）のＮＩＭが、ＲＯＮＡを培養して神経スフェアを形成するために使用される。別の実施形態では、工程（４）の直後の工程で使用される培地、具体的には工程（５）のＮＰＣ培地が、ＲＯＮＡを培養して神経スフェアを形成するために使用される。
一実施形態では、ＮＰＣ培地は、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）－ＩサプリメントおよびＢ－２７（商標）サプリメント、マイナスビタミンＡを補充した、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地である。さらなる実施形態では、ＮＰＣ培地は、ＣＴＳ（商標）ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）－Ｉサプリメント、およびｃＧＭＰ等級またはＣＴＳ（商標）等級のＢ－２７（商標）サプリメント、ＸｅｎｏＦｒｅｅ、マイナスビタミンＡを補充した、ＣＴＳ（商標）Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地である。好ましい実施形態では、ＮＰＣ培地は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、および／またはグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、および／またはＬ－アスコルビン酸、および／またはＮ6，Ｏ2’－ジブチリルアデノシン３’，５’環状一リン酸ナトリウム塩（ＤＢ－ｃＡＭＰ）をさらに含む。より具体的な実施形態では、ＢＤＮＦは、動物質不含組み換えＢＤＮＦまたはＧＭＰ等級の組み換えＢＤＮＦであり、および／またはＧＤＮＦは、動物質不含組み換えＧＤＮＦまたはＧＭＰ等級の組み換えＧＤＮＦである。好ましい実施形態では、神経栄養因子の１つまたはそれより多くは、ＧＭＰ等級、ｃＧＭＰ等級またはＣＴＳ（商標）等級である。より好ましくは、神経栄養因子の各々は、ＧＭＰ等級、ｃＧＭＰ等級またはＣＴＳ（商標）等級である。
一実施形態では、神経スフェアは、工程（５）において消化酵素を使用することによって切り離される。別の実施形態では、神経スフェアは、工程（５）において機械的手段によって切り離される。
一実施形態では、工程（１）の前に、ＥＳＣまたはｉＰＳＣは、好ましくはラミニンでコーティングされた培養表面において、８０～９０％の培養密度まで維持および拡大されている。培養表面は培養プレートであり得る。好ましくは、コーティング用のラミニンは臨床等級のものである。
一実施形態では、工程（１）におけるＥＳＣまたはｉＰＳＣは、ＥＢの形成を誘導するためにｈＰＳＣ培地に播種される前に、例えば、消化酵素によりまたは機械的手段により単一細胞または細胞凝集体に分散される。好ましくは、より完全かつ均一に分散した細胞を得るように消化酵素が使用される。一実施形態では、幹細胞は、ｈＰＳＣ培地において、超低接着９６ウェルプレートの５，０００～４０，０００細胞／ウェル、好ましくは約１０，０００～３５，０００細胞／ウェル、より好ましくは約２０，０００～３０，０００細胞／ウェル、最も好ましくは３０，０００細胞／ウェルの密度で播種される。一実施形態では、幹細胞は、ｈＰＳＣ培地にコロニーとして播種される。
一実施形態では、工程（１）または工程（５）で使用される消化酵素は、ＣＴＳ（商標）ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ Ｅｎｚｙｍｅである。一実施形態では、消化酵素は、臨床等級、ＧＭＰ等級、ｃＧＭＰ等級またはＣＴＳ（商標）等級である。
具体的な実施形態では、工程（２）の培養は懸濁培養である。具体的な実施形態では、工程（３）の培養は接着培養である。
別の実施形態では、本出願の１つより多い（例えば、２つ、３つ、またはそれより多い）ＥＢ培地が工程（２）で使用される。別の実施形態では、本出願の１つより多い（例えば、２つ、３つ、またはそれより多い）ＮＩＭが工程（３）で使用される。
第２の態様では、本出願は、第１の態様の方法によって作製されたＮＰＣ、または第１の態様の方法によって作製されたＮＰＣに由来する細胞に関する。例えば、ＮＰＣに由来する細胞は、ニューロン、星状膠細胞前駆細胞、星状膠細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞またはオリゴデンドロサイトであり得る。
一実施形態では、第１の態様の方法によって作製されたＮＰＣの大部分は、ＦＯＸＧ１+ＮＰＣである。例えば、当該方法によって作製されたＮＰＣの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％は、ＦＯＸＧ１+ＮＰＣである。
好ましい実施形態では、第１の態様の方法によって作製されたＮＰＣまたはそれに由来する細胞は、前臨床使用および臨床使用に適している。
第３の態様では、本出願は、薬開発または臨床適用における第２の態様のＮＰＣまたはそれに由来する細胞の使用に関する。
第４の態様では、本出願は、ニューロン、星状膠細胞前駆細胞、星状膠細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、オリゴデンドロサイト、またはそれらの任意の１つまたはそれより多くを含む混合細胞集団を、第１の態様の方法により作製されたＮＰＣから調製する方法に関する。一実施形態では、当該方法はＮＰＣのさらなる分化を含む。別の好ましい実施形態では、当該方法は、臨床等級、ＧＭＰ等級、ｃＧＭＰ等級またはＣＴＳ（商標）等級の培地を用いて実施される。
第５の態様では、本出願は、第１の態様の方法により作製されたＮＰＣから分化したニューロン、星状膠細胞前駆細胞、星状膠細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、またはオリゴデンドロサイトに関する。例えば、ニューロン、星状膠細胞前駆細胞、星状膠細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞またはオリゴデンドロサイトは、第４の態様の方法によって得られる。好ましくは、ニューロン、星状膠細胞前駆細胞、星状膠細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞またはオリゴデンドロサイトは、前臨床使用および臨床使用に適している。
上記からわかるように、ＥＢ培地およびＮＩＭは、基本培地およびサプリメントを含む同じ必須成分を共有することができ、これは本発明の方法の成功に寄与している。したがって、第６の態様では、本出願は、ＥＳＣまたはｉＰＳＣからＮＰＣを作製する際のＥＢ培地および／またはＮＩＭにおける基本培地とサプリメントの組み合わせの使用に関し、ここで、基本培地はＤＭＥＭ／Ｆ１２またはＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）ＤＭＥＭ／Ｆ１２であり、サプリメントはＮ－２サプリメントおよびＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）－Ｉサプリメントであり、かつ基本培地およびサプリメントは臨床等級である。好ましくは、基本培地およびサプリメントの１つまたはそれより多くは、ＧＭＰ等級、ｃＧＭＰ等級またはＣＴＳ（商標）等級である。一実施形態では、基本培地は、臨床等級のＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地、好ましくはＣＴＳ（商標）Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地をさらに含む。別の実施形態では、サプリメントは、臨床等級のＢ－２７（商標）サプリメント、ＸｅｎｏＦｒｅｅ、マイナスビタミンＡ、好ましくはｃＧＭＰ等級またはＣＴＳ（商標）等級のＢ－２７（商標）サプリメント、ＸｅｎｏＦｒｅｅ、マイナスビタミンＡをさらに含む。
本発明の特徴および利点のより良い理解を容易にするために、以下の詳細な説明および添付の図面が提供される。しかし、当業者は、限定よりもむしろ例示目的でそれらが提供されることを理解するであろう。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって制御される。
ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）からのヒト神経前駆細胞（ｈＮＰＣ）の作製における必須工程を示すフローチャートを例示し、各工程の終了時の細胞培養物の外観を示す明視野顕微鏡写真を伴う。 ｈＥＳＣから分化した臨床等級のｈＮＰＣ（実施例１）の明視野画像を示す。 本発明の実施例１で得られた臨床等級のｈＮＰＣの免疫蛍光染色結果を示す。本明細書で使用される場合「ＤＡＰＩ」という用語は、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドールを指す。 本発明の実施例１で得られた臨床等級のｈＮＰＣのフローサイトメトリー結果を示す。 本発明の実施例１においてｈＮＰＣ培養物から得られる、インビトロ分化後の臨床等級のヒト神経細胞の特徴づけの結果を示す。本発明の実施例１における拡大培養から得られる臨床等級のｈＮＰＣの２ヵ月間のインビトロ分化後の皮質ニューロンマーカー（ＢＲＮ２、ＣＴＩＰ２、ＴＢＲ１およびＳＡＴＢ２）の免疫蛍光染色結果を示す。 本発明の実施例１においてｈＮＰＣ培養物から得られる、インビトロ分化後の臨床等級のヒト神経細胞の特徴づけの結果を示す。本発明の実施例１における拡大培養から得られる臨床等級のｈＮＰＣのヵか月間のインビトロ分化後のシナプスタンパク質マーカー（シナプシンおよびＰＳＤ９５）の免疫蛍光染色結果を示す。 本発明の実施例１においてｈＮＰＣ培養物から得られる、インビトロ分化後の臨床等級のヒト神経細胞の特徴づけの結果を示す。インビトロ分化の６日目および１３日目の臨床等級のヒト神経細胞の電気生理学的活性の結果を示す。 本発明の実施例１においてｈＮＰＣ培養物から得られる、インビトロ分化後の臨床等級のヒト神経細胞の特徴づけの結果を示す。本発明の実施例１における拡大培養から得られる臨床等級のｈＮＰＣの３ヵ月間のインビトロ分化後のグリア細胞マーカーの免疫蛍光染色結果を示す。細胞核はＤＡＰＩによってマークされ、星状細胞はＧＦＡＰによってマークされ、およびオリゴデンドロサイト前駆細胞はＯＬＩＧ２によってマークされる。 本発明の実施例１おける拡大培養から得られた臨床等級のｈＮＰＣに対する増殖曲線である。 本発明の実施例４によって提供されたｈｉＰＳＣから分化した臨床等級のｈＮＰＣの明視野画像である。 本発明の実施例４において増殖培養から得られるｈＮＰＣの免疫蛍光染色結果である。 本発明の実施例４において増殖培養から得られるｈＮＰＣのフローサイトメトリー結果である。 本発明の実施例４においてｈＮＰＣのインビトロ分化から得られた臨床等級のヒト神経細胞の特徴づけの結果を示す。本発明の実施例４における拡大培養から得られる臨床等級のｈＮＰＣからの２ヵ月間のインビトロ分化後の皮質ニューロンマーカー（ＢＲＮ２、ＣＴＩＰ２、ＴＢＲ１およびＳＡＴＢ２）の免疫蛍光染色結果を示す。 本発明の実施例４においてｈＮＰＣのインビトロ分化から得られた臨床等級のヒト神経細胞の特徴づけの結果を示す。本発明の実施例４における拡大培養から得られる臨床等級のｈＮＰＣからの２ヵ月間のインビトロ分化後のシナプスタンパク質マーカー（シナプシンおよびＰＳＤ９５）の免疫蛍光染色結果を示す。 本発明の実施例４においてｈＮＰＣのインビトロ分化から得られた臨床等級のヒト神経細胞の特徴づけの結果を示す。インビトロ分化の６日目および１４日目の臨床等級のヒト神経細胞の電気生理学的活性を示す。 本発明の実施例４においてｈＮＰＣのインビトロ分化から得られた臨床等級のヒト神経細胞の特徴づけの結果を示す。本発明の実施例４における拡大培養から得られる臨床等級のｈＮＰＣの３ヵ月間のインビトロ分化後のグリア細胞マーカーの免疫蛍光染色結果を示す。細胞核はＤＡＰＩによってマークされ、星状細胞はＧＦＡＰによってマークされ、およびオリゴデンドロサイト前駆細胞はＯＬＩＧ２によってマークされる。 実施例７および表２に記載されるような培地の様々な組み合わせを使用する細胞分化方法の結果を示す。組み合わせ１の結果を示す。 実施例７および表２に記載されるような培地の様々な組み合わせを使用する細胞分化方法の結果を示す。組み合わせ４の結果を示す。 実施例７および表２に記載されるような培地の様々な組み合わせを使用する細胞分化方法の結果を示す。組み合わせ５の結果を示す。 実施例７および表２に記載されるような培地の様々な組み合わせを使用する細胞分化方法の結果を示す。組み合わせ８の結果を示す。 実施例７および表２に記載されるような培地の様々な組み合わせを使用する細胞分化方法の結果を示す。組み合わせ１０の結果を示す。 実施例８の方法によって形成されたＥＢの明視野画像を示す。 本発明の実施例９における拡大培養から得られるｈＮＰＣの免疫蛍光染色結果である。 本発明の実施例９においてｈＮＰＣのインビトロ分化から得られた臨床等級のヒト神経細胞の特徴づけの結果を示す。本発明の実施例９における拡大培養から得られる臨床等級のｈＮＰＣからの２ヵ月間のインビトロ分化後の皮質ニューロンマーカー（ＢＲＮ２、ＣＴＩＰ２、ＴＢＲ１およびＳＡＴＢ２）の免疫蛍光染色結果を示す。 本発明の実施例９においてｈＮＰＣのインビトロ分化から得られた臨床等級のヒト神経細胞の特徴づけの結果を示す。本発明の実施例９における拡大培養から得られる臨床等級のｈＮＰＣからの２ヵ月間のインビトロ分化後のシナプスタンパク質マーカー（シナプシンおよびＰＳＤ９５）の免疫蛍光染色結果を示す。 本発明の実施例９においてｈＮＰＣのインビトロ分化から得られた臨床等級のヒト神経細胞の特徴づけの結果を示す。インビトロでの分化の７日目および１４日目の臨床等級のヒト神経細胞の電気生理学的活性を示す。 本発明の実施例９においてｈＮＰＣのインビトロ分化から得られた臨床等級のヒト神経細胞の特徴づけの結果を示す。本発明の実施例９において増殖培養から得られる臨床等級のｈＮＰＣの３ヵ月間のインビトロでの分化後のグリア細胞マーカーの免疫蛍光染色結果を示す。細胞核はＤＡＰＩによってマークされ、ニューロンはＭａｐ２によってマークされ、星状細胞はＧＦＡＰによってマークされ、およびオリゴデンドロサイト前駆細胞はＯＬＩＧ２によってマークされる。
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、各々の個々の刊行物、特許、または特許出願が、引用により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同じ程度に、引用により本明細書に組み込まれる。
本開示の他の場所で特に定義されていない限り、本明細書で使用されるすべての他の技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。
添付の特許請求の範囲を含め、本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」などの単語の単数形は、文脈が明確に別段指示しない限り、それらの対応する複数の指示対象を含む。
「または」という用語は、文脈が明確に別段指示しない限り、「および／または」という用語を意味し、それと交換可能に使用される。
本開示に関連して、別段に指示がない限り、「含む（comprise）」という文言、および「含む（comprises）」および「含むこと（comprising）」などのその変形は、明記された要素、例えば、成分、特性、工程、またはそれらの群を含蓄することを暗示すように理解されるが、任意の他の要素、例えば、成分、特性および工程を除外するものではない。本明細書で使用される場合、「含む（comprise）」という用語またはその変形は、「含有する（contain）」、「含む（include）」、または場合によっては「有する（having）」という用語、またはそれらの同等の変形で置き換えることができる。特定の実施形態では、「含む（comprise）」という文言は、「からなる（consisting of）」のシナリオも含む。
臨床等級
本出願の方法において、既知または未知であるかに関わらず、薬剤、培地、および細胞由来物質の他の供給源の使用に制限されることなく、ｈＮＰＣを作製するための材料、特に培養培地の１つまたはそれより多くを構成する材料、ならびに本出願におけるマトリックスおよび酵素に関する用語「臨床等級（clinical grade）」は、それ自体が臨床使用に適している、および／または安全かつ安定した細胞、特に臨床使用に適しているｈＮＰＣを作製するように幹細胞、特に胚性幹細胞または人工多能性幹細胞の分化を可能にするような、薬剤、培地、または細胞由来物質を示唆している。
より好ましくは、本出願のｈＮＰＣを作製するために使用される薬剤、培地、または細胞由来物質、特に本出願の培養培地の１つまたはそれより多くを構成するものは、ＧＭＰ（製造管理および品質管理の基準）等級またはｃＧＭＰ（現行の製造管理および品質管理の基準）等級であり、これは、当該薬剤、培地、または細胞由来物質が、承認されたＧＭＰまたはｃＧＭＰの品質を有し、当局によって、例えば、ＷＨＯ、ＭＯＨ（厚生省、中華人民共和国）、米国食品医薬品局または欧州医薬品庁によって規定されているＧＭＰまたはｃＧＭＰ基準に基づいて作製されていることを意味している。「ＧＭＰ」または「ｃＧＭＰ」は、製品の製造プロセスが適切に監視および管理され、エンドユーザ向けのそれらの製品が一貫して高い安全性を有していることを保証するために製造業者が従うべき（現行の）基準を示している。
「ＣＴＳ」または「ＣＴＳ（商標）」という用語は、細胞療法システムの略である。これは、製造業者、サーモフィッシャー（Thermo Fisher）が使用する用語であり、細胞療法の製造用の特定の製品が、高品質であり、ｃＧＭＰ基準を満たしていることを示している。
本出願に関連して、ＮＰＣを参照する「臨床使用の（of clinical use）」または「臨床使用に適した（suitable for clinical use）」という語句は、ＮＰＣが、臨床および前臨床の実施のための特定の規制によって要求される基準、例えば製造管理および品質管理の基準（ＧＭＰ）を少なくとも満たしていることを意味している。具体的には、本出願の方法により分化を経て作製されたＮＰＣは、臨床使用に適した特性を有している。
様々な段階での細胞型
本明細書で使用される場合、「神経前駆細胞」または「ＮＰＣ」という用語は、分化によって、限定されないが、ニューロンおよびグリア細胞、例えば、星状細胞前駆細胞、星状細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞およびオリゴデンドロサイトなどの神経系統の細胞を生じさせる細胞の型を指す。前駆細胞は幹細胞様細胞であるが、幹細胞よりも複製および増殖の能力が低い。しかし、完全に分化した細胞と比較して、前駆細胞は依然として様々な細胞型に分化する能力を有している。したがって、前駆細胞は、細胞置換療法のためのより安全な種細胞として機能することができる。特定の型の細胞、特にＮＰＣの作製の成功は、形態の観察、細胞型特異的バイオマーカーの検出、および特異的なバイオマーカーと電気生理学的活性を有する特定のタイプの神経細胞型へのインビトロ分化によって判定することができる。例えば、本出願の方法によって作製されたＮＰＣは、細胞の、比較的均一な円柱形状およびロゼット状の放射状配置を含む、神経前駆細胞の典型的な形態を示すことができる。
本明細書で使用される場合、略語「ＦＯＸＧ１」または「Ｆｏｘｇ１」は、終脳の発達を大脳などのいくつかの重要な構造へと誘導することによってヒト脳の発達において最も早く発現される転写因子の１つである「フォークヘッドボックスＧ１」を表す。大脳皮質は、前脳フォークヘッドボックスＧ１（ＦＯＸＧ１）を発現する原基に由来する。したがって、ＦＯＸＧ１は、最終的に前脳細胞に分化する前駆細胞に対するマーカーとして機能する。本出願の一実施形態では、本出願の方法によって作製されたＮＰＣはＦＯＸＧ１を発現する。
本明細書で使用される場合、「胚性幹細胞（embryonic stem cells）」または「ＥＳＣ」という用語は、胚に由来する多能性幹細胞を指す。本明細書で使用される場合、「人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cells）」または「ｉＰＳＣ」という用語は、分化した体細胞を再プログラミングすることによって作製された多能性幹細胞を指す。本出願の方法は、指向性分化のための出発物質としてＥＳＣまたはｉＰＳＣのいずれかを使用することができる。本出願の具体的な実施形態では、ＥＳＣまたはｉＰＳＣは、哺乳動物起源、特にヒト起源を有する。本出願は、ＥＳＣおよびｉＰＳＣを含む幹細胞の供給源を、それらが臨床使用の要件を満たす限り、限定しない。上記細胞は、商業的供給源から直接取得することができるか、または製造業者によって、例えば体細胞をｉＰＳＣに再プログラミングすることによって調製することができる。
本明細書で使用される場合、「胚様体（embryoid body）」または「ＥＢ」という用語は、ＥＳＣおよびｉＰＳＣから三次元的に増殖する細胞凝集体を指す。ＥＢは懸濁培養で形成することができる。しかし、ＥＢ培養の従来の方法では均一なサイズおよび形状のＥＢを取得することは困難である。
本出願に関連して、本明細書で交換可能に使用される場合、「ロゼット型神経幹細胞由来神経凝集体（Rosette-type neural stem cell derived Neural Aggregates）」、「ロゼット神経凝集体（ROsette Neural Aggregates）」または「ＲＯＮＡ」という用語は、ＥＳＣまたはｉＰＳＣ由来であり、高度にコンパクトな３Ｄカラム状の神経凝集体に自己組織化された、神経幹細胞の凝集体を指す。本出願の方法、具体的には工程（３）で形成されたロゼットは、ＦＯＸＧ１およびネスチンに対して免疫陽性である。本出願の方法では、ＲＯＮＡは、概して、初期分化後８日目に、すなわち、本発明の方法の工程（３）で、ＥＢが、コーティングされた培養表面（例えば、コーティングされたプレート）に移された約１日後に作製される。
本出願に関連して、本明細書で使用される場合、「神経スフェア（neurosphere）」という用語は、懸濁培養から形成された、ＲＯＮＡから単離された球状の神経運命細胞凝集体を指す。神経スフェアは、神経幹細胞、神経前駆細胞、およびいくつかの分化した神経細胞を含む、様々な種類の神経細胞で構成される不均一集団である。本出願の方法では、神経スフェアは主にＮＰＣで構成され、これは、単一細胞に分散または消化され、コーティングされた培養表面、例えばコーティングされた細胞培養プレートに播種し、高純度の単層ＮＰＣを形成することができる。本出願の方法では、神経スフェアは、概して、初期分化後２１日目に、すなわち、本発明の方法の工程（４）で、ＲＯＮＡがＮＰＣ培地中で培養された約１日後に作製される。ＲＯＮＡを培養して神経スフェアを形成するプロセスでは、直前または直後の工程で使用されるものと同じ培地を使用することができる。例えば、ＲＯＮＡを培養するためのＮＩＭまたは単層ＮＰＣを形成するためのＮＰＣ培地を使用することができる。
本開示では、細胞が培養表面（培養プレートなど）から除去されるか、または神経スフェアが、機械的手段を取るか、もしくは酵素（付着した細胞マトリックスを切り離すことができる酵素など）を適用することによって切り離されることが示唆されている。好ましい実施形態では、凝集細胞は、機械的手段と比較して、消化酵素を使用することによってより均一に別個の単一細胞に分散するまたは切り離すことができる。具体的には、消化酵素による処理は、様々な目標を達成するために、本発明の方法の様々な工程で実施することができる。例えば、本発明の方法の工程（５）における消化によって、神経スフェアを単一細胞に解離する。加えて、消化酵素は、（ａ）当該方法の工程（１）で細胞を播種する前に幹細胞を切り離し、懸濁するため、および／または（ｂ）当該方法の工程（５）の後の継代中にＮＰＣを切り離すためにも使用することができる。前述の工程で使用される消化酵素は、同じであってもよく、または異なっていてもよい。具体的な実施形態では、本出願の方法、特に工程（１）で使用される酵素は、コロニー中心部の細胞が互いに付着したままである中で、培養プレートなどの培養表面からコロニーを剥がすだけの酵素と比較して、細胞コロニーを個別の単一細胞に消化することができる。例示的な酵素は、アキュターゼ、ディスパーゼ、ベルセン（ＥＤＴＡ）またはＴｒｙｐＬＥであり得る。好ましい実施形態では、酵素は、幹細胞（ＥＳＣまたはｉＰＳＣ）、神経スフェアおよびＮＰＣを消化するために使用することができる、ＣＴＳ（商標）ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ Ｅｎｚｙｍｅである。別の実施形態では、神経スフェアを解離するための工程（５）の酵素は、ＣＴＳ（商標）ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ Ｅｎｚｙｍｅである。好ましくは、本出願の方法において細胞を消化または分離するのに適した消化酵素または細胞分離酵素溶液は、臨床等級、ＧＭＰ等級、ｃＧＭＰ等級もしくはＣＴＳ（商標）等級であるか、または消化酵素は、臨床使用のためにＮＰＣを調製するのに適している。酵素は、その製造業者が推奨する量で使用することができる。
ｉＰＳＣ／ＥＳＣ、ＲＯＮＡに加えて、単層ＮＰＣの培養のために、培養プレートなどの培養表面は、付着した細胞の増殖をサポートするため、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）でコーティングされる。ＥＣＭは、外側の細胞表面マトリックスであり、主にコラーゲン、エラスチンおよびラミニンなどのタンパク質で構成されている。ＥＣＭは、哺乳動物細胞の培養に広く使用されており、当業者に知られている。固体支持体または培養表面、例えば培養プレートをコーティングするために使用することができるＥＣＭの非限定的な例としては、マトリゲル（商標）、ラミニン、ポリリジン、ポリオルニチン（ＰＯ）／フィブロネクチン（ＦＮ）／ラミニン（ｌａｍ）の組み合わせ、フィブロネクチン（ＦＮ）などが挙げられる。好ましい実施形態では、ＲＯＮＡ培養用のプレートなどの培養表面は、マトリゲル（商標）またはラミニンでコーティングされる。より好ましい実施形態では、ＲＯＮＡ培養用のプレートなどの培養表面は、バイオラミナ（BioLamina）から入手可能なラミニン－５２１、具体的には臨床等級またはＧＭＰ等級のＭＸ５２１またはＣＴ５２１でコーティングされる。
所望の型の細胞の分化または形質転換は、その発現がその型の細胞に特異的であるタンパク質マーカーの免疫染色によって判定することができる。神経学（neuronomics）において従来から使用されているマーカーは当業者に周知である。例えば、微小管関連タンパク質２（Ｍａｐ２）アイソフォームａ、ｂ、およびｃは、ニューロン、具体的には核周部および樹状突起でのみ発現される。
本出願はまた、例えば分化培地における培養によって、本発明の方法により作製されたＮＰＣから、限定されないが、ニューロン、および星状膠細胞およびオリゴデンドロサイトなどのグリア細胞を含む、さらに分化した細胞を作製する方法にも関する。分化培地を含む分化に使用される条件は、増殖が意図される細胞型に応じて当業者によって決定することができる。好ましくは、分化培地は、ＮＰＣの分化から得られる細胞が前臨床使用および臨床使用に適しているように、臨床等級、ＧＭＰ等級、ｃＧＭＰ等級またはＣＴＳ（商標）等級である。
具体的な実施形態では、本発明の方法によって作製されたＮＰＣは、ニューロンを産生するために神経分化培地で培養される。本出願のＮＰＣ培地、例えばＣＴＳ－ＮＰＣ培地は、神経分化培地として使用することができ、これは、分化によって幹細胞からニューロンを作製するプロセス全体の複雑性を軽減し、前臨床使用および臨床使用に適したニューロンを生み出すことができる。
培養培地
本出願の各工程で使用される培地の組成は、ＮＰＣの分化を成功させるために不可欠である。本出願の任意の培地およびその培地に含まれる成分は、臨床等級、好ましくはＧＭＰ等級、ｃＧＭＰ等級またはＣＴＳ（商標）等級であるべきであるか、または分化による臨床使用に適したＮＰＣを作製するために使用することができる。
培地は、特定の型の細胞の増殖に必要とされる栄養素の混合物を含む。培地は、通常、基本培地にサプリメントを加えることによって調製される。広い意味で、サプリメントは、タンパク質、脂質、アミノ酸、ビタミン、ホルモン、サイトカイン、増殖因子などを含む、細胞培養に必要とされる基本培地には存在しない追加の成分を指す。しかし、本発明に関連して、「サプリメント」には、ｈＰＳＣ培地およびＥＢ培地に別々に加えられる阻害剤、またはＮＰＣ培地に別々に加えられるＬ－アスコルビン酸、ＤＢ－ｃＡＭＰ、神経栄養因子は含まれない。本出願の方法で使用される培地のいずれかに含まれる基本培地およびサプリメントは、臨床等級、好ましくはＧＭＰ等級、ｃＧＭＰ等級またはＣＴＳ（商標）等級である。
本出願に関連して、ｈＰＳＣ培地は、本発明の方法の工程（１）においてＥＳＣまたはｉＰＳＣからのＥＢの形成を促進するための培養培地である。本発明の方法に適したｈＰＳＣ培地は、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）ｈＰＳＣ ＸＦ培地、ＣＴＳ（商標）Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８培地、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）Ｂａｓｉｃ０３、ＳｔｅｍＭＡＣＳ（商標）ｉＰｓ－Ｂｒｅｗ、Ｓｔｅｍ－Ｐａｒｔｎｅｒ（登録商標）ＡＣＦ、ＴｅＳＲ（商標）－ＡＯＦおよびＴｅＳＲ２からなる群から選択することができる。
好ましい実施形態では、本発明の方法の工程（１）におけるｈＰＳＣ培地に、ＲＯＣＫ阻害剤を補充することができる。ＲＯＣＫ阻害剤は、セリン－スレオニンタンパク質キナーゼファミリーのキナーゼである、ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）を阻害し、解離または解凍後の細胞のアポトーシスを防ぐ、一種のタンパク質キナーゼ阻害剤である。細胞骨格に作用することによって、ＲＯＣＫは、細胞の形状および移動の調節に関与し、細胞の不死化および分化も調節する。例示的なＲＯＣＫ阻害剤には、限定されないが、Ｙ－２７６３２が含まれる。分化による臨床使用に適したＮＰＣを作製するために、臨床等級、ＧＭＰ等級、ｃＧＭＰ等級またはＣＴＳ（商標）等級のＲＯＣＫ阻害剤が本出願の方法で使用される。そのようなＲＯＣＫ阻害剤は商業的に入手可能である。ＲＯＣＫ阻害剤は、約１０μＭの濃度でｈＰＳＣ培地に加えることができる。
本出願に関連して、ＥＢ培地は、ＥＢを培養し、神経分化を誘導するための培養培地である。具体的には、ＥＢ培地は、本発明の方法の工程（２）で使用される培地を指す。
好ましい実施形態では、ＥＢ培地は阻害剤を含む。より具体的には、阻害剤は、ＢＭＰ阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤およびＡＬＫ阻害剤を含むまたはからなる。一実施形態では、ＥＢ培地は、Ｎｏｇｇｉｎ、ドルソモルフィン、ＤＭＨ－１、ＬＤＮ－１９３１８９およびＳＢ４３１５４２からなる群から選択される１つまたはそれより多くの阻害剤を含む。好ましくは、ＥＢ培地は、Ｎｏｇｇｉｎ、ＬＤＮ－１９３１８９、ＤＭＨ－１およびドルソモルフィンの任意の１つまたはそれより多く、例えば１つまたは２つ、と組み合わせたＳＢ４３１５４２を含む。より具体的には、ＥＢ培地は、Ｎｏｇｇｉｎ、ＳＢ４３１５４２およびドルソモルフィンの組み合わせを含む。ＥＢ培地中のＮｏｇｇｉｎの濃度は、２５～１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは４０～６０ｎｇ／ｍＬ、最も好ましくは５０ｎｇ／ｍＬであり得る。ＥＢ培地中のドルソモルフィンの濃度は、０．５～２μＭ、好ましくは０．７５～１．５μＭ、最も好ましくは１μＭであり得る。ＥＢ培地中のＳＢ４３１５４２の濃度は、５～１５μＭ、好ましくは７～１３μＭ、より好ましくは８～１２μＭ、最も好ましくは１０μＭであり得る。
具体的な実施形態では、ＥＢ培地の基本培地およびサプリメントは、以下の表１から選択することができる。より具体的な実施形態では、ＥＢ培地は、表１に示されるような基本培地とサプリメントとの組み合わせを有する。
本出願に関連して、ＮＩＭは、ＲＯＮＡの形成を誘導するための培養培地である。
ＥＢ培地またはＮＩＭの基本培地が、２つの基本培地を混合することによって作られる場合、２つの培地の混合比は、容量で約１：１である。
一実施形態では、ＮＩＭおよびＥＢ培地は、基本培地およびサプリメントの同じ組成を有し、ＥＢ培地が阻害剤を追加で含むという点でのみ異なる。同一の必須成分を有するＮＩＭおよびＥＢ培地を使用することで、培地の調製がより効率的になる。
具体的な実施形態では、ＮＩＭの基本培地およびサプリメントは、表１から選択することができる。より具体的な実施形態では、ＮＩＭは、表１に示されるような基本培地とサプリメントの組み合わせを有する。
表１において、「ＣＴＳ－ＤＭＥＭ／Ｆ１２」は、ＣＴＳ（商標）ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ギブコ（Gibco））を指し；「ＤＭＥＭ／Ｆ１２」は、ｃＧＭＰ等級のＤＭＥＭ／Ｆ１２（ギブコ）を指し；「ＣＴＳ－ＮＢ」は、ＣＴＳ（商標）Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地（ギブコ）を指し；「ＣＴＳ－Ｂ２７」は、ＣＴＳ（商標）等級のＢ－２７（商標）サプリメント、ＸｅｎｏＦｒｅｅ、マイナスビタミンＡ（ギブコ）を指し；ＣＴＳ－Ｎ２は、ＣＴＳ（商標）Ｎ－２サプリメント（ギブコ）を指し；「ＣＴＳ－ＧｌｕｔａＭＡＸ」は、ＣＴＳ（商標）ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）－Ｉサプリメント（ギブコ）を指し；ＮＤＳは、Ｎｏｇｇｉｎ、ドルソモルフィン、およびＳＢ４３１５４２を指す。パーセンテージは、培地の容量に基づいて計算される。
Figure 2023551851000002
別の実施形態では、本出願の１つより多くのそれぞれの培地を、ＥＢおよびＲＯＮＡの培養プロセスで使用することができる。工程（２）のＥＢ培養プロセスにおいて、表１に挙げられるような基本培地およびサプリメントを含むＥＢ培地などの、本開示の２つまたはそれより多くのＥＢ培地を、任意の順序および任意の組み合わせで使用することができる。同様に、表１に挙げられるような基本培地およびサプリメントを含むＮＩＭなどの、本開示の２つまたはそれより多くのＮＩＭを、任意の順序および任意の組み合わせで使用することができる。例えば、第１の培地が使用され、続いて第２の培地が使用されるか；または第１の培地が使用され、続いて第２の培地が使用され、そして第１の培地に変更して戻るか；または第１の培地が使用され、続いて第２の培地および第３の培地が使用される；など。より具体的な例では、工程（２）および／または工程（３）において、ＣＴＳ等級またはＧＭＰ等級のＮ２Ｍ培地が最初に使用され、続いてＣＴＳ等級のＮＤＭ培地が使用される。１つより多くの培地が使用される場合、当業者に周知の手段によって培養中の任意の時点で培地交換を行うことができる。
本出願に関連して、ＮＰＣ培地は、ＮＰＣのための培養培地である。ＮＰＣ培地は、好ましくは、（ｉ）ＮＰＣを維持するのに適した基本培地；および（ii）ＣＴＳ（商標）ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）－ＩサプリメントおよびＣＴＳ（商標）等級のＢ－２７（商標）サプリメント、ＸｅｎｏＦｒｅｅ、マイナスビタミンＡ、を含むまたはからなる。より好ましい実施形態では、ＮＰＣ培地は、ＢＤＮＦ、および／またはＧＤＮＦ、および／またはＬ－アスコルビン酸、および／またはＤＢ－ｃＡＭＰをさらに含む。
ＢＤＮＦおよびＧＤＮＦなどの神経栄養因子は、別個のニューロン集団の生存、増殖、または分化に重要な因子である。ＮＰＣ培地に含まれるＢＤＮＦまたはＧＤＮＦは、動物質を含まない製品として提供することができる。ＢＤＮＦおよび／またはＧＤＮＦは、臨床等級、ＧＭＰ等級、ｃＧＭＰ等級またはＣＴＳ（商標）等級であり得る。
本開示で例示されるような、培地、サプリメント、阻害剤、神経栄養因子または他の薬剤などの、任意の具体的な製品は、同じタイプであるが異なる商標または製品名の製品に置き換えられてもよく、または機能的等価物に置き換えられてもよい。当業者は、異なる商標または製品名の実質的に同じ製品に加えて、機能的等価物もまた、本開示によって包含されることを理解するであろう。
方法の工程
単に参照を容易にするために、本出願の方法は、多数の工程に分割され、その各々は、培養の手順および／または処理の１つまたはそれより多くを含む。当該方法の工程（１）から（５）は、培養培地の変化および／または各工程の終了時に得られる細胞培養物の形態に基づいて実質的に定義される。
当該方法の工程（１）では、ｈＰＳＣ培地中で幹細胞を培養することによって、幹細胞、特にＥＳＣまたはｉＰＳＣがＥＢを形成することを可能にする。一実施形態では、幹細胞は、培養プレートまたはフラスコなどの培養容器、好ましくは超低接着培養プレート、より好ましくは超低接着９６ウェル培養プレートにおいて培養される。典型的には、工程（１）の培養は３７℃で行われる。細胞は、次の工程に付されるまで、約２４～７２時間、好ましくは２日間培養される。工程（１）の終了時に、幹細胞は、丸く滑らかな表面を特徴とする形態を有するＥＢを形成する。ｈＰＳＣ培地は、好ましくは、ＲＯＣＫ阻害剤を含む。
当該方法の工程（２）では、ＥＢをＥＢ培地中で増殖させ、ここで、ＥＢは自発的な神経分化を受ける。特に、ＥＢは工程（２）において懸濁液中で培養される。一実施形態では、幹細胞は、培養プレートまたはフラスコなどの培養容器、好ましくは低接着培養プレート、より好ましくは低接着６ウェル培養プレートにおいて培養される。典型的に、工程（２）の培養は３７℃で行われる。ＥＢは、次の工程に進むまで、約１００～１４０時間、好ましくは５日間培養される。好ましくは、ＥＢ培地は新鮮な培地と毎日交換される。工程（２）の終了時に、ＥＢは、丸くて滑らかな表面を有し、より大きく成長していることを特徴とする形態を有する。好ましいＥＢ培地は、ＥＢの神経分化の誘導を促進する阻害剤をさらに含む。
当該方法の工程（３）では、所望の培養段階でのＥＢをＮＩＭ中で増殖させて、ＲＯＮＡの形成を誘導する。一実施形態では、ＥＢは、臨床等級のＥＣＭ材料でコーティングされた培養プレート、フラスコ、またはペトリ皿などの培養表面に付着させられる。典型的には、工程（３）の培養は３７℃で行われる。工程（３）の神経誘導は、通常、約５～２０日間続く。工程（３）の終了時に、ＥＢは、ロゼットのクラスターであるＲＯＮＡに分化し、結果として三次元の円柱状の細胞凝集体になる。
当該方法の工程（４）では、ＲＯＮＡ中のロゼット様細胞を単離させ、ＮＰＣ培地の懸濁液中で増殖させて、神経スフェアを形成する。一実施形態では、神経凝集体は、培養プレートまたはフラスコなどの培養容器、好ましくは低接着培養プレート、より好ましくは低接着６ウェル培養プレートにおいて培養される。例えば、工程（４）の開始時に６ウェル低接着培養プレートに播種された細胞の量は、６ウェル培養プレートから得られるＲＯＮＡの量に対応している。典型的には、工程（４）の培養は３７℃で行われる。神経凝集体は、次の工程に進むまで約１２～２４時間培養される。工程（４）の終了時に、球状の神経スフェアが、丸く滑らかな表面を特徴とする形態を有して形成される。
当該方法の工程（５）では、神経スフェアがＮＰＣ培地において単層ＮＰＣを形成することを可能にする。一実施形態では、工程（５）は、神経スフェアの切り離しの工程（５ａ）および培養の工程（５ｂ）を含む。切り離しは、酵素処理または機械的手段などの他の既知の方法によって行うことができる。酵素処理によって行われる工程（５ａ）は、神経スフェアを消化酵素で５～１０分間処理することによって細胞を切り離すことを目的とする。酵素処理された神経スフェアは、培養のために所定数でプレーティングできるように単一細胞に解離する。培養工程（５ｂ）は、臨床等級のＥＣＭ材料でコーティングされた培養プレートまたはフラスコなどの培養表面で行われる。細胞は、約０．５～４．０×１０6細胞／ｃｍ2、好ましくは０．８～３．５×１０6細胞／ｃｍ2、より好ましくは１．０×１０6細胞／ｃｍ2の密度で播種される。典型的には、工程（５ｂ）の培養は３７℃で行われる。翌日、ＮＰＣは８０～１００％の培養密度で観察することができる。
工程（５）の後、ＮＰＣは、維持培養に付され、１回または複数回継代することができる。好ましくは、細胞は、３～５日ごと、具体的には４日ごとに継代される。細胞を継代するとき、ＮＰＣは、消化酵素で処理し、洗浄し、計数することができ、その後、培養プレートまたはフラスコなどの培養表面、好ましくは臨床等級のＥＣＭ材料でコーティングされた６ウェル培養プレートに移される。好ましくは、培地は、例えば使用済みの培地の半分量を新鮮な培地と交換することによって毎日または一日おきに交換される。
工程（１）の前に、本発明の方法は、幹細胞の維持を含むことができる。工程（１）を開始するために、維持培養中の幹細胞を、機械的手段によって、または消化酵素で処理し、洗浄し、計数することができる。当業者は、維持培養のための適切な培地を選択することができる。市販の幹細胞が使用される場合は、製造業者が推奨する条件下で維持培養を行うことができる。
使用
本出願の方法は、臨床使用および前臨床使用に適したＮＰＣを産生するのに適している。例えば、本発明の方法によって産生されたＮＰＣは、薬開発、疾患モデリング、前臨床研究および臨床研究、ならびに既存の治療法および開発中の新しい治療法にも使用することができる。
本発明の方法によって作製されたＮＰＣは、１つまたはそれより多くの種類の分化神経細胞、特に前臨床使用および／または臨床使用に適した分化神経細胞を産生するための出発物質としても使用することができる。例えば、分化神経細胞は、ニューロンまたは星状膠細胞やオリゴデンドロサイトなどのグリア細胞であり得る。
実施例１．分化によるｈＥＳＣからのｈＮＰＣの作製
本明細書に開示されている方法のプロセスの工程は、図１によって示されるようなフローチャートで簡単に要約されている。詳細な工程および材料は次のとおりである。
胚様体（ＥＢ）の調製
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）株Ｈ１を、シャンハイ アプライド セル バイオテクノロジー社（Shanghai Applied Cell Biotechnology Co., Ltd.）（カタログ番号ＡＣ－２００１００２Ｈ１）から購入し、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）ｈＰＳＣ ＸＦ培地（バイオロジカル インダストリーズ（Biological Industries）、ＢＩ）を含む６ウェルプレートで維持した。６～１０分間５％のＣＯ2で３７℃のインキュベータにおいて１ウェルあたり１ｍＬのＣＴＳ（商標）ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ Ｅｎｚｙｍｅ（ギブコ）を用いて細胞を消化した後、ＥＳＣを分離し、回収し、１ウェルあたり２．５ｍＬのＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）ｈＰＳＣ ＸＦ培地（ＢＩ）中の臨床等級のラミニン－５２１（バイオラミナ、ＭＸ５２１／ＣＴ５２１）でコーティングされたプレートに１．６５×１０4細胞／ｃｍ2の密度で播種した。
培養密度が８０～９０％に達したら、培地を廃棄し、細胞を２ｍＬ／ウェルのＣＴＳ（商標）ＤＰＢＳ（塩化カルシウムおよび塩化マグネシウム不含）（ギブコ）で洗浄した。細胞を、３７℃のインキュベータにおいて５％のＣＯ2で６～１０分間１ウェルあたり１ｍＬのＣＴＳ（商標）ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ Ｅｎｚｙｍｅ（ギブコ）を用いて消化した。顕微鏡で観察して細胞の一部がプレートから分離し始めたら、各ウェルに３ｍＬのＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）ｈＰＳＣ ＸＦ培地（ＢＩ）を加えることによって消化を停止した。遠心後、細胞を、１０μＭのＲｏｃｋ阻害剤（ＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ（登録商標）Ｙ－２７６３２、和光（Wako））を含むＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）ｈＰＳＣ ＸＦ培地（ＢＩ）で再懸濁し、生細胞を計数した。
細胞を、１０μＭのＲＯＣＫ阻害剤（和光）を含む２００μＬのＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）ｈＰＳＣ ＸＦ培地（ＢＩ）を用いて１ウェルあたり３０，０００細胞の密度で超低接着９６ウェルプレートに播種し、５％ＣＯ2を用いて３７℃でインキュベータにおいて培養した。翌日、各ウェルに胚様体（ＥＢ）が形成され、ＥＢが同じサイズであることが観察された。
ＥＢの指向性分化
細胞を、２日間（指向性分化の０～２日目）超低接着９６ウェルプレートにおいて１０μＭのＲｏｃｋ阻害剤（和光）を含むＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）ｈＰＳＣ ＸＦ培地（ＢＩ）中で培養した。その後、ＥＢを、１ウェル当たり２８～３２ＥＢの密度で低接着６ウェルプレートに移し、使用済みの培養培地を廃棄した。２．５ｍＬのＣＴＳ－ＥＢ培地を各ウェルに加えた。ここで、ＣＴＳ－ＥＢ培地は、ＣＴＳ（商標）ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地（ギブコ）とＣＴＳ（商標）Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地（ギブコ）を１：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の比率で混合することによって基本培地を得、これに５０ｎｇ／ｍＬのＮｏｇｇｉｎ ＧＭＰ（Ｒ＆Ｄ）、１μＭのドルソモルフィン（トクリス（Tocris））、１０μＭのＳＢ４３１５４２（トクリス）、１ｖｏｌ％のＣＴＳ（商標）Ｎ－２サプリメント（１００×）（ギブコ）、および０．５ｖｏｌ％のＣＴＳ（商標）ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）－Ｉサプリメント（２００×）（ギブコ）を加えて調製した。ＥＢを、インキュベータにおいて５％のＣＯ2を用いて３７℃でさらに５日間培養し、使用済みの培地を、毎日新鮮なＣＴＳ－ＥＢ培地に完全に交換した。
初期の分化後の７日目に、ＥＢを、臨床等級のラミニン－５２１（バイオラミナ、ＭＸ５２１／ＣＴ５２１）でコーティングされた６ウェルプレートに移して、ＥＢの完全な接着を可能にし、神経幹細胞およびＮＰＣの拡大を促進する臨床等級の無血清神経誘導培地（ＮＩＭ）で培養した。臨床等級の無血清ＮＩＭは、ＣＴＳ（商標）ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地（ギブコ）とＣＴＳ（商標）Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地（ギブコ）を１：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の比率で混合することによって基本培地を得、これに１ｖｏｌ％のＣＴＳ（商標）Ｎ－２サプリメント（１００×）（ギブコ）、０．５ｖｏｌ％のＣＴＳ（商標）ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）－Ｉサプリメント（２００×）（ギブコ）を加えて調製した。最初の５日間は１日おきに使用済みの培地の半分を新鮮な培地に交換することによってＮＩＭを交換し、５日の後は毎日使用済みの培地の半分を交換することによって交換した。臨床等級のラミニン－５２１（バイオラミナ、ＭＸ５２１／ＣＴ５２１）でコーティングされたプレートに播種されたＥＢの初日から開始して、ＥＢを再びプレートに付着させ、付着細胞凝集体を徐々に形成した。後に、典型的な神経特異的ロゼットを形成し、これは神経幹細胞凝集体の形成を示唆していた。神経幹細胞およびＮＰＣが徐々に拡大すると、コロニーの中心にＲＯＮＡを形成した。
初期分化後の２１日目に、ＮＰＣを高めた神経凝集体を選択し、実体顕微鏡下で単離し、選択した神経凝集体を、各ウェルに２．５ｍＬのＣＴＳ－ＮＰＣ培地を含む低接着６ウェルプレートに移した。ＣＴＳ－ＮＰＣ培地は、２０ｎｇ／ｍＬの動物質不含組み換えヒト／マウス／ラットＢＤＮＦ（ペプロテック（PeproTech））、２０ｎｇ／ｍＬの動物質不含組み換えヒトＧＤＮＦ（ペプロテック）、０．２ｍＭのＬ－アスコルビン酸（ＶＣ）（シグマ（Sigma））、０．５ｍＭのＮ6，Ｏ2’－ジブチリルアデノシン３’，５’環状一リン酸ナトリウム塩（ＤＢ－ｃＡＭＰ）（シグマ）、１ｖｏｌ％のＣＴＳ（商標）ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）－Ｉサプリメント（１００×）（ギブコ）および２ｖｏｌ％のＣＴＳ（商標）等級のＢ－２７（商標）サプリメント、ＸｅｎｏＦｒｅｅ、マイナスビタミンＡ（５０×）（ギブコ）を、ＣＴＳ（商標）Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地（ギブコ）へと加えることによって調製した。
１日の培養後、神経スフェアの形成を観察することができた。低接着６ウェルプレートの１ウェル中の神経スフェアを選択し、２４ウェル細胞培養プレートのウェルに移した。できるだけ慎重に培地を除去した。０．５ｍＬのＣＴＳ（商標）ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ Ｅｎｚｙｍｅ（ギブコ）を各ウェルに加えて、神経スフェアを５～１０分間消化し、１．５ｍＬのＣＴＳ－ＮＰＣ培地をゆっくり加えて、神経スフェアの外層細胞が緩んだら消化を終了した。神経スフェアを、１５ｍＬの遠心管に移し、２～５分間沈殿させた。上清を可能な限り除去した。１ｍＬのＣＴＳ－ＮＰＣ培地を加え、神経スフェアを１ｍＬのピペットで単一細胞に解離し、生細胞の数を計数した。解離した細胞を、１ウェルあたり５ｍＬのＣＴＳ－ＮＰＣ培地を用いて臨床等級のラミニン－５２１（バイオラミナ、ＭＸ５２１／ＣＴ５２１）でコーティングした６ウェル細胞培養プレート上に１．０×１０6細胞／ｃｍ2の密度で播種した。翌日、選択したｈＮＰＣが、９０～１００％の培養密度で接着して増殖していることを観察することができた。使用済みの培地の半分を新鮮な培地と交換することによって、培地を毎日または一日おきに交換した。
６ウェル培養プレートで増殖したｈＮＰＣを消化し、４日ごとに継代した。具体的には、ｈＮＰＣを、まず２ｍＬ／ウェルのＣＴＳ（商標）ＤＰＢＳ（塩化カルシウムおよび塩化マグネシウム不含、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水）（ギブコ）で１回洗浄し、続いて、６～１０分間、５％のＣＯ2を用いて３７℃のインキュベータにおいて１ｍＬ／ウェルのＣＴＳ（商標）ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ Ｅｎｚｙｍｅ（ギブコ）で酵素消化した。ＣＴＳ（商標）ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ Ｅｎｚｙｍｅ溶液を、顕微鏡で観察して細胞が培養プレートに付着したまま円形になり始めた後に、直ちに廃棄した。３ｍＬの新鮮なＣＴＳ－ＮＰＣ培地を各ウェルに加え、ほとんど全ての細胞が分離されるまで１ｍＬのピペットで８～１０回ピペット処理した。細胞の懸濁液を１５ｍＬの遠心管に移し、４分間２００ｇで遠心分離した。遠心分離後、上清を廃棄し、細胞ペレットをＣＴＳ－ＮＰＣ培地で再懸濁し、生細胞の数を計数した。その後、細胞を、各ウェルにおいて５ｍＬのＣＴＳ－ＮＰＣ培地を用いて臨床等級のラミニン－５２１（バイオラミナ、ＭＸ５２１／ＣＴ５２１）でコーティングした６ウェル細胞培養プレートへと１．０×１０6細胞／ｃｍ2の細胞密度で播種した。翌日、ｈＮＰＣが、９０～１００％の培養密度で付着して増殖していることを観察することができた。使用済みの培地の半分を新鮮な培地と置き換えることによって、培地を毎日または一日おきに交換した。ｈＮＰＣを４回継代した後、Ｐ５のｈＮＰＣを凍結保存したか、または直接使用する準備を整えた。
実施例２．分化によってｈＥＳＣから作製されたｈＮＰＣの特徴づけ
実施例１に示したような分化プロセスによるｈＮＰＣの作製の成功を確認するために、得られた細胞を、形態の観察および細胞特異的バイオマーカーの検出に基づく検証にさらした。
細胞形態
図２は、本発明の実施例１の方法によるｈＥＳＣの指向性分化によって作製されたｈＮＰＣの明視野画像である。本発明で提供される方法によって得られたｈＮＰＣが、付着して増殖し、相対的に均一な柱状形態であり、細胞のロゼット様放射配列を特徴とする、典型的なｈＮＰＣ形態を有することが、図２からわかる。
免疫蛍光染色アッセイ
本発明の実施例１に記載された方法によって得られたｈＮＰＣに対して、免疫蛍光染色アッセイも実施した。図３によって示されるように、作製した細胞のほとんどは、ＦＯＸＧ１とネスチンの両方の発現を示し、これは、分化による高純度の大量のｈＮＰＣの作製に成功したことを示唆していた。具体的には、作製した細胞の集団の中で、９８．５２％もの高いＦＯＸＧ１+細胞の割合および９９．２６％もの高いネスチン+細胞の割合を達成した（図３）。
フローサイトメトリー
実施例１で作製した細胞を、ＦＯＸＧ１、ＰＡＸ６およびネスチンの発現に基づいてｈＮＰＣを同定するフローサイトメトリーにかけた。上記の免疫蛍光染色アッセイと同様の結果が得られた。フローサイトメトリーの結果によれば、９５．６９％もの高いＦＯＸＧ１+細胞の割合、７６．１１％もの高いＰＡＸ６+細胞の割合、および９８．０２％もの高いネスチン+細胞の割合を達成した（図４）。
実施例３．ｈＥＳＣから作製したｈＮＰＣの分化
所望の細胞型にさらに分化する実施例１の分化によって作製されたｈＮＰＣの能力を試験するために、複数の実験を行った。
ニューロンへのｈＮＰＣの分化
６ウェル培養プレートで増殖したｈＮＰＣを消化し、ニューロン分化のために播種した。ＣＴＳ－神経分化培地は、実施例１に記載したＣＴＳ－ＮＰＣ培地と同じであった。ｈＮＰＣを、まず２ｍＬ／ウェルのＣＴＳ（商標）ＤＰＢＳ（ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウム不含）（ギブコ）で１回洗浄し、続いて、６～１０分間５％のＣＯ2を用いて３７℃のインキュベータにおいて１ｍＬ／ウェルのＣＴＳ（商標）ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ Ｅｎｚｙｍｅ（ギブコ）で酵素消化させた。ＣＴＳ（商標）ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ Ｅｎｚｙｍｅ溶液を、顕微鏡で観察して細胞が培養プレートに付着したまま円形になり始めた後に、すぐに廃棄した。３ｍＬの新鮮なＣＴＳ－神経分化培地を各ウェルに加え、ほとんど全ての細胞が分離されるまで１ｍＬのピペットで８～１０回ピペット処理した。細胞の懸濁液を、１５ｍＬの遠心管に移し、４分間２００ｇで遠心分離した。遠心分離後、上清を廃棄し、細胞ペレットをＣＴＳ－神経分化培地で再懸濁し、生細胞の数を計数した。その後、細胞を、各ウェルにおいて５００μＬのＣＴＳ－神経分化培地を用いて臨床等級のラミニン－５２１（バイオラミナ、ＭＸ５２１／ＣＴ５２１）でコーティングされた２４ウェル培養プレートへと２．５×１０4の生細胞の細胞密度で蒔いた。翌日、ｈＮＰＣが付着して増殖していることを観察することができた。使用済みの培地の半量を新鮮な培地と置き換えることによって、培地を３～７日おきに交換した。
免疫蛍光染色アッセイ
本発明の実施例１における拡大培養から得られたｈＮＰＣのインビトロ分化を示すために、免疫蛍光染色アッセイを実施した。
図５Ａは、２ヶ月間インビトロで分化させた後のｈＮＰＣの培養物に対してヒト大脳皮質の６層に特異的な様々なマーカーを用いて実施した免疫蛍光染色の結果を示す。図５Ａによって示されるように、蛍光シグナルはマーカーの発現を表し、これらは、層II～IVについては脳－２（ＢＲＮ２）および特別なＡＴリッチ配列結合タンパク質２（ＳＡＴＢ２）、層ＶおよびVIについてはニワトリオボアルブミン上流プロモーター転写因子相互作用タンパク質２（ＣＴＩＰ２）、層Ｉ、Ｖ、およびVIについてはＴ－ボックス脳タンパク質１（ＴＢＲ１）、およびニューロンについてはＭａｐ２（微小管関連タンパク質２）であった。免疫染色の結果は、実施例１の方法によって得られたｈＮＰＣが、ヒト大脳皮質の６層全ての神経細胞に分化することに成功したことを実証した。
図５Ｂは、それぞれシナプス前マーカーおよびシナプス後マーカーである、シナプシンおよびシナプス後密度タンパク質９５（ＰＳＤ９５）の免疫染色の結果を示す。図５Ｂによって示されるように、シナプスタンパク質を表すシグナルが離散点として分布し、これがニューロンの成熟を示唆している。図５Ｃによって示されるように、インビトロ分化の１週間（６日目）以内に電気生理学的活性を検出することができた。また、培養時間の延長後（１３日目）に、スパイク発火が徐々に強まり、より規則的な自発発火、シングルバースト、およびネットワークバーストが発生した。
実施例１に記載されるような方法によって得られたｈＮＰＣのインビトロ分化の３ヵ月後に、免疫蛍光染色アッセイを実施して、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）およびオリゴデンドロサイト転写因子２（ＯＬＩＧ２）の発現を検出した。図５Ｄによって示されるように、ＧＦＡＰおよびＯＬＩＧ２の陽性シグナルは、星状膠細胞およびオリゴデンドロサイト前駆細胞が、本出願の方法によって得られたｈＮＰＣからさらに分化されたことを示唆していた。
まとめると、上述の免疫染色アッセイの結果は、実施例１に記載されるような方法によってＥＳＣから作製されたｈＮＰＣが、望ましい生理学的機能を有するヒト大脳皮質の６層全ての神経細胞にさらに分化することができることを実証した。
増殖曲線
図６は、本発明の実施例１で得られたｈＮＰＣ（Ｐ５）の増殖曲線である。ｈＮＰＣの倍加時間を、倍加時間の式 ＰＤＴ＝ｌｇ２×（Ｔ－Ｔ0）／（ｌｇＮT－ｌｇＮ0）（式中、ＰＤＴは倍加時間であり、Ｔは細胞数を計数した時点であり、Ｔ0は細胞を播種した時点であり、ＮTは時点Ｔでの細胞計数であり、そしてＮ0は播種した細胞数である。）にしたがって計算した。ｈＮＰＣの倍加時間は７３時間と計算された。
また、ｈＮＰＣ細胞が２４時間で増殖し始めたことが図６からわかる。細胞計数は、７２時間で播種した細胞数の約２倍になり、９６時間でプラトーに達した。その後、細胞数は増加することなく比較的高いレベルにとどまり、増殖の喪失を示唆していた。この段階の細胞は、インビトロ分化の可能性を依然として有していた。したがって、４日後に細胞を継代することによって、本出願のＮＰＣの最大の収量をもたらすことができた。
実施例４．分化によるｉＰＳＣからのｈＮＰＣの作製
ｈＥＳＣ株Ｈ１の代わりにカタログ番号ＳＣＳＰ－１３０１でステムセルバンク、チャイニーズアカデミーオブサイエンス（Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences）から購入したヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から開始したことを除いて、実施例１に記載したプロセスと同じプロセスを実施した。
実施例５．分化によってｉＰＳＣから作製されたｈＮＰＣの特徴づけ
実施例４の分化プロセスによるｉＰＳＣからのｈＮＰＣの作製の成功を確認するために、得られた細胞を、形態の観察および細胞特異的バイオマーカーの検出に基づく検証に付した。
細胞形態
図７は、本発明の実施例４の方法によるｉＰＳＣの指向性分化によって作製されたｈＮＰＣの明視野画像である。ｈＮＰＣが、付着して増殖し、相対的に均一な柱状形態であり、細胞のロゼット様放射配列を特徴とする、典型的なｈＮＰＣ形態を有することが、図７からわかる。
免疫蛍光染色アッセイ
本発明の実施例４に記載された方法によって得られたｈＮＰＣに対して、免疫蛍光染色アッセイも実施した。図８によって示されるように、細胞のほとんどは、前脳領域のｈＮＰＣに特異的な２つの分子マーカーであるＦＯＸＧ１とネスチンの両方の発現を示し、これは、分化による高純度の大量のｈＮＰＣの作製に成功したことを示唆していた。具体的には、作製した細胞の集団の中で、９５．７０％もの高いＦＯＸＧ１+細胞の割合および９６．８４％もの高いネスチン+細胞の割合を達成した（図８）。
フローサイトメトリー
実施例４で作製した細胞を、ＦＯＸＧ１、ＰＡＸ６およびネスチンの発現に基づいてｈＮＰＣを同定するフローサイトメトリーアッセイにかけた。上記の免疫蛍光染色アッセイと同様の結果が得られた。フローサイトメトリーの結果によれば、９３．５５％もの高いＦＯＸＧ１+細胞の割合、７０．６６％もの高いＰＡＸ６+細胞の割合、および９５．１６％もの高いネスチン+細胞の割合を達成した（図９）。
実施例６．ｉＰＳＣから作製されたｈＮＰＣの分化
所望の細胞型、例えばニューロンにさらに分化する実施例４の分化によって作製されたｈＮＰＣの能力を試験するために、複数の実験を行った。
ニューロンへのｈＮＰＣの分化
ｈＮＰＣの分化を、実施例３に記載した方法と同じ方法で行った。
免疫蛍光染色アッセイ
本発明の実施例４における拡大培養から得られたｈＮＰＣのインビトロ分化を示すために、免疫蛍光染色アッセイを実施した。
図１０Ａは、ヒト大脳皮質の６層に特異的なマーカーの発現を検出した、ｈＮＰＣのインビトロ分化の２ヵ月後に実施した免疫蛍光染色の結果を示す。図１０Ａによって示されるように、蛍光シグナルはマーカーの発現を表し、これらは、層II～IVについてはＢＲＮ２およびＳＡＴＢ２、層ＶおよびVIについてはＣＴＩＰ２、層Ｉ、ＶおよびVIについてはＴＢＲ１、そしてニューロンについてはＭａｐ２であった。免疫染色の結果は、実施例４の方法によって得られたｈＮＰＣが、ヒト大脳皮質の６層全ての神経細胞に分化することに成功したことを実証した。
図１０Ｂは、シナプシンおよびＰＳＤ９５に対する免疫蛍光染色の結果を示し、それぞれシナプス前マーカーおよびシナプス後マーカーであるこれら２つのマーカーの発現を示唆している。図１０Ｂによって示されるように、シナプスタンパク質の発現を表すシグナルを離散点として分布し、これが分化後のニューロンの成熟を示唆していた。図１０Ｃによって示されるように、インビトロ分化の６日目に電気生理学的活性を検出することができた。また、培養時間が延長されるにつれて、スパイク発火が徐々に強まり、より規則的な自発発火およびネットワークバーストが観察された。
実施例４に記載されるような方法によって得られたｈＮＰＣのインビトロ分化の３ヵ月後に、免疫蛍光染色アッセイを実施して、ＧＦＡＰおよびＯＬＩＧ２の発現を検出した。図１０Ｄによって示されるように、ＧＦＡＰおよびＯＬＩＧ２の陽性シグナルは、星状膠細胞およびオリゴデンドロサイト前駆細胞が、この時点で本出願の方法によって得られたｈＮＰＣからさらに分化したことを示唆していた。
まとめると、上述の免疫染色アッセイは、実施例４に記載されるような方法によってｉＰＳＣから作製されたｈＮＰＣが、望ましい生理学的機能を有するヒト大脳皮質の６層全ての細胞に分化することができることを実証した。
実施例７．様々な培養培地による指向性分化
本発明者らは、実施例１に記載されるような方法で、臨床等級の一連の様々な培養培地を試験した。具体的には、基本培地の組成ならびにＥＢ培地およびＮＩＭのサプリメントを、あらゆる試験で変更したが、残りの条件は同じままとした。結果を以下の表２および表３に要約する。
表２および表３の培地の組み合わせ１～４は、表１に挙げたものと同一であるが、組み合わせ５～１０は、追加で試験した培地組成である。組み合わせ６～１０のＥＢ培地およびＮＩＭは、基本培地の組成およびサプリメントが異なる。「ＮＥＡＡ」は、ＧＭＰ等級のＭＥＭ非必須アミノ酸溶液を指し、「ＣＴＳ－ＫＯＳＲ」は、ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）ＳＲ ＸｅｎｏＦｒｅｅ ＣＴＳ（商標）を指す。「ＢＩ－ＥＢ」は、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）ｈＰＳＣ ＸＦ培地（増殖因子不含）を指す。
Figure 2023551851000003
Figure 2023551851000004
本出願の培地組成を表す試験の組み合わせ１～４が、優れたまたはかなり良好な結果をもたらしたことが、上記の表および図１１Ａ～１１Ｅからわかる。
実施例８．幹細胞コロニーから開始した指向性分化
本出願の好ましい実施形態、例えば実施例１または実施例４に記載されるような方法では、幹細胞を消化し、細胞を培養プレートに特定の密度で播種することによって、ＥＢを形成した。本実施例では、本発明者らは、所定数の単一幹細胞の代わりに幹細胞コロニーから開始する方法を試験した。本実施例は、非特許文献２に先に公開された手順を反映しているが、培地およびサプリメントを、それらの臨床等級の対応物に置き換えた。
ＥＳＣまたはｉＰＳＣを、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）ｈＰＳＣ ＸＦ培地中でＣＴＳ（商標）ビトロネクチンでコーティングされたプレートにおいて維持した。ＥＳＣまたはｉＰＳＣコロニーを、約２０分間コラゲナーゼＮＢ ６ ＧＭＰ等級（０．１５ＰＺ Ｕ／ｍＬのＨＢＳＳ、カルシウム、マグネシウム、フェノールレッドなし）で処理した。細胞数を計数することなく、分離したコロニーをＣＴＳ－ＥＢＭに直接移し、その中で１日増殖させた。２０％のＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）ＳＲ ＸｅｎｏＦｒｅｅ ＣＴＳ（商標）（ギブコ）、１ｖｏｌ％のＧＭＰ等級のＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（ギブコ）、０．５ｖｏｌ％のＣＴＳ（商標）ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）－Ｉサプリメント（ギブコ）を、ＣＴＳ（商標）ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）ＤＭＥＭ／Ｆ－１２に加えることによって、ＣＴＳ－ＥＢＭを調製した。
残りの手順は、実施例１および実施例４の工程と同じである。２日目から６日目まで、細胞の培養に使用したＥＢ培地は、ＣＴＳ－ＥＢＭ＋ＮＤＳであった。ＣＴＳ－ＥＢＭ＋ＮＤＳは、５０ｎｇ／ｍＬのＮｏｇｇｉｎ ＧＭＰ、１μＭのドルソモルフィン、１０μＭのＳＢ４３１５４２、２０％のＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）ＳＲ ＸｅｎｏＦｒｅｅ ＣＴＳ（商標）（ギブコ）、１ｖｏｌ％のＧＭＰ等級のＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（ギブコ）、０．５ｖｏｌ％のＣＴＳ（商標）ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）－Ｉサプリメント（ギブコ）およびＣＴＳ（商標）ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）ＤＭＥＭ／Ｆ－１２を含有している。
６日目に形成されたＥＢは、球状の形状を示さず（図１２）、ＮＰＣへの分化に失敗した。結果は、実験室で成功することが証明されたプロトコルを臨床へと変換する際の不確実性を示した。基本培地およびサプリメントを臨床等級の対応物に単に置き換えるだけでは、臨床等級のＮＰＣの作製の成功を保証することができない。
実施例９．２つのＮＩＭの組み合わせを使用することによる指向性分化
２つのＮＩＭを連続して使用して神経分化を誘導したことを除いて、実施例１または実施例４に記載されたプロセスと同じプロセスを実施した。初期分化後の７日目に、ＥＢを、臨床等級のラミニン－５２１（バイオラミナ、ＭＸ５２１／ＣＴ５２１）でコーティングされた６ウェルプレートに移して、ＥＢの完全な付着を可能にし、神経幹細胞およびＮＰＣの拡大を促進する２つの異なるタイプの臨床等級の無血清神経誘導培地（ＮＩＭ）で培養した。ＲＯＮＡの分化中の１日目から７日目まで、臨床等級の無血清Ｎ２Ｍを使用して、これを、ＣＴＳ（商標）ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地（ギブコ）とＣＴＳ（商標）Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地（ギブコ）を１：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の比率で混合して、基本培地を得、その基本培地に１ｖｏｌ％のＣＴＳ（商標）Ｎ－２サプリメント（１００×）（ギブコ）、０．５ｖｏｌ％のＣＴＳ（商標）ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）－Ｉサプリメント（２００×）（ギブコ）を加えることによって調製した。ＲＯＮＡの分化中の８日目から１４日目まで、臨床等級の無血清ＮＤＭを使用して、これを、ＣＴＳ（商標）ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地（ギブコ）とＣＴＳ（商標）Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地（ギブコ）を１：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の比率で混合して、基本培地を得、その基本培地に０．５ｖｏｌ％のＣＴＳ（商標）Ｎ－２サプリメント（２００×）（ギブコ）、１ｖｏｌ％のＣＴＳ（商標）等級のＢ－２７（商標）サプリメント、ＸｅｎｏＦｒｅｅ、マイナスビタミンＡ（１００×）（ギブコ）および０．５ｖｏｌ％のＣＴＳ（商標）ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）－Ｉサプリメント（２００×）（ギブコ）を加えることによって調製した。
本実施例に記載された方法によって得られたｈＮＰＣに対して、免疫蛍光染色アッセイを実施した。図１３によって示されるように、細胞のほとんどは、ＦＯＸＧ１とネスチンの両方の発現を示し、これが分化による高純度の大量のｈＮＰＣの作製に成功したことを示唆していた。具体的には、作製した細胞の集団の中で、９８．０３％もの高いＦＯＸＧ１+細胞の割合および９９．３０％もの高いネスチン+細胞の割合を達成した（図１３）。
本発明の実施例９における拡大培養から得られたｈＮＰＣのインビトロ分化を示すために、免疫蛍光染色アッセイを実施した。
図１４Ａは、ヒト大脳皮質の６層に特異的なマーカーの発現を検出した、ｈＮＰＣのインビトロ分化の２ヶ月後に実施した免疫蛍光染色の結果を示す。図１４Ａによって示されるように、蛍光シグナルは、マーカーの発現を表し、これらが、層II～IVについてはＢＲＮ２およびＳＡＴＢ２、層ＶおよびVIについてはＣＴＩＰ２、層Ｉ、ＶおよびVIについてはＴＢＲ１であった。免疫蛍光染色の結果は、実施例９の方法によって得られたｈＮＰＣが、ヒト大脳皮質の６層全ての神経細胞に分化することに成功したことを実証した。
図１４Ｂは、シナプシンおよびＰＳＤ９５に対する免疫蛍光染色の結果を示し、それぞれシナプス前マーカーおよびシナプス後マーカーであるこれら２つのマーカーの発現を示唆している。図１４Ｂによって示されるように、シナプスタンパク質の発現を表すシグナルを離散点として分布し、これが分化後のニューロンの成熟を示唆していた。図１４Ｃによって示されるように、インビトロでの分化の７日目に電気生理学的活性を検出することができた。また、培養時間が延長されるにつれて、スパイク発火が徐々に強まり、より規則的な自発発火およびネットワークバーストが観察された。
実施例９に記載されるような方法によって得られたｈＮＰＣのインビトロ分化の３ヵ月後に、免疫蛍光染色アッセイを実施して、Ｍａｐ２、ＧＦＡＰおよびＯＬＩＧ２の発現を検出した。図１４Ｄによって示されるように、Ｍａｐ２、ＧＦＡＰおよびＯＬＩＧ２の陽性シグナルは、ニューロン、星状膠細胞およびオリゴデンドロサイト前駆細胞が、この時点で本出願の方法によって得られたｈＮＰＣからさらに分化したことを示唆していた。
まとめると、上述の免疫染色アッセイは、実施例９に記載されるような方法によってｉＰＳＣから作製されたｈＮＰＣが、望ましい生理学的機能を有するヒト大脳皮質の６層全ての細胞に分化することができることを実証した。

Claims (20)

  1. 胚性幹細胞（ＥＳＣ）または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から神経前駆細胞（ＮＰＣ）を作製する方法であって、
    （１）ヒト多能性幹細胞培地（ｈＰＳＣ培地）においてＥＳＣまたはｉＰＳＣを培養して胚様体（ＥＢ）を形成させる工程；
    （２）工程（１）により形成されたＥＢを、基本培地およびサプリメントを含むＥＢ培地において培養する工程；
    （３）工程（２）の後、神経誘導培地（ＮＩＭ）を用いる細胞外マトリックス（ＥＣＭ）コート培養表面上でＥＢを培養し、ロゼット神経凝集体（ＲＯＮＡ）を形成する工程であって、ここで、ＮＩＭが基本培地およびサプリメントを含む、工程；
    （４）工程（３）により形成されたＲＯＮＡを培養し、神経スフェアを形成する工程；ならびに
    （５）神経スフェアを単細胞に切り離し、そしてＮＰＣ培地を用いるＥＣＭコート培養表面上で培養し、単層ＮＰＣを形成する工程であって、ここでＮＰＣ培地が基本培地およびサプリメントを含む、工程
    を含み；
    ここで、ｈＰＳＣ培地、ならびにＥＢ培地、ＮＩＭ、およびＮＰＣ培地に含まれる基本培地およびサプリメントは臨床等級である、方法。
  2. ＥＢ培地、ＮＩＭおよびＮＰＣ培地に含まれる基本培地およびサプリメントの、１つまたはそれより多く、好ましくは全てが、ＧＭＰ等級、ｃＧＭＰ等級またはＣＴＳ（商標）等級である請求項１記載の方法。
  3. ｈＰＳＣ培地、ＥＢ培地、ＮＩＭおよびＮＰＣ培地の、１つまたはそれより多く、好ましくは全てが、ＧＭＰ等級、ｃＧＭＰ等級またはＣＴＳ（商標）等級である請求項１記載の方法。
  4. ｈＰＳＣ培地が、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）ｈＰＳＣ ＸＦ培地、ＣＴＳ（登録商標）Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）Ｂａｓｉｃ０３、ＳｔｅｍＭＡＣＳ（商標）ｉＰｓ－Ｂｒｅｗ、Ｓｔｅｍ－Ｐａｒｔｎｅｒ（登録商標）ＡＣＦ、ＴｅＳＲ（商標）－ＡＯＦおよびＴｅＳＲ２である請求項１記載の方法。
  5. ｈＰＳＣ培地は、ＲＯＣＫ阻害剤が補充されている請求項１記載の方法。
  6. ＥＢ培地が、
    （ｉ）ａ）～ｃ）からなる群より選択される基本培地
    ａ）ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地単独、
    ｂ）Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地と組み合わせたＤＭＥＭ／Ｆ１２、
    ｃ）Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地と組み合わせたＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地；および
    （ii）ｄ）～ｅ）を含むまたはからなるサプリメント
    ｄ）Ｎ－２サプリメントおよびＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）－Ｉサプリメント；
    ｅ）Ｎ－２サプリメント、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）－ＩサプリメントおよびＢ－２７（商標）サプリメント、マイナスビタミンＡ
    を含む請求項１記載の方法。
  7. ＥＢ培地が阻害剤をさらに含み、阻害剤が、ＢＭＰ阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤およびＡＬＫ阻害剤を含むまたはからなり、好ましくはＮｏｇｇｉｎ、ＳＢ４３１５４２、ＬＤＮ－１９３１８９、ＤＭＨ－１およびドルソモルフィン、好ましくは、Ｎｏｇｇｉｎ、ＬＤＮ－１９３１８９、ＤＭＨ－１およびドルソモルフィンの任意の１つまたはそれより多く、例えば１つまたは２つ、と組み合わせたＳＢ４３１５４２、例えばＮｏｇｇｉｎ、ＬＤＮ－１９３１８９、ＤＭＨ－１およびドルソモルフィンの１つまたは２つと組み合わせたＳＢ４３１５４２を含むまたはからなる、請求項６記載の方法。
  8. 阻害剤の１つまたはそれより多くが、臨床等級、好ましくはＧＭＰ等級、ｃＧＭＰ等級またはＣＴＳ（商標）等級である請求項５または７記載の方法。
  9. ＮＩＭが、
    （ｉ）ａ）～ｃ）からなる群より選択される基本培地
    ａ）ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地単独、
    ｂ）Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地と組み合わせたＤＭＥＭ／Ｆ１２、
    ｃ）Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地と組み合わせたＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地；および
    （ii）ｄ）～ｅ）を含むまたはからなるサプリメント
    ｄ）Ｎ－２サプリメントおよびＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）－Ｉサプリメント；
    ｅ）Ｎ－２サプリメント、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）－ＩサプリメントおよびＢ－２７（商標）サプリメント、マイナスビタミンＡ
    を含む請求項１記載の方法。
  10. 工程（４）の培養が、ＮＩＭまたはＮＰＣ培地を用いて行われる請求項１記載の方法。
  11. ＮＰＣ培地の基本培地が、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地、好ましくはＣＴＳ（商標）Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地であり、ＮＰＣ培地のサプリメントが、（ａ）ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）－Ｉサプリメント、好ましくはＣＴＳ（商標）ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）－Ｉサプリメント、および（ｂ）Ｂ－２７（商標）サプリメント、マイナスビタミンＡ、好ましくはｃＧＭＰ等級またはＣＴＳ（商標）等級のＢ－２７（商標）サプリメント、ＸｅｎｏＦｒｅｅ、マイナスビタミンＡである請求項１記載の方法。
  12. ＮＰＣ培地が、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、および／またはグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、および／またはＬ－アスコルビン酸、および／またはＮ6、Ｏ2’－ジブチリルアデノシン３’，５’環状一リン酸ナトリウム塩（ＤＢ－ｃＡＭＰ）をさらに含む請求項１１記載の方法。
  13. ＢＤＮＦが、動物質不含組み換えＢＤＮＦまたはＧＭＰ等級の組み換えＢＤＮＦであり、および／またはＧＤＮＦが、動物質不含組み換えＧＤＮＦまたはＧＭＰ等級の組み換えＧＤＮＦである請求項１２記載の方法。
  14. 工程（１）におけるＥＳＣまたはｉＰＳＣは、ＥＢの形成を誘導するためにｈＰＳＣ培地に播種される前に、例えば、消化酵素によりまたは機械的手段により単一細胞または細胞凝集体中に分散される請求項１記載の方法。
  15. １つより多くのＥＢ培地が工程（２）で使用され、および／または１つより多くのＮＩＭが工程（３）において使用される、請求項１記載の方法。
  16. 請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法により作製されるＮＰＣまたはそれから誘導された細胞。
  17. 前臨床使用および臨床使用に好適である請求項１６記載のＮＰＣまたはそれから誘導された細胞。
  18. 薬開発または臨床適用における請求項１６または１７記載のＮＰＣまたはそれから誘導された細胞の使用。
  19. ニューロン、星状膠細胞前駆細胞、星状膠細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、オリゴデンドロサイト、またはそれらの細胞の１つまたは複数を含む混合細胞集団を、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法により、好ましくは臨床等級の培地、好ましくはＧＭＰ等級、ｃＧＭＰ等級またはＣＴＳ（商標）等級の培地を使用することにより作製されたＮＰＣから作製する方法。
  20. ＥＳＣまたはｉＰＳＣからのＮＰＣ作成におけるＥＢ培地および／またはＮＩＭにおけるＮ－２サプリメントおよびＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）－Ｉサプリメントとの組み合わせでのＤＭＥＭ／Ｆ１２またはＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）ＤＭＥＭ／Ｆ１２の組み合わせの使用であって、ＥＢ培地および／またはＮＩＭが臨床等級である、使用。
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