CN108456659B - 3d大脑类器官的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种3D大脑类器官的制备方法，包括：将RONA法获得的神经球经accutase消化为单细胞，计数后接种于细胞培养板上在培养基A中培养，培养至第7天后在培养基B中继续培养，培养至第25～35天时，Matrigel包裹神经球后继续培养至55～65天，第二次Matrigel包裹神经球后继续培养。本发明还提供了一种用于培养3D大脑类器官的培养基。本发明从RONA方法得到的高度纯化的神经球开始，用较为简单的方法可以控制并培养得到大小及结构均一的真正的3D大脑类器官，其具有大脑的六层皮层结构和抑制性中间神经细胞各亚型，适用于体外疾病研究、药物筛选等，具有重大的产业化的意义。

Description

3D大脑类器官的制备方法
技术领域
本发明属于3D大脑类器官技术领域，尤其涉及一种从人神经球制备3D大脑类器官的方法。
背景技术
人的神经细胞或大脑组织很难获得，在体外几乎无法培养，使得很多神经疾病的研究和药物研发没有很好的人源模型而停滞不前。由胚胎干细胞或诱导多能干细胞诱导分化得到人的神经细胞作为神经疾病模型是这几年国际上的创新技术和热点。同时由于3D培养更能模拟大脑组织环境和细胞交流，对于神经细胞的成熟和功能有着重要的促进作用，并且所得到3D大脑类器官在研究人大脑发育和相关疾病上有不可替代的作用，最近各种人3D器官的体外培养成为新的热点。
传统的人3D大脑类器官的制作方法一般通过从拟胚胎体(Embryonic Body)开始，如2013年及2014年Lancaster等发表在Nature及Nature protocol上的3D大脑类器官的制作方法使得界内在体外使用人多能干细胞(包括胚胎干细胞及诱导多能干细胞)得到3D的模拟人大脑的类器官上前进了一大步。最近Qian等2016年在Cell上发表的也是使用类似的方法从人多能干细胞制作大脑类器官来研究寨卡病毒引发小脑症的机制，并且发明了小的多孔板搅拌装置来降低因子的用量和成本，以及增加均一性。但是，这两种方法所得到的3D大脑类器官由于同时可能含有其他胚层的细胞和结构，难以稳定控制得到产品的可重复性，结构相似性等，在神经系统疾病模型和药物筛选领域的应用受到限制，同时也影响到用其所获得数据的代表性和可靠性。
2017年Lee等在Neuropsychopharmacology上发表的文章中，其手工挑选出大小在50000～200000微米之间的玫瑰花样细胞簇(主要为NPC，神经前体细胞)，对其进行诱导，但是其得到的3D新大脑皮层小体不具有发育出后脑 (NKX2.1染色为阴性)的潜能。而且，Lee等的方法较为复杂，无法做到简易，大批量而且均一。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种3D大脑类器官的制备方法，本发明提供的方法可以得到大小、结构均一的3D大脑类器官，且方法简易，适于产业化。
本发明提供了一种3D大脑类器官的制备方法，包括：
将RONA法获得的神经球经accutase消化为单细胞，计数后接种于细胞培养板上在培养基A中培养，培养至第7天后在培养基B中继续培养，培养至第 25～35天时，包裹神经球后继续培养至55～65天，第二次包裹神经球后继续培养；
所述培养基A包括：维甲酸、BDNF、GDNF、抗坏血酸、cAMP、Neurobasal 培养基和不含维生素A的B27添加剂；
所述培养基B包括：BDNF、GDNF、抗坏血酸、cAMP、Neurobasal培养基和不含维生素A的B27添加剂。
本发明从RONA方法得到的高度纯化的神经球开始，保证了99％以上是神经干细胞，从而解决了其他方法含有非神经命运的干细胞及在后续培养中会出现非大脑组织的问题。本发明将神经球打散成为单细胞后计数并按固定数量接种，可以保证细胞团的大小和组成的均一性，即使培养至90天以后3D类脑器官的大小及结构也不会出现显著差异。同时本发明培养过程中使用的培养基A和培养基B确保所培养的3D大脑类器官能被诱导成为前脑，中脑和后脑三个脑区的组织，以及大脑六层皮层的细胞和结构。
本发明从通过RONA法纯化得到的neurosphere(神经球)出发，该方法获得的人神经前体细胞99％以上是神经干细胞。RONA法纯化得到neurosphere (神经球)的具体过程参见Xu JC和Fan J于2016年4月在Science Translational Medicine上所发表的Culturednetworks of excitatory projection neurons and inhibitory interneurons forstudying human cortical neurotoxicity一文。
本发明首先将通过RONA法纯化得到的neurosphere(神经球)经accutase 消化为单细胞，计数后接种于细胞培养板上。具体而言，本发明计数后种植同等数量的1000～50000个细胞至多孔细胞培养板上，保证细胞团大小的均一。在一个实施例中，接种同等数量的1000～10000个细胞至圆底超低附的96孔细胞培养板的孔内。
接种后在培养基A中进行培养，所述培养基A包括：维甲酸(retinoic acid)、BDNF、GDNF、抗坏血酸(ascorbic acid)、cAMP、Neurobasal培养基和不含维生素A的B27添加剂。在一个实施例中，所述培养基A包括：1～5μM维甲酸； 10～30ng/ml BDNF；10～30ng/mlGDNF；0.1～0.5mM抗坏血酸；5～15μM cAMP； Neurobasal和不含维生素A的B27添加剂。在一个实施例中，所述培养基A包括： 2μM维甲酸；20ng/ml BDNF；20ng/ml GDNF；0.2mM抗坏血酸；10μM cAMP； Neurobasal和不含维生素A的B27添加剂，其中，Neurobasal和不含维生素A的 B27添加剂的用量比为50:1。
接种后在培养基A中置于37℃，5％CO2细胞培养箱中的低速圆周摇床上摇动培养，每3～5天半量换液，第二天即可观察到每个孔内都形成一个大小均一的神经球，培养至第7天更换至培养基B中同等条件继续培养。
在本发明中，所述培养基B包括：BDNF、GDNF、抗坏血酸、cAMP、 Neurobasal培养基和不含维生素A的B27添加剂。在一个实施例中，所述培养基B包括：10～30ng/ml BDNF；10～30ng/ml GDNF；0.1～0.5mM抗坏血酸； 5～15μM cAMP；Neurobasal和不含维生素A的B27添加剂。在一个实施例中，所述培养基B包括：20ng/ml BDNF；20ng/ml GDNF；0.2mM抗坏血酸；10μM cAMP；Neurobasal和不含维生素A的B27添加剂，其中，Neurobasal和不含维生素A的B27添加剂的用量比为50:1。
在培养基B继续培养至第25～35天时，包裹神经球后继续培养至55～65天，第二次包裹神经球后继续培养，培养至85-100天左右，可以得到均一的模拟人大脑组成的3D大脑类器官，并可根据需求继续包裹和培养。
具体而言，本发明在培养至第25～35天时，用Matrigel包裹神经球后继续培养至55～65天，用Matrigel第二次包裹神经球后继续培养。
具体而言，本发明还可以在培养至第85～100天第三次包裹神经球后继续培养，第三次也用Matrigel包裹神经球。
在一个实施例中，本发明培养至第30天时，包裹神经球后继续培养至60 天，第二次包裹神经球后继续培养至90天第三次包裹神经球后继续培养。
实验结果表明，本发明从RONA方法得到的高度纯化的神经球出发，制备的3D类脑小体的大小和形状都相对非常均一，而且在88天时直径可达到4mm 并且仍然能继续生长；且其能够表达Nestin、Tuj1、Foxg1、TBR2、NKX2.1 等标志物，具备发育出前脑、中脑和后脑的能力；其也能够表达BRN2，SATB2， CTIP2，TBR1等标志物，且在分布和比例上与大脑非常相似，具备稳定得到具有大脑皮层结构的能力。
本发明从RONA方法得到的高度纯化的神经球开始，用较为简单的方法可以控制并培养得到大小及结构均一的真正的3D大脑类器官，其具有大脑的六层皮层结构和抑制性中间神经细胞各亚型，适用于体外疾病研究、药物筛选等，具有重大的产业化的意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的3D大脑类器官的制备工艺流程图；
图2是本发明实施例1培养至第17天的3D类脑小体照片；
图3是本发明实施例1培养至第50天的3D类脑小体照片；
图4是本发明实施例1培养至第50天的3D类脑小体照片；
图5是本发明实施例1培养至第88天的3D类脑小体照片；
图6为实施例1培养至第88天的3D类脑小体不同大脑皮层神经细胞的组织切片及染色照片；
图7为实施例1培养至第63天的3D类脑小体神经胶质细胞及神经细胞的组织切片及染色照片；
图8为实施例1培养至第63天的3D类脑小体神经胶质细胞及神经细胞的组织切片及染色照片。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
参见图1，图1为本发明实施例1提供的3D大脑类器官的制备工艺流程图。
步骤一、从RONA法(见Xu JC和Fan J于2016年4月在Science TranslationalMedicine上所发表的Cultured networks of excitatory projection neurons andinhibitory interneurons for studying human cortical neurotoxicity一文)得到neurosphere(神经球)后，第二天经accutase消化为单细胞，计数后分别接种同等数量的5000个细胞至圆底超低附的96孔细胞培养板的孔内，使用培养基A放置在37摄氏度的二氧化碳孵箱的圆周摇床上培养7天，每3～5天半量换液培养；培养基A为含有终浓度2μMretinoic acid，20ng/ml BDNF and GDNF，0.2mM ascorbic acid，10μM cAMP的Neurobasal及B27添加剂(不含 Vitamine A)，其中，Neurobasal和B27添加剂的用量比为50:1；
步骤二、第二天即可观察到每个孔内都形成一个大小均一的神经球，在培养至第7天时，更换培养基，使用培养基B继续培养；培养基B为含有终浓度 20ng/ml BDNF andGDNF，0.2mM ascorbic acid，10μM cAMP的Neurobasal及 B27添加剂(不含Vitamine A)，其中，Neurobasal和B27添加剂的用量比为50:1；
步骤三，培养至第30天时，在非亲水的无菌材料表面用Matrigel包裹神经球，继续在96孔中培养至第60天，继续包裹Matrigel并培养至第90天，可以得到均一的模拟人大脑组成的3D大脑类器官，并可根据需求继续包裹和培养。
参见图2、图3、图4和图5，图2是本发明实施例1培养至第17天的3D类脑小体照片，图3是本发明实施例1培养至第50天的3D类脑小体照片，图4是本发明实施例1培养至第50天的3D类脑小体照片，图5是本发明实施例1培养至第88 天的3D类脑小体照片。由图2～图5可知，3D类脑小体的大小和形状都相对非常均一，而且在88天时直径可达到4mm并且仍然能继续生长，而其他大部分方法得到的3D类脑小体在同样时间很难生长到这样的大小并保持健康。
参见图6，图6为实施例1培养至第88天的3D类脑小体不同大脑皮层神经细胞的组织切片及染色照片，其中，REELIN，BRN2，SATB2，CTIP2，TBR1 依次分别是大脑皮层I/II，III，IV，V，VI各层神经细胞的标志物。由图6 可知，本发明所述的制作方法得到的3D类脑小体表达上述不同皮层的标志物。
参见图7，图7为实施例1培养至第63天的3D类脑小体神经胶质细胞及神经细胞的组织切片及染色照片，其中，nNOS,PV及SST分别是抑制性大脑神经元的标志物，MAP2是相对成熟的神经细胞的标志物，DAPI是DNA染料。由图7 可知，本发明所述的制作方法得到的3D类脑小体至少含有在大脑发育和功能上起着十分重要作用的这三种抑制性大脑神经元，并且相对成熟。
参见图8，图8为实施例1培养至第63天的3D类脑小体神经胶质细胞及神经细胞的组织切片及染色照片，其中，GFAP及MAP2分别是神经胶质细胞和神经细胞的标志物，DAPI是DNA染料。经统计，神经胶质细胞在3D类脑小体所有细胞中的比例大约为50-70％。由图8 可知，本发明所述的制作方法得到的3D 类脑小体含有在大脑发育和功能上起着十分重要作用的神经胶质细胞，并且大致比例和分布非常接近人大脑的组成。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种3D大脑类器官的制备方法，其特征在于，包括：
将RONA法获得的神经球经accutase消化为单细胞，计数后接种于圆底超低附的细胞培养板上在培养基A中在圆周摇床上培养，培养至第7天后在培养基B中继续培养，培养至第25～35天时，用Matrigel包裹神经球后继续培养至55～65天，用Matrigel第二次包裹神经球后继续培养；
所述培养基A包括：维甲酸、BDNF、GDNF、抗坏血酸、cAMP、Neurobasal培养基和不含维生素A的B27添加剂；
所述培养基B包括：BDNF、GDNF、抗坏血酸、cAMP、Neurobasal培养基和不含维生素A的B27添加剂。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将RONA法获得的神经球经accutase消化为单细胞，计数后接种同等数量的1000～50000个细胞至圆底超低附的多孔细胞培养板上在培养基A中在圆周摇床上培养。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在培养基A中培养的条件为：在37℃，5％CO2细胞培养箱中的低速圆周摇床上摇动培养。
4.根据权利要求1～3任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述培养基A包括：1～5μM维甲酸；10～30ng/ml BDNF；10～30ng/ml GDNF；0.1～0.5mM抗坏血酸；5～15μM cAMP；Neurobasal和不含维生素A的B27添加剂；
所述培养基B包括：10～30ng/ml BDNF；10～30ng/ml GDNF；0.1～0.5mM抗坏血酸；5～15μM cAMP；Neurobasal和不含维生素A的B27添加剂。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述培养基A包括：2μM维甲酸；20ng/ml BDNF；20ng/ml GDNF；0.2mM抗坏血酸；10μM cAMP；Neurobasal和不含维生素A的B27添加剂；
所述培养基B包括：20ng/ml BDNF；20ng/ml GDNF；0.2mM抗坏血酸；10μM cAMP；Neurobasal和不含维生素A的B27添加剂。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，还包括：培养至第85～100天第三次包裹神经球后继续培养。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，培养至第85～100天用Matrigel第三次包裹神经球后继续培养。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，培养至第30天时，包裹神经球后继续培养至60天，第二次包裹神经球后继续培养至90天第三次包裹神经球后继续培养。
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