JP6981403B2 - 神経分化能を亢進させる神経幹細胞用培地 - Google Patents

Description

本発明は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の培養培地、及び培養方法に関する。より詳細には、本発明は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の神経分化能を亢進させる培地、及び当該培地を用いて神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の神経分化能を亢進させる方法等に関する。

筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病などの難治性神経疾患や神経損傷を治療する方法の１つとして、近年、神経細胞や神経幹細胞を生体へ移植する方法の開発に期待が寄せられている。神経幹細胞とは、自己複製能を有し、複分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）を有する未分化な細胞であり、神経系の多様な細胞（神経細胞及び神経前駆細胞（ｎｅｕｒａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）、並びにグリア細胞（アストロサイト、オリゴデンドロサイト等）及びグリア前駆細胞等）を生み出す能力を有する細胞である。神経幹細胞及び神経前駆細胞は、それ自体を移植するほか、神経細胞等の通常成体で増殖し難い細胞を供給することができるため、再生医療における生体材料の提供源として注目を集めている。

神経幹細胞は増殖能と複分化能を有するため、生体に移植すると生体内で機能的な神経系細胞を産生できると考えられているが、一方で増殖能のある神経幹細胞を移植することで腫瘍化することが懸念される。このため、あらかじめインビトロで神経幹細胞から分化させた神経前駆細胞を再生医療に用いることが検討されているが、この場合も作製した神経前駆細胞に増殖能のある細胞が混入し残存するリスクがある。移植後の神経系細胞中に増殖性の細胞が混入し腫瘍を形成するのを避けるためには、増殖性の細胞を極力含まないようにすることが重要となる。非増殖性の神経細胞による治療を行う場合には、神経幹細胞から神経細胞に高効率に分化可能であることが重要となる。従って、神経幹細胞から神経系細胞を高効率に産生させる方法の開発や、得られた分化後の神経系細胞中に含まれる増殖性の細胞を低減させるような神経系細胞の調製方法の開発が重要な課題となる。

ところで、グルタミンを含まない培地について、これまでにいくつかの報告がなされている。
非特許文献１には、血球系の細胞であるヒト赤白血病細胞株Ｋ５６２細胞をグルタミン不含培地で培養した際に、赤血球への分化が促進されることが記載されている。
また非特許文献２には、ラットのグリオーマ細胞であるＣ６グリオーマ細胞をグルタミン不含培地で培養すると、オリゴデンドロサイト様の細胞への分化が促進されることが記載されている。

しかしながら、グルタミン、アスパラギン及びアスパラギン酸からなる１以上のアミノ酸を含まない培地が神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の分化能や神経細胞産生能にどのような影響を与えるのかについては全く明らかになっていない。

Ｃａｎｈ Ｈｉｅｐ Ｎら、「Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｓｏｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒａｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｋ５６２ ｃｅｌｌｓ．」Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０１２ Ｄｅｃ；１５２（６）：５０９−５１９． Ｍａｒｔｉｎ Ｍら、「Ｅｎｅｒｇｅｔｉｃ ａｎｄ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｃ６ ｇｌｉｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｇｒｏｗｎ ｏｎ ３−Ｄ ｓｕｐｐｏｒｔ； ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ．」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ．１９９８ Ｄｅｃ；３０（６）：５６５−７８．

本発明の目的は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の、神経分化能を亢進させることが可能な培地、及び当該培地を用いて神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の、神経分化能を亢進させる方法を提供することである。

本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン及びＬ−アスパラギン酸からなる群より選択される１以上のアミノ酸を除去した培地中で、神経幹細胞を培養すると、該細胞の増殖能が抑制され、かつ該細胞の神経分化能が亢進することを見出した。Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン及びＬ−アスパラギン酸からなる群より選択される１以上のアミノ酸を除去した培地を用いると、亢進した神経分化能を維持したまま、神経幹細胞を継代することができた。神経分化能が亢進した神経幹細胞から神経細胞へ分化させると、増殖性が低く分化した細胞の割合の多い神経細胞集団を得られた。これらの知見に基づき、更に検討を重ね、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）Ｌ−グルタミンを実質的に含まない、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞培養用培地。
（２）Ｌ−グルタミン濃度が１００μＭ以下である、（１）に記載の培地。
（３）Ｌ−グルタミンを含まない、（１）又は（２）に記載の培地。
（４）ホロトランスフェリンを含む、（１）〜（３）のいずれかに記載の培地。
（５）Ｌ−トリプトファン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン及びＬ−ヒスチジンを含む、（１）〜（４）のいずれかに記載の培地。
（６）神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の神経分化能を亢進するための培地である、（１）〜（５）のいずれかに記載の培地。
（７）無血清培地である、（１）〜（６）のいずれかに記載の培地。
（８）（１）〜（７）のいずれかに記載の培地中で、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を培養することを含む、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の培養方法。
（９）神経分化能が亢進した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を製造するための方法である、（８）記載の方法。
（１０）培養期間が４日以上である、（８）又は（９）記載の方法。
（１１）以下の工程を含む神経細胞の作製方法：
（Ｉ）（１）〜（７）のいずれかに記載の培地中で神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を培養し、神経分化能が亢進した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を得ること；
（ＩＩ）工程（Ｉ）で得た神経分化能が亢進した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を、神経細胞分化誘導条件下で培養し、神経細胞集団を得ること。
（１２）（９）の方法により得られる、神経分化能が亢進した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞。
（１３）神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞、及び（１）〜（７）のいずれかに記載の培地を含んでなる、培養調製物。

本発明の培地は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の神経分化能を亢進させる効果を有する。本発明の培養方法により、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を培養すると、増殖能が抑制されているが神経分化能が亢進した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を得ることができる。神経分化能が亢進した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞は、分化誘導培養により、多くの神経細胞を産生するため、効率的に神経細胞を作製することが可能となる。またこのように作製された神経細胞集団は増殖性の細胞が少ないため、神経細胞を生体に移植した際の腫瘍化のリスクが軽減され、より安全な治療方法の開発に貢献することができる。

図１は、Ｌ−グルタミン除去培地による神経分化の促進効果を示す図である。Ｌ−グルタミンを含む培地（Ｆｕｌｌ）、又はＬ−グルタミンを含まない培地(ΔＧｌｎ）で神経幹細胞を４日間培養した（Ｄａｙ４）（図１Ａ及びＢ）。Ｌ−グルタミンを含まない培地で培養した神経幹細胞においては、神経幹細胞の増殖性が低下していた（図１Ｂ）。上記培地で４日間培養後、神経分化誘導培地に置き換え、２１日間培養し（Ｄａｙ２５）、神経細胞を免疫染色した。Ｌ−グルタミンを含む培地（Ｆｕｌｌ）と比較して、Ｌ−グルタミンを含まない培地（ΔＧｌｎ）で培養した神経幹細胞は、多くの神経細胞を産生した（図１Ｃ）。図１Ｄに、ＮｅｕｒｏＤ１、Ｓｙｎａｐｓｉｎ１の発現強度を示す。図１Ｄ中、各項目の左のバーがＦｕｌｌ、右のバーがΔＧｌｎを示す。Ｌ−グルタミンを含まない培地で２０日間培養した神経幹細胞の増殖曲線は直線性を示した（図１Ｅ）。 図２は、細胞内アミノ酸含有量の分析結果を示す図である。横軸：定量したアミノ酸、縦軸：細胞数あたりのアミノ酸含有量（ｎｍｏｌ／１ｘ１０^６細胞）。各項目の左のバーがＦｕｌｌ、右のバーがΔＧｌｎを示す。 図３は、細胞数あたりのＴＣＡサイクル中の有機酸含有量を示す図である。各項目の左のバーがＦｕｌｌ、右のバーがΔＧｌｎを示す。 図４は、神経幹細胞におけるアポトーシスを示す図である。

本発明は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞培養用培地（以下、これらを総称して本発明の培地ともいう）、当該培地を用いた神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の培養方法（以下、これらを総称して本発明の培養方法ともいう）、並びに該方法により得られる、神経分化能が亢進した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞等を提供する。

（１）神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞
本明細書中、神経幹細胞とは、神経系細胞（神経細胞及びグリア細胞（アストロサイト、オリゴデンドロサイトなど）、並びにそれらの前駆細胞）への複分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）を維持し、自己複製能を有する未分化な細胞を意味する。具体的には、神経幹細胞とは、神経細胞及びグリア細胞（アストロサイト、オリゴデンドロサイトなど）を最終的に生み出す能力を有し、かつ、初期化などの特別な操作を加えない限りにおいて、表皮系細胞、血球系細胞、筋肉細胞等の神経系以外の細胞を実質的に生み出さない細胞である。実質的に生み出さないとは、神経幹細胞の生み出す細胞のうち、９０％以上が、神経細胞及びグリア細胞（アストロサイト、オリゴデンドロサイトなど）、並びにそれらの前駆細胞のいずれかである状態を指す。

本明細書中、神経前駆細胞（ｎｅｕｒａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）とは、分裂能を有する未分化な細胞であって、１種以上の神経細胞に最終的に分化する能力を有する細胞を指す。神経前駆細胞は、神経細胞を最終的に生み出すよう運命決定され、かつ神経細胞及びその前駆細胞以外を実質的に生み出さない細胞を指す。グリア前駆細胞（ｇｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）とは、神経幹細胞に由来し、分裂能を有する未分化な細胞であって、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリア、上衣細胞、シュワン細胞のいずれか又はそれらの前駆細胞に分化する能力を有し、かつ神経細胞に実質的に分化しない細胞を指す。

神経幹細胞及び神経前駆細胞は、厳密に区別することが困難なため、本明細書中「神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞」として区別なく使用される場合がある。

本発明においては、通常、哺乳動物由来の神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞が用いられる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明において用いられる神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞は、好ましくはマウス等のげっ歯類又はヒト等の霊長類の神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞であり、より好ましくは、ヒト神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞である。

本発明に用いられる神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞は、多能性幹細胞由来のもの、生体組織から分離したもの、線維芽細胞などから多能性幹細胞を経由せずに直接分化誘導したもの（Ｍａｔｓｕｉ Ｔら，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２０１２ Ｊｕｎ；３０（６）：１１０９−１９）などが挙げられ、上記に記載の未分化性を維持し複分化能を維持する細胞であって神経細胞を生み出す能力を維持する限り、特に制限されない。本発明に用いられる神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞は、好ましくは多能性幹細胞由来のものであり、より好ましくは誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）由来のものである。

多能性幹細胞から神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を作製する方法としては、自体公知の方法を用いることができる。多能性幹細胞由来の神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の作製方法の例としては、多能性幹細胞の浮遊培養を行い胚葉体形成を経由して神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を形成させる方法（Ｂａｉｎ Ｇら，Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．１９９５ Ａｐｒ；１６８（２）：３４２−５７など）、ストローマ細胞等をフィーダー細胞として使う方法、ｂＦＧＦを含む無血清培地中で多能性幹細胞の浮遊培養を行う方法（Ｗａｔａｎａｂｅ Ｋら，Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００５ Ｍａｒ；８（３）：２８８−９６など）、ＳＭＡＤシグナル阻害剤Ｎｏｇｇｉｎ及びＳＢ４３１５４２の存在下で多能性幹細胞（ＥＳ細胞等）を接着培養する方法（Ｃｈａｍｂｅｒｓ ＳＭら，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９ Ｍａｒ；２７（３）：２７５−８０）、単層培養した多能性幹細胞（ＥＳ細胞等）を、ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ３（ＧＳＫ３）阻害剤、ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ β（ＴＧＦ−β）阻害剤、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤存在下で培養する方法（Ｌｉ Ｗら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１１ Ｍａｙ １７；１０８（２０）：８２９９−３０４）などが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書中、多能性幹細胞とは、自己複製能及び分化／増殖能を有する未熟な細胞であって、胎盤を除く生体を構成する全ての組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。多能性幹細胞の例としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）（Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋら，Ｃｅｌｌ．２００７ Ｎｏｖ ３０；１３１（５）：８６１−７２）、精子幹細胞（ｍＧＳ細胞）（Ｋａｎａｔｓｕ−Ｓｈｉｎｏｈａｒａ Ｍら，Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ．２００７ Ｊａｎ；７６（１）：５５−６２）、胚性生殖細胞（Ｍａｔｓｕｉ Ｙら，Ｃｅｌｌ．１９９２ Ｓｅｐ ４；７０（５）：８４１−７）などが挙げられる。

細胞が神経幹細胞であることは、例えば、細胞をＥＧＦ及びｂＦＧＦを含む無血清培地中で浮遊培養し、培養した細胞塊を分散処理後に、後述の実施例に記載の分化誘導培地中で接着培養を行い、神経細胞及びグリア細胞のいずれをも産生することを指標として確認することができる。
また、神経幹細胞は、神経幹細胞で発現することが知られている遺伝子、その転写産物、タンパク質など（神経幹細胞マーカー）により確認することもできる。
神経幹細胞マーカーの例としては、細胞骨格タンパク質であるネスチン（Ｎｅｓｔｉｎ；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６，６６（１９９７））、ＳＯＸ１（ＳＲＹ（ｓｅｘ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ Ｙ）−ｂｏｘ１）、ＳＯＸ２（ＳＲＹ（ｓｅｘ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ Ｙ）−ｂｏｘ２）、Ｐａｘ６（ｐａｉｒｅｄ ｂｏｘ ６）、Ｋｉ６７、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、脂肪酸結合タンパク質７（Ｆａｂｐ７、ＢＬＢＰともいう）などが知られており、当業者は、これらのマーカーを適宜組み合わせて所望の神経幹細胞であることを確認することができる。

細胞が神経前駆細胞であることは、例えば、細胞をＥＧＦ及びｂＦＧＦを含む無血清培地中で浮遊培養し、培養した細胞塊を分散処理後に、後述の実施例に記載の分化誘導培地中で接着培養を行ったときに、神経細胞を産生しグリア細胞を産生しないことを指標として確認することができる。
また、神経前駆細胞は、神経前駆細胞で発現することが知られている遺伝子、その転写産物、タンパク質など（神経前駆細胞マーカー）により確認することもできる。神経前駆細胞で発現する遺伝子としては、Ｔｂｒ２、ＭＡＳＨ１、ネスチン、ＮｅｕｒｏＤ１等が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、これらのマーカーを適宜組み合わせて細胞が神経前駆細胞であることを確認することができる。
神経前駆細胞の例としては、ＳＯＸ２陰性かつネスチン陽性である細胞が挙げられるが、これに限定されない。

本明細書中、神経細胞（ｎｅｕｒｏｎ）は、神経系の機能的単位となる細胞を意味する。通常、神経細胞は、細胞体と神経突起（例、軸索、樹状突起）から構成されるが、発生期の幼若ニューロン、網膜のアマクリン細胞、嗅球の顆粒細胞などの神経突起をもたない神経細胞（無極性神経細胞）も存在する。神経細胞は形態別に分類した場合、無極性神経細胞、単極性神経細胞、偽単極性神経細胞、双極性神経細胞、多極性神経細胞に分類され、本明細書中、神経細胞はこれらの全てを包含する。
神経細胞は、中枢神経系神経細胞及び末梢神経系神経細胞を包含する。神経細胞は、運動神経細胞であってもよく、感覚神経細胞であってもよく、介在神経細胞であってもよい。神経細胞の例としては、ドーパミン作動性神経細胞、ノルアドレナリン作動性神経細胞、アドレナリン作動性神経細胞、セロトニン作動性神経細胞、アセチルコリン作動性神経細胞、γアミノ酪酸作動性神経細胞、グルタミン酸作動性神経細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。

細胞が神経細胞であることは、神経細胞で発現することが知られている遺伝子、その転写産物、タンパク質など（神経細胞マーカー）により確認することができる。
分化した神経細胞のマーカーの例としては、ＭＡＰ２（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）、ニューロフィラメント、シナプシン１、βＩＩＩチューブリン、ＮｅｕＮ（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＦＯＸ３（Ｆｏｒｋｈｅａｄ ｂｏｘ ｐｒｏｔｅｉｎ）、カルビンジン、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ（ｐｏｌｙｓｉａｌｙｌａｔｅｄ ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、Ｄｏｕｂｌｅｃｏｒｔｉｎ、Ｐｅｒｉｐｈｅｒｉｎ等が挙げられる。
神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞が産生する細胞が、神経細胞か否かは、例えば、上述のマーカーにより確認することができる。

（２）神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞培養用培地
本発明の培地は、Ｌ−グルタミン（２−アミノ−４−カルバモイル酪酸）、Ｌ−アスパラギン（２−アミノ−３−カルバモイルプロピオン酸）及びＬ−アスパラギン酸（２−アミノブタン二酸）からなる群より選択される１以上のアミノ酸（本明細書中、「神経分化関連アミノ酸」ともいう）を実質的に含まないことを特徴とする。
選択される「神経分化関連アミノ酸」は、１種（Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、又はＬ−アスパラギン酸）であってもよく（この場合、本発明の培地は他の２種の神経分化関連アミノ酸を含有し得る）、２種（Ｌ−グルタミン及びＬ−アスパラギンの組み合わせ、Ｌ−グルタミン及びＬ−アスパラギン酸の組み合わせ、又はＬ−アスパラギン及びＬ−アスパラギン酸の組み合わせ）であってもよく（この場合、培地は他の１種の神経分化関連アミノ酸を含有し得る）、３種全て（Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、及びＬ−アスパラギン酸）であってもよい。
一態様として、本発明は、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン及びＬ−アスパラギン酸からなる群より選択されるいずれか１種のアミノ酸を実質的に含まないことを特徴とする培地を提供する。該態様において、本発明の培地は、選択されない他の２種の神経分化関連アミノ酸のいずれか一方、又は両方を含んでいてもよい。

本発明の培地は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の神経分化能を亢進するための培地であり得る。本発明の培地中で、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を培養することにより、該細胞の神経分化能を亢進させることが可能となる。さらに、本発明の培地中で培養した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を、神経細胞へ分化させると、得られる神経細胞集団においては増殖性細胞の数が低減される。このため、神経細胞移植治療に有用な神経細胞を提供することが可能となり、神経細胞移植治療用の神経細胞の作製に適した、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を提供することができる。

本明細書中、「培地がＬ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン及びＬ−アスパラギン酸からなる群より選択される１以上のアミノ酸を実質的に含まない」とは、該培地中で神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を培養した時に、標準的な培地アミノ酸濃度相当（Ｌ−グルタミン ０．３−３．０ｍＭ（例、２．５ｍＭ）；Ｌ−アスパラギン ０．０５−１．０ｍＭ（例、０．０５ｍＭ）；Ｌ−アスパラギン酸 ０．０５−１．０ｍＭ（例、０．０５ｍＭ））の当該選択された神経分化関連アミノ酸を含有すること以外は組成が同一な対照培地中で培養した時と比較して、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の神経分化能が亢進されるのに十分な程度に、培地中の選択された神経分化関連アミノ酸の濃度が低減されていることを意味する。

例えば、「培地がＬ−グルタミンを実質的に含まない」とは、該培地中で神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を培養した時に、Ｌ−グルタミンを標準的な培地Ｌ−グルタミン濃度相当（０．３−３．０ｍＭ（例、２．５ｍＭ））を含有すること以外は組成が同一な対照培地中で培養した時と比較して、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の神経分化能が亢進されるのに十分な程度に、培地中のＬ−グルタミン濃度が低減されていることを意味する。他の神経分化関連アミノ酸についても同様である。

本明細書中、「Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン及びＬ−アスパラギン酸からなる群より選択される１以上のアミノ酸を実質的に含まない」とは、選択された神経分化関連アミノ酸のみならず、選択された神経分化関連アミノ酸の代替用ジペプチド（選択された神経分化関連アミノ酸残基を含むジペプチドであって、培地中でペプチダーゼ等により分解されることにより当該選択された神経分化関連アミノ酸を供給するジペプチド）等の、培地中に選択された神経分化関連アミノ酸を提供する物質をも含まないことを意味する。

本明細書中、「Ｌ−グルタミンを実質的に含まない」とは、培地中にＬ−グルタミンのみならず、Ｌ−アラニルＬ−グルタミン等のＬ−グルタミンとアミノ酸とのジペプチド（Ｌ−グルタミン代替用ジペプチド）をも実質的に含まないことを意味する。
本明細書中、「Ｌ−アスパラギンを実質的に含まない」とは、培地中にＬ−アスパラギンのみならず、Ｌ−アスパラギンの代替用ジペプチド（例、Ｌ−アラニルＬ−アスパラギン）をも実質的に含まないことを意味する。
本明細書中、「Ｌ−アスパラギン酸を実質的に含まない」とは、培地中にＬ−アスパラギン酸のみならず、Ｌ−アスパラギン酸の代替用ジペプチド（例、Ｌ−アラニルＬ−アスパラギン酸）をも実質的に含まないことを意味する。

「Ｌ−グルタミンを実質的に含まない培地」とは、該培地中のＬ−グルタミン濃度（Ｌ−グルタミンとＬ−グルタミン代替用ジペプチドとの合計濃度）が、通常、１００μＭ以下、好ましくは１０μＭ以下、更に好ましくは１００ｎＭ以下であり、最も好ましくは０ｎＭである培地を指す。
「Ｌ−アスパラギンを実質的に含まない培地」とは、該培地中のＬ−アスパラギン濃度（Ｌ−アスパラギンとＬ−アスパラギン代替用ジペプチドとの合計濃度）が、通常、１０μＭ以下、好ましくは１００ｎＭ以下、更に好ましくは１ｎＭ以下であり、最も好ましくは０ｎＭである培地を指す。
「Ｌ−アスパラギン酸を実質的に含まない培地」とは、該培地中のＬ−アスパラギン酸濃度（Ｌ−アスパラギン酸とＬ−アスパラギン酸代替用ジペプチドとの合計濃度）が、通常、１０μＭ以下、好ましくは１００ｎＭ以下、更に好ましくは１ｎＭ以下であり、最も好ましくは０ｎＭである培地を指す。
本明細書中、選択された神経分化関連アミノ酸を含まないとは、該神経分化関連アミノ酸の濃度が０ｎＭであることを指す。

本明細書中、「神経分化能」とは、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞が、神経細胞へ分化する能力を意味する。

本発明の培地は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の神経分化能を亢進させる効果を有する。

「神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の神経分化能を亢進させる」とは、本発明の培地中で培養した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞と、選択された神経分化関連アミノ酸の濃度が標準的な培地アミノ酸濃度（Ｌ−グルタミン ０．３−３．０ｍＭ；アスパラギン ０．０５−１．０ｍＭ；アスパラギン酸 ０．０５−１．０ｍＭ）相当であること以外は本発明の培地と同一の組成を有する比較対照培地中で培養した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞（本明細書中、単に比較対照細胞ともいう）とを、神経細胞分化条件下（例えば、Ｎ２及びＢ２７存在中）で培養して神経細胞を作製した時に、一定細胞数当たりの神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞から生じる神経細胞数が、比較対照よりも多いこと、あるいは培養開始後から一定期間に到達するまでの間に産生される神経細胞数が比較対照より多いことを意味する。

例えば、選択された神経分化関連アミノ酸がＬ−グルタミンである場合、「神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の神経分化能を亢進させる」とは、本発明の培地中で培養した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞と、Ｌ−グルタミンの濃度が標準的な培地Ｌ−グルタミン濃度相当（０．３−３．０ｍＭ（例、２．５ｍＭ））であること以外は本発明の培地と同一の組成を有する比較対照培地中で培養した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞とを、神経細胞分化条件下（例えば、Ｎ２及びＢ２７存在中）で培養して神経細胞を作製した時に、１つの神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞から生じる神経細胞数が、比較対照よりも多いこと、あるいは培養開始後から一定期間に到達するまでの間に産生される神経細胞数が比較対照より多いことを意味する。

本発明の培地は、選択された神経分化関連アミノ酸以外の成分については、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の神経分化能の亢進を達成し得る限り特に限定されず、通常の神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の維持培養に使用される組成を適宜採用し得る。

本発明の培地は、哺乳動物細胞の培養に通常用いられる培地の組成から、選択された神経分化関連アミノ酸を除去したものを基礎培地として調製してもよい。基礎培地としては、所望の効果を達成し得る限り特に限定されないが、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｆ−１２培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ／Ｆ１２培地、ハム培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、又はこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地を挙げることができる。また、多能性幹細胞培養用として通常用いられる培地の組成から選択された神経分化関連アミノ酸を除去したものを基礎培地として調製してもよい。
市販の多能性幹細胞培養用の基礎培地である、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ培地（味の素）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｍＴｅＳＲ１培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＴｅＳＲ２培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＲＨＢ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ，Ｉｎｃ．）、ＴｅＳＲ^ＴＭ−Ｅ６（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｈＥＳＦ−ＧＲＯ培地（ニプロ株式会社）、ＨＥＳＦ−ＤＩＦ培地（ニプロ株式会社）、ＣＳＴＩ−７（株式会社細胞科学研究所）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ６培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等の組成から、選択された神経分化関連アミノ酸を除去したものを基礎培地として調製することもできる。

本発明の培地は、化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、好ましくは、含有成分が化学的に決定された培地（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ；ＣＤＭ）である。本発明の培地は、化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、無血清培地であることが好ましい。本発明における「無血清培地」とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味する。本発明では、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、ｂＦＧＦなどの増殖因子）を含む培地も、無調整又は未精製の血清を含まない限り、無血清培地に含まれる。

無血清培地は、血清代替物を含有していてもよい。血清代替物としては、例えば、血清アルブミン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール又は３’チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などを適宜含有するものを挙げることができる。かかる血清代替物は、例えば、ＷＯ９８／３０６７９に記載の方法により調製することができる。血清代替物としては市販品を利用してもよい。かかる市販の血清代替物としては、例えば、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ^ＴＭ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製：以下、ＫＳＲと記すこともある。）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−ｄｅｆｉｎｅｄ Ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、Ｂ２７（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ｎ２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）が挙げられるが、これらに限定されない。

通常、本発明の培地は、全ての必須アミノ酸（Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−トリプトファン及びＬ−バリン）を含む。

神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の神経分化能の亢進を達成し得る限り特に限定されるものではないが、本発明の培地に含まれる必須アミノ酸の濃度は、それぞれ以下に例示される：
Ｌ−ロイシン ０．００５−１００ｍM、好ましくは０．５−２０ｍM；
Ｌ−リジン ０．００５−１００ｍM、好ましくは１−２０ｍM；
Ｌ−フェニルアラニン ０．００５−１００ｍM、好ましくは０．５−１０ｍM；
Ｌ−イソロイシン ０．００５−１００ｍM、好ましくは０．５−２０ｍM；
Ｌ−スレオニン ０．００５−１００ｍM、好ましくは０．５−１０ｍM；
Ｌ−ヒスチジン ０．００５−１００ｍM、好ましくは０．５−１０ｍM
Ｌ−メチオニン ０．００５−１００ｍM、好ましくは０．５−５ｍM；
Ｌ−トリプトファン ０．００５−１００ｍM、好ましくは０．０５−１ｍM；
Ｌ−バリン ０．００５−１００ｍM、好ましくは０．５−１０ｍM。

各必須アミノ酸の濃度の組合せとしては、Ｌ−ロイシン ０．００５−１００mM、Ｌ−リジン ０．００５−１００mM、Ｌ−フェニルアラニン ０．００５−１００mM、Ｌ−イソロイシン ０．００５−１００mM、Ｌ−スレオニン ０．００５−１００mM、Ｌ−ヒスチジン ０．００５−１００mM、Ｌ−メチオニン ０．００５−１００mM、Ｌ−トリプトファン ０．００５−１００mM及びＬ−バリン ０．００５−１００mMが例示されるが、これに限定されない。

より好ましくは、本発明の培地は、全ての必須アミノ酸（Ｌ‐ロイシン０．５−２０ｍM、Ｌ−リジン１−２０ｍM、Ｌ−フェニルアラニン０．５−１０ｍM、Ｌ−イソロイシン０．５−２０ｍM、Ｌ−スレオニン０．５−１０ｍM、Ｌ−ヒスチジン０．５−１０ｍM、Ｌ−メチオニン０．５−５ｍM、Ｌ−トリプトファン０．０５−１ｍM及びＬ−バリン０．５−１０ｍM）を含む。

本発明の培地は、好ましくは、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン及びＬ−アスパラギン酸以外の全ての非必須アミノ酸（Ｌ−アラニン ０．２−２ｍM、Ｌ−アルギニン１−１０ｍM、グリシン１−１０ｍM、Ｌ−グルタミン酸０．５−１０ｍM、Ｌ−システイン０．５−１０ｍM、Ｌ−セリン０．５−１０ｍM、Ｌ−チロシン０．５−１０ｍM、Ｌ−プロリン０．５−５ｍM）を含む。

本発明の培地が、Ｌ−アスパラギン及び／又はＬ−アスパラギン酸を実質的に含まず、Ｌ−グルタミンを含む場合、Ｌ−グルタミンの培地中の濃度は、０．３−３．０ｍＭであることが好ましい。
本発明の培地が、Ｌ−グルタミン及び／又はＬ−アスパラギン酸を実質的に含まず、Ｌ−アスパラギンを含む場合、Ｌ−アスパラギンの培地中の濃度は、０．０５−１．０ｍＭであることが好ましい。
本発明の培地が、Ｌ−グルタミン及び／又はＬ−アスパラギンを実質的に含まず、Ｌ−アスパラギン酸を含む場合、Ｌ−アスパラギン酸の培地中の濃度は、０．０５−１．０ｍＭであることが好ましい。

本発明の培地は、上述のアミノ酸に加えて、Ｌ‐シスチン等の天然アミノ酸を含んでいてもよい。
本発明の培地は、さらに培地添加物を含有してもよい。培地添加物としては、ビタミン類、サイトカイン及び成長因子などのタンパク質、Ｌ−アスコルビン酸、リン酸Ｌ−アスコルビルマグネシウム、ピルビン酸ナトリウム、２−アミノエタノール（エタノールアミン）、グルコース、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、インスリン、プロゲステロン、セレン酸ナトリウム、プトレシン等が挙げられるが、これらに限定されない。添加物は自体公知の濃度範囲内で含まれることが好ましい。本発明の培地は、Ｌ−アスコルビン酸を含んでもよく、含まなくてもよい。

本発明の培地は、さらにホロトランスフェリンを含んでいてもよい。鉄と結合したトランスフェリンはホロトランスフェリン、鉄と結合していないトランスフェリンはアポトランスフェリンと呼ばれる。本明細書中、ホロトランスフェリンは、アポトランスフェリン１分子と鉄イオン１つが結合した分子、及びアポトランスフェリン１分子と鉄イオン２つが結合した分子を含む。
本発明の培地がホロトランスフェリンを含む場合、培地に含まれるホロトランスフェリンの濃度は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の神経分化能の亢進等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、０．０１〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．１〜６．５μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは０．１〜５μｇ／ｍｌである。
ヒトトランスフェリンをコードする核酸配列としてはＮＭ＿００１０６３（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．）が、ヒトトランスフェリンのアミノ酸配列としてはＮＰ＿００１０５４が挙げられるが、これらに限定されない。
ホロトランスフェリンは、市販の試薬（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いることもできる。

本発明の培地は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の継代培養に使用される増殖因子（例えば、ＥＧＦ：１０〜１００ｎｇ／ｍＬ、ｂＦＧＦ：１０〜１００ｎｇ／ｍｌ等）を含んでいてもよい。

本発明の培地は、脂肪酸を含んでもよい。本発明の培地に含まれる脂肪酸としては、オレイン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、イコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、酪酸、酢酸、パルミトレイン酸、吉草酸（バレリアン酸）、カプロン酸、エナント酸（ヘプチル酸）、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、マルガリン酸、クセン酸、エレオステアリン酸、アラキジン酸、８，１１−エイコサジエン酸、５，８，１１−エイコサトリエン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、ネルボン酸、セロチン酸、モンタン酸、メリシン酸などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の培地に含まれる脂肪酸は飽和脂肪酸であってもよく、不飽和脂肪酸であってもよい。

例えば、本発明の培地は、選択された神経分化関連アミノ酸（例、Ｌ−グルタミン、アスパラギン又はアスパラギン酸）を含まない基礎培地に炭酸水素ナトリウム、セレン、トランスフェリン、インスリン、ｂＦＧＦ及び２−アミノエタノールを添加して調製することができるが、これに限定されない。

本発明の培地のｐＨは、約５．０〜約８．５であることが好ましく、より好ましくは約６．０〜約８．０に調整される。培地は、メンブレンフィルター等を用いた濾過滅菌などの滅菌処理を行うことが好ましい。

本発明の培地の形態は、本発明の所望の効果が得られる限り特に限定されず、例えば、液体培地、半流動培地、及び固形培地の形態として調製することができる。また、本発明の培地を、粉末状の形態として調製してもよい。粉末状の形態に調製することにより、輸送や保存が極めて容易となり得る。かかる粉末状の培地は、使用直前に滅菌水等を添加し、必要に応じて、メンブレンフィルター等を用いて滅菌することにより、簡便に液体培地とすることができる。本発明の培地は、接着培養、浮遊培養、包埋培養、組織培養等のいずれの培養方法にも用いることができる。

（３）神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の培養方法
本発明は、上記本発明の培地中で神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を培養することを含む、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の培養方法（本明細書中、本発明の培養方法ともいう）を提供する。

本発明の培地を用いて神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を培養することにより、神経分化能が亢進した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を得ることが可能となる。特に、本発明の培地を用いて培養した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を、神経細胞へ分化させると、増殖が抑制された神経細胞集団を得ることができるため、本発明の培養方法は、神経細胞移植用の神経細胞の作製に有用である。従って、本発明の培養方法は、好ましくは神経分化能が亢進した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を製造するための方法である。また、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の維持培養において、培地中のＬ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン及びＬ−アスパラギン酸からなる群より選択される１以上のアミノ酸の濃度を、該アミノ酸が「実質的に含まれない」濃度にまで低減させて、引き続き培養することにより、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の神経分化能を亢進させることができる。本発明は、このような神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の神経分化能の亢進方法ともとらえることが出来る。選択した神経分化関連アミノ酸の濃度の低減は、培養に用いる培地を、選択した神経分化関連アミノ酸を所定の濃度で含有する培地から、本発明の培地に切り替えることにより実施することが出来る。神経分化関連アミノ酸を含む培地中に細胞を懸濁した溶液を、約１０倍量のΔＧｌｎ培地に懸濁することで、切り替え前の培地は１０倍程度に希釈される。通常の操作により培地交換を行えば、交換前の培地の持ちこしは多くとも１／１００容量程度と見積もられるため、例えば培地切り替えの直後〜数時間後までに切り替え後の培地を本発明の培地で置換することにより、神経分化関連アミノ酸を含む培地は少なくとも１，０００倍程度に希釈されると見積もられる。上述の様に、一般的な、多能性幹細胞や神経幹細胞の維持用培地には、Ｌ−グルタミンは０．３〜３．０ｍＭ程度、Ｌ−アスパラギンは０．０５〜１．０ｍＭ程度、Ｌ−アスパラギン酸は０．０５〜１．０ｍＭ程度含まれる。そこで、例えば、Ｌ−グルタミンを０．３〜３．０ｍＭの濃度で含有する培地中で神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を維持培養し、その培地を、Ｌ−グルタミンを実質的に含まない本発明の培地に交換して、引き続き維持培養を継続することにより、Ｌ−グルタミン濃度を０．３〜３．０ｍＭから、例えば、１００μＭ以下、好ましくは１０μＭ以下、更に好ましくは１００ｎＭ以下、更により好ましくは１ｎＭ以下であり、最も好ましくは０ｎＭにまで低減させて、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の神経分化能を亢進させる。また、例えば、Ｌ−アスパラギンを０．１〜１．０ｍＭの濃度で含有する培地中で神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を維持培養し、その培地を、Ｌ−アスパラギンを実質的に含まない本発明の培地に交換して、引き続き維持培養を継続することにより、Ｌ−アスパラギン濃度を０．１〜１．０ｍＭから、例えば、１０μＭ以下、好ましくは１００ｎＭ以下、更に好ましくは１ｎＭ以下であり、最も好ましくは０ｎＭにまで低減させて、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の神経分化能を亢進させる。また、Ｌ−アスパラギン酸を０．１〜１．０ｍＭの濃度で含有する培地中で神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を維持培養し、その培地を、Ｌ−アスパラギン酸を実質的に含まない本発明の培地に交換して、引き続き維持培養を継続することにより、Ｌ−アスパラギン酸濃度を０．１〜１．０ｍＭから、例えば、１０μＭ以下、好ましくは１００ｎＭ以下、更に好ましくは１ｎＭ以下であり、最も好ましくは０ｎＭにまで低減させて、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の神経分化能を亢進させる。

本発明の培養方法において用いられる神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞は、好ましくは単離されている。「単離」とは、目的とする成分や細胞以外の因子を除去する操作がなされ、天然に存在する状態を脱していることを意味する。「単離された神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞」の純度（全細胞数に占める神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の数の百分率）は、通常７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９９％以上、最も好ましくは１００％である。

本発明の培養方法における、培地中の神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の濃度は、所望の効果を有する限り特に制限されないが、通常５ｘ１０^３〜１０^５個／ｃｍ^３、好ましくは、１０^４〜３ｘ１０^４個／ｃｍ^３である。

本発明の培養方法における培養条件は、本発明の培地が用いられることを除いては、所望の効果を達成し得る限り特に限定されず、培養の目的に応じて通常の神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の培養に用いられる培養条件を適宜採用し得る。

本発明の培養方法において、細胞の培養に用いられる培養器は、所望の効果を達成し得る限り特に限定されず、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリディッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、及びローラーボトルなどが挙げられる。

細胞の培養に用いられる培養器は、細胞接着性であっても細胞非接着性であってもよく、目的に応じて適宜選ばれる。
細胞接着性の培養器は、培養器の表面の細胞との接着性を向上させる目的で、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）等の任意の細胞支持用基質又はそれらの機能をミミックする人工物でコーティングされたものであり得る。

その他の培養条件は、適宜設定できる。例えば、培養温度は、所望の効果を達成し得る限り特に限定されないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。ＣＯ_２濃度は、約１〜１０％、好ましくは約２〜５％である。酸素濃度は、通常１〜４０％であるが、培養条件などにより適宜選択される。

本発明の培養方法において、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞は、接着培養、浮遊培養、組織培養などの自体公知の方法により培養可能である。

神経分化能の亢進などの所望の効果を達成し得る限り特に制限されるものではないが、本発明の培養方法における神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を培養する期間は、通常２日間以上、好ましくは４日間以上、より好ましくは８日間以上である。本発明の培地中で培養した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を回収し、その一部又は全部を新鮮な本発明の培地中に継代し、引き続き培養を続けることにより、亢進された神経分化能を維持したまま、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を継代培養することができる。
神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を継代する場合、自体公知の方法により神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を分散処理してもよい。細胞を分散処理する方法の例としては、キレート剤（例、ＥＤＴＡ）や酵素（例、トリプシン、コラゲナーゼ）等による処理、機械的な分散（例、ピペッティング）などの操作が挙げられる。

（４）神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞からの神経細胞の作製方法
本発明は、上記本発明の培地中で神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を培養し、続いて神経細胞への分化誘導培養を行い神経細胞集団を得ることを特徴とする、神経細胞作製方法（本明細書中、本発明の神経細胞作製方法ともいう）を提供する。

本明細書中、神経細胞集団とは、神経細胞を含む細胞の集団を意味する。神経細胞集団には、神経細胞以外の細胞を含み得る。神経細胞集団は、神経細胞を含む限り特に制限はないが、通常、細胞集団内の細胞の１％以上、好ましくは５％以上、より好ましくは２０％以上、さらに好ましくは４０％以上が神経細胞である。

本発明の神経細胞作製方法を用いることにより、短期間で多くの神経細胞を高効率に作製することが可能となる。また本発明の神経細胞作製方法により得られる神経細胞集団は、神経細胞集団に含まれる増殖性細胞の割合が低いため、細胞移植治療に用いた場合に腫瘍化のリスクが低い。従って、本発明の神経細胞作製方法により作製した神経細胞は、移植治療に好適に用いられ得る。

本発明の神経細胞作製方法は、以下の工程を含む：
（Ｉ）本発明の培地中で神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を培養し、神経細胞分化能が亢進した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を得ること；
（ＩＩ）工程（Ｉ）で得た神経分化能が亢進した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を、神経細胞分化誘導条件下で培養し、神経細胞集団を得ること。

工程（Ｉ）は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を本発明の培地中で、神経分化能の亢進に十分な期間（例えば、２日以上、好ましくは４日以上、より好ましくは８日以上）培養することにより達成することができる。その他の培養条件は、本発明の培養方法の記載に準ずる。

工程（ＩＩ）における神経細胞分化誘導条件は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の神経細胞への分化を達成し得る限り特に限定されず、所望の神経細胞への分化誘導に使用される培養条件を適宜採用し得る。神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の接着培養方法の例としては、Ｆｌａｎａｇａｎ ＬＡら，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ．２００６ Ａｐｒ；８３（５）：８４５−５６、Ｃｏｎｔｉ Ｌら，ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌｏｇｙ．，２００５ Ｓｅｐ；３（９）：ｅ２８３などに記載の方法が挙げられる。神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の浮遊培養とは、培地中において、培養器又はフィーダー細胞（用いられる場合）に対して非接着性の条件下で神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を培養することをいう。神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の浮遊培養方法の例としては、ニューロスフィア法（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ＢＡ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓ Ｓ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＳＡ，１９９２ Ｍａｒ ２７；２５５（５０５２）：１７０７−１０．）、無血清凝集浮遊培養法（ＳＦＥＢ法、ＳＦＥＢｑ法；Ｗａｔａｎａｂｅら，Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８，２８８−２９６（２００５））などが挙げられる。神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の組織培養とは、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を含む組織を、スライスなどの組織片又は組織全体として培養する方法である。神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の組織培養としては、Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅ ＮＡら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９２ Ｏｃｔ ９；２５８（５０８０）：２９９−３０２．、Ｋｏｍｕｒｏ Ｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９２ Ａｕｇ ７；２５７（５０７１）：８０６−９．に記載のスライス培養法などが挙げられる。神経細胞分化誘導条件は、当業者に周知であり、当業者は所望の神経細胞分化誘導条件を適宜採用することができる。

工程（ＩＩ）における、培地中の神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の濃度は、所望の効果を有する限り特に制限されないが、通常５ｘ１０^３〜１０^５個／ｃｍ^３、好ましくは、１０^４〜３ｘ１０^４個／ｃｍ^３である。

工程（ＩＩ）の分化誘導培養における培養条件は、増殖性細胞の占める割合が低減される等の所望の効果を達成し得る限り特に限定されず、培養の目的に応じて公知の培養方法を適宜採用し得る。

工程（ＩＩ）の分化誘導培養において、細胞の培養に用いられる培養器は、所望の効果を達成し得る限り特に限定されず、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリディッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、及びローラーボトルなどが挙げられる。

細胞の培養に用いられる培養器は、細胞接着性であっても細胞非接着性であってもよく、目的に応じて適宜選ばれる。
細胞接着性の培養器は、培養器の表面の細胞との接着性を向上させる目的で、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）等の任意の細胞支持用基質又はそれらの機能をミミックする人工物でコーティングされたものであり得る。

その他の培養条件は、適宜設定できる。例えば、培養温度は、所望の効果を達成し得る限り特に限定されないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。ＣＯ_２濃度は、約１〜１０％、好ましくは約２〜５％である。酸素濃度は、通常１〜４０％であるが、培養条件などにより適宜選択される。

工程（ＩＩ）の分化誘導培養において、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞は、接着培養、浮遊培養、組織培養などの自体公知の方法により培養可能である。

工程（ＩＩ）の分化誘導培養において、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を培養する期間は、増殖性の低減された神経細胞の産生などの所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、少なくとも神経細胞が出現するまで培養が継続される。神経細胞の出現は、上述の神経細胞マーカーの発現を評価することにより確認することが出来る。

一実施態様において、分化誘導培養は、分化誘導培地中で、神経分化能が亢進した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を培養する。

増殖性の低減された神経細胞の産生などの所望の効果を達成し得る限り特に制限されるものではないが、工程（ＩＩ）の分化誘導培養において分化誘導培地を用いる場合、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を培養する期間は、通常１０日間以上、好ましくは２１日間以上、より好ましくは６０日間以上である。分化誘導培地中で培養を行う場合、通常３日に１回、好ましくは２日に１回以上、新鮮な培地に交換する。
分化誘導培地を用いる場合、工程（ＩＩ）において、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を分散処理し、分散処理した細胞を分化誘導培養に付すことが好ましい。分化誘導培地を用いる場合、工程（ＩＩ）は、細胞接着性の容器を用いることが好ましい。

工程（ＩＩ）において用いられる分化誘導培地の組成は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の神経細胞への分化を達成し得る限り特に制限されず、公知の神経細胞分化誘導用培地を用いることができる。
分化誘導培地は、ＥＧＦ及びｂＦＧＦ等の神経幹細胞の未分化性を維持する物質を含まないことが好ましい。

工程（ＩＩ）において用いられる分化誘導培地は、哺乳動物細胞の培養に通常用いられる培地を基礎培地として調製してもよい。基礎培地としては、所望の効果を達成し得る限り特に限定されないが、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｆ−１２培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ／Ｆ１２培地、ハム培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、又はこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地を挙げることができる。

工程（ＩＩ）において用いられる分化誘導培地は、化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、好ましくは、含有成分が化学的に決定された培地（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ；ＣＤＭ）である。分化誘導培地は、化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、無血清培地であることが好ましい。本発明における「無血清培地」とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味する。本発明では、精製された血液由来成分や動物組織由来成分を含む培地も、無調整又は未精製の血清を含まない限り無血清培地に含まれる。

無血清培地は、血清代替物を含有していてもよい。血清代替物としては、例えば、血清アルブミン、脂肪酸、非必須アミノ酸、トランスフェリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール又は３’チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などを適宜含有するものを挙げることができる。かかる血清代替物は、例えば、ＷＯ９８／３０６７９に記載の方法により調製することができる。血清代替物としては市販品を利用してもよい。かかる市販の血清代替物としては、例えば、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ^ＴＭ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製：以下、ＫＳＲと記すこともある。）、Ｇｌｕｔａｍａｘ^ＴＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−ｄｅｆｉｎｅｄ Ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、Ｂ２７（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ｎ２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）が挙げられるが、これらに限定されない。

工程（ＩＩ）において用いられる分化誘導培地は、さらに培地添加物を含有してもよい。培地添加物としては、ビタミン類、サイトカイン及び成長因子などのタンパク質、Ｌ−アスコルビン酸、リン酸Ｌ−アスコルビルマグネシウム、ピルビン酸ナトリウム、２−アミノエタノール、グルコース、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、インスリン、プロゲステロン、セレン酸ナトリウム、プトレシン等が挙げられるが、これらに限定されない。添加物は自体公知の濃度範囲内で含まれることが好ましい。

工程（ＩＩ）において用いられる分化誘導培地は、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン及びＬ−アスパラギン酸を含んでいてもよい。

工程（ＩＩ）において用いられる分化誘導培地は、脂肪酸を含んでもよい。分化誘導培地に含まれる脂肪酸としては、オレイン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、イコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、酪酸、酢酸、パルミトレイン酸、吉草酸（バレリアン酸）、カプロン酸、エナント酸（ヘプチル酸）、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、マルガリン酸、クセン酸、エレオステアリン酸、アラキジン酸、８，１１−エイコサジエン酸、５，８，１１−エイコサトリエン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、ネルボン酸、セロチン酸、モンタン酸、メリシン酸などが挙げられるが、これらに限定されない。分化誘導培地に含まれる脂肪酸は飽和脂肪酸であってもよく、不飽和脂肪酸であってもよい。

分化誘導培地のｐＨは、約５．０〜約８．５であることが好ましく、より好ましくは約６．０〜約８．０に調整される。培地は、メンブレンフィルター等を用いた濾過滅菌などの滅菌処理を行うことが好ましい。

本発明の一実施態様として、分化誘導培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を基礎培地とし、トランスフェリン、Ｇｌｕｔａｍａｘ、Ｂ２７サプリメント、Ｎ２サプリメント、グルコース、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、インスリン、プロゲステロン、亜セレン化ナトリウム及びプトレシンを含む。

上記の培地を用いる場合、工程（ＩＩ）における、細胞を培養する期間は、神経細胞への分化誘導を達成し得る限り特に限定されないが、通常は、１０日以上、好ましくは２１日以上、より好ましくは６０日以上である。

工程（ＩＩ）は、特定の種類の神経細胞に分化させるものであってもよい。

本発明の神経細胞作製方法は、工程（Ｉ）、（ＩＩ）に続いて、さらに工程（ＩＩＩ）神経細胞集団から神経細胞を単離する工程を含み得る。
神経細胞集団からの神経細胞の単離は、自体公知の方法により行うことができる。
神経細胞集団から神経細胞を単離する方法の例としては、所望の神経細胞特異的に存在する細胞外抗原に対する抗体を用いてフローサイトメトリーにより単離する方法、所望の神経細胞特異的に存在する細胞外抗原に対する抗体を結合させたマイクロビーズにより単離する方法等が挙げられるが、これらに限定されない。
神経細胞集団の単離は、混入が予測される神経前駆細胞及び神経幹細胞を除去することによっても達成され得る。

（５）神経分化能が亢進した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞
本発明は、上記本発明の培養方法によって得られる、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞（本発明の神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞）を提供する。

前述のとおり、本発明の神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞は、神経分化能が亢進している。
本発明の神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を本発明の培地中で、通常は、２日以上、好ましくは４日以上、より好ましくは８日以上培養することにより得ることができる。その他の培養条件は、本発明の培養方法の記載に準ずる。

本発明の神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞は、好ましくは単離されている。「単離」とは、目的とする成分や細胞以外の因子を除去する操作がなされ、天然に存在する状態を脱していることを意味する。「単離された神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞」の純度（全細胞数に占める神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の数の百分率）は、通常７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９９％以上、最も好ましくは１００％である。

一実施態様として、本発明の神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞は凍結保存させた状態で提供され得る。本発明の神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞は、凍結保存することが可能であり、必要に応じて融解・起眠して使用することができる。凍結保存は、自体公知の細胞凍結保存方法を使用することができる。凍結保存の例としては、本発明の組成物にジメチルスルホキシドを加え、−８０〜−２００℃、好ましくは−１９６℃（液体窒素中）の条件で本発明の神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を保存する。

（６）神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞培養調製物
本発明は、上記本発明の培地及び神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を含む、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞培養調製物（本発明の培養調製物）を提供する。

本発明の培養調製物における神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞は、生存し、増殖している細胞である。

本発明の培養調製物における神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞は、好ましくは単離されている。「単離」とは、目的とする成分や細胞以外の因子を除去する操作がなされ、天然に存在する状態を脱していることを意味する。「単離された神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞」の純度（全細胞数に占める神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の数の百分率）は、通常７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９９％以上、最も好ましくは１００％である。

本発明の培養調製物において、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞は、本発明の培地中に存在する。一態様において、本発明の培養調製物は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の、本発明の培地中の懸濁液である。本発明の培養調製物は、適切な容器中に封入されていてもよい。

本発明の培養調製物は、上記本発明の培養方法の実施に有用である。

一実施態様として、本発明の培養調製物は凍結保存させた状態で提供され得る。本発明の培養調製物は、凍結保存することが可能であり、必要に応じて融解・起眠して使用することができる。凍結保存は、自体公知の細胞凍結保存方法を使用することができる。凍結保存の例としては、本発明の培養調製物にジメチルスルホキシドを加え、−８０〜−２００℃、好ましくは−１９６℃（液体窒素中）の条件で本発明の培養調製物を保存する。

以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

実施例１：グルタミンを実質的に含まない培地での神経幹細胞の培養法
（１）Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗｉｎｇ ｎｅｕｒｏ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｌｉｋｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ（以下ＬｔＮＥＳ細胞）誘導法
ｉＰＳ細胞よりＥＢ（ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ）を形成させ、Ｅ６培地（Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓまたはＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からアスコルビン酸及びトランスフェリンを除いた組成に相当する培地にトランスフェリン（終濃度０．５〜１０μｇ／ｍＬ）、エタノールアミン（終濃度５〜５０μＭ）、ヒト血清アルブミン（終濃度０．１〜５ｍｇ／ｍＬ）を添加した培地中にて、４日間培養した。ポリ−Ｌ−オルニチン（ＰＯ）コートしたｄｉｓｈにＥＢを播種し、上記培地中で１０日程度培養し、Ｒｏｓｅｔｔｅ様の構造が形成されることを確認した。Ｒｏｓｅｔｔｅ部分をくり抜き、ニューロスフィアとして上記培地中で浮遊培養を７日程度行った。ニューロスフィアをトリプシン／ＥＤＴＡにて分散し、ＰＯ／ラミニンコートしたｄｉｓｈ上でＲＨＢ−Ａ培地中にて培養し、ＬｔＮＥＳ細胞を作成した。

（２）ＬｔＮＥＳ細胞の培養法
Ｅ６培地（Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓまたはＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からアスコルビン酸、トランスフェリン及びＬ−グルタミンを除いた組成に相当する培地に、トランスフェリン（終濃度０．５〜１０μｇ／ｍＬ）、エタノールアミン（終濃度５〜５０μＭ）、ヒト血清アルブミン（終濃度０．１〜５ｍｇ／ｍＬ）、２０ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦを添加して、Ｌ−グルタミン不含培地（ΔＧｌｎ培地）を作製した。また、Ｌグルタミン（０．３−３．０ｍＭ）を含有すること以外は、ΔＧｌｎ培地と組成が同一な対照培地（Ｆｕｌｌ培地）を作製した。
ヒト多能性幹細胞より誘導したＬｔＮＥＳ細胞をＦｕｌｌ培地に懸濁し、細胞懸濁液を作製した。Ｆｕｌｌ培地又はΔＧｌｎ培地に対して１／１０量の該細胞懸濁液を加え、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で培養を行った。交換前の培地の持ち込みを減らすため、培養開始２時間後に培地交換を実施し、さらに培養を続けた。このため、交換前の培地は少なくとも１，０００倍程度には希釈されていると見積もられる。ＬｔＮＥＳ細胞の継代には、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ内で、３７℃、１分間インキュベートを行い、培地で希釈し、その後ピペッティングを行い、単一の細胞とした。１．５ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）で上記培地中に分散させた細胞を播種し３７℃、５％ＣＯ_２環境下で培養を行った。細胞数測定は、トリパンブルー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）による死細胞染色を行った上で、血球計算盤で行った。
培養４日後の神経幹細胞の顕微鏡像を図１Ａに示す。ΔＧｌｎ培地中で４日間培養した神経幹細胞は、Ｆｕｌｌ培地で培養した神経幹細胞と同様の形態を示した。

実施例２：神経系細胞誘導の促進効果の検証
Ｌ−グルタミン不含培地で培養した細胞の分化能を検証するため、分化誘導実験を行った。
実施例１と同様に、ｉＰＳ細胞より神経幹細胞を誘導し、Ｌ−グルタミン不含培地（ΔＧｌｎ培地）又は対照培地（Ｆｕｌｌ培地）中で４日間培養を行った。
培養後、培地の代わりにＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃、１分間インキュベートして細胞分散処理を行った。ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを培地で希釈後、ピペッティングを行い、ポリＬオルニチン／フィブロネクチンでコートした４８ウェルプレートに１．５ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した。Ｌ−グルタミンを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に、１ｘＮ２サプリメント（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１ｘＢ２７サプリメント（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加した分化誘導培地中でＤａｙ４〜Ｄａｙ２５までの２１日間培養した。細胞の培養は、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下のインキュベーター内で行った。培地交換は２日に一度行った。
分化誘導培養後の細胞からＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに転写後、ｑＰＣＲを行い、Ｎｅｕｒｏ Ｄ１（Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １）、ｓｙｎａｐｓｉｎ １の発現強度を測定した。また、分化誘導培養後の細胞を固定し、神経細胞マーカーであるβＩＩＩチューブリンに対する抗体を用いた蛍光抗体法により免疫染色を行った。
免疫染色の結果を図１Ｃに示す。分化誘導後の細胞には、βＩＩＩチューブリン陽性である分化した神経細胞が含まれていることが示された。ΔＧｌｎ培地で培養した神経幹細胞は、Ｆｕｌｌ培地中で培養した神経幹細胞より、多くの分化した神経細胞を産生した。従って、ΔＧｌｎ培地は、神経幹細胞の分化促進作用を有することが示された。
ｑＰＣＲの結果を図１Ｄに示す。Ｌ−グルタミンをΔＧｌｎ培地で培養した神経幹細胞から誘導された神経細胞中では、神経細胞マーカーであるＳｙｎａｐｓｉｎ１、及び神経前駆細胞マーカーであるＮｅｕｒｏＤ１の発現が亢進していた。

実施例３：神経細胞の増殖性の抑制効果の検証
実施例１に記載の神経幹細胞培養方法に従って、対照培地（Ｆｕｌｌ培地）又はＬ−グルタミン不含培地（ΔＧｌｎ培地）中で、神経幹細胞を４日間培養した。培養した細胞を、４%-パラホルムアルデヒドりん酸緩衝液によって室温で２０分間固定した。固定した細胞はＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）で洗浄した後、エタノール中で室温にて５分間インキュベートし、風乾させた。その後、細胞を０．４％クリスタルバイオレットメタノール溶液（和光純薬：０３８−０４８６２）で２０分間染色し、純水で洗浄を行った。１％ＳＤＳ水溶液を３５０μＬ加えて２０分間振とうすることでクリスタルバイオレットを溶出し、溶出液の５７０ｎｍ吸光度をマイクロプレートリーダーＳＨ―９０００（コロナ電気社）で測定することにより、細胞数の定量を行った。
結果を図１Ｂに示す。ΔＧｌｎ培地中で４日間培養した時の神経幹細胞の数は、Ｆｕｌｌ培地中で培養した場合よりも少なかった。従って、ΔＧｌｎ培地は、神経幹細胞の増殖を抑制することが示された。

実施例４：神経幹細胞の増殖効果の検証
実施例１に記載の神経幹細胞培養方法に従って、対照培地（Ｆｕｌｌ培地）又はＬ−グルタミン不含培地（ΔＧｌｎ培地）中で、神経幹細胞を４日間培養した。その後２０日(ｔｏｔａｌ ５継代)まで培養し、培養４日目、８日目、１２日目、１６日目、２０日目で細胞数の計測を行った。
結果を図１Ｅに示す。ΔＧｌｎ培地中で培養した神経幹細胞の数は直線的な増殖を示した(図１Ｅ)。

実施例５：培地中のアミノ酸の分析
実施例１に記載の神経幹細胞培養方法に従って、対照培地（Ｆｕｌｌ培地）又はＬ−グルタミン不含培地（ΔＧｌｎ培地）中で、神経幹細胞を４日間以上培養した。培養した細胞を、培地除去後氷冷メタノールを用いて溶解し、回収した。細胞内のアミノ酸量、TCAサイクルに関するケト酸及び有機酸量を分析した。以下に、アミノ酸、ケト酸、有機酸の分析手順を示す。
〈アミノ酸の分析手順〉
試料溶液の誘導体化反応
検体を１０μＬ採取し、内標準溶液を１０μＬ加え、アミノタグワコー ＡＰＤＳタグワコー用ホウ酸緩衝液（和光純薬製）を６０μＬ入れ振とうし、さらにアミノタグワコー アミノ酸分析試薬（ＬＣ/ＭＳ用）（和光純薬製）を２０μＬ加え激しく振とうした。
その後、ブロックヒーターを用いて５５℃で１０分間加熱した。冷却後、反応溶液に希釈液を４００μＬ加え振とうし、分析試料とした。
誘導体化反応溶液の分析
試料は、移動相としてＡ液にアミノタグワコー ＡＰＤＳタグワコー用溶離液（和光純薬製）、Ｂ液にアセトニトリル６００μＬと水４００μＬを混合したものを用い、固定相にＣ８カラムを使用してＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムに導入し、各アミノ酸の質量数で検出した。
また内標準として、アミノタグワコー ＡＰＤＳタグワコー用アミノ酸内部標準混合液（和光純薬製）Ｎｏ．１を650μｌ採取し、Ｎｏ．２ ５０μＬを添加し、５０μＭ Ｐｕｔ−ｄ８と水を１：１：８の割合で混合した物を用いた。
分析装置
分析装置は、ＡＰＩ４０００ ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム（ＡＢ ＳＣＩＥＸ製）を用いた。
結果を図２に示す。ΔＧｌｎ培地中で培養した細胞の細胞内アミノ酸含有量が変化しており、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、アスパラギンに関して有意な上昇が観察された。またグルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸に関して有意な減少が観察された。
〈ケト酸の分析手順〉
誘導体化試薬溶液の調製
Ｏ‐（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンジル）−ヒドロキシルアミン１０ｍｇを０．１％水酸化ナトリウム水溶液とアセトニトリルを等量ずつ混合した溶液１ｍＬに溶解し誘導体化試薬溶液とした。
試料溶液の誘導体化反応
反応バイアルに試料溶液２０μＬを入れ、誘導体化試薬溶液２０μＬを加え、よく撹拌した後、氷水中で３０分間静置し誘導体化反応を行った。その後、アセトンとアセトニトリルを等量ずつ混合した溶液を１０μＬ加え、誘導体化反応を停止させた。その後、０．１％水酸化ナトリウム水溶液とアセトニトリルを等量ずつ混合した溶液５０μＬを加え、希釈した溶液を分析試料とした。
誘導体化反応溶液の分析
移動相としてＡ液に２５ｍＭギ酸水溶液、Ｂ液にアセトニトリル、固定相にＰｈカラムを使用し、分析試料をＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムに導入し、各ケト酸に対応した質量数で検出した。
分析装置
分析装置は、ＡＰＩ４０００ ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム（ＡＢ ＳＣＩＥＸ製）を用いた。
〈有機酸の定量手順〉
誘導体化試薬溶液の調製
３−ピコリルアミン１０ｍｇを５％のトリエチルアミンを含むＤＭＳＯ溶液に２００ｍＭになるように溶解し誘導体化試薬溶液とした。
縮合剤溶液の調製
４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルフォリニウム塩酸塩を５０ｍＭになるようにＤＭＳＯに溶解し縮合剤溶液とした。
内標準溶液の調製
各有機酸の安定同位体標識化合物の濃度が１００μＭになるように蒸留水に溶解し、内標準原液とした。各内標準原液を等量分取し、最終濃度が１０μＭになるように蒸留水を加え、内標準溶液とした。
試料溶液の誘導体化反応
反応バイアルに試料溶液１００μＬを入れ、内標準溶液１０μＬを加え、よく撹拌した後、ロータリーエバポレターで減圧乾固した。減圧乾固した試料に１０μＬの５０％アセトニトリル溶液と１５μＬの誘導体化試薬溶液及び３０μＬの縮合剤溶液を加え、溶解した後、８０℃で６０分加熱し誘導体化を行った。反応溶液３０μＬをバイアルに分取し、５０ｍＭギ酸アンモニウム水溶液１２０μＬを加え、希釈した溶液を分析試料とした。
誘導体化反応溶液の分析
移動相としてＡ液にｐＨ６に調整した２５ｍＭギ酸アンモニウム水溶液、Ｂ液にアセトニトリル、固定相にＣ８カラムを使用し、分析試料をＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムに導入し、各有機酸に対応した質量数で検出した。
分析装置
分析装置は、ＡＰＩ４０００ ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム（ＡＢ ＳＣＩＥＸ製）を用いた。
結果を図３に示す。ΔＧｌｎ培地中で培養した細胞の細胞内のTCAサイクルに関連する有機酸含有量が変化しており、ピルビン酸に関して有意な上昇が観察された。またαケトグルタル酸、クエン酸、イソクエン酸、フマル酸、リンゴ酸に関して有意な減少が観察された。

実施例６：Ｌ−グルタミン除去培地培養細胞の細胞死の有無の検証
実施例１に記載の神経幹細胞培養方法に従って、対照培地（Ｆｕｌｌ培地）又はＬ−グルタミン不含培地（ΔＧｌｎ培地）中で、神経幹細胞を４日間培養した。培養した細胞を、４％パラホルムアルデヒドりん酸緩衝液によって室温で２０分間固定した。固定した細胞はＰＢＳで洗浄した後、ａｐｏｐｔｏｓｉｓマーカーであるｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ−３に対する抗体及び核染色剤であるＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて免疫染色を行った。結果を図４に示す。
Ｌ−グルタミン不含培地中で培養した神経幹細胞（ΔＧｌｎ）、及びＬ−グルタミン含有培地中で培養した神経幹細胞（Ｃｏｎｔｒｏｌ）のいずれにおいても、アポトーシスはほとんど観察されなかった。培地中のＬ−グルタミンの有無に関わらずアポトーシスはほとんど起こっていなかった。従って、Ｌ−グルタミン不含培地において、感受性の高い一部の細胞の細胞死が起こっているわけではないことが示された。

実施例７：各非必須アミノ酸除去培地による神経分化促進効果の検証
実施例１に記載のＦｕｌｌ培地から、各必須アミノ酸（グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、グリシン、セリン又はプロリン）を除いた組成の培地を作製した。実施例１と同様に、ｉＰＳ細胞より神経幹細胞を誘導し、各非必須アミノ酸除去培地又はＦｕｌｌ培地中で８−１２日間培養を行った。
培養後、培地の代わりにＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃、１分間インキュベートして細胞分散処理を行った。ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを培地で希釈後、ピペッティングを行い、ポリＬオルニチン／フィブロネクチンでコートした４８ウェルプレートに１．５ｘ１０^５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した。ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に１ｘＮ２サプリメント（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１ｘＢ２７サプリメント（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加した培地中で２０日間培養した。細胞の培養は、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下のインキュベーター内で行った。培地交換は２日に一度行った。
培養後の細胞を固定し、神経細胞マーカーであるβＩＩＩチューブリンに対する抗体を用いた蛍光抗体法により免疫染色を行った。βＩＩＩチューブリン陽性細胞の神経突起長を画像解析により定量した結果を表１に示す。表１中の記号はコントロール（Ｆｕｌｌ）を1としたときの相対的な平均神経突起長を、＋＋：＞１．５、＋：１．５〜０．３、−：０．３＞として示した。グルタミンを含まない培地、アスパラギン酸を含まない培地、及びアスパラギンを含まない培地は、神経幹細胞の神経分化能を亢進させる作用を示した。

本発明によれば、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の神経分化能を亢進させることが可能となり、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞培養にかかる人的コスト及び金銭的コストを削減することができる。

本出願は、日本で出願された特願２０１６−０７１９６７（出願日：２０１６年３月３１日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (8)

1. Ｌ−トリプトファン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ヒスチジン、及びホロトランスフェリンを含み、
   Ｌ−グルタミン及びＬ−グルタミン代替用ジペプチドを含まない、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞培養用培地。
2. 神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の神経分化能を亢進するための培地である、請求項１に記載の培地。
3. 無血清培地である、請求項１又は２に記載の培地。
4. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の培地中で、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を培養することを含む、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の培養方法。
5. 神経分化能が亢進した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を製造するための方法である、請求項４記載の方法。
6. 培養期間が４日以上である、請求項４又は５記載の方法。
7. 以下の工程を含む神経細胞の作製方法：
   （Ｉ）請求項１〜３のいずれか一項に記載の培地中で神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を培養し、神経分化能が亢進した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を得ること；
   （ＩＩ）工程（Ｉ）で得た神経分化能が亢進した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を、神経細胞分化誘導条件下で培養し、神経細胞集団を得ること。
8. 神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞、及び請求項１〜３のいずれか一項に記載の培地を含んでなる、培養調製物。

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