JP2022528737A - Ａｂｃｇ２陽性角膜輪部幹細胞を得る又は維持する方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、多能性幹細胞をまず眼球前駆細胞に誘導し、次いでこの眼球前駆細胞をＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞に分化させることによる、ＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞の製造方法を提供する。本発明は、初代角膜輪部幹細胞等の角膜輪部幹細胞のＡＢＣＧ２陽性表現型を維持する方法も提供する。【選択図】なし

Description

本明細書は、多能性幹細胞の眼球前駆細胞への分化、さらにＡＢＣＧ２陽性輪部幹細胞への分化に関する。これらの細胞は、所望に応じて、さらに高増殖性のΔＮｐ６３α陽性の角膜輪部前駆細胞に、そして最終的に角膜上皮細胞に分化されてもよい。本発明は、初代角膜輪部幹細胞、又は当該分化方法により得られた角膜輪部幹細胞等の角膜輪部幹細胞のＡＢＣＧ２陽性表現型を維持する方法にも関する。

ヒトの角膜は、眼球の前面で保護バリアとして機能し、私たちにクリアな視界を提供する多層構造の透明な結合組織である。最外の角膜上皮は、急速な更新サイクルを持っており、この更新サイクルは、眼球表面の絶え間ない細胞消失と入れ替えとを介して現れる。この上皮層の代謝回転を可能にしているのは、フォークト・パリセード（Ｐａｌｉｓａｄｅｓ ｏｆ Ｖｏｇｔ）にある特定の解剖学的ニッチ構造に存在し、上皮に新しい細胞を供給する輪部幹細胞（Ｌｉｍｂａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、ＬＳＣ）である。ＬＳＣの機能障害や欠損は、「角膜上皮幹細胞疲弊症（ｌｉｍｂａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ、ＬＳＣＤ）」と呼ばれる臨床症状を引き起こし、最終的には角膜失明につながる可能性がある。残念ながら、適切なドナー組織が世界的に不足しているため、ＬＳＣ移植によるＬＳＣＤの効率的な治療は妨げられている。それゆえ、ヒト胚性多能性幹細胞及び人工多能性幹細胞（それぞれｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ）を含むヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）からＬＳＣを分化させることで、無尽蔵の代替細胞源を提供することを目的としたいくつかのプロトコルが開発されている。重要なのは、多くの研究室が依然として動物由来の成分を利用しており、これらの方法の臨床的な翻訳（臨床への橋渡し）を妨げているにもかかわらず、いくつかの臨床的に関連する明確な、フィーダー細胞を使用しない技術も導入されていることである（Ｈｏｎｇｉｓｔｏら、２０１７ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ；Ｍｉｋｈａｉｌｏｖａら、２０１４ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ）。

非常に多様な手法に加えて、この分野に存在するもう一つの重要な課題は、臨床的に関連するＬＳＣ集団の特定である。角膜輪部基底部上皮にあるＬＳＣと思われる細胞にはいくつかのタンパク質が関連しているが、これらの細胞を明確に識別するための特異的なマーカーは見つかっていない。ｐ６３αの発現は、臨床移植の成功と関連しており、現在、臨床的関連性を示す最も有望なマーカーとみなされている（Ｒａｍａら、２０１０、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、３６３：１４７－５５）。

国際公開第２０１８／０３７１６１号パンフレット及びＨｏｎｇｉｓｔｏら、２０１７ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒは、フィーダーを使用しない培養から得られたヒト多能性幹細胞を、まず眼球前駆細胞に分化させ、次にｐ６３陽性角膜輪部上皮前駆細胞に分化させる方法を開示する。この方法は、多能性幹細胞を、まずＴＧＦ－β阻害剤と線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）の存在下で培養し、次に骨形成タンパク質４（ＢＭＰ－４）の存在下で培養する誘導期を含む。次に、このようにして得られた眼球前駆細胞は、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ヒドロコルチゾン、インスリン、イソプロテレノール、及びトリヨードチロニンからなる群から選択される１種以上のサプリメント（補助剤）を含む細胞培地を用いて、ｐ６３陽性角膜上皮前駆細胞に分化させられる。任意に、ｐ６３陽性の角膜上皮前駆細胞は、その後、成熟角膜上皮細胞又は角膜重層上皮に成熟させられる。

角膜では、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧメンバー２（ＡＢＣＧ２）の発現は、輪部基底層のみに存在し、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２色素を排出する能力を持つ未熟で静止したＬＳＣ亜集団（ＳＰ）の表現型と関連付けられてきた。培養すると、これらの細胞は、ＡＢＣＧ２陰性の細胞に比べて活性化し、大きな成長力を発揮する（Ｄｅ Ｐａｉｖａら、２００７、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ）。

輪部基底部上皮に発現している多種多様なタンパク質の分化階層及び機能的役割をさらに理解することで、将来のＬＳＣ移植の有効性及び安全性の両方が大幅に向上すると考えられる。現在、ＬＳＣの特定は、最終分化した角膜上皮（ＣＥ）のマーカーであるサイトケラチン（ＣＫ）３及びサイトケラチン１２の非発現と組み合わせた、いくつかの陽性マーカーの同時発現に依存している（Ｓｃｈｌｏｅｔｚｅｒ－Ｓｃｈｒｅｈａｒｄｔ及びＫｒｕｓｅ ２００５ Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ）。これらのマーカーの相互関係や、機能的な階層における正確な位置については、いくつかの研究を除いて、ほとんど知られていない。

とはいうものの、ＡＢＣＧ２は、生体内での能幹細胞の表現型についての有望なマーカーとして認識されており、それゆえ、臨床的に関連するＬＳＣの特定に使用することができよう。従って、角膜上皮の状態、疾患、病理の治療や研究に使用されてもよいＡＢＣＧ２陽性ＬＳＣを得るための方法が必要とされている。加えて、このような細胞は、とりわけ幹細胞がフィーダー細胞を欠く細胞培養物から得られる場合には、毒物学的研究及び医薬品開発にも使用されてよい。さらに、異種由来の成分又は未定義の成分を避けることも、これらの方法の潜在的な臨床翻訳の安全性を向上させる重要な目的である。

国際公開第２０１８／０３７１６１号パンフレット

Ｈｏｎｇｉｓｔｏら、２０１７ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ Ｍｉｋｈａｉｌｏｖａら、２０１４ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ Ｒａｍａら、２０１０、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、３６３：１４７－５５ Ｄｅ Ｐａｉｖａら、２００７、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｓｃｈｌｏｅｔｚｅｒ－Ｓｃｈｒｅｈａｒｄｔ及びＫｒｕｓｅ ２００５ Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ

本発明の目的は、細胞培養条件におけるＡＢＣＧ２の容易に失われる発現に関連する課題を克服するように、ＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞並びにその製造及び維持の方法を提供することである。本発明の目的は、独立請求項に記載された内容を特徴とする方法によって達成される。本発明の好ましい実施形態は、従属請求項に開示されている。

従って、本発明は、角膜輪部幹細胞のＡＢＣＧ２陽性表現型を維持する方法であって、ＥＧＦ及び少なくとも１種のＷｎｔ活性化因子を含む培養培地中でＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞を培養する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ活性化因子は、ＧＳＫ３阻害剤、好ましくはＣＨＩＲ９９０２１、及びＲ－スポンジン（ｓｐｏｎｄｉｎ）ファミリーのタンパク質、好ましくはＲ－スポンジン－１又はそのサプリメントＲＳ－２４６２０４からなる群から選択される。いくつかのさらなる実施形態では、培養培地は、ノギン又はそのサプリメント、例えばＬＤＮ－１９３１８９を含んでいてもよい。

加えて、本発明は、以下を含むＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞の製造方法も提供する。
ＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞の製造方法であって、ａ）多能性幹細胞を提供する工程と、ｂ）ＴＧＦ－β阻害剤及び線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、好ましくは塩基性ＦＧＦを含む細胞培養培地中で上記細胞を培養する工程と、ｃ）ＴＧＦ－β阻害剤及びＦＧＦを除去し、工程ｂ）で得られた細胞を、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ－４）を含む細胞培養培地中で培養し、これにより眼球前駆細胞を生成する工程と、ｄ）上記眼球前駆細胞を角膜分化培地中で培養し、これによりＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞を生成する工程と、ｅ）上記ＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞を、ＥＧＦ及び少なくとも１種のＷｎｔ活性化因子を含む維持細胞培養培地中で培養し、これにより工程ａ～ｄ）を経て得られたＡＢＣＧ２陽性輪部幹細胞の表現型を維持する工程と含む方法。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ活性化因子は、ＧＳＫ３阻害剤、好ましくはＣＨＩＲ９９０２１、及びＲ－スポンジンファミリーのタンパク質、好ましくはＲ－スポンジンｇ－１又はそのサプリメントＲＳ－２４６２０４からなる群から選択される。いくつかのさらなる実施形態では、培養培地は、ノギン又はそのサプリメント、例えばＬＤＮ－１９３１８９も含んでよい。

本発明のさらなる態様、特定の実施形態、目的、詳細、及び利点は、以下の図面、詳細な説明、及び実施例に記載されている。

以下では、添付の図面を参照して、好ましい実施形態によって本発明をより詳細に説明する。

本発明の方法の模式図。図１Ａは、多能性幹細胞からのＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞の製造方法の１つの実施形態を示す。図１Ｂは、初代角膜輪部幹細胞のＡＢＣＧ２陽性表現型を維持する方法の１つの実施形態を示す。 ｈＰＳＣ－ＬＳＣ分化中の推定ＬＳＣマーカー発現の特性評価。（図２Ａ）ＩＦで示した、選択した時間点でのｈＰＳＣ－ＬＳＣ培養物の代表的な形態及びタンパク質発現。同じ縦列のすべての画像にスケールバー１００μｍが適用される。細胞核はＤＡＰＩで対比染色されており、各パネルの右上隅に表示されている。（図２Ｂ）１０日目及び２４日目のｈＰＳＣ－ＬＳＣ集団におけるマーカー発現の違い。１試料あたり５枚の画像と、各時間点で最低１４００個の細胞を、サイトスピン試料から各マーカーについて分析した。データはｎ＝２～３の個々の細胞分化の平均値＋ＳＤで示している。（図２Ｃ）２４日目のサイトスピン試料におけるΔＮｐ６３とｐ６３αとの二重染色の代表的なＩＦ画像であり、ΔＮｐ６３α陽性の表現型を確認する。Ｃ及びＤの両方にスケールバー１００μｍが適用される。（図２Ｄ）１０日目のサイトスピン試料におけるＡＢＣＧ２とｐ６３αとの二重染色の代表的なＩＦ画像であり、共局在パターンを示している。（図２Ｅ）サイトスピン試料から分析した、１０日目及び２４日目のｈＰＳＣ－ＬＳＣにおけるｐ６３α及びＡＢＣＧ２の発現とその共局在。１試料あたり５枚の画像と、各時間点で最低３０００個の細胞を、二重染色したサイトスピン試料から分析した。データはｎ＝３の個々の細胞分化の平均＋ＳＤで示している。（図２Ｆ）各試料の１０，０００個の記録されたイベントからＦＡＣＳを用いて分析した、ＵＤ－ｈＰＳＣ、１０日目及び２４日目のｈＰＳＣ－ＬＳＣにおけるＡＢＣＧ２タンパク質の発現レベル。データはｎ≧３の個々の細胞分化の平均値＋ＳＤで示し、統計はマン・ホイットニー（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ）のＵ検定で計算した。（図２Ｇ）各試料について３つのテクニカルレプリケート（技術的反復）を用いてｑＲＴ－ＰＣＲで分析した、ＵＤ－ｈＰＳＣ、１０日目及び２４日目のｈＰＳＣ－ＬＥＳＣにおける相対的なＡＢＣＧ２ ｍＲＮＡの発現レベル。データはｎ＝２の個々の細胞分化の平均＋ＳＤで示している。すべての代表的なデータは、ｈＥＳＣ株Ｒｅｇｅａ０８／０１７で示されている。 ｈＰＳＣ－ＬＳＣの形態及びｐ６３α／ＡＢＣＧ２の発現に対する培養条件の影響。角膜分化（ＣｎＴ－３０）条件と、ＡＢＣＧ２陽性ＬＳＣ維持（Ｃｎｔ－０７＋ＥＮＲＣ）条件とで培養を続けた（全培養時間のうち）２１日目の代表的な細胞形態並びにｐ６３α及びＡＢＣＧ２タンパク質の発現。（図３Ａ）Ｐ６３α及びＡＢＣＧ２の発現パターンは、Ｃｎｔ－０７＋ＥＮＲＣ条件で細胞を継代した後も維持されていた。（図３Ｂ）角膜分化条件（ＣｎＴ－３０）と、ＡＢＣＧ２陽性ＬＳＣ維持条件（Ｃｎｔ－０７＋ＥＮＲＣ）とで培養を続けた（全培養時間のうち）２１日目のｈＰＳＣ－ＬＳＣの相対的なＡＢＣＧ２ ｍＲＮＡ発現。（図３Ｃ）代表的なデータはすべてｈＥＳＣ株Ｒｅｇｅａ０８／０１７で示されている。すべての画像のスケールバーは１００μｍ。 継代中のＡＢＣＧ２陽性ｈＰＳＣ－ＬＳＣのマーカー発現及び増殖能力。（図４Ａ）ヒトＰＳＣ－ＬＳＣコロニーは、ＣｎＴ－０７＋ＥＮＲＣ条件で継代した後も、その形態及びｐ６３α／ＡＢＣＧ２の発現パターンを維持している。黒のスケールバーは２００μｍであり、白のスケールバーは１００μｍである。個体数（集団）倍加時間が安定していることからもわかるように、５回の継代の過程で２０，２０の個体数（集団）の倍加が達成され、培養が疲弊する明確な兆候は見られなかった（図４Ｂ～図４Ｃ、黒点）。継代３で細胞を凍結保存しても、ｈＰＳＣ－ＬＳＣの増殖能力には影響がないようであった（図４Ｂ～図４Ｃ、白枠）。代表的なデータはすべての、ｈＥＳＣ株Ｒｅｇｅａ１１／０１３で示されている。

本発明は、多能性幹細胞をまず眼球前駆細胞に誘導し（誘導期）、次いでこの眼球前駆細胞をＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞（角膜上皮幹細胞）に分化させ（分化期）、次いでＡＢＣＧ２の発現を維持する（維持期）ことによる、ＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞の製造方法を提供する。初代角膜輪部幹細胞及び多能性幹細胞由来の角膜輪部幹細胞を含む、角膜輪部幹細胞のＡＢＣＧ２陽性表現型を維持する方法も提供する。さらには、本発明は、本発明に従って得られた又は維持されたＡＢＣＧ２陽性細胞の治療的使用に関する。

細胞
本明細書で使用する場合、用語「角膜輪部幹細胞」は、角膜輪部の基底部上皮層に位置し、角膜上皮の再増殖を担う成体幹細胞を指す。この用語は、「輪部幹細胞（ＬＳＣ）」、「輪部上皮幹細胞（ＬＥＳＣ）」、「角膜上皮幹細胞」及び「角膜上皮前駆細胞」という用語と交換可能である。本明細書で使用する場合、用語「前駆体」及び「前駆細胞」は、特段の記載がない限り、互換的に使用されてもよい。

本明細書で使用する場合、用語「初代角膜輪部幹細胞」は、生体組織から直接採取された角膜輪部幹細胞を指す。初代角膜輪部幹細胞を得るための手段及び方法は、当該技術分野において容易に利用可能である。

本明細書で使用する場合、用語「多能性幹細胞由来の角膜輪部幹細胞」は、多能性幹細胞に由来する角膜輪部幹細胞を指す。いくつかの実施形態では、本発明は、多能性幹細胞をまず眼球前駆細胞に誘導し（誘導期）、次いでこの眼球前駆細胞を、所望に応じて高増殖性のΔＮｐ６３α陽性の輪部上皮前駆細胞に、そして最終的に成熟した角膜上皮細胞に向けてさらに分化させることができるＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞に分化させる（分化期）ことによる、ＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞の製造方法を提供する。

本明細書で使用する場合、用語「多能性幹細胞」は、胚外組織を含まない、ヒト又は動物の体のすべての細胞型に分化する可能性を有するあらゆる幹細胞を指す。これらの幹細胞には、胚性幹細胞（ＥＳＣ）及び人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）の両方が含まれる。従って、本発明での使用に適した細胞は、ｉＰＳＣ及びＥＳＣから選択される幹細胞を含む。ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）が好ましく、それらには、ヒトｉＰＳＣ（ｈｉＰＳＣ）及びヒトＥＳＣ（ｈＥＳＣ）が含まれる。

ＥＳＣ、とりわけｈＥＳＣは、培養中に無限の増殖が可能であり、従って、故障や欠陥のあるヒト組織の代替となる細胞及び組織を供給することができるため、治療上非常に興味深い。しかしながら、ヒト胚性幹細胞から眼球前駆細胞を製造することは、倫理的な課題に直面する可能性がある。本発明の一実施形態によれば、当該方法自体又はあらゆる関連する行為が、ヒト胚の破壊を伴わないという但し書きの下、ヒト胚性幹細胞が使用されてもよい。

一般にｉＰＳ細胞又はｉＰＳＣと略される人工多能性幹細胞は、非多能性細胞、典型的には成体（成人）の体細胞から、当該技術分野で周知の手段及び方法によって特定の遺伝子の強制的な発現を誘導することにより、人工的に誘導される一種の多能性幹細胞である。ｉＰＳ細胞を使用する利点は、胚細胞を一切使用する必要がないため、倫理的な問題を回避できることである。さらなる利点は、ｉＰＳＣ技術を採用することで、免疫拒絶反応の問題がない患者特異的な細胞の生成が可能になることである。それゆえ、本発明の一実施形態によれば、ｉＰＳ細胞の使用が好ましい。臨床用途では、ｈｉＰＳ細胞が好ましい。

人工多能性幹細胞は、多くの側面において、胚性幹細胞等の天然の多能性幹細胞と類似している。例示的な側面としては、特定の幹細胞遺伝子及びタンパク質の発現、クロマチンメチル化パターン、倍加時間、胚様体形成、奇形腫（テラトーマ）形成、生存可能なキメラ形成、効力及び分化能等が挙げられるが、天然の多能性幹細胞との関係の全容はまだ評価されているところである。人工多能性細胞は、典型的には、成体の皮膚細胞、血液細胞、胃又は肝臓から作られるが、他の代替物も可能である。当業者は、研究及び治療目的のためのｉＰＳ細胞の可能性をよく知っている。

多能性幹細胞は、自然な細胞の運命に従って自発的に分化する傾向があるため、細胞培養で維持するのは困難である。望ましくない分化を防ぐために、多能性幹細胞は通常、フィーダー細胞上で培養される。ヒト多能性細胞のフィーダー細胞としてであっても、マウス胚性線維芽細胞（マウス胎仔線維芽細胞）（ＭＥＦ）等の動物由来のフィーダー細胞が広く用いられている。また、動物由来の材料に代わるものとして、ヒト多能性幹細胞の培養には、ヒト包皮フィーダー細胞等のヒト由来のフィーダー細胞も採用されている。従って、いくつかの実施形態では、フィーダー細胞上で、好ましくはヒト包皮フィーダー細胞等のヒトフィーダー細胞上で培養された多能性幹細胞が、ＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞の当該製造方法に採用されてもよい。

フィーダー細胞の使用に関連する欠点を克服するために、新しいフィーダーフリーの細胞培養方法が開発されている。従って、用語「フィーダーフリー培養」又はその言語的変化は、フィーダー細胞を一切使用しないで多能性幹細胞を培養することを指す。

フィーダー細胞の使用は、例えば、当該技術分野で周知のように、適切な基材コーティングで置き換えることによって省略することができる。適切なコーティング材料としては、ラミニン、コラーゲン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ナイドジェン、プロテオグリカン、及びＥ－カドヘリン等のヒト又は動物の、天然抽出の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）タンパク質若しくは組換え細胞外マトリクス（ＥＣＭ）タンパク質、並びにそのアイソフォーム、フラグメント、及びペプチド配列が挙げられるが、これらに限定されない。上記ＥＣＭタンパク質のアイソフォームの非限定的な例としては、ラミニンの異なるアイソフォーム、例えば、ラミニン－５１１、ラミニン－５２１、ラミニン－３２２、ラミニン－４１１等が挙げられる。上記フラグメントの非限定的な例としては、ヒトラミニンアイソフォームのＥ８フラグメントが挙げられ、一方、上記ペプチド配列の非限定的な一例は、ビトロネクチンのＡｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列である。上記ＥＣＭタンパク質、アイソフォーム、フラグメント、又はペプチド配列は、他のタンパク質と融合していてもよく、ＩｇＧ－Ｆｃドメインと融合したＮ－カドヘリンドメインは、そのような融合タンパク質の非限定的な一例である。代替又は追加の適切なコーティング材料としては、マウス胚性線維芽細胞、ヒト線維芽細胞、間葉系幹細胞、及び腫瘍等、ヒト若しくは動物由来の様々な組織型若しくは細胞型からのＥＣＭ又は基底膜抽出物が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる適切なコーティング材料としては、単独で、あるいはＥＣＭタンパク質若しくはその配列、若しくは他の化学的若しくは物理的な表面修飾で機能化された、天然又は合成の生体材料及びそのハイブリッドが挙げられる。このような生体材料の非限定的な例としては、ＰＭＥＤＳＡＨ（ポリ［２－（メタクリロイルオキシ）エチル－ジメチル－（３－スルホプロピル）アンモニウムヒドロキシド］）及びコラーゲングラフト混合セルロースエステル膜（ＭＣＥ－ＣＯＬ）が挙げられる。さらなる適切なコーティング材料の非限定的な例としては、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標） Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ（登録商標）表面、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標） ＰｕｒｅＣｏａｔ（商標）、ＣＥＬＬｓｔａｒｔ（商標）、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、又はＧｅｌｔｒｅｘ（登録商標）等の市販品が挙げられる。上述のタンパク質、アイソフォーム、フラグメント、ペプチド配列、融合タンパク質、抽出物、生体材料又は市販品のいずれも、当該技術分野で周知のように、フィーダー細胞を置き換えるために、単独で、又は任意の適切な組み合わせ若しくは混合物で使用されてもよい。フィーダー細胞を置き換えるための適切なコーティング材料を入手し、選択し、及び使用するための手段並びに方法は、当該技術分野で容易に利用可能である。

上記に従い、フィーダーフリー条件で培養された多能性幹細胞は、ＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞の当該製造方法のいくつかの実施形態において採用されてもよい。

好ましい細胞外マトリクスタンパク質としては、それぞれ５つ、４つ及び３つの遺伝子変異体が見つかっているα鎖、β鎖及びγ鎖を含むヘテロ三量体の糖タンパク質であるラミニンが挙げられる。ラミニン分子は、その鎖の組成に応じて名前が付けられている。従って、本明細書で使用する場合、用語「ラミニン－５２１」は、α５、β２、及びγ１鎖を含有するラミニンを指し、一方、用語「ラミニン－５１１」は、α５、β１、及びγ１鎖を含有するラミニンを指す。好ましいラミニンとしては、組換えヒトラミニン－５２１、組換えヒトラミニン－５１１、及び組換えヒトラミニン－５１１のフラグメントＥ８が挙げられる。

ヒト多能性幹細胞は、フィーダー細胞上ではコロニーとして成長するが、ヒト多能性幹細胞は、ラミニン５２１上でのフィーダーを使用しない培養では単層として成長し、より効果的な増殖が可能となる。さらに、フローサイトメトリーによる解析では、フィーダーフリー培養系で培養されたヒト多能性幹細胞は、フィーダー細胞上で培養された細胞と比較して、高い多能性マーカーの陽性率を示す。

実際、フィーダー細胞を含有する培養物から得られたヒト多能性幹細胞と、フィーダーフリー培養から得られたヒト多能性幹細胞は異なるように見える。国際公開第２０１８／０３７１６１号パンフレットの実験部分で実証されているように、欧州特許出願公開第２８２８３８０号明細書に開示されている角膜分化方法は、フィーダー細胞を含む培養物から得られたヒト多能性幹細胞に対しては良好な結果を与えるが、フィーダーフリー培養から得られた多能性幹細胞に対しては同様の良好な結果を与えない。他方、国際公開第２０１８／０３７１６１号パンフレットの方法では、フィーダーフリー培養から得られたヒト多能性幹細胞を、まず眼球前駆細胞に、そしてｐ６３陽性の角膜上皮前駆細胞（すなわち角膜輪部幹細胞）に、優れた態様で分化させることができる。今回は、本発明が、ＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞の優れた維持を提供する。このように、本発明のいくつかの実施形態では、フィーダーフリー培養から得られた未分化多能性幹細胞が、ＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞の製造に用いられる。しかしながら、本発明は、フィーダーフリー培養から得られたヒト多能性幹細胞の分化に限定されるものではなく、フィーダー細胞上で培養された多能性幹細胞をＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞に分化させるためにも用いられてよい。

本明細書で使用する場合、用語「眼球前駆細胞」は、多能性幹細胞から誘導され、かつ多能性マーカーＯＣＴ－４（ＰＯＵ５Ｆ１としても知られる）の下方制御及び眼球特異的な細胞系統への分化を示す遺伝子であるＰＡＸ６の上方制御を特徴とする眼球の任意の細胞系統を広く指す。多能性マーカーを定量化する手段及び方法は、当該技術分野で容易に利用可能である。

本明細書で使用する場合、用語「ｐ６３陽性角膜輪部幹細胞」は、細胞表面にｐ６３を発現する角膜輪部幹細胞の集団を指す。

本明細書で使用する場合、用語「ＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞」は、細胞表面にＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧメンバー２（ＡＢＣＧ２）を発現する角膜輪部幹細胞の集団を指す。

ＡＢＣＧ２及びｐ６３等の細胞表面マーカーは、免疫蛍光法及びフローサイトメトリー、例えば蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を含むがこれらに限定されない、この目的に適した任意の利用可能な技術によって定量化されてもよい。

ＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞の製造方法
国際公開第２０１８／０３７１６１号パンフレットは、フィーダーフリー培養から得られた多能性幹細胞を、まずＴＧＦ－β阻害剤及び線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）の存在下で、次いで骨形成タンパク質４（ＢＭＰ－４）の存在下で、眼球前駆細胞に誘導することによる、分化した眼球細胞の製造方法を開示する。このようにして得られた眼球前駆細胞は、次に、ＴＧＦ－β阻害剤、ＦＧＦ及びＢＭＰ－４を除去し、上記眼球前駆細胞を、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ヒドロコルチゾン、インスリン、イソプロテレノール、及びトリヨードチロニンからなる群から選択される１種以上のサプリメントの存在下で培養することにより、ｐ６３陽性角膜上皮前駆細胞（ｐ６３陽性角膜輪部幹細胞）に分化させられる。任意に、このｐ６３陽性の角膜上皮前駆細胞は、続いて、成熟角膜上皮細胞又は角膜重層上皮に成熟させることができる。

意外なことに、国際公開第２０１８／０３７１６１号パンフレットの方法を通して、異なる時間点でのいくつかの多能性マーカー、輪部幹細胞マーカー、及び角膜上皮マーカーの発現パターンを注意深く分析したところ、ＡＢＣＧ２は一過性にしか発現されず、１０～１１日目にピークを迎え、その後、分化プロトコルの２１日目（４日間の誘導期間を含む）までに非常に低いレベルまで徐々に減少することが明らかになった。同時に、ｐ６３のΔＮｐ６３αアイソフォームの発現は着実に増加していた。加えて、培養培地に少なくとも上皮成長因子（ＥＧＦ）及び少なくとも１種のＷｎｔ活性化因子を補充することで、継代せずに少なくとも３５日目まで、サブコンフルエントな培養物を継代して少なくとも５０日目まで、ＡＢＣＧ２の強い発現を維持できることが予想外にも判明した。

このように、本発明は、ＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞を製造及び維持する方法を提供し、この方法は、以下に詳細に説明するように、そして表１にまとめられているように、誘導期、分化期及び維持期を含む。

誘導期
誘導期では、得られた多能性幹細胞が、表面外胚葉及び眼球前駆細胞に誘導される。

誘導期は、懸濁培養でも接着培養でも行われてよい。誘導期が接着培養で行われる場合、当該技術分野で一般に公知のように、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）タンパク質又はその組み合わせ等の材料でコーティングされた基板を使用することが有利である場合がある。好ましいＥＣＭタンパク質としては、ラミニン、コラーゲン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ナイドジェン、及びプロテオグリカン又はそのペプチド配列が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、フィーダー細胞を置き換えるのに適した任意のコーティングを使用して、誘導期を接着培養で実施できるようにしてもよい。

いくつかの実施形態では、懸濁培養で誘導期を実施することが好ましい。このような実施形態では、誘導期の第１工程は、フィーダーフリー培養から得られた多能性幹細胞から胚様体を形成することを含む。本明細書で使用する場合、用語「胚様体」（ＥＢ）は、３次元の細胞集合体を指す。胚様体の形成は、当該技術分野で周知の様々な凝集促進方法によって達成することができる。

本明細書で使用する場合、用語「凝集促進方法」は、物理的又は化学的手段によって多能性幹細胞からの胚様体の形成を促進することができる任意の方法を指す。

胚様体の形成は、例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標） Ｃｏｓｔａｒ（登録商標） 超低接着表面等の非付着促進性の細胞培養表面の存在下で、又は細胞の付着を防止する１種以上の薬剤の存在下で、懸濁培養で多能性幹細胞を培養する物理的凝集促進方法を採用することによって達成することができる。

ＥＢ形成を達成するために凝集を促進する適切な物理的方法のさらなる非限定的な例としては、懸滴培養が挙げられる。このような方法では、多能性幹細胞を含む懸濁液をペトリ皿の蓋の上に規則的な配列でプレーティングし、その後、ＰＢＳ等の適切な液体で満たされたペトリ皿の底に反転した蓋を置き、滴が乾燥するのを防ぐ。最終的には、幹細胞は垂れ下がった液滴の底に落ち、１滴につき１つのＥＢに集約される。Ｐｅｒｆｅｃｔａ３Ｄ（登録商標） Ｈａｎｇｉｎｇ Ｄｒｏｐ Ｐｌａｔｅｓ （３Ｄ Ｂｉｏｍａｔｒｉｘ（スリーディー・バイオマトリクス））等、懸滴法に基づく市販品も使用してよい。

適切な物理的な凝集促進方法としては、マルチウェル技術及び微細加工技術を用いて、例えば、低接着性の９６ウェルプレート又はマイクロウェルアレイを用いて、大きさが制御されたＥＢの形成を誘導する方法も挙げられる。このようなプレート又はアレイの非限定的な例としては、マイクロウェルがパターン化されたマイクロウェル付きポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）モールド、アガロースヒドロゲルのマイクロウェルアレイ、及び市販のＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ステムセル・テクノロジーズ））マイクロアレイプレートが挙げられる。

また、ＥＢ形成を得るための物理的な凝集促進方法として、遠心分離若しくは回転、又は微小重力環境等の他の物理的環境による強制的な凝集が採用されてもよい。

さらなる好適な凝集促進方法としては、細胞の凝集を助ける薬剤の存在下で細胞を培養する方法が挙げられる。このような薬剤の非限定的な例としては、ガラクトース誘導体（例えばカラギーナン）、グルコース誘導体（例えばデキストラン硫酸）、ポリエチレングリコール、Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）等の、細胞をより緊密に接触させる高分子クラウダー（高分子量混み合い分子）が挙げられる。

また、メチルセルロース、フィブリン、ヒアルロン酸、デキストラン、アルギン酸、又はアガロース等のヒドロゲルに多能性幹細胞を封入又は捕捉することで、半固体の懸濁培地中に個別に分離したＥＢを生成する物理的凝集促進方法を用いてもよい。

任意の適切な物理的凝集促進方法が、ブレビスタチン若しくはＲｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤等の１種以上の凝集促進化学剤、又は単一細胞の生存率を高め、かつ／若しくは幹細胞の凝集を促進する他のアポトーシス阻害剤と組み合わせて使用されてもよい。あるいは、細胞の凝集が、化学的手段のみにより、例えば、上記の化学剤を使用することにより促進されてもよい。

従来、胚様体は、付着したコロニー又は付着したコロニーの領域を手動で分離することによっても、多能性幹細胞から形成されてよい。しかしながら、本発明の方法のいくつかの実施形態においては、フィーダーフリー条件で培養された多能性幹細胞は、手動で小さな凝集体又は単一細胞に解離させた後には自発的に再凝集しないため、手動での分離は、胚様体を得るための実行可能な選択肢ではない。ＲＯＣＫ阻害剤又はブレビスタチン等の１種以上の凝集促進剤を添加すると、解離によって誘導されるアポトーシスが顕著に減少し、解離後に胚様体を形成することができる。

胚様体の形成に必要な時間は、使用する方法等の様々な変動因子によって変わる可能性がある。典型的には、この工程の継続時間は、約１時間～約４８時間の間、より具体的には約５時間～約２４時間の間、又は一晩、すなわち約１８時間である。しかしながら、ある場合には、この工程の継続時間は４８時間よりもさらに長くてもよい。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は、胚様体の形成のために、ブレビスタチンの存在下で約１日間培養される。

誘導期の第２工程では、誘導期の第１工程から得られた胚様体を、活性のある「誘導サプリメント」、すなわちＴＧＦ－β阻害剤及びＦＧＦを含む誘導培地に供する。接着性の細胞が用いられる場合（すなわち、胚様体を形成する工程が省略される場合）、細胞を誘導培地に供することは、誘導期の第１工程とみなされてもよい。上記誘導サプリメントは、多能性幹細胞の眼球前駆細胞への誘導を増進し、臨床的に価値のある角膜輪部幹細胞へのさらなる分化効率を向上させることが判明した。

いくつかの好ましい実施形態では、誘導培地中のＴＧＦ－β阻害剤の量は、約１μＭ～約１００μＭ、好ましくは約１～約３０μＭであり、かつ／又は、線維芽細胞成長因子の量は、約１ｎｇ／ｍｌ～約１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約２ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約３０ｎｇ／ｍｌ～約８０ｎｇ／ｍｌである。

本発明の誘導培地は、基礎培地及び本発明の誘導サプリメントから構成されているか、又は基礎培地及び本発明の誘導サプリメントを含むと考えられてもよい。しかしながら、当該技術分野で一般的なさらなるサプリメントが適用されてもよい。本明細書で使用する場合、用語「一般的な細胞培養用サプリメント」は、抗生物質、Ｌ－グルタミン、及び血清、血清アルブミン又は血清代替物、好ましくは規定の（限定された）血清代替物を含む、実質的にすべての細胞培養培地で使用される材料を指す。

他方、いくつかの実施形態では、誘導培地は、誘導サプリメント、基礎培地、抗生物質、Ｌ－グルタミン、及び規定の血清代替物以外の材料を含まない。

いくつかのより具体的な実施形態では、誘導サプリメントとして、式Ｉ又は式ＩＩのＴＧＦ－β阻害剤、及びｂＦＧＦが使用される。いくつかのさらに具体的な実施形態では、誘導サプリメントは、ＳＢ－５０５１２４、及びｂＦＧＦである。いくつかのなおさらに具体的な実施形態では、ＳＢ－５０５１２４は、約１０μＭの濃度で使用され、ｂＦＧＦは、約５０ｎｇ／ｍｌの濃度で使用される。

上述の実施形態のいずれも、誘導培地が、神経分化を含む眼球系統以外の系統への分化を誘導することが一般的に知られているいかなるサプリメントも含まない、追加又は代替の実施形態の基礎を形成してもよい。そのような一般的に公知のサプリメントとしては、レチノイン酸、アスコルビン酸、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、及びグリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの好ましい実施形態では、誘導培地は、Ｗｎｔ阻害剤を含有しない。

誘導サプリメントを用いて接着細胞又は胚様体を誘導するために使用される時間は、細胞株、細胞の初期分化状態、並びに使用する特定のサプリメント及びその濃度等の様々な変動因子に応じて変化する可能性がある。典型的には、この工程の継続時間は、約１日～約７日（すなわち、約２２時間～約１８５時間）、より具体的には、約１日～約５日（すなわち、約２２時間～約１３２時間）で変化する。いくつかの実施形態では、胚様体は誘導サプリメントの存在下で約１日間（すなわち、約２２時間～約２６時間）培養される。

誘導期の次の工程では、第１の誘導サプリメント（ＴＧＦ－β阻害剤及びＦＧＦ）が除去され、誘導期の前の工程から得られた接着細胞又は胚様体が、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ－４）の存在下で培養されて、細胞が表面外胚葉に導かれ、同時に神経系統への分化が防がれる。典型的な濃度としては、約１ｎｇ／ｍｌ～約１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌ～約５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約２５ｎｇ／ｍｌが挙げられる。

ＢＭＰ－４を用いて接着細胞又は胚様体を誘導するために使用される時間は、ＢＭＰ－４の濃度等の様々な変動因子に応じて変化する可能性がある。典型的には、この工程の継続時間は、約１２時間～約５日間（すなわち、約１２時間～約１３２時間）、好ましくは約２４時間～約４日間（すなわち、約２４時間～約１０５時間）、より具体的には２日間（すなわち、約４３時間～約５３時間）で変化し、この時間は、培養培地を新鮮な培地に交換することを含んでも含まなくてもよい。いくつかの実施形態では、この工程は、約２日間、好ましくはまず、好ましくは約２５ｎｇ／ｍｌの量のＢＭＰ－４を補充した培地で約１日間、その後、同じく好ましくは約２５ｎｇ／ｍｌの量のＢＭＰ－４を補充した新鮮な培地でさらに約１日間実施される。

誘導期の全体的な継続時間（期間）は、様々な変動因子に応じて変化してもよい。典型的には、誘導期の継続時間は、２日程度から数日の範囲で変化する可能性がある。好ましい時間範囲は、約２．５日～約１８日、すなわち、約５４時間～約４７５時間である。いくつかの実施形態では、誘導期の好ましい全体の継続時間は、約３日～約７日（すなわち、約６５時間～約１８５時間）、又は約３日～約５日（すなわち、約６５時間～約１３２時間））である。より具体的には、誘導期の好ましい全体の継続時間は、任意の１日間の胚様体形成工程を含めて４日間である。本明細書で使用する場合、用語「約」は、指定された値の約１０％の変動を意味する。従って、例えば、用語「約３日」には６５時間～７９時間の変動があり、他方、用語「約７日」には１５２時間～１８６時間の変動がある。誘導時間が短いと、ＯＣＴ４の下方制御及びＰＡＸ６の上方制御が弱くなり、前駆体マーカーであるＰＡＸ６やｐ６３の発現が弱くなることによって判断されるように、分化の効率が悪くなる可能性がある。さらに、ヒト多能性幹細胞は、とりわけ塩基性線維芽細胞成長因子の存在下で、神経系統に分化する傾向があることが知られているため、誘導時間を長くすれば、より多くの神経分化が予想できる。

凝集促進剤
本明細書で使用する場合、機能的用語「凝集促進剤」は、胚様体の形成を促進することができる薬剤を指す。凝集促進剤の非限定的な例としては、以下に詳細を開示するブレビスタチン及びＲｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤が挙げられる。

ブレビスタチンは、非筋肉性ミオシンＩＩの細胞透過性の、選択的でかつ可逆的な阻害剤である。その名前は、細胞の小疱形成（ブレッビング）を阻害する能力に由来する。アクチン－ミオシン系の細胞骨格は、細胞の収縮、運動性、及び組織の構築に不可欠な動的な系である。アクチン－ミオシンモーターは、アクチンフィラメントと、アクチンフィラメントに沿って滑ることで収縮をもたらす非筋肉性のミオシンＩＩ重鎖とからなる。このプロセスは、Ｒｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）等のキナーゼを介したリン酸化により活性化されるミオシン軽鎖の結合によって開始（トリガ）される。ＥＣＭ及び上皮細胞との接触がなくなると、アクチン－ミオシンは自由に収縮できるようになり、細胞膜が過度に小疱形成し、最終的には細胞死に至る等、表現型に変化が生じる。個体差のあるヒトＥＳ細胞でアクチン－ミオシン収縮を阻害すると、細胞の生存率やクローニングの効率が劇的に向上する。アクチン－ミオシン収縮は、ＲＯＣＫ制御の下流の標的である。ブレビスタチンは当該技術分野で容易に利用可能である。

ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ ｆｏｒｍｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ（ＲＯＣＫ、Ｒｈｏ関連コイルドコイル形成プロテインセリン／スレオニンキナ－ゼ）ファミリーのプロテインキナーゼの、細胞透過性の、非常に強力かつ選択的な阻害剤である。ＲＯＣＫ阻害剤の非限定的な例としては、クロマン１、ファスジル、ファスジル塩酸塩、ＧＳＫ２６９９６２Ａ、ＧＳＫ４２９２８６Ａ、Ｈ－１１５２、Ｈ－１１５２二塩酸塩、ヒドロキシファスジル、ヒドロキシファスジル塩酸塩、Ｋ－１１５、Ｋ－１１５遊離塩基、ＬＸ７１０１、ＲＫＩ－１４４７、ＲＯＣＫ阻害剤（アザインドール１）、ＳＡＲ４０７８９９、ＳＡＲ４０７８９９塩酸塩、ＳＬｘ－２１１９、ＳＲ－３６７７、チアゾビビン、及びＹ－２７６３２が挙げられ、これらはすべて、例えばＭｅｄＣｈｅｍ Ｅｘｐｒｅｓｓ（メドケム・エクスプレス）から入手可能である。

好ましいＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ－２７６３２（ジヒドロクロリドトランス－４－［（１Ｒ）－１－アミノエチル］－Ｎ－４－ピリジニルシクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩）であり、これは、触媒部位への結合についてＡＴＰと競合することにより、ＲＯＣＫ１及びＲＯＣＫ２の両方を阻害する。さらに、Ｙ－２７６３２は、多能性幹細胞のアポトーシス（アノイキス）の強力な阻害剤であり、解離したヒト多能性幹細胞の生存を許容し、強制凝集プロトコルにおける胚様体形成を改善し、凍結保存された単一のヒトＥＳ細胞の解凍後の生存率を向上させる。

当業者は、当該技術分野で容易に利用可能な様々な方法を用いて、所与の薬剤が凝集促進活性を有するか否か、及び当該方法での使用に適しているか否かを容易に判断することができる。そのような方法の非限定的な例としては、凝集体形成の視覚的評価及び細胞生存率アッセイが挙げられる。

ＴＧＦ－ベータ（ＴＧＦ－β）阻害剤
本明細書で使用する場合、「ＴＧＦ－β阻害剤」は、機能的に、形質転換成長因子β１を阻害できる物質を指す。

形質転換成長因子β１（ＴＧＦ－β１）は、病気の状態及び正常な状態での成長、分化、遊走、細胞の生存、接着等、多くの生物学的活動に関与する多面的サイトカインの大規模なスーパーファミリーのメンバーである。このスーパーファミリーでは３０近いメンバーが同定されている。これらは２つの主要な枝、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ／Ｎｏｄａｌ及びＢＭＰ／ＧＤＦ（Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ（骨形成タンパク質）／Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（成長分化因子））、に分類されると考えられている。これらは非常に多様で、しばしば補完的な機能を持っている。胚の発生過程で短期間しか発現しないものや、限られた種類の細胞でしか発現しないもの（例えば、抗ミュラー管ホルモン、ＡＭＨ、インヒビン）もあれば、胚形成の間及び成体の組織において広く発現するもの（例えば、ＴＧＦβ１、ＢＭＰ４）もある。ＴＧＦ－β１は、細胞外マトリクス（線維化因子）の合成における強力な制御因子であり、創傷治癒にも関与している。

化学的、構造的に見て、適切なＴＧＦ－β阻害機能は、タンパク質及び低分子有機化合物の中に見出されてもよい。当業者であれば、生物学的マトリクスからタンパク質を単離する手段、又は組換え技術によってタンパク質を生成する手段を知っている。

ＴＧＦ－β阻害活性を示す化合物は、スクリーニングによって見つけられてもよい。好ましくは、ＴＧＦ－β阻害剤は、比較的低いモル質量を有する有機分子、例えば、８００ｇ／モル未満、好ましくは５００ｇ／モル未満のモル質量を有する低分子である。一般的な構造として、好適な低モル質量のＴＧＦ－β阻害剤である式Ｉは、以下のように記述されてもよい。

上記式Ｉ中、Ｒ_１はＣ_１～Ｃ_５脂肪族アルキル基、カルボン酸、アミドを表し、Ｒ_２はＣ_１～Ｃ_５脂肪族アルキルを表し、Ｒ_３及びＲ_４はヘテロ原子、Ｏ又はＮを含む脂肪族アルキルを表し、これらは互いに連結して５員又は６員のヘテロ環を形成してもよい。

典型的な構造は、２個の酸素原子を有するヘテロ環を含み、一般式ＩＩの低分子と呼べる場合である。

上記式ＩＩ中、Ｒ_１は、Ｃ_１～Ｃ_５脂肪族アルキル基、芳香族カルボン酸又はアミドを表し、Ｒ_２は、Ｃ_１～Ｃ_５脂肪族アルキルを表す。

このようなＴＧＦ－β阻害剤の１つの非限定的な例は、ＳＢ ４３１５４２としても知られている４－［４－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－５－（２－ピリジニル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］－ベンズアミドであり、これは、複数の供給元から市販されており、トランスフォーミング成長因子－βＩ型受容体（ＡＬＫ５）、ＡＬＫ４及びＡＬＫ７の選択的阻害剤として販売されている。特異的なＴＧＦ阻害剤の別の非限定的な例は、ＳＢ ５０５１２４としても知られている２－（５－ベンゾ［１，３］ジオキソール－５－イル－２－ｔｅｒｔ－ブチル－３Ｈ－イミダゾール－４－イル）－６－メチルピリジン塩酸塩水和物である。

しかしながら、ＴＧＦ－β阻害活性を示すか、又はＴＧＦ阻害剤として市販されている他の小分子も、本発明の文脈において同様に好適である可能性がある。化学合成又は組換え生産によって得られる物質から上記ＴＧＦ－β阻害剤を選択する場合、規定培地を提供することができる。これは、ゼノフリー及び無血清（セラムフリー）の条件の要件にも適合する。

当業者であれば、当該技術分野で容易に利用可能な様々な方法を用いて、所与の薬剤がＴＧＦ－β阻害活性を有するか否か、及び当該方法での使用に適しているか否かを容易に判断することができる。

線維芽細胞成長因子
本発明の誘導培地では、分化に寄与するために、線維芽細胞成長因子が必要である。線維芽細胞成長因子、又はＦＧＦは、一般に血管新生、創傷治癒及び胚発生に関与する成長因子の一群である。ＦＧＦはヘパリン結合タンパク質であり、細胞表面に結合したヘパラン硫酸プロテオグリカンとの相互作用がＦＧＦのシグナル伝達に必須であることが示されている。ＦＧＦは、様々な細胞及び組織の増殖分化の過程において重要な役割を果たす。

本発明での使用に適した好ましい線維芽細胞成長因子は、塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ又はＦＧＦ－２）である。しかしながら、いくつかの実施形態では、ＦＧＦの代わりに、線維芽細胞成長因子受容体を活性化するように設計された（例えば、組換えＤＮＡバリアント又は変異体によって産生される）特定の合成低分子ペプチド等の他の材料が使用されてもよい。線維芽細胞成長因子は、基礎培地として使用される血清代替物に含まれていてもよいし、本発明に係る最終的な細胞培養培地に別途添加されてもよい。

分化期
必ずではないが好ましくは懸濁培養で行われる上述の誘導期に続いて、接着培養での分化期が行われる。後者の段階では、誘導期で産生された眼球前駆細胞が、ＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞に分化される。

分化期は接着培養で行われるべきであり、上皮細胞にとっては細胞外マトリクス（ＥＣＭ）に付着する能力が重要であると考えられているため、当該技術分野で一般に公知のＥＣＭタンパク質でコーティングされた細胞培養プレートやボトル等の基材を使用することが有利である。好ましいＥＣＭタンパク質としては、コラーゲンＩＶ及びラミニン、好ましくはラミニン－５２１及び／又はラミニン－５１１が挙げられる。より好ましくは、細胞培養基材は、コラーゲンＩＶとラミニン５２１及び／又はラミニン５１１との混合物でコーティングされ、さらに好ましくは、５μｇ／ｃｍ^２のコラーゲンＩＶ及び０．７５μｇ／ｃｍ^２のラミニン５２１でコーティングされる。他の適切なコーティング材料の非限定的な例としては、コラーゲンＩ、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ナイドジェン、プロテオグリカン、又はそれらのペプチド配列、それらを含む市販の接着培養基材、例えばＣＥＬＬｓｔａｒｔ（商標）、及びＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）又はＧｅｌｔｒｅｘ（登録商標）等の基底膜抽出物が挙げられる。さらに、フィーダー細胞の置き換えに適した任意のコーティングが分化期に使用されてもよい。ヒトでの使用においてゼノフリー条件が望まれる場合は、基質は、ヒト又は組換えヒト由来の１種以上のＥＣＭタンパク質でコーティングされるべきである。細胞培養基材をコーティングする手段及び方法は、当該技術分野で一般的に利用可能である。

典型的には、ＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞を得るには、眼球前駆細胞を本発明の角膜分化条件下で約３日～約１４日間、好ましくは約７日間培養する必要がある。いくつかの好ましい実施形態では、ＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞は、誘導期を約２．５日～約１８日間実施した後、角膜分化期を約３日～１４日間実施することにより得られる。いくつかのさらに好ましい実施形態では、ＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞は、誘導期を約４日間実施した後、角膜分化期を約６～７日間実施することにより得られる。この長さの分化段階の後に、最も純粋なＡＢＣＧ２陽性細胞集団を得ることができる。分化時間が短いと、より不均一な細胞集団が得られ、一方、分化時間が長いと、ＡＢＣＧ２の発現の消失とｐ６３の発現の出現が同時に起こり、その後、角膜上皮細胞への最終的な成熟が起こる。成熟した角膜上皮のマーカーの非限定的な例としては、ＣＫ１２及びＣＫ３が挙げられる。

本明細書で使用する場合、用語「角膜分化培地」は、角膜系統への細胞の分化、好ましくはＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞への分化を支持する細胞培養培地を指す。当業者であれば、当該技術分野で容易に利用可能な様々な方法を用いて、所与の細胞培地が角膜分化培地とみなされるか否か、ひいては本分化期での使用に適しているか否かを容易に判断することができる。

上記に従って、分化期での使用に適した培養培地は、例えば、ＣＥＬＬｎＴＥＣＨ（セルンテック）から市販されているＣｎＴ－３０等の任意の角膜培地、又は角膜上皮細胞の培養に適した任意のサプリメントホルモン上皮培地（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ ｈｏｒｍｏｎａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ、ＳＨＥＭ）であってもよい。他のいくつかの実施形態では、分化培地は、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ヒドロコルチゾン、インスリン、イソプロテレノール及びトリヨードチロニンからなる群から選択される１種以上の分化サプリメント等の材料を、任意の適切な基礎培地に添加することによって構成されてもよい。いくつかの実施形態では、角膜分化培地は、上記１種以上の分化成熟サプリメント、基礎培地、抗生物質、Ｌ－グルタミン、及び規定の血清代替物以外の材料を含有しない。すなわち、いくつかの実施形態では、上記角膜分化培地は、ＴＧＦ－β阻害剤、線維芽細胞成長因子、及びＢＭＰ－４、又は機能的に同等の薬剤といったいずれの材料も含まない。いくつかのさらなる実施形態では、上記角膜分化培地は、Ｗｎｔ阻害剤も含まない。

上述の実施形態のいずれも、分化培地が、神経分化を含む眼系統以外の細胞系統への分化を引き起こすことが一般的に知られているいかなるサプリメントも含まない、追加又は代替の実施形態の基礎を形成してもよい。そのような一般的に知られているサプリメントとしては、レチノイン酸、アスコルビン酸、ＢＤＮＦ、及びＧＤＮＦが挙げられるが、これらに限定されない。

維持期
上述の分化期の後には、接着培養による維持期が続く。この段階では、分化期で得られた角膜輪部幹細胞のＡＢＣＧ２陽性表現型が維持される。

維持期で使用するのに適した培養培地は、例えば、当該技術分野で入手可能で、角膜上皮細胞を培養するのに適した任意の角膜培地又は任意のサプリメントホルモン上皮培地（ＳＨＥＭ）であってよい。非限定的な例としては、ＣＥＬＬｎＴＥＣＨから市販されているＣｎＴ－０７及びＣｎＴ－３０、並びにＨｏｎｇｉｓｔｏら、２０１７、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓに開示されているＸＦＤＭ－が挙げられる。いくつかの他の実施形態では、維持培地は、任意の適切な基礎培地に、分化サプリメントとして少なくとも上皮成長因子（ＥＧＦ）及び少なくとも１種のＷｎｔ活性化因子を添加することによって構成されてもよい。好ましいＷｎｔ活性化因子としては、ＣＨＩＲ９９０２１等のグリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤、及びＲ－スポンジン又はＲＳ－２４６２０４等のその代替物が挙げられる。さらなる好ましい維持サプリメントは、ノギンである。いくつかの実施形態では、維持培地は、ヒドロコルチゾン、インスリン、イソプロテレノール、及びトリヨードチロニンをさらに含んでもよい。代替的又は追加的に、いくつかの実施形態では、維持培地は、上記維持サプリメント、基礎培地、抗生物質、Ｌ－グルタミン、及び規定の血清代替物以外の材料を含まない。従って、いくつかの実施形態では、培地は、ＴＧＦ－β阻害剤、線維芽細胞成長因子、及びＢＭＰ－４、又は機能的に同等の薬剤といったいずれの材料も含まない。

いくつかの実施形態では、ＡＢＣＧ２陽性表現型は、少なくとも５０日間、６回の継代にわたって、また、凍結保存にわたって維持される可能性がある。

上皮成長因子
本発明の分化培地において、角膜輪部幹細胞のＡＢＣＧ２発現を維持するためには、上皮成長因子が必要である。

いくつかの好ましい実施形態では、分化培地中のＥＧＦの量は、約１ｎｇ／ｍｌ～約１５０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約５ｎｇ／ｍｌ～約５０ｎｇ／ｍｌである。

いくつかの実施形態では、ＥＧＦの代わりに、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を活性化するように設計された（例えば、組換えＤＮＡバリアント又は変異体によって産生される）特定の合成低分子ペプチド等の他の材料が使用されてもよい。

ＥＧＦは、血清代替物、基礎培地で提供されてもよいし、ＥＧＦは、本発明に係る最終的な細胞培養培地に別途添加されてもよい。

Ｗｎｔ活性化因子
癌原遺伝子のＷｎｔファミリーは、少なくとも１６の公知のメンバーから構成されており、これらのメンバーは、発癌、並びに細胞運命及び胚発生の制御等のいくつかの他の発生プロセスに関与する分泌シグナル伝達タンパク質をコードしている。本明細書で使用する場合、用語「Ｗｎｔ活性化因子」は、Ｗｎｔシグナル伝達経路を活性化することができる物質を指す。タンパク質及び低分子のＷｎｔ活性化因子の両方が当該技術分野で公知である。

グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤は、本発明で使用するための好ましいＷｎｔ活性化因子の例示的なクラスである。複数の提供元から市販されているＣＨＩＲ９９０２１は、ＧＳＫ３の最も選択的な阻害剤であり、従って、本発明で使用するための特に好ましいＷｎｔ活性化因子である。さらなるＧＳＫ３阻害剤としては、ＳＢ－２１６７６３、ＢＩＯ（６－ブロモインジルビン－３’－オキシム）、ＬＹ２０９０３１４及び塩化リチウムが挙げられるが、これらに限定されるものではなく、これらはすべて市販されている。

いくつかの好ましい実施形態では、分化培地中のＣＨＩＲ９９０２１等のＧＳＫ３阻害剤の量は、約１μＭ～約１５μＭ、約１μＭ～約１０μＭ、約１μＭ～約５μＭ、好ましくは約３μＭである。

本発明での使用に適したＷｎｔ活性化因子の別のクラスは、Ｒ－スポンジンタンパク質ファミリーであり、その４つのメンバーは、Ｒ－スポンジン－１、Ｒ－スポンジン－２、Ｒ－スポンジン－３及びＲ－スポンジン－４として指定され、正統的なＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路の分泌されたアゴニストである。

いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ活性化因子はＲ－スポンジン－１である。好ましい濃度範囲としては、約１００ｎｇ／ｍｌ～約２μｇ／ｍｌ、約５００ｎｇ／ｍｌ～約２μｇ／ｍｌ、好ましくは約１μｇ／ｍｌが挙げられる。

ＲＳ－２４６２０４は、低分子のＲ－スポンジン－１代用物であり、これも本発明での使用に適している。好ましい濃度範囲としては、約６．２５μＭ～約２００μＭ、及び約２５μＭ～約５０μＭが挙げられる。

いくつかの実施形態では、分化サプリメントは、ＣＨＩＲ９９０２１等の少なくとも１種のＧＳＫ３阻害剤、及びＲ－スポンジン－１等の少なくとも１種のＲ－スポンジンを含んでもよい。いくつかの他の実施形態では、上記少なくとも１種のＧＳＫ３阻害剤の量を増加させることが、上記少なくとも１種のＲ－スポンジンの存在を置き換えるために使用されてもよく、その逆もまた同様である。

当業者は、当該技術分野で容易に利用できる様々な方法を用いて、所与の薬剤がＷｎｔ活性化特性を有するか否か、及び当該方法での使用に適しているか否かを容易に判断することができる。化合物は、Ｗｎｔ活性化因子として作用する能力について、例えば、市販の試験キット、Ｅｎｚｏ（エンゾ）から入手可能なＬＥＡＤＩＮＧ ＬＩＧＨＴ（登録商標） Ｗｎｔレポーターアッセイスターターキットを用いて試験することができる。

ノギン
ＮＯＧとしても知られるノギンは、神経組織、筋肉、及び骨を含む多くの身体組織の発達に関与するタンパク質である。

本発明のいくつかの実施形態では、分化培地は、角膜輪部幹細胞のＡＢＣＧ２発現を支援するために、ノギンをさらに含むか、又はノギンを補充されてもよい。

典型的には、分化培地中のノギンの量は、約１０ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌで変化してもよく、例えば約１００ｎｇ／ｍｌであってもよい。

ＬＤＮ－１９３１８９は、低分子のノギン代用物であり、本発明での使用にも適している。好ましい濃度範囲としては、例えば、約０．０１μＭ～約１μＭが挙げられる。さらなるノギン代用物としては、ＤＭＨ１等のドルソモルフィン類似体が挙げられるが、これらに限定されない。

角膜輪部幹細胞のＡＢＣＧ２陽性表現型を維持する方法
本発明は、上述したＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞の製造方法に加えて、角膜輪部幹細胞のＡＢＣＧ２陽性表現型を維持する方法も提供する。

この方法において、ＡＢＣＧ２陽性表現型を維持しようとする角膜輪部幹細胞は、初代角膜輪部幹細胞、又は上述の分化方法により生成された角膜輪部幹細胞が挙げられるがこれらに限定されず、任意のＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞であってよい。

角膜輪部幹細胞のＡＢＣＧ２陽性表現型を維持する方法は、ＥＧＦ及び少なくとも１種のＷｎｔ活性化因子を含む培養培地で、ＡＢＣＧ２陽性表現型の角膜輪部幹細胞を培養する工程を含む。いくつかの実施形態では、培地は、ＥＧＦ及び少なくとも１種のＧＳＫ３阻害剤（ＣＨＩＲ９９０２１等）を含む。いくつかの他の実施形態では、培地は、ＥＧＦ及びＲ－スポンジン（Ｒ－スポンジン－１等）又はその代用物（ＲＳ－２４６２０４等）を含む。いくつかのさらなる実施形態では、培地は、ＥＧＦ、少なくとも１種のＧＳＫ３阻害剤（ＣＨＩＲ９９０２１等）及びＲ－スポンジン（Ｒ－スポンジン－１等）又はその代用物（ＲＳ－２４６２０４等）を含む。これらの各実施形態において、培地は、ノギンをさらに含んでいてもよい。ＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞の製造方法に関して上述したこれらのサプリメントの好ましい濃度範囲は、角膜輪部幹細胞のＡＢＣＧ２陽性表現型を維持する当該方法にも適用される。

いくつかの実施形態では、ＡＢＣＧ２陽性表現型は、少なくとも５０日間、６回の継代にわたって、また、凍結保存にわたって維持される可能性がある。

ＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞の当該製造方法の維持期に関連して記載された任意の実施形態は、特段の記載がない限り、角膜輪部幹細胞のＡＢＣＧ２陽性表現型を維持する当該方法に適用され、その逆もまた同様である。

培養条件及び培地の一般的特徴
どのような培地も、基礎培地とサプリメントとで構成されていると考えられてよい。本発明の誘導培地では、必須のサプリメントは、まずＴＧＦ－β阻害剤及びＦＧＦ、次にＢＭＰ－４であり、本発明の維持培地では、必要なサプリメントは、ＥＧＦ及び少なくとも１種のＷｎｔ活性化因子を含む。しかしながら、培養培地の文脈では、眼球組織以外の組織への分化を誘導することが知られていない限り、当該技術分野で一般的なサプリメントがさらに適用されてもよい。培地の成分に言及する場合、この用語には、基礎培地に対するサプリメント及び材料の両方が含まれる。

使用時又は使用準備が整っているとき、本発明の培養培地は、上述した適切な必須サプリメントを含んでいる。しかしながら、当該分野での一般的な慣行によれば、培地の材料は、上記成分を含む濃縮物として提供されてもよいし、提供される指示に従って実験室で使用する前に適切な組み合わせを調製するためのバイアルのセットとして提供されてもよい。多くの場合、培養培地は使用直前に希釈して最終組成物に調製される。それゆえ、そのような即時調製に使用するのに適した任意のストック溶液又は調製キットが当該方法で使用する細胞培養培地を得るために使用されてもよいことが理解される。例えば、上記の誘導培地の調製には、サプリメントとしてのＴＧＦ－β阻害剤及び線維芽細胞成長因子を、それぞれ別個の容器に入れて、又はそれらを任意に組み合わせて含み、任意に他の成分、例えば基礎培地又はその調製のための消耗品を含む細胞培養キットが採用されてもよい。

本明細書中でいう「（培養）培地」又は「培養液」は、微生物、細胞、小植物の成長を支援するために設計された任意の液体又はゲル状の配合物を広く指す。細胞の維持及び成長を目的とした配合物を指す場合には、「細胞培養培地」という用語が用いられる。当該技術分野では、誘導培地、成長培地、分化培地、成熟培地等の表現は、一般的な表現である「培養培地」の亜種と考えることができる。当業者は、培養培地中又は培養培地上で生細胞を維持し栄養を与えるために必要な基本的な成分を熟知しており、市販の基本的な培地が広く利用可能である。通常、このような基本的な成分は「基礎培地」と呼ばれ、必要なアミノ酸、ミネラル、ビタミン及び有機化合物を含んでいる。一般に、基礎培地は、単離された純粋な成分から組み合わされてもよい。必要に応じて、基礎培地に培養培地の特別の特徴又は機能に寄与する物質を補ってもよい。非常に一般的なサプリメントとしては、汚染物質の増殖を抑えるために使用される抗生物質、Ｌ－グルタミン酸、血清、血清アルブミン、血清代替物等が挙げられる。当業者は、必要な又は任意の培養培地成分及びその濃度の両方に精通している。

本発明の方法及びその様々な実施形態で使用するために、基礎培地は、幹細胞が効果的に分化できる任意の幹細胞培養培地であってよい。適切な基礎培地の非限定的な例としては、ノックアウトダルベッコ変法イーグル培地（ＫＯ－ＤＭＥＭ）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ－１０、Ｆ－１２、グラスゴー最少必須培地（Ｇ－ＭＥＭ）、イスコフ改変ダルベッコ培地、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの好ましい実施形態では、レチノール、ｂＦＧＦ及びアクチビンＡを省略して改変したＲｅｇＥＳ培地（本明細書ではＲｅｇＥＳｂａｓｉｃと呼ばれ、Ｖａａｊａｓａａｒｉら、Ｍｏｌ Ｖｉｓ． ２０１１；１７：５５８－７５に開示されている）が基礎培地として使用される。いくつかのより好ましい実施形態では、ＲｅｇＥＳｂａｓｉｃは、本発明の誘導培地の基礎培地として使用される。

より良い臨床的受容性のために、当該方法及びその様々な実施形態で使用するすべての培地は、好ましくは実質的にゼノフリー、実質的に無血清、又は実質的に規定のものであり、より好ましくはこれらの組み合わせであり、最も好ましくは同時に実質的にゼノフリー、実質的に無血清、及び実質的に規定のものである。本明細書では、「実質的に」は、意図しない痕跡は無関係であることを意味し、臨床又は実験室の規則の下で、ゼノフリー、無血清、又は規定のものとして考えられ、受け入れられているものは、ここにも適用される。

本明細書で使用する場合、用語「ゼノフリー」は、異物や外来成分が含まれていないことを意味する。従って、ヒトの細胞培養の場合は、用語「ゼノフリー」は、ヒト以外の動物成分を含まない状態を指す。言い換えれば、ヒトでの使用のための角膜細胞を製造するためにゼノフリーの条件が望まれる場合、あらゆる細胞培養培地のすべての成分は、ヒト又は組換え体由来のものでなければならない。

伝統的に、血清、特にウシ胎仔血清（ＦＢＳ）は、真核細胞のインビトロ細胞培養のための必須の成長及び生存成分を提供する細胞培養において価値を見出されてきた。ＦＢＳは、食肉用に飼育された牛の食肉処理場で採取された血液から製造される。「無血清」は、培養培地が動物性又はヒト性の血清を含まないことを示す。規定培地（限定培地）は、未規定の（不明確な）培地、例えば、培養細胞から回収した使用済みの培地であって、培養細胞によって培地中に分泌された代謝産物、成長因子及び細胞外マトリクスタンパク質を含有する培地を指す「馴化培地」を使用することに矛盾がある場合に価値を見出される。未規定の培地は、生物学的な自然の変動により、かなりの相違点を帯びる可能性がある。細胞培養における未規定の成分は、例えば、創薬及び毒性研究における細胞モデル実験の再現性を損なう。従って、「規定培地」又は「規定の培養培地」は、培地がすべて既知の量の材料を有する組成物を指す。通常、細胞培養のために培養培地に添加される血清は、既知の量の血清成分、例えば、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、及び場合によっては特定の成長因子（例えば、塩基性線維芽細胞成長因子、形質転換成長因子又は血小板由来成長因子）で置き換えられる。

合成培地（既知組成培地）は、ヒト又は動物の細胞をインビトロで細胞培養するのに適した成長培地であって、化学成分がすべて既知である培地である。合成培地は、動物由来の成分を全く含まず、最も純粋で一貫性のある細胞培養環境を意味する。当然のこととして、合成培地は、ウシ胎仔血清も、ウシ血清アルブミンも、ヒト血清アルブミンも含むことができない。というのも、これらの産物は、ウシ又はヒトの供給元に由来し、アルブミン及び脂質の複雑な混合物を含有するからである。

合成培地は、ウシ血清アルブミン又はヒト血清アルブミンが、化学的に明確な組換え体（アルブミンに関連する脂質を欠く）又はＢＳＡ／ＨＳＡの機能の一部を再現できるポリマーであるポリビニルアルコール等の合成化学物質のいずれかに置き換えられている点で、無血清培地とは異なる。合成培地の次のレベルの規定培地は、タンパク質を含まない培地である。これらの培地は、動物性タンパク質の加水分解物を含み、昆虫やＣＨＯ細胞の培養に一般的に使用されているが、その配合は複雑である。

いくつかの実施形態によれば、本発明の培地は、ゼノフリー血清代替配合物を含む。規定のゼノフリーの血清代替の配合物又は組成物は、幹細胞のインビトロでの導出、維持、増殖、又は分化に使用するための任意の適切な基礎培地を補うために使用されてもよい。上記血清代替物は、血清を含まない基礎培地若しくは血清を含む基礎培地のいずれか、又はそれらの任意の組み合わせを補充するために使用されてもよい。ゼノフリーの基礎培地にゼノフリーの血清代替物を補充すると、最終的な培養培地もゼノフリーとなる。１つの例は、本発明の文脈で適用可能なゼノフリーの血清代替物を記述した、参考として本明細書に組み込まれるＲａｊａｌａら、２０１０に記載されている。血清代替物の別の非限定的な例は、どちらもＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ライフ・テクノロジーズ）から市販されているＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標） Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｋｏ－ＳＲ）及びゼノフリーバージョンのＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標） ＳＲ ＸｅｎｏＦｒｅｅ ＣＴＳ（商標）である。

治療上の使用
本発明は、必要とする対象における、角膜上皮幹細胞疲弊症（ＬＳＣＤ）等の眼疾患の治療方法も提供する。当該方法は、本発明に従って製造又は維持された効率的な量のＡＢＣＧ陽性角膜輪部幹細胞を上記対象に投与する工程を含む。

上記に従い、本発明は、ＬＳＣＤ等の眼疾患の治療に使用するための、本発明に従って製造又は維持されたＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞も提供する。

本明細書で使用する場合、用語「対象」は、任意の哺乳動物、好ましくはヒトを指す。

治療に使用するためのＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞は、同種異系間のものでもよいし、又は自家性のものでであってもよい。

本明細書で使用する場合、用語「効率的な量」は、眼疾患の有害な影響を少なくとも改善する、ＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞の量を指す。ｐ６３陽性細胞が細胞集団のわずか３％を占めるだけの輪部幹細胞の培養で、７８％の治療成功率をもたらすことが報告されていることから（Ｒａｍａら、２０１０、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、３６３：１４７－５５）、わずか３％以上のＡＢＣＧ２陽性細胞を含む角膜輪部幹細胞の集団も、臨床的に有用であると考えられてもよく、従って「効率的な量」という用語に包含されてもよい。しかしながら、好ましくは、ＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞の効率的な量は、ＡＢＣＧ２陽性細胞が全細胞集団の少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも９０％を占める細胞集団を指す。

本明細書で使用する場合、用語「治療」又は「治療する」は、疾患を改善、軽減、抑制、又は治癒することを含んでもよい目的で、本発明のＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞を対象に投与することを含むことを意図している。

本発明の番号付きの例示的な実施形態
１． 角膜輪部幹細胞のＡＢＣＧ２陽性表現型を維持する方法であって、ＥＧＦ及び少なくとも１種のＷｎｔ活性化因子を含む培養培地中でＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞を培養する工程を含む方法。

２． ＥＧＦの量が、約１ｎｇ／ｍｌ～約１５０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約１５ｎｇ／ｍｌ～約５０ｎｇ／ｍｌである実施形態１に記載の方法。

３． 上記Ｗｎｔ活性化因子が、ＧＳＫ３阻害剤及びＲ－スポンジンファミリーのタンパク質からなる群から選択される実施形態１又は実施形態２に記載の方法。

４． 上記ＧＳＫ３阻害剤が、ＣＨＩＲ９９０２１、ＳＢ－２１６７６３、ＢＩＯ（６－ブロモインジルビン－３’－オキシム）、ＬＹ２０９０３１４及び塩化リチウムからなる群から選択される実施形態３に記載の方法。

５． ＧＳＫ３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１である実施形態４に記載の方法。

６． ＣＨＩＲ９９０２１の量が、約１μＭ～約１５μＭ、約１μＭ～約１０μＭ、約１μＭ～約５μＭ、又は約３μＭである実施形態５に記載の方法。

７． 上記Ｒ－スポンジンファミリーのタンパク質が、Ｒ－スポンジン－１及びそのサプリメントＲＳ－２４６２０４、Ｒ－スポンジン－２、Ｒ－スポンジン－３及びＲ－スポンジン－４からなる群から選択される実施形態３に記載の方法。

８． Ｒ－スポンジンファミリーのタンパク質がＲ－スポンジン－１である実施形態７に記載の方法。

９． Ｒ－スポンジン－１の量が、約１００ｎｇ／ｍｌ～約２μｇ／ｍｌ、約５００ｎｇ／ｍｌ～約２μｇ／ｍｌ、又は約１μｇ／ｍｌである実施形態８に記載の方法。

１０． ＲＳ－２４６２０４の量が、約６．２５μＭ～約２００μＭ、又は約２５μＭ～約５０μＭである実施形態７に記載の方法。

１１． 上記培養培地が、ノギン、又はＬＤＮ－１９３１８９及びＤＭＨ１等のドルソモルフィン類似体からなる群から選択されるそのサプリメントをさらに含む実施形態１から実施形態１０のいずれか１つに記載の方法。

１２． ノギンの量が、約１０ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、又は約１００ｎｇ／ｍｌである実施形態１１に記載の方法。

１３． ＬＤＮ－１９３１８９の量が、約０．０１μＭ～約１μＭである実施形態１１に記載の方法。

１４． 上記ＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞が、ＡＢＣＧ２陽性初代角膜輪部幹細胞又は多能性幹細胞由来のＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞である実施形態１から実施形態１３のいずれか１つに記載の方法。

１５． 上記細胞がヒト細胞である実施形態１４に記載の方法。

１６． ＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞の製造方法であって
ａ）多能性幹細胞を提供する工程と、
ｂ）上記細胞を、ＴＧＦ－β阻害剤及び線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、好ましくは塩基性ＦＧＦを含む細胞培養培地中で培養する工程と、
ｃ）上記ＴＧＦ－β阻害剤及び上記ＦＧＦを除去し、工程ｂ）で得られた細胞を、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ－４）を含む細胞培養培地中で培養し、これにより眼球前駆細胞を生成する工程と、
ｄ）上記眼球前駆細胞を角膜分化培地中で培養し、これによりＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞を生成する工程と、
ｅ）上記ＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞を、ＥＧＦ及び少なくとも１種のＷｎｔ活性化因子を含む維持細胞培養培地中で培養し、これにより工程ａ～ｄ）を経て得られたＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞の表現型を維持する工程と
を含む方法。

１７． ＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞の製造方法であって、
ａ）ＴＧＦ－β阻害剤及び線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、好ましくは塩基性ＦＧＦを含む細胞培養培地中で多能性幹細胞を培養する工程と、
ｂ）上記ＴＧＦ－β阻害剤及び上記ＦＧＦを除去し、工程ａ）で得られた細胞を、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ－４）を含む細胞培養培地中で培養し、これにより眼球前駆細胞を生成する工程と、
ｃ）上記眼球前駆細胞を角膜分化培地中で培養し、これによりＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞を生成する工程と、
ｄ）上記ＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞を、ＥＧＦ及び少なくとも１種のＷｎｔ活性化因子を含む維持細胞培養培地中で培養し、これにより工程ａ～ｅ）を経て得られたＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞の表現型を維持する工程と
を含む方法。

１８． 上記ＴＧＦ－β阻害剤が、８００ｇ／モル未満、好ましくは５００ｇ／モル未満のモル質量を有するＴＧＦ－β阻害剤から選択される実施形態１６又は実施形態１７に記載の方法。

１９． 上記ＴＧＦ－β阻害剤が、式Ｉに係る有機分子から選択され、

上記式中、Ｒ_１は、Ｃ_１～Ｃ_５脂肪族アルキル基、カルボン酸、アミドを表し、Ｒ_２は、Ｃ_１～Ｃ_５脂肪族アルキルを表し、Ｒ_３及びＲ_４は、ヘテロ原子、Ｏ又はＮを含む脂肪族アルキルを表し、これらは互いに連結して５員又は６員のヘテロ環を形成してもよい実施形態１８に記載の方法。

２０． 線維芽細胞成長因子が、塩基性ＦＧＦ及び線維芽細胞成長因子様の活性を示す合成低分子ペプチドから選択される実施形態１６から実施形態１８のいずれか１つに記載の方法。

２１． ＴＧＦ－β阻害剤の量が、１μＭ～１００μＭ、好ましくは１～３０μＭである実施形態１６から実施形態２０のいずれか１つに記載の方法。

２２． 線維芽細胞成長因子の量が、１ｎｇ／ｍｌ～約１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約２ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約３０ｎｇ／ｍｌ～約８０ｎｇ／ｍｌである実施形態１６から実施形態２１のいずれか１つに記載の方法。

２３． ＢＭＰ－４の量が１ｎｇ／ｍｌ～１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは２５ｎｇ／ｍｌである実施形態１６から実施形態２２のいずれか１つに記載の方法。

２４． ＥＧＦの量が、約１ｎｇ／ｍｌ～約１５０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約１５ｎｇ／ｍｌ～約５０ｎｇ／ｍｌである実施形態１６から実施形態２３のいずれか１つに記載の方法。

２５． 上記Ｗｎｔ活性化因子が、ＧＳＫ３阻害剤及びＲ－スポンジンファミリーのタンパク質からなる群から選択される実施形態１６から実施形態２４のいずれか１つに記載の方法。

２６． 上記ＧＳＫ３阻害剤が、ＣＨＩＲ９９０２１、ＳＢ－２１６７６３、ＢＩＯ（６－ブロモインジルビン－３’－オキシム）、ＬＹ２０９０３１４及び塩化リチウムからなる群から選択される実施形態２５に記載の方法。

２７． ＧＳＫ３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１である実施形態２６に記載の方法。

２８． ＣＨＩＲ９９０２１の量が、約１μＭ～約１５μＭ、約１μＭ～約１０μＭ、約１μＭ～約５μＭ、又は約３μＭである実施形態２７に記載の方法。

２９． 上記Ｒ－スポンジンファミリーのタンパク質が、Ｒ－スポンジン－１及びそのサプリメントＲＳ－２４６２０４、Ｒ－スポンジン－２、Ｒ－スポンジン－３及びＲ－スポンジン－４からなる群から選択される実施形態２５に記載の方法。

３０． Ｒ－スポンジンファミリーのタンパク質がＲ－スポンジン－１である実施形態２９に記載の方法。

３１． Ｒ－スポンジン－１の量が、約１００ｎｇ／ｍｌ～約２μｇ／ｍｌ、約５００ｎｇ／ｍｌ～約２μｇ／ｍｌ、又は約１μｇ／ｍｌである実施形態３０に記載の方法。

３２． ＲＳ－２４６２０４の量が、約６．２５μＭ～約２００μＭ、又は約２５μＭ～約５０μＭである実施形態２９に記載の方法。

３３． 上記維持培養培地が、ノギン、又はＬＤＮ－１９３１８９及びＤＭＨ１等のドルソモルフィン類似体からなる群から選択されるそのサプリメントをさらに含む実施形態１６から実施形態３２のいずれか１つに記載の方法。

３４． ノギンの量が、約１０ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、又は約１００ｎｇ／ｍｌである実施形態３３に記載の方法。

３５． ＬＤＮ－１９３１８９の量が、約０．０１μＭ～約１μＭである実施形態３３に記載の方法。

３６． 上記多能性幹細胞が、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞及び胚性幹（ＥＳ）細胞から選択されるが、ただし、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞が使用される場合、上記方法はヒト胚の破壊を含まない実施形態１６から実施形態３５のいずれか１つに記載の方法。

３７． 上記細胞がヒト細胞である実施形態１６から実施形態３６のいずれか１つに記載の方法。

３８． 工程ａ）が、上記多能性幹細胞から胚様体を形成することを含む実施形態１６及び実施形態１６を引用する場合の実施形態１８から実施形態３７のいずれかに記載の方法。

３９． 上記多能性幹細胞から胚様体を形成することを含む工程が工程ａ）に先行する実施形態１７及び実施形態１７を引用する場合の実施形態１８から実施形態３７のいずれかに記載の方法。

４０． 上記胚様体を形成することが、物理的又は化学的方法によって行われ、好ましくは、接着防止剤の存在下で細胞を培養すること、懸滴中で細胞を培養すること、微細加工技術、遠心分離等による強制的な凝集、並びに高分子クラウダー、ブレビスタチン及びＲＯＣＫ阻害剤等の１種以上の凝集促進剤の存在下で細胞を培養することからなる群から選択される法によって行われる実施形態３８又は実施形態３９に記載の方法。

４１． 工程ｄ）及び工程ｅ）における上記培養が、少なくともコラーゲンＩＶ並びにラミニン、好ましくはラミニン５２１及び／又はラミニン５１１でコーティングされた基材上で行われる実施形態１６及び実施形態１６を引用する場合の実施形態１８から実施形態４０のいずれかに記載の方法。

４２． 工程ｃ）及び工程ｄ）における上記培養が、少なくともコラーゲンＩＶ並びにラミニン、好ましくはラミニン５２１及び／又はラミニン５１１でコーティングされた基材上で実施される実施形態１７及び実施形態１７を引用する場合の実施形態１８から実施形態４０のいずれかに記載の方法。

４３． 実質的にゼノフリー、実質的に無血清及び／又は規定の条件で実施される実施形態１から実施形態４２のいずれか１つに記載の方法。

４４． 工程ｂ）の継続時間が、１～７日間、好ましくは１日間実施される実施形態１６及び実施形態１６を引用する場合の実施形態１８から実施形態４３のいずれかに記載の方法。

４５． 工程ａ）の継続時間が１～７日間、好ましくは１日間実施される実施形態１７及び実施形態１７を引用する場合の実施形態１８から実施形態４３のいずれかに記載の方法。

４６． 工程ｃ）の継続時間が０．５～５日間、好ましくは２日間実施される実施形態１６及び実施形態１６を引用する場合の実施形態１８から実施形態４３のいずれかに記載の方法。

４７． 工程ｂ）の継続時間が０．５～５日間、好ましくは２日間実施される実施形態１７及び実施形態１７を引用する場合の実施形態１８から実施形態４３のいずれかに記載の方法。

４８． 工程ｄ）の継続時間が３～１４日間、好ましくは６～７日間、より好ましくは７日間実施される実施形態１６及び実施形態１６を引用する場合の実施形態１８から実施形態４３のいずれかに記載の方法。

４９． 工程ｃ）の継続時間が、３～１４、好ましくは６～７日間、より好ましくは７日間実施される実施形態１７及び実施形態１７を引用する場合の実施形態１８から実施形態４３のいずれかに記載の方法。

５０． 工程ｅ）の継続時間が、５０日未満又は少なくとも５０日等の任意の所望の日数の間実施される実施形態１６及び実施形態１６を引用する場合の実施形態１８から実施形態４３のいずれかに記載の方法。

５１． 工程ｄ）の継続時間が、５０日未満又は少なくとも５０日等の任意の所望の日数の間実施される実施形態１７及び実施形態１７を引用する場合の実施形態１８から実施形態４３のいずれかに記載の方法。

５２． 眼疾患、好ましくは角膜上皮幹細胞疲弊症（ＬＳＣＤ）の治療に使用するための、ＡＢＣＧ２陽性表現型が実施形態１から実施形態１５のいずれか１つに記載の方法によって維持されているか、又は請求項１６から請求項５１のいずれか１つに記載の方法によって製造されたＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞。

技術の進歩に伴い、本発明の概念を様々な方法で実施できることは、当業者には明らかであろう。本発明及びその実施形態は、以下に説明する例に限定されるものではなく、特許請求の範囲の射程内で変わってもよい。

実施例１． ヒト多能性幹細胞から角膜輪部上皮幹細胞への分化の検討により、ＡＢＣＧ２又はΔＮｐ６３αを発現する２つの異なる細胞集団がその後出現することが明らかになる
これらの実験は、国際公開第２０１８／０３７１６１号パンフレットに開示されている分化方法を用いて、ヒト多能性幹細胞から角膜輪部上皮幹細胞への分化過程に沿った分化階層を解析するために行った。

材料及び方法
国際公開第２０１８／０３７１６１号パンフレットの分化プロトコル
遺伝的に異なる３つの組織内由来ｈＰＳＣ株、ｈＥＳＣ株Ｒｅｇｅａ０８／０１７及びＲｅｇｅａ１１／０１３（Ｓｋｏｔｔｍａｎら、２０１０）、並びにｈｉＰＳＣ株ＵＴＡ．０４６０７．ＷＴを本研究では使用した。ヒトＰＳＣ培養物は、血清及びフィーダー細胞を含まない条件で日常的に維持し、Ｈｏｎｇｉｓｔｏら２０１７ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ及びＨｏｎｇｉｓｔｏら２０１８ ＪｏＶＥにこれまでに記載されているように、角膜上皮系統に向けて分化させた。簡単に言うと、未分化のｈＰＳＣのコロニーを酵素的に単細胞懸濁液に解いて、懸濁培養での誘導のために、低接着性ウェルプレート上の規定ＸＦ－Ｋｏ－ＳＲ培地に移した。初日に胚様体（ＥＢ）の形成をサポートするために、５μＭのブレビスタチン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（シグマ・アルドリッチ））をＸＦ－Ｋｏ－ＳＲに添加した。続く３日間のＥＢとしての誘導期間のあいだ、まずＸＦ－Ｋｏ－ＳＲ培地に１０μＭのＳＢ－５０５１２４及び５０ｎｇ／ｍｌのヒト塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ Ｉｎｃ．（ペプロテック）、ロッキーヒル（Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ）、ニュージャージー州）を１日間、２５ｎｇ／ｍｌの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）－４（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ Ｉｎｃ．）を２日間添加した。誘導後、ＥＢを、さらに上皮分化させるために、０．５μｇ／ｃｍ^２の組換えラミニン－５２１（ＬＮ－５２１、Ｂｉｏｌａｍｉｎａ（バイオラミナ）、スウェーデン）及び５μｇ／ｃｍ^２のヒト胎盤由来ＩＶ型コラーゲン（Ｃｏｌ ＩＶ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）がコーティングされたウェルの市販の規定のＣｎＴ－３０角膜分化培地（ＣＥＬＬｎＴＥＣ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＡＧ（セルンテック・アドバンスト・セル・システムズ）、ベルン、スイス）に移した。標準的な分化では、その後、接着した培養物をＣｎＴ－３０で維持し、分析又は凍結保存まで週に３回培地を交換した。細胞形態の代表的な画像は、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ２０００－Ｓ位相差顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｅｕｒｏｐｅ（ニコン・インスツルメンツ・ヨーロッパ））で撮影した。

免疫蛍光法による分化プロトコル中のタンパク質発現プロファイリング
Ｒｅｇｅａ０８／０１７及びＵＴＡ．０４６０７の未分化（ＵＤ）のヒト多能性幹細胞及びｈＰＳＣ由来のＬＳＣを、７日目、９日目、１１日目、１４日目、１７日目、２１日目、２４日目（４日間の誘導期間を含む）の時間点で、ＯＣＴ－３／４、ＰＡＸ－６、ＡＢＣＧ２、ｐ６３α、ΔＮｐ６３、ＣＫ－１５、ＣＫ－１４及びＣＫ－１２の発現について、免疫蛍光標識（ＩＦ）を用いて完全に特性評価するために用いた。ＯＣＴ－３／４、ＡＢＣＧ２、ｐ６３α、ΔＮｐ６３、ＣＫ－１５及びＣＫ－１４の発現を定量化するためのサイトスピン試料を１０日目及び２４日目の時間点で調製した。染色の前に、細胞を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で１５～２０分間、室温（ＲＴ）で固定した。一次抗体及び二次抗体（表１）を用いた基本的なＩＦプロトコルは、基本的にＭｉｋｈａｉｌｏｖａら、２０１４にこれまで記載されている通りに実施した。染色した細胞の生の画像をＯｌｙｍｐｕｓ（オリンパス） ＩＸ５１蛍光顕微鏡で撮影し、ＩｍａｇｅＪ画像処理及び解析用ソフトウェア（ｈｔｔｐｓ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）を細胞計数分析のために使用した。ＩＦの特性評価とサイトスピンの定量化は、個々の分化バッチからの細胞を用いて、両方の株について２～３回繰り返した。続いて、１１日目及び２４日目のＩＦ解析により、ｈＥＳＣ株Ｒｅｇｅａ１１／０１３の同様のタンパク質発現プロファイルが確認された。

ＡＢＣＧ２についての蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）分析
ＦＡＣＳ抗体で標識するために、まず細胞を酵素的に解離させ、ＤＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ（ロンザ））中に０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び２ｎＭ ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ（ギブコ）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（サーモフィッシャーサイエンティフィック））を含む予め冷却したＦＡＣＳ洗浄バッファで洗浄した。カウントした細胞は、試料ごとに２～１０×１０^５細胞を５ｍｌチューブに分けて入れた。最適化した量の適切な抗体を１００μｌの試料体積に加え、遮光しながら氷上で２０分間インキュベートした。最後に、試料を２回洗浄し、上記洗浄バッファに再懸濁し、分析するまで氷上で保存した。ＡＰＣ結合モノクローナルマウス抗ヒトＣＤ３３８（ＡＢＣＧ２）抗体、クローン５Ｄ３（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（ビーディー・ファーミンジェン）、＃５６１４５１）を用いて細胞を標識した（試料あたり３μｌ）。また、ＡＰＣ結合マウスＩｇＧ２ｂκ抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、＃５５５７４５）を適切なアイソタイプ対照として使用し、集団をゲートするために非染色の陰性試料を調製した。ＦＡＣＳ解析は、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標） Ｆｕｓｉｏｎセルソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ビーディー・バイオサイエンシーズ）、サンノゼ、カリフォルニア州、米国）を用いて行い、個々の分化バッチからの解析は、Ｒｅｇｅａ０８／０１７株及びＵＴＡ．０４６０７．ＷＴ株の両方について少なくとも３回繰り返した。各試料について、１０，０００イベントを記録した。

ＡＢＣＧ２の定量的ＲＴ－ＰＣＲ
ペレット化した細胞試料から、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ（キアゲン）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて全ＲＮＡを抽出し、ＮａｎｏＤｒｏｐ－１０００分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ナノドロップ・テクノロジーズ））を用いて各試料のＲＮＡ濃度を測定した。各試料の４００ｎｇの全ＲＮＡを、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（アプライド・バイオシステムズ）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いたｃＤＮＡ合成に使用した。得られたｃＤＮＡ試料は、配列特異的ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ（＃ＨＳ０１０５３７９０＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ｑＰＣＲでそれらのＡＢＣＧ２ ｍＲＮＡについて分析した。ＧＡＰＤＨ（Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍ１）をハウスキーピング遺伝子として用いた。すべての試料と対照は、７３００ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、３回の反応として実行した。結果は、－２ΔΔＣｔ法（Ｌｉｖａｋ及びＳｃｈｍｉｔｔｇｅｎ、２００１）を用いて解析し、ＧＡＰＨＤを基準にして、未分化対照（ＵＤ－ｈＰＳＣ）との相対的な遺伝子発現の倍率変化として示した。

結果
ｈＰＳＣがＬＳＣに分化する過程の異なる段階でのタンパク質発現を調べるために、遺伝的に異なる２つのフィーダーフリー培養のｈＰＳＣ株、ｈＥＳＣ株Ｒｅｇｅａ０８／０１７及びｈｉＰＳＣ株ＵＴＡ．０４６０７．ＷＴを、確立された２段階のプロトコル（Ｈｏｎｇｉｓｔｏら、２０１７ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ）を用いて角膜系統に導いた。分化プロセスに沿って、ＯＣＴ３／４、及びいくつかの認められたＬＳＣ及び成熟した角膜上皮関連のマーカータンパク質の発現パターンの変化を、免疫蛍光標識（ＩＦ）を用いて広範囲に特性評価した。８つのＩＦ分析時間点は、０日目（ＵＤ－ｈＰＳＣ）、７日目、９日目、１１日目、１４日目、１７日目、２１日目及び２４日目（４日間の誘導期間を含む）を含んでいた。この時間のあいだ、多能性関連因子であるＯＣＴ－３／４の発現は著しく下方制御されたのに対して、ＰＡＸ－６、ΔＮｐ６３α、ＣＫ－１５及びＣＫ－１４の発現は顕著に増加し、これは、輪部上皮様細胞集団が出現していることを示した（図２Ａ）。興味深いことに、ＡＢＣＧ２は一過性にしか発現せず、９～１１日目にピークを迎え、その後徐々に減少し、分化２４日目までに非常に低いレベルになった（図２Ａ）。このプロトコルを用いた以前の結果（Ｈｏｎｇｉｓｔｏら、２０１７）と同様に、成熟した角膜上皮マーカーＣＫ－１２は、この特性評価枠の間、検出されないままであり（データは示していない）、細胞の未分化な前駆細胞表現型をさらに確認した。サイトスピン試料からのタンパク質発現を定量化したところ、１０日目及び２４日目の時間点の細胞集団の間に大きな違いがあることが確認された（図２Ｂ）。代表的なｈＥＳＣ株（Ｒｅｇｅａ０８／０１７）では、ＡＢＣＧ２の発現が６２．３％（ＳＤ ６．７）から１．８％（ＳＤ ０．９）に減少し、ΔＮｐ６３αの発現（ΔＮｐ６３抗体及びｐ６３α抗体を用いた二重染色により示されるとおり。図２Ｃ）は２３．２％（ＳＤ １４．１）から５４．３％（ＳＤ ６．２）に増加した。ＣＫ１５及びＣＫ１４の発現は、１０日目には検出されなかったレベルから、２４日目までにそれぞれ３７．０％（ＳＤ １２．４）及び５６．２％（１４．３）に増加した。他方、ＯＣＴ３／４は、１０日目にはすでに１．５％未満の細胞でしか発現しておらず、２４日目までに１％未満にまでさらに減少した。分化過程におけるＡＢＣＧ２及びΔＮｐ６３αの挙動が異なることから、１０日目及び２４日目のサイトスピン試料を用いて、ＡＢＣＧ２とｐ６３αとの共局在を調べた。興味深いことに、図２Ｄに示したように、両マーカーの最も強い染色は、典型的には異なる細胞で観察された。さらに、１０日目にはＡＢＣＧ２とｐ６３αとが３１．６％の細胞で共局在していたのに対し、２４日目にはＡＢＣＧ２＋／ｐ６３α＋の細胞は１％しかなかった（図２Ｅ）。しかしながら、２つの時間点の間で観察された差は、統計的には有意ではなかった（マン・ホイットニーのＵ検定）。

ＡＢＣＧ２の発現パターンを確認するために、ＵＤ－ｈＰＳＣだけでなく、１０日目～１１日目及び２４日目～２６日目のｈＰＳＣ－ＬＳＣからも、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）分析を行った。その結果、ＵＤ－ｈＰＳＣ及びより分化した２４～２５日目のｈＰＳＣ－ＬＳＣでは、ともにＡＢＣＧ２の発現が低かったが（代表的なｈＥＳＣ株であるＲｅｇｅａ０８／０１７では、それぞれ０．８％、ＳＤ １．３及び１．５％、ＳＤ ２．０）、１０～１１日目のｈＰＳＣ－ＬＳＣでは、ＡＢＣＧ２の発現レベルが有意に高かった（２１．６％、ＳＤ ８．２、マン・ホイットニーのＵ検定）（図２Ｆ）。加えて、転写レベルでのＡＢＣＧ２発現の変化をｑＲＴ－ＰＣＲで解析したところ、１０日目のｈＰＳＣ－ＬＳＣ集団では、ＵＤ－ｈＰＳＣ及び２４日目のｈＰＳＣ－ＬＳＣ集団と比較して、ＡＢＣＧ２ ｍＲＮＡの発現レベルも顕著に高いことが確認された（図２Ｇ）。これらを合わせると、上記特性解析は、ｈＰＳＣ－ＬＳＣの分化過程において、１０～１１日目と２４日目の時間点の間で、提案した輪部上皮幹細胞／前駆細胞マーカーのＡＢＣＧ２、ΔＮｐ６３α、ＣＫ－１５及びＣＫ－１４についての非常に異なる発現プロファイルを明らかにした。

実施例２． ＡＢＣＧ２発現の維持
ＡＢＣＧ２の発現を長期間維持するために必要な培養条件を確立するために、この実験を行った。

材料及び方法
ＡＢＣＧ２陽性ｈＰＳＣ－ＬＳＣ表現型を維持するための培養条件
ＡＢＣＧ２陽性集団を維持するために、ＣｎＴ－３０の培養培地を、ＣｎＴ－０７（ＣＥＬＬｎＴＥＣ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＡＧ、ベルン、スイス）に置き換え、１０～１１日目（４日間の誘導期間を含む）にＥＮＲＣ（５０ｎｇ／ｍｌマウス組換え上皮成長因子（ＥＧＦ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（インビトロジェン））、１００ｎｇ／ｍｌのマウス組換えノギン、１μｇ／ｍｌのヒト組換えＲ－スポンジン－１（いずれもＰｅｐｒｏｔｅｃｈ）、及び３μＭのＣＨＩＲ－９９０２１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ（ステムジェント））を補充した。ＣｎＴ－０７＋ＥＮＲＣ培地を接着培養物に直接導入するか、あるいは、ｈＰＳＣ－ＬＳＣを同時に酵素的に解いて単細胞懸濁液とし、上記新しい培地で１０００～５０００細胞／ｃｍ^２の密度で新しいＬＮ－５２１／Ｃｏｌ ＩＶコーティングした新しいウェルに継代した。いずれの場合も、ｈＰＳＣ－ＬＳＣはその後、標準的な給餌法に従って培養した。ＡＢＣＧ２陽性コロニーが出現した後、ＣｎＴ－０７＋ＥＮＲＣでのｈＰＳＣ－ＬＳＣのさらなる増殖及び／又は培養の継続は、サブコンフルエントな培養物を１０００細胞／ｃｍ^２の密度で、新しいＬＮ－５２１／Ｃｏｌ ＩＶコーティングのマトリクスに継代することにより達成した。この細胞の凍結保存は、Ｈｏｎｇｉｓｔｏら、２０１７ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒに記載されているように行った。

Ｃｎｔ－０７＋ＥＮＲＣで培養したｈＰＳＣ－ＬＳＣコロニーにおける高いＡＢＣＧ２発現の保存は、研究した３つのｈＰＳＣ株すべてでＩＦにより確認した。Ｒｅｇｅａ０８／０１７及びＵＴＡ．０４６０７．ＷＴについては、定量的ＲＴ－ＰＣＲ分析を実施した。上記特性評価方法の実施は、基本的に実施例１に記載したものに従った。

上記に加えて、ＡＢＣＧ２陽性ｈＰＳＣ－ＬＳＣ表現型を維持するための以下の改変培養条件を、ｈＥＳＣ株Ｒｅｇｅａ０８／０１７を用いて試験した。

第１の関連実験では、異なる細胞培養培地を、ＥＮＲＣの補充を伴う基礎培地として試験した。試験した基礎培地は、市販の多能性幹細胞培養培地Ｅ８ Ｆｌｅｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、市販の角膜分化培地ＣｎＴ－３０（ＣＥＬＬｎＴＥＣ）、及びＨｏｎｇｉｓｔｏら、２０１７ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ＆ Ｔｈｅｒに記載されている自前で配合したゼノフリー基礎培地ＸＦ－Ｋｏ－ＳＲを含んでいた。

第２の関連実験では、ＣｎＴ－０７を、改変ＥＮＲＣ配合物を補充した基礎細胞培養培地として使用した。各実験条件では、ＥＮＲＣの１つの成分が提供されなかった。従って、試験した条件は、ＣｎＴ－０７＋ＥＮＲ（ＣＨＩＲ－９９０２１なし）、ＣｎＴ－０７＋ＥＮＣ（Ｒ－スポンジン－１なし）、ＣｎＴ－０７＋ＥＲＣ（ノギンなし）及びＣｎＴ－０７＋ＮＲＣ（ＥＧＦなし）であった。

上述の両実験では、試験した細胞培養条件を、１１日目（４日間の分化期間を含む）に接着したｈＰＳＣ－ＬＳＣ培養物に直接導入し、週３回の標準的な給餌法に従って１０日間培養した。実験終了時には、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ２０００－Ｓ位相差顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｅｕｒｏｐｅ）を用いて、細胞の形態を評価し、代表的な画像を撮影した。２回目の実験では、細胞を固定し、ＡＢＣＧ２抗体及びｐ６３α抗体を用いたＩＦ染色に供し、ＡＢＣＧ２陽性ｈＰＳＣ－ＬＳＣ表現型の維持を確認した。

増殖分析
Ｒｅｇｅａ１１／０１３について、各継代培養終了時に個体数の倍加を以下の式を用いて算出した：ｌｏｇ（Ｎ／Ｎ０）／ｌｏｇ２（式中、Ｎ０はプレーティングされた細胞の数、Ｎは培養期間終了時の細胞の数）。同様に、各継代についての個体数倍加時間を以下の式で算出した。Ｔ×ｌｏｇ２／ｌｏｇ（Ｎ－Ｎ０）（式中、Ｔは時間単位の培養の継続時間である）。

結果
重要なことに、角膜分化培地ＣｎＴ－３０を、ＥＧＦ、ノギン、Ｒ－スポンジン－１及びＣＨＩＲ－９９２０１の特定の組み合わせ（ＥＮＲＣ）を補充した上皮維持培地ＣｎＴ－０７に置き換えると、コロニーの形態が維持され、ＡＢＣＧ２が強く発現した。一方、完全なＥＮＲＣを添加した他の試験した細胞培養培地、つまりＥ８ Ｆｌｅｘ、ＣｎＴ－３０及びＸＦ－Ｋｏ－ＳＲは、不要な細胞型に関連して、所望の細胞形態を保持及び拡大することに効果的ではなかった（データは示さず）。効率の悪い性能にもかかわらず、これらの培地も、少なくともその一部の実施形態において、本発明での使用に適している。興味深いことに、ＥＮＲＣの完全な組み合わせを補充したＣｎＴ－０７に加えて、ＡＢＣＧ２陽性ｈＰＳＣ－ＬＳＣ表現型は、ＣＨＩＲ－９９０２１を含むすべての試験したＥＮＲＣ改変条件、すなわちＣｎＴ－０７＋ＥＮＣ、ＣｎＴ－０７＋ＥＲＣ及びＣｎＴ－０７＋ＮＲＣにおいて維持された。

注目すべきは、ＡＢＣＧ２陽性コロニーは低レベルのｐ６３αしか発現していなかったのに対し、ＣｎＴ－３０条件のＡＢＣＧ２陰性の細胞がｐ６３αを発現していたことである（図３Ａ）。さらに、ＣｎＴ－０７＋ＥＮＲＣの条件では、細胞を継代した後でもＡＢＣＧ２の発現が維持されたが（図３Ｂ）、ＣｎＴ－３０の分化培地中で培養及び継代を続けると、実施例１のｈＰＳＣ－ＬＳＣの分化過程で説明したように、上記細胞は堅牢なＡＢＣＧ２の発現を失い、ｐ６３αを発現する表現型にさらに分化した。これらのＩＦ結果は、遺伝的に異なる３つの細胞株、２つのｈＥＳＣ株（Ｒｅｇｅａ０８／０１７及びＲｅｇｅａ１１／０１３）並びに１つのｈｉＰＳＣ株（ＵＴＡ．０４６０７．ＷＴ）で確認した。ＣｎＴ－０７＋ＥＮＲＣ条件の効果は３つのケースで一貫していたが、さらなる継代での成長効果や他の細胞型を生成する傾向は細胞株間で異なることが観察された。継代を行わない場合、ＡＢＣＧ２陽性コロニーはＣｎＴ－０７＋ＥＮＲＣ中で少なくとも２４日間（ｈＰＳＣ－ＬＥＳＣの総培養時間で３５日間）持続したが、この日数は１つの株Ｒｅｇｅａ０８／０１７で試験した最も長い解析した時間点であった（データは示さず）。

ＡＢＣＧ２陽性ｈＰＳＣ－ＬＳＣを継代するための最適な時間点を決定するために、２つの異なる時間点を試験した。まず、細胞をＣｎＴ－０７＋ＥＮＲＣで１０日間培養し、ＡＢＣＧ２の発現が安定した２１日目に継代を実施した。代替のアプローチでは、１１日目（つまり、ｈＰＳＣ－ＬＥＳＣの分化過程におけるＡＢＣＧ２発現枠のピーク時）に細胞を継代し、ＣｎＴ－０７＋ＥＮＲＣに再播種してさらに培養した。ＡＢＣＧ２陽性コロニーの維持は、どちらの方法でも達成され、３つの細胞株すべてで確認されたが、増殖効果には細胞株特異的な大きな違いがあった。Ｒｅｇｅａ１１／０１３では、後者のアプローチにより、非常に増殖性の高いコロニーが形成され、他の細胞種の細胞がほとんど混入しなかった。コロニーの形態及びＡＢＣＧ２／ｐ６３αの発現は、さらなる継代でも影響を受けなかった（図４Ａ）。Ｒｅｇｅａ１１／０１３では、５回の継代で２０回を超える以上の個体数の倍加（ＰＤ）が観察され、平均個体数倍加時間（ＰＤＴ）は５０．９時間（ＳＤ １６．４）であった（図４Ｂ－Ｃ、黒点線）。加えて、継代２と継代３の間（ｐ２－ｐ３）で凍結保存しても、図４Ｂ～図４Ｃの白枠線で示すように、細胞の増殖能力に顕著な影響はなかった。

Claims (13)

1. 角膜輪部幹細胞のＡＢＣＧ２陽性表現型を維持する方法であって、ＥＧＦ及び少なくとも１種のＷｎｔ活性化因子を含む培養培地中でＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞を培養する工程を含む方法。
2. 前記Ｗｎｔ活性化因子が、ＧＳＫ３阻害剤、好ましくはＣＨＩＲ９９０２１、及びＲ－スポンジンファミリーのタンパク質、好ましくはＲ－スポンジン－１又はそのサプリメントＲＳ－２４６２０４からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
3. 前記培養培地がノギン又はそのサプリメントＬＤＮ－１９３１８９をさらに含む請求項１又は請求項２に記載の方法。
4. 前記ＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞が、ＡＢＣＧ２陽性初代角膜輪部幹細胞又は多能性幹細胞由来のＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞である請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の方法。
5. ＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞の製造方法であって、
   ａ）多能性幹細胞を提供する工程と、
   ｂ）前記細胞を、ＴＧＦ－β阻害剤及び線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、好ましくは塩基性ＦＧＦを含む細胞培養培地中で培養する工程と、
   ｃ）前記ＴＧＦ－β阻害剤及び前記ＦＧＦを除去し、工程ｂ）で得られた前記細胞を、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ－４）を含む細胞培養培地中で培養し、これにより眼球前駆細胞を生成する工程と、
   ｄ）前記眼球前駆細胞を角膜分化培地中で培養し、これによりＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞を生成する工程と、
   ｅ）前記ＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞を、ＥＧＦ及び少なくとも１種のＷｎｔ活性化因子を含む維持細胞培養培地中で培養し、これにより工程ａ～ｄ）を経て得られたＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞の表現型を維持する工程と
   を含む方法。
6. 前記Ｗｎｔ活性化因子が、ＧＳＫ３阻害剤、好ましくはＣＨＩＲ９９０２１、及びＲ－スポンジンファミリーのタンパク質、好ましくはＲ－スポンジンｇ－１又はそのサプリメントＲＳ－２４６２０４からなる群から選択される請求項５に記載の方法。
7. 工程ｅ）の前記維持培養培地が、ノギン又はそのサプリメントＬＤＮ－１９３１８９をさらに含む請求項５又は請求項６に記載の方法。
8. 前記多能性幹細胞が、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞及び胚性幹（ＥＳ）細胞から選択されるが、ただし、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞が使用される場合、前記方法はヒト胚の破壊を含まない請求項５から請求項７のいずれか１項に記載の方法。
9. 工程ａ）が、前記多能性幹細胞から胚様体を形成することを含む請求項５から請求項８のいずれか１項に記載の方法。
10. 工程ａ）における前記胚様体を形成することが、物理的又は化学的方法によって行われ、好ましくは、接着防止剤の存在下で細胞を培養すること、懸滴中で細胞を培養すること、微細加工技術、遠心分離等による強制的な凝集、並びに高分子クラウダー、ブレビスタチン及びＲＯＣＫ阻害剤等の１種以上の凝集促進剤の存在下で細胞を培養することからなる群から選択される方法によって行われる請求項９に記載の方法。
11. 工程ｄ）及び工程ｅ）における前記培養が、少なくともコラーゲンＩＶ並びにラミニン、好ましくはラミニン５２１及び／又はラミニン５１１でコーティングされた基材上で行われる請求項６から請求項１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 実質的にゼノフリー、実質的に無血清及び／又は規定の条件で実施される請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 眼疾患、好ましくは角膜上皮幹細胞疲弊症（ＬＳＣＤ）の治療に使用するための、ＡＢＣＧ２陽性表現型が請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の方法によって維持されているか、又は請求項５から請求項１２のいずれか１項に記載の方法によって製造されたＡＢＣＧ２陽性角膜輪部幹細胞。

Images