KR20200133367A

KR20200133367A - 다분화능성 줄기세포 분화 촉진제

Info

Publication number: KR20200133367A
Application number: KR1020207029989A
Authority: KR
Inventors: 히데노리 마쓰오; 아유미 가; 무네히로 야마다; 요시야 토미노리
Original assignee: 오리엔탈고우보고오교가부시끼가이샤
Priority date: 2018-03-22
Filing date: 2019-03-20
Publication date: 2020-11-27
Also published as: WO2019182044A1; EP3770250A4; EP3770250A1; US11814652B2; CN112105718A; JPWO2019182044A1; JP7287948B2; US20210024897A1

Abstract

본 발명은, 다분화능성 줄기세포로부터 분화 세포를 효율적으로 얻기 위한 소재를 제공하는 것을 과제로 한다. 즉, 본 발명은, β-니코틴아미드 모노뉴클레오티드 또는 이의 약리학적으로 허용되는 염, 및, 이들의 용매화물을 유효 성분으로 하는 것을 특징으로 한다, 다분화능성 줄기세포 분화 촉진제 및 다분화능성 줄기세포를, β-니코틴아미드 모노뉴클레오티드 또는 이의 약리학적으로 허용되는 염, 및, 이들의 용매화물을 함유하는 배양배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는, 다분화능성 줄기세포의 분화 방법이다.

Description

다분화능성 줄기세포 분화 촉진제

본 발명은, 다분화능성 줄기세포의 분화를 촉진시키는 소재, 및, 그 소재를 사용한 다분화능성 줄기세포를 분화시키는 방법에 관한 것이다.

본원은 2018년 3월 22일에 출원된 일본 특허출원 2018-055186호에 기초해 우선권을 주장하고, 그 내용을 여기에 원용한다.

다분화능성 줄기세포란, 자기 복제능을 갖는 미분화(未分化) 세포로서, 여러 가지 세포로 분화 가능한 세포이다. 최근, 환자의 손상된 조직에 다분화능성 줄기세포 또는 다분화능성 줄기세포로부터 분화 유도시킨 세포를 이식해, 그 기능의 재생을 도모하는 재생 의료가 활발히 연구되고 있다. 재생 의료에서는, 다분화능성 줄기세포 또는 그 분화 세포를 대량으로 준비할 필요가 있기 때문에, 다분화능성 줄기세포를 효율적으로 증식시키는 방법 또는 다분화능성 줄기세포를 효율적으로 분화시키는 방법의 개발이 활발하다.

다분화능성 줄기세포의 분화를 촉진하는 방법으로는, 예를 들면 인간 줄기세포를 TGF-β 슈퍼패밀리(분화 유도 인자)를 함유하는 분화 유도용 배양배지에서 배양하기 전에 미리 니코틴아미드(NAM)로 배양함으로써, 인간 줄기세포의 망막 색소 상피 세포로의 분화를 촉진할 수 있다는 것이 보고되어 있다(예를 들면, 특허 문헌 1 참조). 또한, 다분화능성 줄기세포의 배양 방법으로는, 예를 들면 간엽계 줄기세포를 니코틴아미드(NAM)와 섬유아세포 성장 인자 4(FGF4)를 함유하는 배지내에서 배양함으로써, 간엽계 줄기세포를 효율적으로 증식시키는 것이 보고되어 있다(예를 들면, 특허 문헌 2 참조). 유도만능 줄기세포(iPS 세포)를 NAM 존재하에서 배양하면, NAM이 시르투인(Sirtuin) 또는 PARP의 기능을 억제함으로써, 배아 줄기세포(ES 세포)와 유전자 발현 패턴이 꽤 유사한 iPS 세포를 효율적으로 제조할 수 있다는 것이 보고되어 있다(예를 들면, 특허 문헌 3 참조). 이들 방법에 의해 효율적으로 조제된 다분화능성 줄기세포를 분화 유도용 배양배지에서 배양함으로써, 효율적으로 분화 세포를 얻을 수 있다. 그 외에, NAM이 다능성 줄기세포의 다능성의 결실이나 재프로그래밍의 장애를 해소하는 것도 보고되어 있다(예를 들면, 비특허 문헌 1 참조).

한편, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드(NMN)는, 조효소 NAD⁺의 생합성 중간 대사 산물이다. 최근, NMN은, 노화 마우스에서의 인슐린 분비능의 개선 효과, 고지방식이나 노화에 의해 발현되는 2형 당뇨병의 마우스 모델에서 인슐린 감수성이나 분비를 극적으로 개선하는 효과를 갖는 것(예를 들면, 특허 문헌 4 참조), 노화 근육의 미토콘드리아 기능을 현저히 높이는 효과를 갖는 것 등이 보고되고 있다. 또한, NMN의 투여에 의해, 비만, 혈중 지질 농도의 상승, 인슐린 감수성의 저하, 기억력 저하, 및 황반변성증 등의 눈기능 열화와 같은 연령 증가에 수반하는 각종 질환의 증상 개선이나 예방에 유용한 것도 보고되어 있다(예를 들면, 특허 문헌 5 참조).

특허 문헌 1: 일본 특허공표 2010-524457호 공보 특허 문헌 2: 일본 특허공표 2015-507921호 공보 특허 문헌 3: 국제 공개 제2011/102333호 특허 문헌 4: 미국 특허 제7737158호 명세서 특허 문헌 5: 국제 공개 제2014/146044호

비특허 문헌 1: Son, et al., STEM CELLS, 2013, vol. 31, p.1121-1135.

본 발명은, 다분화능성 줄기세포로부터 분화 세포를 효율적으로 얻기 위한 소재, 및, 그 소재를 사용해 다분화능성 줄기세포의 분화를 촉진시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구한 결과, β-니코틴아미드 모노뉴클레오티드(β-NMN)의 존재하에서, 다분화능성 줄기세포를 분화시킴으로써 보다 많은 분화 세포가 얻어지는 것을 알아내 본 발명의 완성에 이르렀다.

즉, 본 발명은, 이하의 다분화능성 줄기세포 분화 촉진제, 다분화능성 줄기세포를 분화시키는 방법, 및 다분화능성 줄기세포의 분화를 촉진하는 방법을 제공하는 것이다.

[1] β-니코틴아미드 모노뉴클레오티드 또는 이의 약리학적으로 허용되는 염, 및, 이들의 용매화물을 유효 성분으로 하는 것을 특징으로 하는, 다분화능성 줄기세포 분화 촉진제.

[2] 다분화능성 줄기세포의 배양배지에, β-니코틴아미드 모노뉴클레오티드 환산으로 0.01∼10 mM 첨가되는, 상기 [1]의 다분화능성 줄기세포 분화 촉진제.

[3] 배아 줄기세포, 유도만능 줄기세포, 간엽계 줄기세포, 조혈 줄기세포, 신경 줄기세포 및 피부 줄기세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 다분화능성 줄기세포로부터 분화 세포를 얻기 위해 이용되는, 상기 [1] 또는 [2]의 다분화능성 줄기세포 분화 촉진제.

[4] 다분화능성 줄기세포를 β-니코틴아미드 모노뉴클레오티드 또는 이의 약리학적으로 허용되는 염, 및, 이들의 용매화물을 함유하는 배양배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는, 다분화능성 줄기세포를 분화시키는 방법.

[5] 상기 배양배지의 β-니코틴아미드 모노뉴클레오티드 농도가 0.01∼10 mM인, 상기 [4]의 방법.

[6] 상기 배양배지가, 다분화능성 줄기세포를 분화시키는 1종 이상의 분화 유도 인자를 함유하는 분화 유도용 배양배지인, 상기 [4] 또는 [5]의 방법.

[7] 상기 분화 유도용 배양배지가, 다능성 줄기세포를 내배엽, 중배엽 또는 외배엽의 어느 하나로 분화 유도하기 위한 배양배지인, 상기 [6]의 방법.

[8] 상기 다분화능성 줄기세포를, β-니코틴아미드 모노뉴클레오티드 또는 이의 약리학적으로 허용되는 염, 및, 이들의 용매화물을 함유하는 다분화능성을 유지하는 배양배지에서 배양한 후, 1종 이상의 분화 유도 인자를 함유하는 분화 유도용 배양배지에서 배양하는, 상기 [4] 또는 [5]의 방법.

[9] 상기 다분화능성 줄기세포가, 배아 줄기세포, 유도만능 줄기세포, 간엽계 줄기세포, 조혈 줄기세포, 신경 줄기세포 및 피부 줄기세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인, 상기 [4]∼[8] 중 어느 하나의 방법.

[10] 다분화능성 줄기세포를, β-니코틴아미드 모노뉴클레오티드 또는 이의 약리학적으로 허용되는 염, 및, 이들의 용매화물을 함유하는 배양배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는, 다분화능성 줄기세포의 분화를 촉진하는 방법.

본 발명에 따른 다분화능성 줄기세포 분화 촉진제는, iPS 세포, ES 세포 등의 다분화능성 줄기세포에 작용함으로써, 다분화능성 줄기세포로부터 분화 세포로의 분화를 촉진시킬 수 있다. 이 때문에, 다분화능성 줄기세포를, 당해 다분화능성 줄기세포 분화 촉진제를 함유시킨 배양배지에서 배양함으로써, 보다 많은 분화 세포를 효율적으로 조제할 수 있다.

도 1은, 실시예 1에 있어서, β-NMN을 첨가한 분화 유도용 배양배지내에서 배양한 iPS 세포의 각 마커의 발현량을 RT-PCR로 조사한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2의 (A)는 실시예 2에서 β-NMN을 첨가한 외배엽 분화 유도용 배양배지내에서 배양한 iPS 세포의 세포수의 경시적 변화를 나타낸 도면이고, (B)는 실시예 2에서 β-NMN을 첨가한 외배엽 분화 유도용 배양배지내에서 배양한 iPS 세포의 파종 후 7일째의 세포수를 나타낸 도면이다.
도 3은, 실시예 2에 있어서, β-NMN을 첨가한 외배엽 분화 유도용 배양배지내에서 배양한 iPS 세포를 네스틴(Nestin)과 Pax6의 발현량으로 분획한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는, 실시예 3에 있어서, β-NMN을 첨가한 중배엽 분화 유도용 배양배지내에서 배양한 iPS 세포의 파종 후 7일째의 세포수를 나타낸 도면이다.
도 5는, 실시예 3에 있어서, β-NMN을 첨가한 중배엽 분화 유도용 배양배지내에서 배양한 iPS 세포를 Brachyury와 CD56의 발현량으로 분획한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은, 실시예 4에 있어서, β-NMN을 첨가한 내배엽 분화 유도용 배양배지내에서 배양한 iPS 세포의 파종 후 7일째의 세포수를 나타낸 도면이다.
도 7은, 실시예 4에 있어서, β-NMN을 첨가한 내배엽 분화 유도용 배양배지내에서 배양한 iPS 세포를 Sox17과 CXCR4의 발현량으로 분획한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은, 실시예 5에 있어서, β-NMN을 첨가한 iPS 세포용 배양배지내에서 배양한 후, 내배엽 분화 유도된 iPS 세포의 파종 후 7일째의 세포수를 나타낸 도면이다.
도 9는, 실시예 5에 있어서, β-NMN을 첨가한 iPS 세포용 배양배지내에서 배양한 후, 내배엽 분화 유도된 iPS 세포를 Sox17의 발현량으로 분획한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10은, 실시예 6에 있어서, β-NMN을 첨가한 iPS 세포용 배양배지내에서 배양한 후, 중배엽 분화 유도된 iPS 세포의 파종 후 7일째의 세포수를 나타낸 도면이다.
도 11은, 실시예 6에 있어서, β-NMN을 첨가한 iPS 세포용 배양배지내에서 배양한 후, 중배엽 분화 유도된 iPS 세포를 Brachyury와 CD56의 발현량으로 분획한 결과를 나타낸 도면이다.
도 12의 (A)는 실시예 7에서 β-NMN을 첨가한 iPS 세포용 배양배지내에서 배양한 후, 외배엽 분화 유도된 iPS 세포의 세포수의 경시적 변화를 나타낸 도면이고, (B)는 실시예 7에서 β-NMN을 첨가한 iPS 세포용 배양배지내에서 배양한 후, 외배엽 분화 유도된 iPS 세포의 파종 후 9일째의 세포수를 나타낸 도면이다.
도 13은, 실시예 7에 있어서, β-NMN을 첨가한 iPS 세포용 배양배지내에서 배양한 후, 외배엽 분화 유도된 iPS 세포를 네스틴(Nestin)과 Pax6의 발현량으로 분획한 결과를 나타낸 도면이다.
도 14는, 실시예 8에 있어서, β-NMN을 첨가한 증식용 배양배지내에서 배양한 간엽계 줄기세포를 골분화 유도해 얻어진 분화 세포에 대한 알리자린 S 염색 화상이다.
도 15는, 실시예 9에 있어서, β-NMN을 첨가한 증식용 배양배지내에서 배양한 간엽계 줄기세포를 지방 분화 유도해 얻어진 분화 세포에 대한 오일 레드 O 염색 화상이다.
도 16은, 실시예 9에 있어서, β-NMN을 첨가한 증식용 배양배지내에서 배양한 간엽계 줄기세포를 지방 분화 유도해 얻어진 분화 세포에 대한, PPAR-γ 유전자의 상대 발현량 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 17은, 실시예 9에 있어서, β-NMN을 첨가한 증식용 배양배지내에서 배양한 간엽계 줄기세포를 지방 분화 유도해 얻어진 분화 세포에 대한, 아디포넥틴(Adiponectin) 유전자의 상대 발현량 측정 결과를 나타낸 도면이다.

본 발명 및 본원 명세서에 있어서 다분화능성 줄기세포란, 자기 복제능을 갖고 또한 다분화능(다양한 세포종으로 분화 가능한 능력)을 갖는 미분화 세포이며, 예를 들면 ES 세포, iPS 세포 등의 다능성 줄기세포 외에, 간엽계 줄기세포, 조혈 줄기세포, 신경 줄기세포, 피부 줄기세포 등의 체성 줄기세포를 들 수 있다. 바람직하게는 외배엽, 중배엽, 내배엽의 어느 세포로도 분화할 수 있는 다능성 줄기세포이다.

본 발명 및 본원 명세서에 있어서 '다분화능성 줄기세포의 분화를 촉진한다'란, 다분화능성 줄기세포를 분화 유도한 경우에 얻어지는 분화 세포의 양이 많아지는 것을 의미한다. 구체적으로, 다분화능성 줄기세포의 분화 촉진에는, 다분화능성 줄기세포의 분화 효율을 향상시키는 형태, 분화 유도시의 세포 증식을 촉진하는 형태, 및 다분화능성 줄기세포의 분화 효율을 향상시키면서 분화 유도시의 세포 증식을 촉진하는 형태가 있다.

본 발명에 따른 다분화능성 줄기세포 분화 촉진제(이하, '본 발명의 분화 촉진제'라고도 한다.)는, NMN(화학식: C₁₁H₁₅N₂O₈P)을 유효 성분으로 하고, 다분화능성 줄기세포를 분화시킬 때 그 배양배지중에 첨가되는 것이다. NMN은, 다분화능성 줄기세포의 각종 배엽성 세포나 체세포로의 분화 효율을 향상시키거나, 분화한 체세포의 증식성을 높일 수 있다. 이 때문에, NMN 존재하에서 다분화능성 줄기세포를 분화시킴으로써, 다분화능성 줄기세포로부터 분화 세포를 보다 효율적으로 얻을 수 있다.

NMN에는 광학이성체로서 α, β의 2 종류가 존재하는데, 본 발명의 분화 촉진제의 유효 성분이 되는 NMN은 β-NMN(CAS 번호: 1094-61-7)이다. β-NMN의 구조는 다음과 같다.

유효 성분으로 하는 β-NMN으로는 어떤 방법으로 조제된 것이라도 무방하다. 예를 들면, 화학 합성법, 효소법, 발효법 등에 의해, 인공적으로 합성한 β-NMN을 정제한 것을, 유효 성분으로서 이용할 수 있다. 또한, β-NMN은 널리 생체에 존재하는 성분이기 때문에, 동물, 식물, 미생물 등의 천연 원료로부터 추출·정제함으로써 얻어진 β-NMN을 유효 성분으로서 이용할 수도 있다. 또한, 시판되고 있는 정제된 β-NMN을 사용해도 된다.

β-NMN을 합성하는 화학 합성법으로는, 예를 들면 NAM과 L-리보스 테트라아세테이트를 반응시켜 얻어진 니코틴아미드 모노뉴클레오티드를 인산화함으로써 β-NMN을 제조할 수 있다. 또한, 효소법으로는, 예를 들면 NAM과 5'-포스포리보실-1'-피로인산(PRPP)으로부터 니코틴아미드 포스포리보실 트랜스퍼라제(NAMPT)에 의해 β-NMN을 제조할 수 있다. 발효법으로는, 예를 들면 NAMPT를 발현하고 있는 미생물의 대사계를 이용해 NAM로부터 β-NMN을 제조할 수 있다.

본 발명의 분화 촉진제의 유효 성분으로는, β-NMN의 약리학적으로 허용되는 염이라도 된다. β-NMN의 약리학적으로 허용되는 염으로는, 무기산염이어도 되고, 아민과 같은 염기성 부위를 갖는 유기산염이라도 된다. 이와 같은 산염을 구성하는 산으로는, 예를 들면 아세트산, 벤젠술폰산, 벤조산, 캄포술폰산, 시트르산, 에텐술폰산, 푸마르산, 글루콘산, 글루타민산, 브롬화수소산, 염산, 이세티온산, 락트산, 말레산, 말산, 만델산, 메탄술폰산, 점액산(mucic acid), 질산, 팜산(pamoic acid), 판토텐산(pantothenic acid), 인산, 숙신산, 황산, 주석산, p-톨루엔술폰산 등을 들 수 있다. 또한, β-NMN의 약리학적으로 허용되는 염으로는, 알칼리염이라도 되고, 카본산과 같은 산성 부위를 갖는 유기염이라도 된다. 이와 같은 산염을 구성하는 염기로는, 예를 들면 알칼리 금속염 또는 알칼리 토류 금속염이며, 수소화 나트륨, 수산화 칼륨, 수산화 칼슘, 수산화 알루미늄, 수산화 리튬, 수산화 마그네슘, 수산화 아연, 암모니아, 트리메틸 암모니아, 트리에틸 암모니아, 에틸렌 디아민, 리진, 아르기닌, 오르니틴, 콜린, N,N'-디벤질에틸렌 디아민, 클로로프로 카인, 프로카인, 디에탄올 아민, N-벤질페네틸아민(N-benzylphenethylamine), 디에틸 아민, 피페라진, 트리스(히드록시메틸)-아미노메탄, 수산화 테트라메틸 암모늄 등의 염기로부터 유도되는 것을 들 수 있다.

본 발명의 분화 촉진제의 유효 성분은, 프리 β-NMN 또는 β-NMN의 약리학적으로 허용되는 염의 용매화물이라도 된다. 당해 용매화물을 형성하는 용매로는, 물, 에탄올 등을 들 수 있다.

본 발명의 분화 촉진제는, β-NMN에 추가해 그 외의 유효 성분을 함유하고 있어도 된다. β-NMN과 병용하는 그 외의 유효 성분은 1종이라도 되고, 2종 이상의 조합이라도 된다. 당해 다른 유효 성분으로는, 예를 들면 알부민, 아스코르브산, α-토코페롤, 인슐린, 트랜스페린, 아셀렌산나트륨, 에탄올 아민, Rock 저해제 등의 다분화능성 줄기세포의 생존 효율이나 증식 효율을 높이는 것으로 알려져 있는 성분이나, 발프로산, 디메틸술폭시드, 덱사메타손, 부티르산, 트리코스타틴 A, GSK3 저해제, BMP 저해제, Wnt 저해제, 액티빈(activin), 노긴(noggin) 등의 다분화능성 줄기세포의 분화 효율을 높이는 것으로 알려져 있는 성분들 중에서 적절히 선택해 이용할 수 있다.

다분화능성 줄기세포를 분화 유도할 때, 분화 유도용 배양배지에 본 발명의 분화 촉진제를 함유시킴으로써, 다분화능성 줄기세포의 분화를 촉진시킬 수 있다. 또한, 다분화능성 줄기세포를 분화 유도하기 전에 본 발명의 분화 촉진제를 함유하는 미분화 세포용 배양배지에서 배양한 후, 본 발명의 분화 촉진제를 함유하고 있지 않은 분화 유도용 배양배지에서 배양하는 것에 의해서도, 다분화능성 줄기세포의 분화를 촉진시킬 수 있다. 분화 유도전에 본 발명의 분화 촉진제를 함유하는 미분화 세포용 배양배지에서 배양하고, 그 후 본 발명의 분화 촉진제를 함유하는 분화 유도용 배양배지에서 배양해도 된다.

분화 유도용 배양배지 또는 미분화 세포용 배양배지에 본 발명의 분화 촉진제를 함유시키는 양으로는, 당해 분화 촉진제를 함유시키지 않은 배양배지에서 배양한 경우와 비교해 다분화능성 줄기세포를 분화 유도해 얻어진 분화 세포의 양이 많아지게 하기 위해 충분한 농도가 되는 양이라면 특별히 한정되지 않고, 다분화능성 줄기세포의 종류나, 목적하는 분화 세포의 종류, 배양배지에의 첨가 시기, 배양배지의 기타 성분과의 밸런스 등을 고려해 적절하게 조정할 수 있다. 배양배지의 β-NMN 농도가 너무 낮은 경우에는, 다분화능성 줄기세포에 대한 분화 촉진 효과가 낮을 우려가 있다. 배양배지에 β-NMN을 과잉 함유시켰을 경우에는, 오히려 분화 유도나 분화 유도시의 세포 증식이 억제될 가능성이 있다. 배양배지에 함유시키는 본 발명의 분화 촉진제의 양은, β-NMN 농도가 0.01∼10 mM이 되는 양인 것이 바람직하고, 0.05∼5 mM이 되는 양인 것이 보다 바람직하고, 0.1∼1 mM이 되는 양인 것이 더욱 바람직하다. β-NMN 농도가 상기 범위 내인 것에 의해, 다분화능성 줄기세포의 분화를 충분히 촉진할 수 있다.

본 발명에 따른 분화 촉진제의 존재하에서의 다분화능성 줄기세포의 배양은, 분화 유도용 배양배지 또는 미분화 세포용 배양배지에 본 발명의 분화 촉진제를 함유시키는 것 외에는, 통상적인 방법에 의해 실시할 수 있다. 예를 들면, 배양 조건은 일반적으로 동물 세포를 배양하는 배양 조건으로 할 수 있고, 필요에 따라 적절하게 개변해도 된다. 예를 들면, 배양 온도 30∼40℃, CO₂ 농도 1∼10 체적%, O₂ 농도 0.1∼25 체적%로 배양할 수 있다.

또한, 본 발명의 분화 촉진제를 함유시키는 미분화 세포용 배양배지로는, 예를 들면 일반적으로, 다분화능성 줄기세포의 유지 또는 증식을 위해 이용되는 배지나, 동물 세포의 배양에 이용되는 배지를 이용할 수 있다. 또한, 시판중인 각종 다능성 줄기세포를 위한 배양배지를 이용할 수도 있다. 본 발명의 분화 촉진제를 함유시키는 미분화 세포용 배양배지로는, 구체적으로 이글의 최소 필수 배지(Eagle's minimum essential medium; MEM), 둘베코 개변 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium; DMEM), α-이글 최소 필수 배지(α-MEM), Iscove 개변 둘베코 배지(IMDM), F-12 배지, F-10 배지, DMEM/F12 배지, RPMI-1640 배지, 간엽계 세포 기초 배지(MSCBM), E8(Essential 8) 배지, TeSR-E8 배지, mTeSR1 배지 등을 들 수 있다. 이들 배지에, 필요에 따라, 아미노산, 무기 염류, 비타민류, 항생 물질 등을 첨가해도 된다. 이들 배양배지에는, 다분화능성 줄기세포의 생존 효율이나 증식 효율을 높이는 것으로 알려져 있는 성분이나, 다분화능성 줄기세포의 미분화 상태를 유지하는 작용을 갖는 것으로 알려져 있는 성분 등을 적절히 함유시켜도 된다. 다분화능성 줄기세포의 생존 효율을 높이는 성분으로는, 예를 들면 Rho 키나아제(ROCK) 저해제를 들 수 있다.

본 발명의 분화 촉진제를 함유시키는 분화 유도용 배양배지로는, 세포의 생존에 필요한 영양분을 함유하는 배양배지에 1종 이상의 분화 유도 인자를 함유시킨 배양배지를 이용할 수 있다. 세포의 생존에 필요한 영양분을 함유하는 배양배지로는 전술한 미분화 세포용 배양배지를 들 수 있다. 미분화 세포용 배양배지에 함유시키는 분화 유도 인자로는, 각종 문헌에 기재되어 있는 다종 다양한 분화 유도 인자 중에서 사용하는 다분화능성 줄기세포의 종류, 목적하는 분화 세포의 종류 등을 고려해 적절하게 결정할 수 있다. 그 외, E6(Essential 6) 배지 등의 시판중인 분화 유도용 배양배지를 이용할 수도 있다. 이들 배양배지에는, 본 발명의 분화 촉진제 외에, 다분화능성 줄기세포의 생존 효율이나 증식 효율을 높이는 것으로 알려져 있는 성분이나, 다분화능성 줄기세포의 분화를 촉진하는 작용을 갖는 것으로 알려져 있는 성분 등을 적절하게 함유시켜도 된다.

본 발명의 분화 촉진제에 의해 분화가 촉진되는 다분화능성 줄기세포로는, 동물 유래의 다분화능성 줄기세포가 바람직하고, 포유류에 유래하는 다분화능성 줄기세포가 보다 바람직하고, 인간 유래의 다분화능성 줄기세포가 더욱 바람직하다. 또한, 본 발명의 분화 촉진제에 의해 분화가 촉진되는 다분화능성 줄기세포로는, 동물 유래의 ES 세포, iPS 세포 또는 간엽계 줄기세포인 것이 바람직하고, 포유류에 유래하는 ES 세포, iPS 세포 또는 간엽계 줄기세포인 것이 보다 바람직하고, 인간 유래의 ES 세포, iPS 세포 또는 간엽계 줄기세포인 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 분화 촉진제는, 특히, 외배엽, 중배엽, 내배엽의 어느 세포로도 분화할 수 있는 다능성 줄기세포의 분화 촉진에 이용되는 것이 바람직하고, ES 세포 또는 iPS 세포의 어느 하나의 배엽으로의 분화 촉진에 이용되는 것이 특히 바람직하다. 예를 들면, ES 세포 또는 iPS 세포를, 이들 다능성 줄기세포를 3 배엽 중 어느 하나의 배엽까지 분화시키는 1종 이상의 분화 유도 인자와 본 발명의 분화 촉진제를 함유하는 분화 유도용 배양배지에서 배양함으로써, 목적하는 배엽 세포로의 분화를 촉진시킬 수 있다.

실시예

다음으로 실시예를 들어 본 발명을 더 상세하게 설명하지만, 본 발명이 이하의 실시예로 한정되는 것은 아니다.

한편, 이후의 실험에서 iPS 세포용 배양배지로는, DMEM/F12 배지에 19.4 ㎎/L의 인슐린, 10.7 ㎎/L의 트랜스페린, 64 ㎎/L의 아스코르브산, 14 ㎍/L의 아셀렌산나트륨, 100 ㎍/L의 인간 FGF2, 2 ㎍/L의 인간 TGFβ1, 543 ㎎/L의 탄산수소나트륨이 되도록 첨가한 배지를 이용했다.

[실시예 1]

iPS 세포의 3 배엽 분화에서의 β-NMN의 효과를 조사했다. iPS 세포로는 인간 iPS 세포 201B7주를 이용했다.

＜배양＞

U-바닥 96 웰 플레이트 'Nunclon Sphera 96U-well plate'(Thermo Fisher Scientific 제품)에 iPS 세포를 10,000 세포/웰이 되도록 파종하고, 분화 유도용 배양배지인 E6 배지(Gibco 제품)에 β-NMN을 종농도 0, 0.25 또는 1 mM이 되도록, Rock 저해제를 종농도 10 μM이 되도록 각각 첨가한 배지에서 1일간 배양했다. Rock 저해제는 Rho 의존적 아포토시스(apoptosis)를 억제하기 위해 첨가했다. 파종 후 1일째와 5일째에, 파종시의 배양배지로부터 Rock 저해제를 제거한 배지로 배지 교환을 행했다.

＜RT-PCR에 의한 각 마커의 발현량 측정＞

파종 후 3일째와 7일째의 세포를 샘플링하고 RT-PCR을 실시해, 미분화 마커(Nanog, Sox2, Oct3/4, Lin28a, Klf4), 내배엽 마커(Sox17, AFP), 중배엽 마커(MSX1, Brachyury), 외배엽 마커(PAX6) 발현의 발현량을 조사했다. 구체적으로는, 샘플링한 세포로부터 RNA 추출용 키트 'RNeasy Mini Kit'(Qiagen 제품)를 이용해 RNA를 추출하고, 추출한 RNA를 템플릿(template)으로 하여, 역전사진용 키트'SuperScript(등록상표) Ⅲ First-Strand Synthesis System'(Thermo scientific 제품)을 이용해 cDNA를 합성했다. 얻어진 cDNA를 이용해 각 마커의 발현량을 PCR에 의해 평가했다. 내부 표준 유전자로서 G3PDH를 컨트롤로 했다.

PCR 산물을 전기 영동해 분리한 후, 염색한 결과를 도 1에 나타낸다. 도면에서 'Day 0'은 파종 직전의 세포의 결과를, 'Day 3' 및 'Day 7'은 각각 파종 후 3일째와 7일째의 세포의 결과를 나타낸다. 그 결과로부터, β-NMN 존재하에서 분화 유도한 세포에서는 β-NMN 비존재하에서 배양한 세포보다 각 미분화 마커의 발현량이 낮아지고, 분화 마커의 발현량이 상승하고 있는 것이 시사되었다.

[실시예 2]

iPS 세포의 외배엽 분화 유도시에서의 β-NMN의 효과를 조사했다. iPS 세포로는 201B7주를 이용했다.

＜배양＞

매트리젤(코닝 제품)로 제조원 프로토콜에 따라 코팅된 12 웰 플레이트에 iPS 세포를 8×10⁵ 세포/웰이 되도록 파종했다. 이 12 웰 플레이트의 세포를, 'STEMdiff Trilineage Differentiation kit'(STEMCELL technology 제품)의 외배엽 분화 유도용 배양배지에 β-NMN을 종농도 0, 0.1, 0.25 또는 1 mM이 되도록, Rock 저해제를 종농도 10 μM이 되도록 각각 첨가한 배지에서 1일간 배양했다. 파종 후 1일째부터 매일, 파종시의 배양배지로부터 Rock 저해제를 제거한 배지로 배지 교환을 행했다.

＜세포수의 경시적 변화＞

파종 후 2, 4 또는 7일째의 세포를 샘플링해 세포수를 카운트 했다. 각 세포의 세포수의 경시적 변화를 도 2의 (A)에, 파종 후 7일째의 세포수를 도 2의 (B)에 각각 나타냈다. 그 결과, β-NMN을 함유하는 외배엽 분화 유도용 배양배지에서 배양한 세포가, β-NMN을 첨가하지 않은 배지에서 배양한 세포보다 세포수가 많았다. 그 결과로부터, β-NMN에 의해 외배엽으로의 분화 유도시의 세포 증식성이 향상되는 것을 알 수 있었다.

＜플로우 사이토미터를 이용한 외배엽 분화 마커 발현 세포의 측정＞

파종 후 2, 4 또는 7일째에 샘플링한 세포를 파라포름알데히드로 고정한 후, 사포닌 함유 PBS로 막투과 처리를 실시했다. 계속해서, 형광 표지한 항네스틴 항체(Biolegend 제품, clone 10 C2) 및 형광 표지한 항Pax6 항체(벡톤 디킨슨 제품, clone O18-1330)를 이용해 세포를 염색했다. 염색된 세포를 세정한 후, 플로우 사이토미터 'FACScaliber'(벡톤 디킨슨 제품)에 의해, 각 세포의 항네스틴 항체의 형광 강도와 항Pax6 항체의 형광 강도를 해석했다. 네스틴(Nestin)과 Pax6는 외배엽의 분화 마커이다.

플로우 사이토미터에 의해 각 세포를 네스틴과 Pax6의 발현량으로 분획한 결과를 도 3에 나타낸다. 네스틴 양성이면서 또한 Pax6 양성인 세포가 외배엽으로 분화한 세포이다. 도면의 퍼센티지는 네스틴 양성 Pax6 양성 세포의 세포 전량에 대한 비율(%)을 나타낸다. 그 결과, β-NMN 존재하에서 배양한 세포가 네스틴 양성 Pax6 양성 세포의 비율이 높았다. 즉, β-NMN 첨가에 의해 외배엽 분화에서의 분화 효율이 향상된 것이 확인되었다.

이들 결과로부터, β-NMN은 외배엽으로의 분화 유도시에 세포의 증식성과 분화 효율 모두를 향상시켜, iPS 세포로부터 외배엽 세포로의 분화를 촉진하는 것을 알 수 있었다.

[실시예 3]

iPS 세포의 중배엽 분화 유도시에서의 β-NMN의 효과를 조사했다. iPS 세포로는 201B7주를 이용했다.

＜배양＞

매트리젤(코닝 제품)로 제조원 프로토콜에 따라 코팅된 24 웰 플레이트에 iPS 세포를 1×10⁵ 세포/웰이 되도록 파종했다. 이 24 웰 플레이트의 세포를, Rock 저해제를 종농도 10 μM이 되도록 첨가한 iPS 세포용 배양배지에서 1일간 배양했다. 파종 후 1일째부터 매일, 'STEMdiff Trilineage Differentiation kit'(STEMCELL technology 제품)의 중배엽 분화 유도용 배양배지에 β-NMN을 종농도 0, 0.1, 0.25 또는 1 mM이 되도록 첨가한 배지로 배지 교환을 행했다. 파종 후 1일째의 배지 교환시에만, 상기 중배엽 분화 유도용 배양배지에 β-NMN과 함께 Rock 저해제를 종농도 10 μM이 되도록 첨가한 배지로 교환했다.

＜세포수의 경시적 변화＞

파종 후 7일째의 세포를 샘플링해 세포수를 카운트 했다. 각 세포의 파종 후 7일째의 세포수를 도 4에 나타낸다. 그 결과, β-NMN을 함유하는 중배엽 분화 유도용 배양배지에서 배양한 세포가, β-NMN을 첨가하지 않은 배지에서 배양한 세포보다 세포수가 많았다. 그 결과로부터, β-NMN에 의해 중배엽으로의 분화 유도시의 세포 증식성이 향상되는 것을 알 수 있었다.

＜플로우 사이토미터를 이용한 중배엽 분화 마커 발현 세포의 측정＞

파종 후 5 또는 7일째에 샘플링한 세포를 파라포름알데히드로 고정한 후, 사포닌 함유 PBS로 막투과 처리를 실시했다. 계속해서, 형광 표지한 항Brachyury 항체(Merck 제품, clone 3E4.2) 및 형광 표지한 항CD56 항체(Biolegend 제품, clone HCD56)를 이용해 세포를 염색했다. 염색된 세포를 세정한 후, 플로우 사이토미터 'FACScaliber'(벡톤 디킨슨 제품)에 의해, 각 세포의 항Brachyury 항체의 형광 강도와 항CD56 항체의 형광 강도를 해석했다. Brachyury와 CD56는 중배엽의 분화 마커이다.

플로우 사이토미터에 의해 각 세포를 Brachyury와 CD56의 발현량으로 분획한 결과를 도 5에 나타낸다. Brachyury 양성이면서 또한 CD56 양성인 세포가 중배엽으로 분화한 세포이다. 도면의 퍼센티지는 Brachyury 양성 CD56 양성 세포의 세포 전량에 대한 비율(%)을 나타낸다. 그 결과, β-NMN 존재하에서 배양한 세포와 β-NMN 비존재하에서 배양한 세포의 Brachyury 양성 CD56 양성 세포의 비율에 명확한 차이는 없었다. 특히, β-NMN을 1 mM 첨가한 세포에서는, β-NMN 무첨가로 배양한 경우보다 분명하게 Brachyury 양성 CD56 양성 세포의 비율이 저하되고 있었다. 즉, β-NMN 첨가는 중배엽 분화에서의 분화 효율에 그다지 영향을 미치지 않는 것이 확인되었다.

이들 결과로부터, β-NMN은 중배엽으로의 분화 유도시에 세포의 증식성을 향상시키지만, iPS 세포로부터 중배엽 세포로의 분화에는 명확한 차이가 없었다.

[실시예 4]

iPS 세포의 내배엽 분화 유도시에서의 β-NMN의 효과를 조사했다. iPS 세포로는 253G1주를 이용했다.

＜배양＞

매트리젤(코닝 제품)로 제조원 프로토콜에 따라 코팅된 24 웰 플레이트에 iPS 세포를 3×10⁵ 세포/웰이 되도록 파종했다. 이 24 웰 플레이트의 세포를, Rock 저해제를 종농도 10 μM이 되도록 첨가한 iPS 세포용 배양배지에서 1일간 배양했다. 파종 후 1일째부터 매일, 'STEMdiff Trilineage Differentiation kit'(STEMCELL technology 제품)의 내배엽 분화 유도용 배양배지에 β-NMN을 종농도 0, 0.1, 0.25 또는 1 mM이 되도록 첨가한 배지로 배지 교환을 행했다. 파종 후 1일째의 배지 교환시에만, 상기 내배엽 분화 유도용 배양배지에 β-NMN과 함께 Rock 저해제를 종농도 10 μM이 되도록 첨가한 배지로 교환했다.

＜세포수의 경시적 변화＞

파종 후 7일째의 세포를 샘플링해 세포수를 카운트 했다. 각 세포의 파종 후 7일째의 세포수를 도 6에 나타낸다. 그 결과, β-NMN을 함유하는 내배엽 분화 유도용 배양배지에서 배양한 세포가, β-NMN을 첨가하지 않은 배지에서 배양한 세포보다 세포수가 많았다. 이 결과로부터, β-NMN에 의해 내배엽으로의 분화 유도시의 세포 증식성이 향상되는 것을 알 수 있었다.

＜플로우 사이토미터를 이용한 내배엽 분화 마커 발현 세포의 측정＞

파종 후 5 또는 7일째에 샘플링한 세포를 파라포름알데히드로 고정한 후, 사포닌 함유 PBS로 막투과 처리를 실시했다. 계속해서, 형광 표지한 항Sox17 항체(벡톤 디킨슨 제품, clone P7-969) 및 형광 표지한 항CXCR4 항체(Biolegend 제품, clone 12G5)를 이용해 세포를 염색했다. 염색된 세포를 세정한 후, 플로우 사이토미터 'FACScaliber'(벡톤 디킨슨 제품)에 의해, 각 세포의 항Sox17 항체의 형광 강도와 항CXCR4 항체의 형광 강도를 해석했다. Sox17과 CXCR4는 내배엽의 분화 마커이다.

플로우 사이토미터에 의해 각 세포를 Sox17과 CXCR4의 발현량으로 분획한 결과를 도 7에 나타낸다. Sox17 양성이면서 또한 CXCR4 양성인 세포가 내배엽으로 분화한 세포이다. 도면의 퍼센티지는 Sox17 양성 CXCR4 양성 세포의 세포 전량에 대한 비율(%)을 나타낸다. 그 결과, β-NMN 존재하에서 배양한 세포와 β-NMN 비존재하에서 배양한 세포의 Sox17 양성 CXCR4 양성 세포의 비율에 명확한 차이는 없었다. 즉, β-NMN 첨가는 내배엽 분화에서의 분화 효율에 그다지 영향을 미치지 않는 것이 확인되었다.

이들 결과로부터, β-NMN은 내배엽으로의 분화 유도시에 세포의 증식성을 향상시키지만, iPS 세포로부터 내배엽 세포로의 분화에는 명확한 차이가 없었다.

[실시예 5]

분화 유도전에 β-NMN 존재하에서 배양하는 것의, iPS 세포의 내배엽 분화 유도에 대한 효과를 조사했다. iPS 세포로는 253G1주를 이용했다.

＜배양＞

매트리젤(코닝 제품)로 제조원 프로토콜에 따라 코팅된 배양용 디쉬에 파종 한 iPS 세포를, iPS 세포용 배양배지에 β-NMN을 종농도 0, 0.25 또는 1 mM이 되도록, Rock 저해제를 종농도 10 μM이 되도록 각각 첨가한 배지에 Rock 저해제를 종농도 10 μM이 되도록 첨가한 배지에서, 1일간 배양했다. 파종 후 1일째부터 매일, 파종시의 배양배지로부터 Rock 저해제를 제거한 배지로 배지 교환을 행했다. 70∼80%의 컨플루언트(confluent)에 도달한 시점에서 배양용 디쉬로부터 iPS 세포를 박리해 회수했다.

회수한 iPS 세포를, 매트리젤(코닝 제품)로 제조원 프로토콜에 따라 코팅된 24 웰 플레이트에 iPS 세포를 3×10⁵ 세포/웰이 되도록 파종했다. 이 24 웰 플레이트의 세포를, 배양용 디쉬내에서 배양하고 있었을 때의 배양배지로부터 β-NMN을 제거하고, Rock 저해제를 종농도 10 μM이 되도록 더 첨가한 배지내에서 1일간 배양했다. 파종 후 1일째부터 매일, 'STEMdiff Trilineage Differentiation kit'(STEMCELL technology 제품)의 내배엽 분화 유도용 배양배지로 배지 교환을 행했다.

＜세포수의 경시적 변화＞

파종 후 7일째의 세포를 샘플링해 세포수를 카운트 했다. 각 세포의 파종 후 7일째의 세포수를 도 8에 나타낸다. 그 결과, β-NMN을 함유하는 iPS 세포용 배양배지에서 배양한 후에 내배엽 분화 유도가 이루어진 세포와, β-NMN을 함유하지 않은 iPS 세포용 배양배지에서 배양한 후에 내배엽 분화 유도가 이루어진 세포는, 세포수에서 명확한 차이가 없었다. 즉, 미분화 배양시에서의 β-NMN 첨가는, 그 후의 내배엽 분화시의 세포 증식에 그다지 영향을 미치지 않는 것을 알 수 있었다.

파종 후 5 또는 7일째에 샘플링한 세포를 파라포름알데히드로 고정한 후, 사포닌 함유 PBS로 막투과 처리를 실시했다. 계속해서, 형광 표지한 항Sox17 항체(벡톤 디킨슨 제품, clone P7-969) 및 형광 표지한 항FoxA2 항체(벡톤 디킨슨 제품, clone N17-280)를 이용해 세포를 염색했다. 염색된 세포를 세정한 후, 플로우 사이토미터 'FACScaliber'(벡톤 디킨슨 제품)에 의해, 각 세포의 항Sox17 항체의 형광 강도와 항FoxA2 항체의 형광 강도를 해석했다. Sox17과 FoxA2는 내배엽의 분화 마커이다.

플로우 사이토미터에 의해 각 세포를 Sox17의 발현량으로 분획한 결과를 도 9에 나타낸다. Sox17 양성인 세포가 내배엽으로 분화한 세포이다. 도면의 퍼센티지는 Sox17 양성 세포의 세포 전량에 대한 비율(%)을 나타낸다. 그 결과, 미분화 배양시에 β-NMN 존재하에서 배양한 iPS 세포가 β-NMN 비존재하에서 배양한 iPS 세포보다 Sox17 양성 세포의 비율이 높았다. 즉, 미분화 배양시에 β-NMN 존재하에서 배양함으로써, 내배엽 분화에서의 분화 효율이 향상된 것이 확인되었다.

이들 결과로부터, iPS 세포를 미리 β-NMN 존재하에서 배양한 후에 내배엽 분화 유도를 실시함으로써, 내배엽으로의 분화 효율이 향상되고, iPS 세포로부터 내배엽 세포로의 분화가 촉진되는 것을 알 수 있었다.

[실시예 6]

분화 유도전에 β-NMN 존재하에서 배양하는 것의, iPS 세포의 중배엽 분화 유도에 대한 효과를 조사했다. iPS 세포로는 201B7주를 이용했다.

＜배양＞

iPS 세포를, 실시예 5와 마찬가지로 하여 배양용 디쉬내에서 배양하고, 70∼80%의 컨플루언트에 도달한 시점에서 배양용 디쉬로부터 iPS 세포를 박리해 회수했다.

회수한 iPS 세포를, 매트리젤(코닝 제품)로 제조원 프로토콜에 따라 코팅된 24 웰 플레이트에 iPS 세포를 1×10⁵ 세포/웰이 되도록 파종했다. 이 24 웰 플레이트의 세포를, 배양용 디쉬내에서 배양하고 있었을 때의 배양배지로부터 β-NMN을 제거하고, Rock 저해제를 종농도 10 μM이 되도록 더 첨가한 배지내에서 1일간 배양했다. 파종 후 1일째부터 매일, 'STEMdiff Trilineage Differentiation kit'(STEMCELL technology 제품)의 중배엽 분화 유도용 배양배지로 배지 교환을 행했다.

＜세포수의 경시적 변화＞

파종 후 7일째의 세포를 샘플링해 세포수를 카운트 했다. 각 세포의 파종 후 7일째의 세포수를 도 10에 나타낸다. 그 결과, β-NMN을 함유하는 iPS 세포용 배양배지에서 배양한 후에 중배엽 분화 유도가 이루어진 세포가, β-NMN을 함유하지 않은 iPS 세포용 배양배지에서 배양한 후에 중배엽 분화 유도가 이루어진 세포보다 세포수가 많았다. 즉, 미분화 배양시에서의 β-NMN 첨가에 의해, 그 후의 중배엽 분화시의 세포 증식이 향상되는 것을 알 수 있었다.

실시예 3과 마찬가지로 하여, 파종 후 5 또는 7일째에 샘플링한 세포를 형광 표지한 항Brachyury 항체 및 형광 표지한 항CD56 항체로 염색해, 플로우 사이토미터에 의해 각 세포의 항Brachyury 항체의 형광 강도와 항CD56 항체의 형광 강도를 해석했다.

플로우 사이토미터에 의해 각 세포를 Brachyury와 CD56의 발현량으로 분획한 결과를 도 11에 나타낸다. Brachyury 양성이면서 또한 CD56 양성인 세포가 중배엽으로 분화한 세포이다. 도면의 퍼센티지는 Brachyury 양성 CD56 양성 세포의 세포 전량에 대한 비율(%)을 나타낸다. 그 결과, 중배엽 분화 유도전에 β-NMN 존재하에서 배양한 세포와 β-NMN 비존재하에서 배양한 세포의, 분화 유도 후의 Brachyury 양성 CD56 양성 세포의 비율에 명확한 차이는 없었다. 즉, 미분화 배양시의 β-NMN은, 그 후의 중배엽 분화 유도에서의 분화 효율에 그다지 영향을 미치지 않는 것이 확인되었다.

이들 결과로부터, iPS 세포를 미리 β-NMN 존재하에서 배양한 후에 중배엽 분화 유도를 실시함으로써 중배엽 분화 유도시의 세포 증식성은 향상되었지만, iPS 세포로부터 중배엽 세포로의 분화에는 명확한 차이가 확인되지 않았다.

[실시예 7]

분화 유도전에 β-NMN 존재하에서 배양하는 것의, iPS 세포의 외배엽 분화 유도에 대한 효과를 조사했다. iPS 세포로는 201B7주를 이용했다.

＜배양＞

회수한 iPS 세포를, 매트리젤(코닝 제품)로 제조원 프로토콜에 따라 코팅된 24 웰 플레이트에 iPS 세포를 3×10⁵ 세포/웰이 되도록 파종했다. 이 24 웰 플레이트의 세포를, 배양용 디쉬내에서 배양하고 있었을 때의 배양배지로부터 β-NMN을 제거하고, Rock 저해제를 종농도 10 μM이 되도록 더 첨가한 배지내에서 1일간 배양했다. 파종 후 1일째부터 매일, 'STEMdiff Trilineage Differentiation kit'(STEMCELL technology 제품)의 외배엽 분화 유도용 배양배지로 배지 교환을 행했다.

＜세포수의 경시적 변화＞

파종 후 7 또는 9일째의 세포를 샘플링해 세포수를 카운트 했다. 각 세포의 세포수의 경시적 변화를 도 12의 (A)에, 파종 후 9일째의 세포수를 도 12의 (B)에 각각 나타냈다. 그 결과, β-NMN을 함유하는 iPS 세포용 배양배지에서 배양한 후에 외배엽 분화 유도가 이루어진 세포가, β-NMN을 함유하지 않은 iPS 세포용 배양배지에서 배양한 후에 외배엽 분화 유도가 이루어진 세포보다 세포수가 많았다. 즉, 미분화 배양시에서의 β-NMN 첨가에 의해, 그 후의 외배엽 분화시의 세포 증식이 향상되는 것을 알 수 있었다.

실시예 2와 마찬가지로 하여, 파종 후 7 또는 9일째에 샘플링한 세포를 형광 표지한 항네스틴 항체 및 형광 표지한 항Pax6 항체로 염색하고, 플로우 사이토미터에 의해 각 세포의 항네스틴 항체의 형광 강도와 항Pax6 항체의 형광 강도를 해석했다.

플로우 사이토미터에 의해 각 세포를 네스틴과 Pax6의 발현량으로 분획한 결과를 도 13에 나타낸다. 네스틴 양성이면서 또한 Pax6 양성인 세포가 외배엽으로 분화한 세포이다. 도면의 퍼센티지는 네스틴 양성 Pax6 양성 세포의 세포 전량에 대한 비율(%)을 나타낸다. 그 결과, 외배엽 분화 유도전에 β-NMN 존재하에서 배양한 세포와 β-NMN 비존재하에서 배양한 세포의, 분화 유도 후의 네스틴 양성 Pax6 양성 세포의 비율에 명확한 차이는 없었다. 즉, 미분화 배양시의 β-NMN은, 그 후의 외배엽 분화 유도에서의 분화 효율에 그다지 영향을 미치지 않는 것이 확인되었다.

이들 결과로부터, iPS 세포를 미리 β-NMN 존재하에서 배양한 후에 외배엽 분화 유도를 실시함으로써, 외배엽 분화 유도시의 세포 증식성은 향상되었지만, iPS 세포로부터 외배엽 세포로의 분화에는 명확한 차이가 인정되지 않았다.

[실시예 8]

분화 유도전에 β-NMN 존재하에서 배양하는 것의, 간엽계 줄기세포의 골분화 유도에 대한 효과를 조사했다. 간엽계 줄기세포로는 인간 지방 조직 유래 간엽계 줄기세포(Lonza 제품, Cat# PT5006)를 이용했다.

＜배양배지＞

증식용 배지로는 'MSCGM Bullet Kit'(Lonza 제품, Cat# PT3001)에 적절하게 β-MNM을 첨가한 배지를 이용했다.

골분화 유도용 배지로는 α-MEM 배지에 소 태아 혈청을 종농도 10 용량%, 덱사메타손을 종농도 10 nM, β-글리세로인산을 종농도 10 mM, 아스코르브산을 종농도 50 ㎍/㎖, 페니실린-스트렙토마이신을 종농도 0.1%가 되도록 첨가한 배지를 이용했다.

＜간엽계 줄기세포의 배양＞

간엽계 줄기세포를 β-MNM 무첨가의 증식용 배지를 이용해, 배양용 디쉬에 5×10³ 세포/㎠가 되도록 파종하고, 37℃, 5 체적%(CO₂)에서 1일간 정치 배양(stationary culture)했다. 파종으로부터 1일 경과후부터 2일 간격으로, β-MNM을 종농도 0, 0.1 또는 0.25 mM이 되도록 첨가한 증식용 배지로 배지 교환을 행했다.

또한, 배양용 디쉬내의 세포 밀도가 80∼90%의 컨플루언트가 된 시점에서 계대를 실시했다. 계대는, 우선, 배양용 디쉬로부터 상청을 제거하고, PBS로 세정한 후, '1×Tryple Select'(Gibco 제품)를 첨가해 37℃, 5 체적%(CO₂)에서 4분간 가만히 두었다. 그 후, 디쉬를 가볍게 쳐 세포를 박리시킨 후, 증식용 배지를 첨가하고 피펫팅에 의해 세포를 싱글화했다. 계속해서, 이 싱글화한 세포를 β-MNM을 첨가한 증식용 배지에 분산시키고, 배양용 디쉬에 5×10³ 세포/㎠가 되도록 파종 해 37℃, 5 체적%(CO₂)에서 정치 배양했다.

4회 계대 배양을 행한 세포를 이후의 분화 Assay에 사용했다.

＜분화 유도＞

β-MNM에 순화ehls 세포를, 48 웰 플레이트에 2×10⁴ 세포/웰이 되도록 파종하고, 37℃, 5 체적%(CO₂)에서 웰 내의 세포 밀도가 80∼90%의 컨플루언트가 될 때까지 β-MNM을 함유시킨 증식용 배지에서 배양한 후, 골분화 유도용 배지로 교환했다. 배지 교환은 3∼4일에 1번 실시하고, 분화 유도 개시부터 14일째에 염색 시험을 실시했다.

＜염색 시험＞

분화 유도 후의 세포에 대해, 알리자린 레드 S를 이용해 침착 칼슘의 염색을 실시해, 위상차 현미경으로 염색 상태를 확인했다.

염색 화상을 도 14에 나타낸다. β-NMN 비첨가(0 mM)의 세포에 비해, 0.1 mM 또는 0.25 mM의 β-NMN을 첨가한 배지에서 배양한 세포는, 칼슘 침착이 강하게 보였다. 이들 결과로부터, β-NMN 존재하에서 증식 배양한 세포는 뼈로의 분화가 촉진되는 것이 시사되었다.

[실시예 9]

분화 유도전에 β-NMN 존재하에서 배양하는 것의, 간엽계 줄기세포의 지방 분화 유도에 대한 효과를 조사했다. 간엽계 줄기세포로는, 실시예 8과 마찬가지로, 인간 지방 조직 유래 간엽계 줄기세포(Lonza 제품, Cat# PT5006)를 이용했다.

＜배양배지＞

증식용 배지로는, 실시예 8과 마찬가지로, 'MSCGM Bullet Kit'(Lonza 제품, Cat# PT3001)에 적절하게 β-MNM을 첨가한 배지를 이용했다.

지방 분화 유도용 배지로는, DMEM-High Glucose 배지에 소 태아 혈청을 종농도 10 용량%, IBMX를 종농도 0.5 mM, 덱사메타손을 종농도 1 μM, 인도메타신을 종농도 200 μM, 페니실린-스트렙토마이신을 종농도 0.1%가 되도록 첨가한 배지를 이용했다.

＜간엽계 줄기세포의 배양＞

분화 유도전의 간엽계 줄기세포의 배양은 실시예 8과 동일하게 실시했다.

＜분화 유도＞

골분화 유도용 배지 대신에 지방 분화 유도용 배지를 이용한 것 외에는, 실시예 8과 동일하게 하여 분화 유도를 실시했다. 분화 유도 개시부터 14일째에 염색 시험 및 세포의 RNA의 회수를 실시했다.

＜염색 시험＞

분화 유도 후의 세포에 대해, 오일 레드 O를 이용해 세포내 지방구(lipid droplet)의 염색을 실시해, 위상차 현미경으로 염색 상태를 확인했다.

염색 화상을 도 15에 나타낸다. β-NMN 비첨가(0 mM)의 세포에 비해, 0.1 mM 또는 0.25 mM의 β-NMN을 첨가한 배지에서 배양한 세포는, 많은 지방구의 축적이 보였다.

＜qPCR 측정＞

분화 유도 후의 세포로부터, 'RNeasy Mini Plus Kit'(QIAGENE 제품)를 이용해 RNA를 추출하고, 이것을 템플릿으로 하여 'SuperScript(등록상표) Ⅲ First-Strand Synthesis Super Mix'(Invitrogen 제품)를 이용해 cDNA를 합성했다. 얻어진 cDNA를 템플릿으로 하여, 표 1에 기재된 프라이머와 시약 'TB Green Fast qPCR Mix'(TaKaRa 제품)를 이용해 qPCR을 실시해, PPAR-γ 유전자, 아디포넥틴 유전자 및 GAPDH 유전자의 발현량을 측정했다. 측정 기기는 리얼타임 PCR 시스템 '7500 Fast Real-Time PCR System'(Applied Biosystems 제품)을 사용했다. GAPDH 유전자는 내부 표준으로서 이용했다.

지방으로 분화 유도한 세포의 qPCR의 결과로부터, 각 유전자의 상대 발현량을 구했다. β-NMN 비첨가(0 mM) 세포의 유전자 발현량을 1로 했다. 도 16은 PPAR-γ 유전자의 상대 발현량 측정 결과를, 도 17은 아디포넥틴 유전자의 상대 발현량 측정 결과를 각각 나타낸다. PPAR-γ 및 아디포넥틴은 모두 지방 분화 마커이다. β-NMN 비첨가(0 mM)의 세포에 비해, 0.1 mM 또는 0.25 mM의 β-NMN을 첨가한 배지에서 배양한 세포는 두 유전자의 발현량 증가가 확인되었다.

오일 레드 O 염색 및 qPCR의 결과로부터, β-NMN 존재하에서 증식 배양한 세포는 지방으로의 분화가 촉진되는 것이 시사되었다.

SEQUENCE LISTING <110> Oriental Yeast Co.,Ltd. <120> Agent for Promoted Differentiation of Pluripotent Stem Cells <130> PC-27444 <160> 6 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer of PPARgamma <400> 1 gagcccaagt ttgagtttgc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer of PPARgamma <400> 2 tcaatgggct tcacattcag 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer of Adiponectin <400> 3 cctggtgaga agggtgagaa 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer of Adiponectin <400> 4 ctcctttcct gccttggatt 20 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer of GAPDH <400> 5 aacgggaagc ttgtcatcaa tggaaa 26 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer of GAPDH <400> 6 gcatcagcag agggggcaga g 21

Claims

β-니코틴아미드 모노뉴클레오티드 또는 이의 약리학적으로 허용되는 염, 및, 이들의 용매화물을 유효 성분으로 하는 것을 특징으로 하는, 다분화능성 줄기세포 분화 촉진제.
제1항에 있어서,
다분화능성 줄기세포의 배양배지에 β-니코틴아미드 모노뉴클레오티드 환산으로 0.01∼10 mM 첨가되는, 다분화능성 줄기세포 분화 촉진제.
제1항 또는 제2항에 있어서,
배아 줄기세포, 유도만능 줄기세포, 간엽계 줄기세포, 조혈 줄기세포, 신경 줄기세포 및 피부 줄기세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 다분화능성 줄기세포로부터 분화 세포를 얻기 위해 이용되는, 다분화능성 줄기세포 분화 촉진제.
다분화능성 줄기세포를 β-니코틴아미드 모노뉴클레오티드 또는 이의 약리학적으로 허용되는 염, 및, 이들의 용매화물을 함유하는 배양배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는, 다능성 줄기세포를 분화시키는 방법.
제4항에 있어서,
상기 배양배지의 β-니코틴아미드 모노뉴클레오티드 농도가 0.01∼10 mM인, 방법.
제4항 또는 제5항에 있어서,
상기 배양배지가 다분화능성 줄기세포를 분화시키는 1종 이상의 분화 유도 인자를 함유하는 분화 유도용 배양배지인, 방법.
제6항에 있어서,
상기 분화 유도용 배양배지가 다능성 줄기세포를 내배엽, 중배엽 또는 외배엽의 어느 하나로 분화 유도하기 위한 배양배지인, 방법.
제4항 또는 제5항에 있어서,
상기 다분화능성 줄기세포를, β-니코틴아미드 모노뉴클레오티드 또는 이의 약리학적으로 허용되는 염, 및, 이들의 용매화물을 함유하는 다분화능성을 유지하는 배양배지내에서 배양한 후, 1종 이상의 분화 유도 인자를 함유하는 분화 유도용 배양배지에서 배양하는, 방법.
제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 다분화능성 줄기세포가 배아 줄기세포, 유도만능 줄기세포, 간엽계 줄기세포, 조혈 줄기세포, 신경 줄기세포 및 피부 줄기세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인, 방법.
다분화능성 줄기세포를 β-니코틴아미드 모노뉴클레오티드 또는 이의 약리학적으로 허용되는 염, 및, 이들의 용매화물을 함유하는 배양배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는, 다분화능성 줄기세포의 분화를 촉진하는 방법.