CN104031882A - 人神经干细胞体外定向诱导分化为多巴胺能神经元的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出一种将人神经干细胞体外定向诱导分化为多巴胺能神经元的方法，该方法包括：人神经干细胞的贴壁培养；多巴胺能神经元前体细胞的诱导；多巴胺能神经元的定向诱导；人神经干细胞和多巴胺能神经元前体细胞的冻存和复苏。通过本发明的步骤，可以在体外获得丰富的多巴胺能神经元，与目前众多多巴胺能神经元生产方式相比，具有成本低廉、安全性高、生产效率高、可操作性强的特点。这一体外多巴胺能神经元生产方式，为多巴胺能神经元临床移植治疗帕金森氏症的应用提供新的思路。

Description

人神经干细胞体外定向诱导分化为多巴胺能神经元的方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种利用无血清培养基贴壁培养神经干细胞并定向诱导分化成多巴胺能神经元的方法。

背景技术

众所周知，造成帕金森症的主要原因是中脑黑质及纹状体中多巴胺能神经元的退行性减少导致的多巴胺神经递质的减少。现行的治疗方法主要是外源性的补充多巴胺前体物质(如L-dopa)以及应用某些多巴胺受体激动剂或类似的一些药物。此类方法的治疗结果并不稳定，容易导致严重的后遗症，并不能从根本上解决问题。治疗帕金森症最理想的方式应该是刺激中脑黑质及纹状体内源性的多巴胺能神经元生成或者是外源性的多巴胺能神经元细胞替代整合至病灶并发挥功能，终止其神经退行性病变甚至修复其受损部位，恢复其功能。

鉴于成人脑部神经干细胞数目有限，并且病灶部位组织受损，刺激其生成新的神经元难度巨大；而外源性的细胞可以通过体外扩增的方式进行大量增殖、分化，利用精确的定位手术进行移植，并且由于中枢神经系统特有的血脑屏障的存在，神经干细胞与多巴胺能神经元的移植几乎不会引起任何的免疫排斥反应。因此，细胞替代治疗为帕金森症患者的治疗提供了一种新的途径，并极有希望在接下来的几十年内替代现有的药物治疗成为帕金森治疗最有效的治疗方式。

通过不断的技术改进，现阶段人们已经能够便捷地获得数量丰富的用于临床试验的神经干细胞，但是却缺乏有效的方法将神经干细胞高效地诱导成多巴胺能神经元细胞用于临床细胞移植治疗帕金森症。Néstor F.Díaz等用鼠胚胎干细胞生产多巴胺能神经元，免疫组化染色分析显示，有94％胚胎干细胞分化成多巴胺能神经元前体细胞，神经元细胞中有26％为多巴胺能神经元细胞。Michela Deleidi等用鼠神经干细胞诱导分化多巴胺能神经元细胞，免疫组化分析显示，未处理的神经干细胞分化为多巴胺能神经元的分化率为40.5±0.5％，而用VPA处理神经干细胞后，其分化率高达62.5±4％。目前国外还没有直接将人神经干细胞诱导分化为多巴胺能神经元的相关报导。国内谢佐平、罗小丹等用鼠神经干细胞诱导分化为多巴胺能神经元细胞，其分化率分别为40％、50.97％。吴卫江等、王莎莉等用人神经干细胞诱导分化为多巴胺能神经元细胞，其分化率分别为14.73％、15.2％。Xuan Wang等使用forsklin和FGF8来诱导人胎脑神经前体细胞分化为多巴胺能神经元，结果显示分化率显著增高，但由于培养基中使用了胎牛血清(BSA)，而无法用于临床。使用本发明的方法，人神经干细胞诱导分化为多巴胺能神经元细胞的分化率高达70％，解决了帕金森症临床治疗上多巴胺能神经元来源的问题，为其治疗提供了新的途径。

发明内容

本发明提供了一种利用无血清培养基贴壁培养神经干细胞并使其定向诱导分化成多巴胺能神经元的方法，该方法同时解决了目前多巴胺能神经元诱导效率偏低、诱导过程使用血清影响临床使用等问题。

本发明利用无血清培养基贴壁培养神经干细胞并使其定向诱导分化成多巴胺能神经元的方法通过以下方式进行实施：

本发明的一种将人神经干细胞体外定向诱导分化为多巴胺能神经元的方法，其包括如下步骤：

步骤1：人神经干细胞的贴壁培养：用无血清培养基将人神经干细胞按照5×10⁴/mL的浓度制成细胞悬液，接种至层粘连蛋白(Laminin，LN，购于Lifetechnologies公司)包被的培养器皿中，35℃培养箱中静置培养24-48小时；

步骤2：多巴胺能神经元前体细胞的诱导：换用多巴胺能神经元前体细胞诱导液，此诱导液由无血清培养基添加细胞因子SHH、FGF8b、CHIR99021组成，35℃培养箱中静置培养7-10天，每3天换液；

步骤3：多巴胺能神经元细胞的定向诱导：换用多巴胺能神经元细胞定向诱导液，此诱导液由神经细胞培养基Neurobasal Medium添加B27、BDNF、GDNF、TGFβ3、ascorbic acid、cAMP、forskolin组成；35℃培养箱中静置培养14-20天，每3天换液；收获细胞后即得到多巴胺能神经元。

上述步骤1、2中细胞的无血清培养基的配方可以为DMEM/F12、B27(1∶50，即产品说明书建议比例)、N2(1∶50，即产品说明书建议比例)、bFGF(basic Fibroblast Growth Factor，碱性成纤维因子，20ng/mL，购于Lifetechnologies)与EGF(Epidermal Growth Factor，表皮生长因子，20ng/mL，购于Lifetechnologies)。

本发明的技术方案中所使用的DMEM/F12培养液、Neurobasal Medium、B27添加剂和N2添加剂都是培养神经干细胞的常用公知的培养基和添加剂，均可购自Lifetechnologies公司，在使用中按照产品说明书所建议的浓度比例添加配制即可，它们也可以从其它商业渠道购买得到。

其中DMEM/F12培养液包含无水氯化钙116.6mg/L、L-亮氨酸59.05mg/L、亚油酸0.042mg/L、五水硫酸铜0.0013mg/L、L-赖氨酸盐酸盐91.25mg/L、硫辛酸0.105mg/L、九水硝酸铁0.05mg/L、L-蛋氨酸17.24mg/L、酚红8.1mg/L、七水硫酸亚铁0.417mg/L、L-苯丙氨酸35.48mg/L、1，4-丁二胺二盐酸盐0.081mg/L、氯化钾311.8mg/L、L-丝氨酸26.25mg/L、丙酮酸钠55mg/L、氯化镁28.64mg/L、L-苏氨酸53.45mg/L、维生素H0.0035mg/L、无水硫酸镁48.84mg/L、L-丙氨酸4.45mg/L、D-泛酸钙2.24mg/L、氯化钠6999.5mg/L、L-天门冬酰胺7.5mg/L、氯化胆碱8.98mg/L、无水磷酸二氢钠54.35mg/L、L-天门冬氨酸6.65mg/L、叶酸2.65mg/L、磷酸氢二钠71.02mg/L、L-半胱氨酸盐酸盐17.56mg/L、i-肌醇12.6mg/L、七水硫酸锌0.432mg/L、L-谷氨酸7.35mg/L、烟酰胺2.02mg/L、L-精氨酸盐酸盐147.5mg/L、L-脯氨酸17.25mg/L、盐酸吡哆醛2mg/L、L-胱氨酸盐酸盐31.29mg/L、L-色氨酸9.02mg/L、盐酸吡哆醇0.031mg/L、L-谷氨酰胺365mg/L、L-酪氨酸38.4mg/L、核黄素0.219mg/L、甘氨酸18.75mg/L、L-缬氨酸52.85mg/L、盐酸硫胺2.17mg/L、L-组氨酸盐酸盐31.48mg/L、D-葡萄糖3151mg/L、胸苷0.365mg/L、L-异亮氨酸54.47mg/L、次黄嘌呤2mg/L、维生素B120.68mg/L。

Neurobasal Medium的配方为甘氨酸30.0mg/L、L-丙氨酸2.0mg/L、L-精氨酸盐酸盐84.0mg/L、一水L-天冬酰胺0.83mg/L、L-半胱氨酸31.5mg/L、一水L-组氨酸盐酸盐42.0mg/L、L-异亮氨酸105.0mg/L、L-亮氨酸105.0mg/L、L-赖氨酸盐酸盐146.0mg/L、L-蛋氨酸30.0mg/L、L-苯丙氨酸66.0mg/L、L-脯氨酸7.76mg/L、L-丝氨酸42.0mg/L、L-苏氨酸95.0mg/L、L-色氨酸16.0mg/L、L-酪氨酸72.0mg/L、L-缬氨酸94.0mg/L、氯化胆碱4.0mg/L、D-泛酸钙4.0mg/L、叶酸4.0mg/L、烟酰胺4.0mg/L、盐酸吡哆醇4.0mg/L、核黄素0.4mg/L、盐酸硫胺4.0mg/L、维生素B120.0068mg/L、i-肌醇7.2mg/L、无水氯化钙200.0mg/L、硝酸铁0.1mg/L、无水氯化镁77.3mg/L、氯化钾400.0mg/L、碳酸氢钠2.2g/L、氯化钠4.0g/L、磷酸二氢钠125.0mg/L、硫酸锌0.194mg/L、D-葡萄糖4.5g/L、HEPES2.6g/L、丙酮酸钠25.0mg/L。

前述步骤2中多巴胺能神经元前体细胞诱导液中，SHH(sonic hedgehog，音猬因子，购于R&D system公司)的终浓度为100-300ng/mL、优选120-280ng/mL，最优选150-250ng/mL；FGF8b(fibroblast growth factor8b，成纤维细胞生长因子8b，购于Lifetechnologies公司)的终浓度为50-200ng/mL、优选60-180ng/mL，最优选80-150ng/mL；；CHIR99021(C₂₂H₁₈Cl₂N₈，一种糖原合成酶激酶-3(GSK-3)抑制剂，购于Millipore公司)的浓度为0.1-1μM、优选0.2-0.9μM，最优选0.3-0.8μM。

前述步骤3中多巴胺能神经元细胞定向诱导液中，BDNF(brain derived neurophicfactor，脑源性神经营养因子，购于Lifetechnologies公司)与GDNF(Glial cellline-derived neurotrophic factor，胶质细胞源性神经营养因子，购于Lifetechnologies公司)的终浓度均为20ng/mL；TGFβ3(transforming growth factor-β3，转化生长因子-β3，购于Lifetechnologies)的浓度为1-20ng/mL、优选2-18ng/mL，最优选5-15ng/mL；ascorbic acid(抗坏血酸，购于Sigma)的终浓度为20-200μM、优选40-180μM，最优选50-150μM；cAMP(Cyclic adenosine monophosphate，环腺苷酸，购于Sigma公司)的终浓度为0.05-0.5mM、优选0.08-0.4mM，最优选0.1-0.3mM；forskolin(C₂₂H₃₄O₇，佛司可林，购于sigma公司)的终浓度为10-50nM、优选15-45nM，最优选20-40nM。

按照本发明提供的方法，可以在体外对人神经干细胞进行大量扩增并将其定向诱导生成多巴胺能神经元。与其他多巴胺能神经元诱导分化方法进行比较：(1)采用本发明的方法，人神经干细胞分化为多巴胺能神经元的分化率高达70％(71.67±2.31％)，可以为帕金森氏症的细胞疗法提供丰富的多巴胺能神经元；(2)本发明中所采用的培养基为DMEM/F12和Neuralbasal，均为无血清培养基且无需任何滋养层细胞，可以避免动物源性及其他细胞系的交叉污染，提高临床应用时的安全性；(3)与从胚胎干细胞逐步向神经细胞方向诱导的技术方案相比，本发明使用直接从个体组织中提取的神经干细胞，相对更容易获取，致瘤性低，临床上可使用从异体神经干细胞制备的多巴胺能神经元进行细胞移植，而不可用从异体胚胎干细胞制备的多巴胺能神经元进行细胞移植；(4)本发明采用直接从供体组织中提取的人神经干细胞诱导分化成多巴胺能神经元细胞，省去了从人胚胎干细胞诱导分化成人神经干细胞的过程，简化了多巴胺能神经元细胞生产流程，减少了生产过程中细胞污染的概率，提高了生产效率；(5)本发明中的细胞在步骤1与步骤2进行完毕后，细胞均可以消化收获并冻存，待需要的时候再复苏并进行后续的培养与分化，提升了实验的可操作性，本实验中，细胞复苏率可达92％。

附图说明

附图1：(1-a)为人神经干细胞贴壁培养第1天；(1-b)为诱导7天后的多巴胺能神经元前体细胞；(1-c)为分化第21天的多巴胺能神经元细胞。

附图2：(2-a)为TH抗体染色的多巴胺能神经元细胞；(2-b)为β-tubulin抗体染色的神经元细胞；(2-c)为(2-a)与(2-b)两图的重叠，显示分化获得的多巴胺能神经元占全部神经元的比例。

具体实施方式

实施例1：人神经干细胞的贴壁培养：

用DPBS(Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline，杜氏磷酸缓冲液)将层粘连蛋白(Laminin，LN，购于Lifetechnologies公司)稀释为10μg/mL；取细胞培养用六孔板，用Laminin溶液进行包被，37℃作用2小时，然后将六孔板用DPBS洗涤一次，室温保存备用；取新鲜传代至P5-P8代的人神经干细胞，细胞计数后，用无血清培养基按照5×10⁴/mL制成细胞悬液，均匀接种至上述准备好的培养板中，35℃，5％CO₂培养箱中静置培养24小时。

上述无血清培养基包含DMEM/F12、B27(1∶50)、N2(1∶50)、bFGF(basic Fibroblast GrowthFactor，碱性成纤维因子，20ng/mL，购于Lifetechnologies公司)与EGF((Epidermal GrowthFactor，表皮生长因子，20ng/mL，购于Lifetechnologies公司)。上述DMEM/F12培养液、B27添加剂和N2添加剂是培养神经干细胞的常用公知添加剂，购自Lifetechnologies公司，它们也可以从其它商业渠道购买得到。

实施例2：多巴胺能神经元前体细胞的诱导：

换用多巴胺能神经元前体细胞诱导液，并去除未贴壁细胞和死细胞；35℃，5％CO₂培养箱中静置培养7天，每3天进行换液；待细胞生长至60-70％时即可以进行多巴胺能神经元的定向诱导。

上述多巴胺能神经元前体细胞诱导液配方如下：

实施例3：多巴胺能神经元前体细胞的冻存与复苏：

细胞冻存步骤：将培养板中的多巴胺能神经元前体细胞用不含Ca、Mg的DPBS洗涤一次，然后加入0.05％的胰酶细胞消化液(trypsin-EDTA)并置于37℃培养箱中消化2分钟，消化完毕加入胰蛋白酶抑制剂(trypsin inhibitor)进行终止消化，然后轻柔的吹打将细胞制成细胞悬液收集至50ml离心管中，400g离心5min，加入20ml DMEM/F12洗涤一次，400g离心5min，然后用冻存液重悬，使其终浓度为1×10⁶/ml。用2ml冻存管进行分装，每管1ml，放置于程序冻存盒中，置于-80℃冰箱过夜，第二天取出置于液氮罐中进行储存。

细胞复苏步骤：取5管液氮中冻存的细胞，放入装有液氮的保温瓶中转移至细胞培养间，然后用止血钳夹住冻存管，迅速浸入37℃水浴锅中，不时摇动2分钟至管中剩余些许冰晶为止，将冻存管拿入生物安全柜中，用酒精棉球擦拭管口消毒，吸出冻存管中的细胞悬液加入预热的复苏液中，再用移液枪取1ml复苏液洗涤冻存管，重复2次，400g离心5min，吸弃上清，加入20ml DMEM/F12洗涤一次，400g离心5min，1ml DMEM/F12重悬细胞，取10ul进行计数，计数3次得到其细胞数均值为4.6×10⁶。然后用多巴胺能神经元细胞定向诱导液进行重悬，终浓度为1×10⁵/ml，并接种至Laminin包被好的培养容器中进行诱导。

实施例4：多巴胺能神经元细胞的定向诱导：

换用多巴胺能神经元细胞定向诱导液，并去除未贴壁细胞和死细胞；35℃，5％CO₂培养箱中静置培养14天，每3天进行换液；即可获得多巴胺能神经元。

上述多巴胺能神经元细胞定向诱导液包含如下成分：

实施例：5：多巴胺能神经元的染色鉴定：

将收获的细胞用4％多聚甲醛进行固定，采用β微管蛋白III(β-Tubulin III，购于sigma公司，终浓度为1∶400)以及酪氨酸羟化酶抗体(TH抗体，购于abcam公司，终浓度为1∶400)进行双染，分别标记其对应的神经元和多巴胺能神经元细胞，然后分别使用二抗488、546(购于Lifetechnologies公司，终浓度为1∶1000)进行染色，在倒置荧光显微镜下随机选择至少6个视野进行拍照并计数分析，计算人神经干细胞分化后多巴胺能神经元细胞所占的比例，该实验中此比例为71.67±2.31％，该实验中视野采用的倍数为20倍。

Claims (7)

1.一种将人神经干细胞体外定向诱导分化为多巴胺能神经元的方法，其包括如下步骤：

步骤1：人神经干细胞的贴壁培养：用无血清培养基将人神经干细胞按照5×10⁴/mL的浓度制成细胞悬液，接种至层粘连蛋白(Laminin)包被的培养器皿中，35℃培养箱中静置培养24-48小时；

步骤2：多巴胺能神经元前体细胞的诱导：换用多巴胺能神经元前体细胞诱导液，此诱导液由无血清培养基添加细胞因子音猥因子(SHH)、成纤维细胞生长因子8b(FGF8b)、糖原合成酶激酶-3(GSK-3)抑制剂CHIR99021组成，35℃培养箱中静置培养7-10天，每3天换液；

步骤3：多巴胺能神经元细胞的定向诱导：换用多巴胺能神经元细胞定向诱导液，此诱导液由神经细胞培养基(Neurobasal Medium)添加B27、脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、转化生长因子-β3(TGFβ3)、抗坏血酸(ascorbic acid)、环腺苷酸(cAMP)、佛司可林(forskolin)组成；35℃培养箱中静置培养14-20天，每3天换液；收获细胞后即得到多巴胺能神经元。

2.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1中细胞的无血清培养基为DMEM/F12、B27(1∶50)、N2(1∶50)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，20ng/mL)与表皮生长因子(EGF，20ng/mL)。

3.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2中多巴胺能神经元前体细胞诱导液配方如下：

4.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3中多巴胺能神经元细胞定向诱导液配方如下：

5.如权利要求1所述的步骤，其特征在于，还可在步骤1和步骤2进行完毕后添加一个细胞冻存步骤，待需要的时候再进行复苏并进行后续的培养和分化。

6.一种多巴胺能神经元前体细胞诱导液，其配方如下：

7.一种多巴胺能神经元细胞定向诱导液，其配方如下：