CN101580816A - 诱导多能性干细胞快速高效产生的新型无血清培养基以及使用其的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种能够快速有效地将体细胞诱导重编程为多能性干细胞(induced Pluripotent stem cell，iPS)的无血清培养基，以及使用该无血清培养基在无需饲养层(feeder)的条件下诱导重编程体细胞的方法，其中所有诱导重编程的速度以及效率均大大提高。此外，本发明还涉及所述培养基用于诱导多能性干细胞的用途，以及用于筛选化合物，尤其是化合物的高通量筛选的方法。

Description

诱导多能性干细胞快速高效产生的新型无血清培养基以及使用其的方法
一.技术领域
本发明涉及一种能够快速有效地将体细胞诱导重编程为多能性干细胞(induced Pluripotent stem cell，iPS)的无血清培养基，以及使用该无血清培养基在无需饲养层(feeder)的条件下诱导重编程体细胞的方法，其中所有诱导重编程的速度以及效率均大大提高。此外，本发明还涉及所述培养基用于诱导多能性干细胞的用途，以及用于筛选化合物，尤其是化合物的高通量筛选的方法
二.发明背景
干细胞(stem cells)是人体及其各种组织细胞的初始来源，其最显著的生物学特征是既有自我更新和不断增殖的能力，又有多向分化的潜能。干细胞根据不同的来源分为成体干细胞(somaticstem cells)和胚胎干细胞(embryonic stem cells，ES细胞)。成体干细胞包括骨髓间充质干细胞、胰腺干细胞、神经干细胞等成体组织中存在的。
1981年，ES细胞的分离和培养首先在小鼠中获得成功，是至今研究最广泛、最成熟的干细胞体系。随后，牛、羊等大动物的ES细胞分离和培养也相继获得成功。
hES细胞研究的应用前景主要是移植治疗，在组织工程学领域中以hES细胞作为种子细胞，可为临床上细胞、组织或器官的移植治疗提供大量的材料。通过控制hES细胞分化培养环境、转染能够促进ES细胞定向分化的关键分子基因等体外诱导分化策略，可获得特异性的组织细胞类型。这类细胞用于移植治疗，将给糖尿病、帕金森氏病、脊髓损伤、白血病、心肌损伤、肾衰竭、肝硬化等疾病的治疗带来新的希望。
一直以来，hES细胞研究面临着许多难题和争议，主要包括以下几个方面：(1)供体卵母细胞的来源困难，hES细胞建系效率低。此外，SCNT技术的不成熟必将需要进一步耗费更多的人类卵母细胞，故而其来源难以得到保证。(2)免疫排斥反应，除非采用SCNT技术，否则患者对hES细胞分化而来的各种细胞和组织仍然存在免疫排斥反应。(3)hES细胞具有成瘤性，移植到受体的体内后有发展为肿瘤的可能性，即使采用SCNT技术、给移植细胞设置自杀基因等应对措施，也不一定能够很好地解决这个问题(Reubinoff BE等人.Embryonic stem cell lines from human blastocysts：somatic differentiation in vitro。Nat Biotechnol 2000；18：399-404；Richards M等人，Bongso A.Human feeders support prolongedundifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stemcells.Nat Biotechnol 2002；20：933-936；Burdon T等人，cell cycle andpluripotency in embryonic stem cells.Trends Cell Biol 2002；12：432-438)。(4)体外保持hES风险(Nakagawa M，等人，N，Yamanaka S.Generation ofinduced pluripotentstem cells without Myc from mouse and humanfibroblasts.Nat Biotechnol 2008；26：101-106)。同样，慢病毒转染技术可能也存在类似的风险。
为避开hES细胞和治疗性克隆研究的伦理学争论，需要找到一种替代途径，以便将人类的体细胞直接转化为多潜能干细胞，为患者提供“个性化”的自体干细胞。2003年，Gurdon研究小组发现，将已完全分化的小鼠胸腺细胞或成人外周血淋巴细胞的细胞核注入爪蟾卵母细胞后，哺乳动物细胞核的分化标志物丧失，而哺乳动物干细胞中最具特征性的标志物Oct4则呈高表达，提示哺乳动物细胞核可直接被两栖动物卵母细胞核泡所重构从而表达Oct4(Byrne JA等人，Nuclei of adult mammalian somaticcells are directly reprogrammed to oct-4 stem cell gene expression byamphibian oocytes.Curr Biol 2003；13：1206-1213)。
2006年，日本京都大学Yamanaka研究小组采用体外基因转染技术，从24个因子中筛选出Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4等4个转录因子，通过逆转录病毒将上述4个转录因子导入胚胎小鼠成纤维细胞或成年小鼠尾部皮肤成纤维细胞，在小鼠ES细胞的培养条件下获得了Fbx15+的多潜能干细胞系，该细胞系在细胞形态、生长特性、表面标志物、形成畸胎瘤等方面与小鼠ES细胞非常相似，而在基因表达谱、DNA甲基化方式及形成嵌合体动物方面却不同于小鼠ES细胞，故将其命名为诱导的多能性干细胞(iPS细胞)(Takahashi K，Yamanaka S.Induction of pluripotent stemcells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by definedfactors.Cell 2006；126：663-676)。
2007-07，Yamanaka研究小组进一步用Nanog代替Fbx15进行筛选，得到了Nanog+的iPS细胞系，该iPS细胞不仅在细胞形态、生长特性、标志物表达、移植到小鼠皮下可形成包含3个胚层组织细胞结构的畸胎瘤等方面与小鼠ES细胞非常相似，而且在DNA甲基化方式、基因表达谱、染色质状态、形成嵌合体动物等方面也与小鼠ES细胞几乎完全相似。此外，研究还发现重新激活原癌基因c-Myc是嵌合体动物出现肿瘤形成的原因；而转染的上述4个基因在iPS细胞中并没有表达，表明这些基因只在诱导过程中起作用，iPS细胞保持多潜能性状态的原因是内源性转录因子，如Nanog等基因的表达(Okita K，Ichisaka T等人，germline-competentinduced pluripotent stem cells.Nature 2007；448：313-317)。同时独立发表的另一篇来自美国科学家的研究论文同样证实了上述4个转录因子足以使小鼠成纤维细胞在体外诱导重构成为类似小鼠ES细胞的iPS细胞(Wernig M等人，In vitro reprogramming of fibroblasts into apluripotent ES cell-like state.Nature 2007；448：318-324)。
新近报道了小鼠肝细胞和胃上皮细胞同样也可被重构成为iPS细胞，遗传学细胞谱系示踪分析显示，iPS细胞源自谱系定型的体细胞的直接重构，而未发现逆转录病毒整合到特定的基因位点与细胞核重构相关(Aoi T等人，Generation of Pluripotent Stem Cells from Adult Mouse Liver andStomach Cells.Science 2008)。
还有研究者利用相同的技术，将上述同样的4个转录因子导入到人类皮肤成纤维细胞中，也成功获得了iPS细胞。原代人类成纤维细胞样滑膜细胞和源自新生儿成纤维细胞的细胞系同样也可被重构成为iPS细胞。这类iPS细胞在细胞形态、增殖能力、表面抗原标志、基因表达谱、多潜能干细胞特异性基因的表观遗传学状态、端粒酶活性等方面与hES细胞相似，并且在体外培养时和在小鼠体内畸胎瘤形成中均可分化为3个胚层的不同细胞类型(Takahashi K等人，Induction of pluripotent stem cells fromadult human fibroblasts by defined factors.Cell 2007；131：861-872)。与此同时，威斯康辛大学Thomson研究小组也报道了成功诱导胎儿成纤维细胞转化为具有hES细胞基本特征的人类iPS细胞，所不同的是他们使用慢病毒作为载体，并在14个候选基因中选择了Oct4、Sox2、Nanog、Lin28等4个基因进行转导(Yu J等人，Induced pluripotent stem cell lines derivedfrom human somatic cells.Science 2007；318：1917-1920)。
Park IH等人，Reprogramming of human somatic cells topluripotency with defined factors.Nature 2008；451：141-146利用来自胎儿、新生儿及成人的皮肤或肺部的原代成纤维细胞，其中包括来自1名健康男性皮肤活检得到的成纤维细胞，采用Yamanaka研究小组的策略也获得了相同的结果。他们还发现Oct4和Sox2在诱导重构为iPS细胞过程中是必需的，正是这两个转录因子维持了人类iPS细胞的多潜能性，而Klf4和c-Myc的作用是改变染色质的结构，从而有利于Oct4和Sox2的结合，以提高诱导的效率。此外，这项研究的重要意义在于将取自皮肤活检的成纤维细胞诱导为iPS细胞。上述研究表明，从活检人类皮肤组织中提取体细胞后进行诱导以制备患者特异性的干细胞是可行的，因而有望克服细胞移植治疗中存在的免疫排斥反应。鉴于导入c-Myc基因可使嵌合体小鼠的肿瘤发生率高达20％，可能会阻碍其未来的临床应用(Okita K，IchisakaT，Yamanaka S.Generation of germline-competent induced pluripotentstem cells.Nature 2007；448：313-317)。因此，Yamanaka研究小组新近报道，小鼠和人类皮肤成纤维细胞转染c-Myc以外的其余3个基因，在调整培养条件后也可得到iPS细胞。去除c-Myc基因尽管可使未来临床应用的安全性显著提高，但形成iPS细胞的效率却明显降低。(Nakagawa M，等人，Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouseand human fibroblasts.Nat Biotechnol 2008；26：101-106)。
然而，尽管已经开发了大量涉及iPS的方法，但是由于iPS目前存在使用病毒作为基因载体，效率低，使用癌基因c-Myc等问题，最理想的方案是通过药物诱导体细胞直接变化成为iPS，在化学成份确定的培养基中进行该过程和相继的分化过程，从而得到完全安全的治疗用细胞。然而，仅仅通过现有的知识来预测某种药物能够取代某一因子是不可能的，最佳方法是高通量筛选，高通量筛选需要高效稳定的iPS诱导系统，高效是为了减少孔径，在同样成本下提高通量；稳定是为了消除批次之间差异，如果筛选上百万种药物，可重复性是很重要的。
然而，现在的iPS诱导系统中所用的培养基均需要血清，而血清除了批次间不稳定外，还存在大量无法确定的成份且各个成分浓度经常有大幅度变化，使得血清在研究机理方面有着天生的劣势。鉴于以上原因，申请人希望研究是否能用无血清培养基诱导iPS。
WO9830679报道了一种血清替代剂(KnockOut Serum Replacement，KOSR)，以及使用该血清替代剂的无血清胚胎干细胞培养基，但是，这种培养基无法支持iPS的增殖和形成。
迄今为止，尚未有文献报道可以在小鼠体细胞，特别是容易取材的成纤维细胞中全程无血清诱导iPS。
此外，在现有的技术中，一般的诱导多能性干细胞的方法在胎牛血清中在饲养层细胞上在大约14天内，诱导效率为大约0.01-0.5％(参见Qin，D.，Li，W.，Zhang，J.& Pei，D.Direct generation of ES-like cells fromunmodified mouse embryonic fibroblasts by Oct4/Sox2/Myc/Klf4.Cellresearch 17，959-962(2007)、Takahashi，K.& Yamanaka，S.Induction ofpluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast culturesby defined factors.Cell 126，663-676(2006)、Meissner，A.，Wernig，M.&Jaenisch，R.Direct reprogramming of genetically unmodified fibroblastsinto pluripotent stem cells.Nature biotechnology 25，1177-1181(2007)、Takahashi，K.等人Induction of pluripotent stem cells from adult humanfibroblasts by defined factors.Cell 131，861-872(2007)、Yamanaka，S.Strategies and new developments in the generation of patient-specificpluripotent stem cells.Cell Stem Cell 1，39-49(2007).)
因此，本发明提供了可以比现有技术更高效快速的在无饲养层细胞的条件下诱导多能性干细胞的无血清培养基。
三.发明内容
在第一个方面中，本发明提供了培养细胞的无血清培养基，其包括基础培养基、代血清添加剂、一种或多种酪氨酸激酶，以及任选地其它成分。
另外，根据本发明的无血清培养基还包含白血病抑制因子(LIF)。
在本发明的另一个方面中，提供了使用上述无血清培养基从体细胞高效率诱导多能性干细胞的方法，其包括以下步骤：
(a)将一个或多个干细胞多能性因子导入体细胞；
(b)用本申请的无血清培养基，在适合于细胞生长的条件下，培养(a)中经导入的体细胞，以将体细胞诱导重编程为多能性干细胞；
(c)检测并且分析经诱导的细胞的多能性；
(d)挑出具有多能性的经诱导的多能性干细胞的单克隆；
(e)在适于胚胎干细胞生长的条件下培养(d)中的单克隆细胞。
本发明还涉及诱导多能性的方法，其中除了包含上述(a)-(e)的步骤外，还另外包括将报告基因导入体细胞，并且在步骤(c)之前首先通过报告基因来指示多能性干细胞的产生以及检测其产生效率。
在本发明的另一个方面中，本发明还涉及根据本发明的无血清培养基快速高效诱导体细胞重编程为多能性干细胞的用途。
最后，本发明还涉及根据本发明的培养基用于在iPS系统中使用经诱导的多能性干细胞筛选化合物，尤其是高通量筛选化合物的用途。
三.附图说明
图1：用4个因子感染(4F，Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc)的MEF不能在mKSR培养基中生长，且不能生成iPS集落，对照为用已知的经典方法培养在血清培养基(mES)中的iPS细胞。标尺，100uM
图2：无血清iPS-SF1比有血清的干细胞培养基能更好地支持iPS的形成。
a.MEF在FBS培养基、iPS-SF1培养基中的生长曲线(n＝3)。
b.在用4因子感染(4F，Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc)或3因子感染(3F，Oct4、Sox2和Klf4)的MEF细胞上在不同的时间点上进行Oct4-GFP阳性细胞的FACS分析。被感染的细胞分别培养在mES培养基和iPS-SF1培养基中。N＝2，误差条指示为s.d。
c.用4因子感染的MEF细胞分别培养在mES培养基以及iPS-SF1培养基中，六天后可见指示细胞重编程至多能性的Oct4-GFP仅在iPS-SF1所培养的细胞中表达，并且形成克隆形态，而培养在经典的血清培养基mES则不表达Oct4-GFP。标尺，100uM
图3.无血清培养基iPS-SF1得到的诱导多能性干细胞(iPS)系具有多能性。
a.感染后由iPS-SF1培养得到的iPS细胞系具有与典型小鼠干细胞相似的突起克隆形态，并强烈表达指示多能性的Oct4-GFP。
b.感染后由iPS-SF1培养得到的iPS细胞系可以在注射到囊胚后形成嵌合体小鼠，供体囊胚为白色ICR小鼠，小鼠身上的黑色毛发提示已经发生嵌合，证明iPS-SF1培养建立的iPS细胞系具有参与体内正常发育的能力。
图4.在8种不同的培养条件下，在感染后第7天，如上所述，用4因子感染时测量Oct4-GFP阳性细胞的百分比。将iPS-SF1样品的值设定为1。左边四条指示了3种补充物分别添加到iPS-SF1中的积极作用。Mock培养基时补充有10％KOSR的DMEM。右边4条标明分别从iPS-SF1中消除每种组分后的消极作用。
图5：血清是重编程的强抑制剂。对于用4因子感染的MEF细胞在感染后第7天分析Oct4-GFP阳性细胞的百分比。将血清以不同浓度补充到iPS-SF1中。N＝2，误差条指示为s.d。
图6：iPS-SF1作为筛选工具。选择了常见各信号通路的靶向化合物。虚线显示了其值被设定为1的对照样品的值。n＝2，误差条指示为s.d。
图7：Oct4/Sox2/Klf4三因子介导的iPS过程中的Nanog启动子甲基化分析。感染了三因子的成纤维细胞分别培养在mES(含血清培养基)及iPS-SF1中，取感染后第二天和第六天的样品进行重硫酸盐测序法分析Nanog启动子的甲基化状态，白圈代表未被甲基化的CpG核苷酸对，而黑圈表示被甲基化的CpG核苷酸对。
图8：不同生长因子(包括酪氨酸激酶和雌激素)在重编程中的效果。分别向无生长因子的iPS-SF1中添加图中的生长因子，并且在感染后第7天分析Oct4-GFP。其中E2是雌激素，FBS培养基作用为阴性对照。n＝2。误差条为s.d.
图9：培养在不同培养基中的感染的MEF的代表性FACS图。来自PE通道的信号被用作为自发荧光的对照。其中iPS-SF1在4因子和3因子感染的MEF中在感染后第7天均显著改善了Oct4-GFP群。
具体实施方案
定义和技术
除非另外指明，本发明的实践将使用分子生物学、微生物学、细胞生物学、免疫学和重组DNA的传统技术，其属于本领域技术范围。参见例如，Sambrook，Fritsch和Maniatis，分子克隆实验指南，第3版(2002)；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel等人编著(1987))；丛书METHODS IN ENZYMOLOGY(Academic Press，Inc.)：PCR2：A PRACTICAL APPROACH(M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor编著，(1995))，Harlow和Lane编著，(1988)ANTIBODIES，A LABORATORY MANUAL and ANIMAL CELLCULTURE(R.I.Freshney编著，(1987))；W.French Anderson等人，HANDBOOK OF STEM CELLS，卷2。
除非另外说明，本文中所用的术语均具有本领域技术人员常规理解的含义，为了便于理解本发明，将本文中使用的一些术语进行了下述定义。
在说明书和权利要求书中使用的，单数型“一个”，和“这个”包括复数参考，除非上下文另有清楚的表述。例如，术语“(一个)细胞”包括复数的细胞，包括其混合物。
所有的数字标识，例如pH、温度、时间、浓度和分子量，包括范围，都是近似值。要了解，虽然不总是明确的叙述所有的数字标识之前都加上术语“约”。也要了解，虽然不总是明确的叙述，本文中描述的试剂仅仅是示例，其等价物是本领域已知的。
本文所述的“诱导的多能性干细胞(iPS细胞)”是这样的细胞，其来源是体细胞通过诱导体细胞重编程的干细胞多能性因子体外诱导变化而成，其在ES细胞培养条件下，与ES细胞在细胞形态、生长特性、表面标志物表达、移植到皮下可形成包含3个胚层组织细胞结构的畸胎瘤等方面与小鼠ES细胞非常相似，而且在DNA甲基化方式、基因表达谱、染色质状态、形成嵌合体动物等方面也与小鼠ES细胞几乎完全相似。
本发明所用的术语“基础培养基”是指任何能够支持细胞生长的培养基。基础培养基提供了标准的无机盐例如锌、铁、镁、钙、和钾，以及维生素、葡萄糖、缓冲系统以及关键的氨基酸。可以用于本发明的基础培养基包括但不限于Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM)、MinimalEssential Medium(MEM)、Basal Medium Eagle(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、αMinimal Essential Medium(αMEM)、Glasgow’s MinimalEssential Medium(G-MEM)、以及Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium。本领域的技术人员已知如何选择适用于所培养的细胞的基础培养基。在优选的实施方案中，基础培养基是DMEM与F12的混合物(1∶1)或高葡萄糖的DMEM。在更优选的实施方案中，基础培养基是具有高葡萄糖(例如4.5g/L)的DMEM。
本发明所用的术语“代血清添加剂”是指在细胞培养中，用于加入到基础培养基中，以部分或全部替代血清在支持细胞生存生长作用方面作用的添加剂，一般包括胰岛素、转金属蛋白、微量元素、维生素等因子，这些因子一般并不包含于基础培养基中，而是由通常培养细胞使用的血清所提供。代血清添加剂包含支持细胞生长的至少一种或多种以下组分：一个或多个胰岛素及胰岛素替代物、一个或多个转金属蛋白及转金属蛋白替代物、一个或多个微量元素、一个或多个维生素、一个或多个氨基酸、一个或多个激素及类激素化合物、血清白蛋白或血清白蛋白替代物、以及一个或多个脂类等。已知多种商业化的代血清添加剂，例如KonckOut SerumReplacement(KOSR)，N2，B27，Insulin-Transferrin-Selenium Supplement(ITS)，G5等，这是本领域技术人员容易获得的。这些添加剂具有成份明确的特点，故而可以按照其在培养基中所占比例确定其各组分的浓度。
本领域技术人员可以根据现有技术，根据所要培养的细胞类型以及其它方面容易地配置代血清添加剂。优选地，本文中所用的代血清添加剂由KOSR、N2和/或B27按一定比例混合得到的混合添加剂，更优选地，最终培养基中KOSR的浓度从5％-20％，N2的浓度从0％到1％，B27的浓度在0％-2％之间；最优选的方案是在最终培养基中KOSR的浓度为10％，N2的浓度为0.5％。
本发明所用的受体酪氨酸激酶包括所有的已经鉴定出的以及将来即将鉴定出的具有受体酪氨酸激酶性质的所有受体酪氨酸激酶类生长因子。优选地，受体酪氨酸激酶选自bFGF、EGF、IGF2或VEGF。最优选地，受体酪氨酸激酶为bFGF。本领域技术人员可以根据所要培养的细胞种类以及其它条件容易地确定所添加的受体酪氨酸激酶的浓度，使之足以维持细胞生长，所述浓度优选在大约3-20ng/ml之间，更优选在大约5-15ng/ml之间，最优选在于大约7ng/mL。在一个优选的实施方案中，本发明的培养基中可以包含大约5ng/mL的bFGF、10ng/ml的EGF、25ng/ml的IGF2，和/或10ng/ml的VEGF。在最优选的实施方案中，本发明的培养基中包含大约5ng/mL的bFGF。
本文所用的LIF是指白血病抑制因子，它是本领域已知的培养干细胞中通常添加的生长因子。本领域技术人员能够根据具体条件调节具体培养基中所用到的LIF的浓度。在本发明的培养基中，优选培养基中添加的LIF的浓度可以在500U/mL-2000U/mL之间，更优选700U/mL-1400U/ml之间，最优选在于大约1000U/ml。
本领域的技术人员已知为了能够有利于细胞的生长，任选地还可以在培养基中添加其它组分。本领域技术人员已知根据所培养的细胞以及其它条件来选择需要在具体培养基中添加的其它组分，例如L-谷氨酰胺，NEAAMEM，以及2-巯基乙醇等。
根据本发明的无血清培养基是通过本领域技术人员已知的常规技术制备的，如A LABORATORY MANUAL and ANIMAL CELL CULTURE(R.I.Freshney编著，(1987))；W.French Anderson等人，HANDBOOK OFSTEM CELLS中所述的混合配制血清的技术和条件。
本文中所用的术语“体细胞”是相对于“生殖细胞”以及“胚胎干细胞”而言的概念，其是由“胚胎干细胞”分化产生的不再具有多能性，而是具有某一具体功能的细胞，其是由“胚胎干细胞”分化或内细胞团继续发育产生的不再具备多能性，一般具有具体功能的细胞，其一般从发育阶段位于囊胚期(在小鼠中具体为受精后3.5天)之后的胎鼠或成鼠取材，取材时一般避免取到可能具有多能性的生殖细胞及其来源(如精原干细胞、生殖嵴干细胞等)。本文中所用的体细胞优选来源于哺乳动物，更优选来源于人、猴、狗、猫、大鼠或小鼠，最优选地，来源于小鼠。本文中的体细胞可以是机体内任何类型的体细胞，优选为成纤维细胞或脑膜细胞。
本文所述的“诱导体细胞重编程的干细胞多能性因子”为对于干细胞多能性维持关键的因子，通过向体细胞中导入所述因子可以在一定条件下诱导体细胞重编程为胚胎干细胞。迄今为止众多文献已经报道了多个可以用于重编程的这样的因子，参见例如Qin，D.，Li，W.，Zhang，J.& Pei，D.Direct generation of ES-like cells from unmodified mouse embryonicfibroblasts by Oct4/Sox2/Myc/Klf4.Cell research 17，959-962(2007)、Okita，K.，Ichisaka，T.& Yamanaka，S.Generation of germline-competentinduced pluripotent stem cells.Nature 448，313-317(2007)、Wernig，M.等人In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-likestate.Nature 448，318-324(2007)、Yamanaka，S.Strategies and newdevelopments in the generation of patient-specific pluripotent stem cells.Cell Stem Cell 1，39-49(2007)等等。本领域技术人员已知多种可以用于这样的干细胞多能性因子。优选地，所述的多能性因子包括Oct4、Sox2(任选地，Sox1)、C-myc(任选地L-Myc或N-Myc)，以及Klf4(任选地，Klf5或Klf2)、Esrrb、Nanog、以及Lin28。上述多能性因子可以根据所要导入的细胞而是任何来源的，优选为小鼠的多能性因子以及其变体，如Sox2，NCBI登录号为NM_011443.3(小鼠包含SRY-框的基因2)；Oct4，NCBI登录号为NM_013633.2(小鼠POU结构域，5类，转录因子1(Pou5f1))；Klf4，NCBI登录号为NM_010637.2(小鼠Kruppel-样因子4))；c-Myc，NCBI登录号为NM_010849.4(小鼠髓细胞瘤病癌基因(myelocytomatosis oncogene)(c-Myc))；Sox1，NCBI登录号为NM_009233.3，(小鼠包含基因1的SRY-框)；Klf2，NCBI登录号为NM_008452.2，(小鼠Kruppel-样因子2(肺))；Klf5，NCBI登录号为NM_009769.4，(小鼠Kruppel-样因子5)；Nanog，NCBI登录号为NM_028016；或者Lin28，NCBI登录号为NM_145833。C-Myc还可以被换为其突变体L-myc(登录号为NM_008506.2，小鼠v-myc髓细胞瘤病病毒爱基因同源物1v，肺癌来源的(禽类)((Mycl1)))；或者N-Myc(登录号为NM_008709.3，小鼠v-myc髓细胞瘤病病毒相关癌基因，神经母细胞瘤衍生的(禽类)(Mycn)。
本文所述的术语“诱导重编程”(有时也仅被简化为“诱导”)是指将体细胞去分化为多能性干细胞的过程。优选地，通过将维持干细胞多能性所需的多能性因子cDNA导入体细胞可以诱导体细胞去分化成为多能性干细胞(Takahashi K，Yamanaka S.Cell.2006；126：663-676；Wernig M，Meissner A，Foreman R，等人，Nature.2007；448：318-324；Yu J，VodyanikMA，Smuga-Otto K等人Science.2007；318：1917-1920)。其中，优选地，所述的多能性因子包括Oct4、Sox2(任选地，Sox1)、C-myc(任选地L-Myc或N-Myc)、Klf4(任选地，Klf5或Klf2)、Nanog、以及Lin28中的一个或多个。
将所述干细胞多能性因子cDNA导入体细胞的方法可以是本领域技术人员熟知的多种技术，包括病毒感染、脂质体转染、转座子介导的插入表达、穿膜蛋白、药物诱导、电穿孔、粒子轰击等各种将DNA转入细胞的方法。优选地，使用包含cDNA的病毒载体进行转染，所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体等多种病毒载体。优选地逆转录病毒载体(例如pMX载体)，如实施例中所述的。
本文所述的“适宜细胞生长的条件”是本领域的常规干细胞培养条件，并且包括一些适宜各个具体细胞系，但是不影响细胞基本性质的修饰，培养方法以及培养条件参见W.French Anderson等人，HANDBOOK OFSTEM CELLS，卷2。
本文所述的报告基因是指能够指示细胞通过外加诱导已经转变为类似胚胎干细胞的阶段，包括利用转基因或同源重组手段加入一段表达荧光蛋白或者抗性的序列，这段序列处在胚胎干细胞特异表达的一些基因的启动子的控制下，故而可以在细胞到达胚胎干细胞状态时激活这段荧光蛋白或抗性基因的表达，从而使这个细胞具有某些可以被检测的性状特征(如发出绿光)而区别于其他未重编程至该状态的细胞。本领域技术常用的报告基因包括绿色荧光蛋白，抗性基因例如氨苄青霉素抗性基因等。本领域的技术人员可以根据细胞的培养条件和用途选择适合于各种实施方案的报告基因。参考例如Young II Yeom等人，Germline regulatory element of Oct-4specific for the totipotent cycle of embryonal cells，Development122，000-000(1996)，Printed in Great Britain，The company of BiologistsLimited 1996，881-894页；Shin-ya Hatano等人，Pluripotential competenceof cells associated with Nanog activation，Mechanisms of Development122(2005)，67-79。_
本文所述的检测细胞多能性的方法是本领域技术人员熟知的，参见例如Yamanaka，S.Strategies and new developments in the generation ofpatient-specific pluripotent stem cells.Cell Stem Cell 1，39-49(2007)等。所述方法包括鉴定多能性分子标记的表达、细胞的甲基化状态检测、胚胎小体EB的形成、畸胎瘤的形成以及施用经诱导的多能性干细胞形成嵌合鼠等等。
本文所述的“嵌合鼠”是通过本领域普通技术人员熟知的“嵌合鼠”技术实施的。是指将胚胎干细胞或通过本文技术获得的iPS细胞注射入小鼠囊胚中，使得其与所注射入小鼠的囊胚中的胚胎细胞混合，共同在代孕母鼠中的子宫内生长发育，小鼠出生后全身上下的各个组织即由两种胚胎细胞共同混合组成，如马赛克拼图样，这样的小鼠被称为嵌合鼠(Evans MJ，等人；The ability of EK cell to form chimeras after selection of clones inG418 and some observation on the intergration of retroviral vectorproviral DNA into EK cells [M]；Cold Spring Harbor Symposia onQuantitative Biology；1985年；Xian MW，Wu BY，Hu XL，Shang KG，WuHL，1996.Construction of chimeric mice of ES cells by microinjectionmethod.Hereditas(北京)18(1)：7-10(中文))。使用iPS能否形成嵌合鼠是检验iPS是否与胚胎干细胞具有类似性质的最直接和最关键的证据。
本文所述的“筛选化合物”是指在一个指定的化合物库中，通过对报告基因或者细胞本身特性的检测，来筛选1.对iPS过程和诱导条件有影响的化合物；2.能够取代目前已知的诱导iPS过程所需的某个至全部因子的化合物。本领域技术人员已经开发了利用iPS过程来筛选化合物的方法，参见例如Yan Shi等人，Induction of Pluripotent Stem Cells from MouseEmbryonic Fibroblasts by Oct4 and Klf4 with Small-Molecule Compounds，Cell Stem Cell 3，568-574，2008年11月6日。
本文所述的“高通量”筛选方法是本领域技术人员已知的，是指利用自动化的仪器设备和较小的样品使用量，在较短的时间周期内可以实施对一个大量文库中每个个体在特定的实验模型中所起作用的筛选。参见例如，Nil Emre，等人，A chemical approach to stem cell biology，CurrentOpinion in Chemical Biology 2007，11：252-258。在本方法中，是用于在大数量级化合物库、天然产物库中针对iPS过程进行高通量筛选。
实施例
下列实施例举例了发明人的标准实验室实践，用于示例本发明的模式，而不应将本发明理解为限定于这些实施例的范围。这些实施例。根据本文公开和本领域技术人员的普遍水平，技术人员将理解下列仅用于示例，可以在不超过本发明的范围内进行各种变动、修饰和改造。其中所涉及的技术，除非特别说明，均是本领域技术人员熟知的分子生物学、细胞生物学、生物化学等各个领域的常规技术。
本发明中所用技术概述：
除了特别说明，本文中提及的各种物质均来自英杰生命科学公司(Invitrogen)
细胞培养：
小鼠胚胎成纤维细胞来自Oct-GFP转基因等位基因和Rosa26等位基因的半合子的e13.5的胚，并且培养在下述成纤维细胞培养基中：高葡萄糖DMEM，补充有10％FBS，L-谷氨酰胺和NEAA。iPS和ES细胞均在包括血清的培养基(mES)和无血清的培养基(mKSR)中的MEF饲养层上培养。各种培养基在本文中的名称以及组分详见表1。MEF饲养层细胞由丝裂霉素C灭活。
表1：所用的培养基
Figure A20091003888300211
Figure A20091003888300221
反转录病毒生产以及产生iPS细胞
从Addgene公司购置包含小鼠Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的DNA的反转录病毒载体(pMXs)。按照现有技术进行病毒的产生和感染(Qin，D.，Li，W.，Zhang，J.& Pei，D.Direct generation of ES-like cells from unmodified mouseembryonic fibroblasts by Oct4/Sox2/Myc/Klf4.Cell research 17，959-962(2007)；Qin，D.等人Mouse meningiocytes express Sox2 and yield high efficiency ofchimeras after nuclear reprogramming with exogenous factors.J Biol Chem 283，33730-33735(2008).)简言之，利用常规方法将这些质粒转染到PlatE细胞中。然后收集病毒上清液并且过滤48小时，以感染MEF，其中补充有1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物。在第二天重复相同的步骤。移除病毒上清液的当天被定义为感染后0天。将病毒感染后(即已经转染了Oct4、Sox2、Klf4和/或c-Myc，下文中，如无特殊说明，3因子感染代表用Oct4、Sox2、Klf4感染，4因子感染代表用Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc感染)的成纤维细胞培养在本发明的培养基中，在感染后10-15天挑取iPS集落，这是基于Oct-GFP(即在荧光显微镜下发射荧光的集落)和典型的ES形态来挑取的。随后如ES细胞样延展和保持挑取的集落(如上所述Qin，D.，Li，W.，Zhang，J.& Pei，D，2007；以及Qin，D.等人，2008)。
重编程效率的定量
用于定量重编程效率的主要方法是Oct4-GFP阳性细胞的FACS分析。基于计时过程的结果，在感染后第7天和第9天用胰蛋白酶消化经感染的MEF细胞，然后通过FACSCalibur分析。GFP阳性的细胞收到来自PE通道的控制信号的门控，最少记录15000个事件。用pMXs-FLAG感染的细胞作为阴性对照。为了证实由FACS分析的效率，直接在荧光显微镜下对感染后第14天的GFP-阳性集落计数。
iPS细胞的表征：
进行碱性磷酸酶和免疫荧光染色(如上所述Qin，D.，Li，W.，Zhang，J.& Pei，D，2007；以及Qin，D.等人，2008)。使用下列一抗：小鼠抗-Oct4(Santa Cruz公司)、小鼠抗-SSEA1(Abcam公司)，小鼠抗-Nanog(Abcam公司)。
实施例1：传统的mKSR培养基不能维持用4个因子转染的MEF的生长，同时也不能诱导形成iPS
如前所述，将四因子的病毒以1∶1∶1∶1混合(每种1ml)后感染到六孔板的一孔中共计3.5万个成纤维细胞中，并且在37度，5％CO2分别培养在mKSR和mES培养基中。
如图1所示，在mKSR中培养的4因子转染的成纤维细胞生长迟缓，在12天时依然没有形成多能性细胞的细胞集落形态，即mKSR培养基不能够诱导和产生iPS集落。
实施例2：应用iPS-SF1培养基能够极大地提高诱导iPS的效率
A.分别将MEF培养在FBS和iPS-SF1培养基中，其生长曲线几乎一致，表明iPS-SF1对于MEF的培养无影响，相对的，在mKSR中MEF的生长基本停止。(图2A)
在分别用3个因子(Oct4、Klf4和Sox2)或者4个因子(cMyc、Oct4、Klf4和Sox2)转染到成纤维细胞后，将所述经转染的细胞分别培养在iPS-SF1培养基中，在转染后第2、5和7天如前所述测定GFP阳性细胞的效率，观察到无论是用4个因子还是用3个因子转染的细胞，均表现出高效率(图2B)，在第7天甚至均达到18％，相对于传统方法(图示mES对照)有非常大的提高。
相应的，在这一过程中，采用荧光显微镜直接观察，也可以发现采用iPS-SF1培养基培养的经转染细胞，在转染后第6天即有强表达Oct4-GFP的类胚胎干细胞克隆出现，而在传统培养基中形成的克隆则没有荧光表达(图2C)。
同样，如图9所示，在第7天分别收获用3因子和4因子感染的MEF细胞后，对其进行FACS效率分析，表明在iPS-SF1中，经感染的MEF细胞的iPS重编程效率(如上文所述，即用Oct4-GFP阳性细胞占总细胞的百分比表示)远大于在常规的mES培养基中(iPS-SF1 vs mES：3因子：0.07％ vs 17.82％；4因子：0.10％ vs 15.07％)。
实施例3：iPS-SF1诱导的iPS具有多能性。
A经诱导得到的iPS细胞系具有与胚胎干细胞相似的细胞形态
如上所述，用3因子感染成纤维细胞，并之后将其一直在iPS-SF1培养基中培养，在感染后第12-14天，根据克隆形态及荧光表达挑取有代表意义的克隆团，经过数代的稳定传代后形成均匀的iPS细胞系。
如图2A所示，左图是正常的胚胎干细胞，右图：上述iPS细胞系。这些细胞系形态与胚胎干细胞非常相似，强烈表达Oct4-GFP的绿色荧光。
B嵌合鼠的形成验证经诱导得到的iPS细胞系具有多能性
构建嵌合鼠
注射用囊胚取自四周龄超排ICR母小鼠(白色)，与同品系公鼠合笼，见栓3.5d(当日见栓为0.5d)时从子宫和输卵管中收集胚胎，移入上覆石蜡油的M16培养液滴内，于37℃ 5％ CO2孵箱内培养。
注射前3h将嵌合用iPS细胞(即上文中所得到的iPS细胞系)更换新鲜培养液，胰酶消化后制成单细胞悬液备用。将适量iPS细胞悬液和囊胚期胚胎移入M2注射液滴内，在显微注射系统下，用持卵针固定囊胚，用注射针吸取iPS细胞，从远离内细胞团的滋养层部位进针，每个囊胚注射细胞10-12个。注射后囊胚腔消失，置于培养液中于孵箱中培养1-3h，待囊胚腔恢复后，移入见栓2.5d的假孕母鼠子宫中进行培育。
图3-B显示了使用本发明方法获得的iPS构建的嵌合鼠，其中非嵌合小鼠为纯白色，嵌合小鼠由于注射的iPS细胞来源于黑色的OG2/Rosa26小鼠，故呈现黑色与白色相间分布的体色，提示经本发明方法获得的iPS细胞可以参与正常的体内发育并形成嵌合体小鼠，提示这些细胞在发育上与胚胎干细胞没有差异。
实施例4：本发明培养基对于iPS诱导过程中多能性基因启动子去甲基化的加速
将培养在mES培养基和本发明iPS-SF1培养基中的经Oct4、Sox2、Klf4三因子感染(如上所述制备)的细胞系中获取基因组DNA(700ng)，通过将其暴露于50.6％的亚硫酸氢钠(Sigma S-1516)和10mM氢醌(Sigma H-9003)的混合物过夜来进行亚硫酸氢盐修饰。通过PCR使用表2中所述的引物组对Nanog的启动子区域进行扩增。将PCR产物克隆到平pMD8-T载体(Takara公司)中，在DH5α中增殖，并且测序。
表2
  基因   正向引物(5’-3’)   反向引物(5’-3’)
  Meth-Nanog   AATGTTTATGGTGGATTTTGTAGGT   CCCACACTCATATCAATATAATAAC
在iPS诱导过程中，最终需要激活内源表达的多能性基因从而自发地维持iPS自我更新而不依赖于外源表达，因此伴随重编程，多能性基因的启动子存在去甲基化的过程，本例用Oct4、Sox2、Klf4三种病毒1∶1∶1感染MEF，并分别培养在传统的mES培养基中及本发明培养基iPS-SF1中，在感染后2天和6天收取细胞样本，提取基因组DNA，将DNA酶切后用重硫酸盐处理过夜，使得未甲基化的CpG碱基对中的C(胞嘧啶)变化为U(尿嘧啶)，之后用巢式PCR扩增出Nanog的启动子，交由本领域已知的测序公司测序(例如Invitrogen公司)，根据测序结果分析iPS过程中Nanog启动子的甲基化变化状态。
如图7所示，3因子感染后的MEF，在mES中缓慢地进行着Nanog启动子的去甲基化(D2：33％，D6：41.7％)，而在本发明培养基(iPS-SF1)中则进行得极为迅速，在D2就已经达到66.7％的去甲基化状态，并且持续进行，在D6时去甲基化水平已经达到80.9％，表示Nanog启动子中被检测的该片段已经基本被激活，而Nanog这一典型的干细胞多能性因子的激活标志着iPS被诱导。
通过上述实施例可以看出，本发明的iPS-SF1培养基不仅能够成功诱导iPS的重编程，并且该诱导重编程可以避免使用有致癌作用的c-Myc基因进行感染，而且在重编程的效率、去甲基化的速度都远高于现有的mES培养基。
实施例5：本发明的培养基中各组分对于iPS重编程效率的影响
将表1中所列出的iPS-SF1培养基中的LIF、N2和bFGF分别缺失，或者在DMEM+10％KOSR(即不含生长因子，同时含有NEAA，L-Glutamine等成份，下文称为bKSR)培养基中分别以与iPS-SF1相当的浓度分别再加入N2和bFGF，来检测LIF、N2、bFGF对于用4因子转染的MEF细胞的iPS重编程效率的影响。图4中各个标记的含义如下：
Mock：bKSR
Mock+LIF：bKSR+LIF
Mock+N2：bKSR-LIF+N2
Mock+bFGF：bKSR-LIF+bFGF
iPS-SF1-LIF：无LIF的iPS-SF1
iPS-SF1-N2：无N2的iPS-SF1
iPS-SF1-bFGF：无bFGF的iPS-SF1
由此可见，bFGF对于iPS重编程效率的影响甚至大于本领域已知的LIF。
实施例6：血清对于用iPS-SF1培养基培养的iPS重编程的抑制作用
如图5所示，当将iPS-SF1培养基中分别加入2％、4％、6％、8％和10％的血清时，与已知的现有技术所不同的，血清将iPS重编程的效率抑制了最高达96％。
实施例7：其它酪氨酸激酶对于本发明培养基的影响
为了验证其它酪氨酸激酶以及雌激素是否也能够在本发明培养基中对于诱导iPS重编程过程起作用，将4因子的病毒感染MEF后，换成以下培养基，其中空白对照是不含bFGF的iPS-SF1，实验组为在空白培养基(即不含bFGF的iPS-SF1)中添加了各种受体酪氨酸激酶(包括碱性成纤维生长因子bFGF，表皮生长因子EGF，血管内皮生长因子VEGF，胰岛素样生长因子二IGF2，以及雌二醇，血清培养基(FBS)作为该实验的阴性对照。
如图8所示，除了bFGF外，其它酪氨酸激酶如EGF、IGF2、VEGF以及雌激素均对于iPS重编程过程的诱导有相当的作用。
实施例8：在iPS-SF1培养基中的iPS过程中筛选化合物
将20,000个MEF细胞种植在12孔平板的每孔中，培养基为iPS-SF1，然后如上所述进行病毒感染，以转染4个因子。将如图6所示的各种化合物以下述浓度分别添加到培养基中：PD0325901(1μM)、CHIR99021(3μM)、SU5402(2μM，EMDbiosciences)、Y-27632(10μM)、维生素E(25μM，Sigma公司)、维生素A(1μM，Sigma公司)、A83-01(0.5μM，EMD)、SB203580(2μM)、Dorspmorphin(3μM，Sigma公司)、PFF-α(10μM)、TSA(20nM，Sigma公司)、VPA(1mM，EMD)、JAK抑制剂(0.3μM，EMD)、5aza-DC(1μM，Sigma公司)、BIX01294(1μM)，Bayk8644(2μM，EMD公司)。
在感染后第7天如上所述收集细胞用于FACS分析，测定相对的GFP效率。可将TSA和VPA能够显著增强iPS重编程的效率(100％)。而在使用本发明的培养基的条件下，原来报道有利于小鼠胚胎干细胞自我更新的化合物例如PD0325901、CHIR99021、SU5402降低了iPS重编程的效率。

Claims (47)

1.诱导多能性干细胞的无血清培养基，其包含基础培养基、代血清添加剂、一个或多个酪氨酸激酶。
2.权利要求1所述的无血清培养基，其还包含白血病抑制因子(LIF)。
3.权利要求1所述的培养基，其中基础培养基包括但不限于Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM)，Minimal EssentialMedium(MEM)，Basal Medium Eagle(BME)，F-10，F-12，RPMI 1640，Glasgow’s Minimal Essential Medium(GMEM)，αMinimal EssentialMedium(αMEM)，Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium和M199。
4.权利要求1所述的培养基，其中代血清添加剂包含支持细胞生长的至少一种或多种以下组分：一个或多个胰岛素及胰岛素替代物、一个或多个转金属蛋白及转金属蛋白替代物、一个或多个微量元素、一个或多个维生素、一个或多个氨基酸、一个或多个激素及类激素化合物、血清白蛋白或血清白蛋白替代物、以及一个或多个脂类。
5.权利要求1-4所述的培养基，其中代血清添加剂选自KonckOutSerum Replacement(KOSR)，N2，B27，Insulin-Transferrin-SeleniumSupplement(ITS)和/或G5。
6.权利要求5所述的培养基，其中代血清添加剂是由KnockOutSerum Replacement(KOSR)、N2和/或B27所调配而成的
7.权利要求6所述的培养基，其中在最终培养基中KOSR的浓度在5％-20％之间。
8.权利要求6或7所述的培养基，其中在最终培养基中N2的浓度在0％-1％之间。
9.权利要求6-8中任一项所述的培养基，其中在最终培养基中B27的浓度在0％-2％之间。
10.权利要求6所述的培养基，其中在最终培养基中KOSR的浓度在5％-20％之间、N2的浓度在0％-1％之间，以及B27的浓度在0％-2％之间。
11.权利要求5所述的培养基，其中代血清添加剂是由KOSR和N2所调配而成的。
12.权利要求11所述的培养基，其中在最终培养基中KOSR的浓度为5％-20％，N2的浓度为0％-1％。
13.权利要求12所述的培养基，其中在最终培养基中KOSR的浓度为大约10％，N2的浓度为大约0.5％。
14.权利要求1至13中任一项所述的培养基，其中酪氨酸激酶选自bFGF、EGF、IGF2或VEGF中的至少一种。
15.权利要求14所述的培养基，其中酪氨酸激酶为bFGF。
16.权利要求15所述的培养基，其中在最终培养基中bFGF的浓度在3-20ng/mL之间。
17.权利要求15所述的培养基，其中在最终培养基中bFGF的浓度在5-15ng/mL之间.
18.权利要求17所述的培养基，其中在最终培养基中bFGF的浓度为大约5ng/mL或大约7ng/mL。
19.权利要求14所述的培养基，其中酪氨酸激酶为EGF。
20.权利要求19所述的培养基，其中在最终培养基中EGF的浓度为大约10ng/mL。
21.权利要求14所述的培养基，其中酪氨酸激酶为IGF2。
22.权利要求21所述的培养基，其中在最终培养基中IGF2的浓度为大约25ng/mL。
23.权利要求14所述的培养基，其中酪氨酸激酶为VEGF。
24.权利要求23所述的培养基，其中在最终培养基中VEGF的浓度为大约10ng/mL。
25.权利要求1至24中任一项所述的培养基，其中所述培养基还包含适于细胞生长的其它组分。
26.权利要求25所述的培养基，其中其它组分选自L-谷氨酰胺、NEAA MEM，丙酮酸钠和2-巯基乙醇。
27.从体细胞高效率诱导多能性干细胞的方法，其包括
(a)将一个或多个干细胞多能性因子导入体细胞；
(b)用权利要求1-26中任一项所述的培养基，在适合于细胞生长的条件下，培养(a)中经导入的体细胞，以诱导体细胞成为多能性干细胞；
(c)检测并且分析经诱导的细胞的多能性；
(d)挑出具有多能性的经诱导的多能性干细胞的单克隆；
(e)在适于胚胎干细胞生长的条件下在胚胎干细胞培养基中培养(d)中的单克隆细胞。
28.权利要求27所述的方法，其中转录因子选自Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog、Esrrb和Lin28。
29.权利要求25的方法，其中导入的方法选自病毒感染、转染、转座子介导的插入表达、穿膜蛋白或药物诱导。
30.权利要求29所述的方法，其中病毒感染为使用逆转录病毒或慢病毒。
31.权利要求27的方法，其中所述体细胞来源于哺乳动物。
32.权利要求31的方法，其中所述体细胞来源于人、猴、猪、狗、猫、大鼠或小鼠。
33.权利要求32的方法，其中所述体细胞来源于小鼠。
34.权利要求27-33中任一项的方法，其中所述体细胞为成纤维细胞或者脑膜细胞。
35.权利要求27-34中任一项的方法，其中检测细胞多能性的方法包括鉴定多能性分子标记的表达、细胞的DNA甲基化状态检测、胚胎小体EB的形成、畸胎瘤的形成或使用经诱导的多能性干细胞的嵌合鼠的形成。
36.权利要求1-26中任一项所述的培养基用于高效率诱导体细胞生成多能性干细胞的用途。
37.权利要求36的用途，其中所述体细胞来源于哺乳动物。
38.权利要求37的用途，其中所述体细胞来源于人、猴、狗、猫、大鼠或小鼠。
39.权利要求38的用途，其中所述体细胞来源于小鼠。
40.权利要求36-39中任一项的用途，其中所述体细胞为成纤维细胞或者脑膜细胞。
41.筛选化合物的方法，包括：
(a)将一个或多个干细胞多能性因子导入体细胞；
(b)用权利要求1-26中任一项所述的培养基，在适合于细胞生长的条件下，培养(a)中经导入的体细胞，以诱导体细胞成为多能性干细胞；
(c)检测并且分析经诱导的细胞的多能性；
(d)挑出具有多能性的经诱导的多能性干细胞的单克隆；
(e)在适于胚胎干细胞生长的条件下在胚胎干细胞培养基中培养(d)中的单克隆细胞。
(f)应用(d)中所培养的经诱导的多能性干细胞筛选化合物。
42.权利要求41的方法，其中(f)中的筛选化合物为高通量筛选化合物。
43.权利要求41或42的方法，其中所述体细胞来源于哺乳动物。
44.权利要求43的方法，其中所述体细胞来源于人、猴、狗、猫、大鼠或小鼠。
45.权利要求44的方法，其中所述体细胞来源于小鼠。
46.权利要求41-45中任一项的方法，其中所述体细胞为成纤维细胞或者脑膜细胞。
47.权利要求41-46中任一项的方法，其中检测细胞多能性的方法包括鉴定多能性分子标记的表达、细胞的甲基化状态检测、胚胎小体EB的形成、畸胎瘤的形成或使用经诱导的多能性干细胞的嵌合鼠的形成。
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