CN104630143A - 一种羊骨髓间充质干细胞的分离与培养方法 - Google Patents
一种羊骨髓间充质干细胞的分离与培养方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种羊骨髓间充质干细胞的分离与培养方法，包括(1)获取羊骨髓；(2)PBS洗涤，ficoll密度梯度离心法分离单核核细胞，接种到完全培养基中贴壁培养，完全培养基为含有10％FBS的DMEM/F12培养基(3)接种18～24h后，用含5～10μg/L EGF和50～100mg/L NEAA的完全培养基进行培养。本发明通过改进常规的密度梯度离心法，再利用改进的培养体系对分离得到的BMSCs进行了高效扩增，成功得到了具有自我更新及分化潜能的BMSCs。利用本发明方法可建立起一种羊BMSCs的快速稳定的分离方法及和高效的扩增体系。
Description
技术领域
本发明属于生命科学领域，具体涉及一种羊骨髓间充质干细胞的分离与培养方法。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。MSC具有干细胞的共性，即自我更新、多向分化和归巢的能力。在特定的机体外分化环境下，能够诱导分化为神经、心脏、肝脏、骨、软骨、肌腱、脂肪、上皮等多种组织细胞。
MSC由于具有自我更新和多向分化的潜能，成为近年来研究的热点。大量研究证实，MSC可以从骨髓中分离得到，也存在于其他不同组织和脏器中，如脂肪组织、脐带血、脐带、胎盘等。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是骨髓基质干细胞，对骨髓中的造血干细胞(HSC)不仅有机械支持作用，还能分泌多种生长因子(如IL-6，IL-11，LIF，M-CSF及SCF等)来支持造血。因此，研究BMSCs在体外的高效分离及培养方法意义非常重大。
目前针对羊BMSCs的分离及培养方法尚未建立，现有技术中对于人BMSCs的研究得较多，人BMSCs的常规分离方法有全骨髓贴壁法跟密度梯度离心法。全骨髓贴壁法为将骨髓培养基重悬后直接接种到培养瓶中，经过多次换液去掉未贴壁的悬浮细胞如红细胞等从而获得BMSCs。这种方法在操作上非常简单方便，但存在细胞纯度低，贴壁效果不好的缺点。主要原因是骨髓中存在大量的红细胞及粒细胞等，如果不去除这部分细胞，BMSCs贴壁的效率会降低，而骨髓中的成纤维细胞也会贴壁从而降低了BMSCs的纯度。
另一种常规的分离方法就是利用淋巴细胞分离液进行密度梯度离心，该方法可以去掉绝大部分的红细胞，提高BMSCs的贴壁率及纯度，但这个方法在操作要求上比较高，在淋巴细胞分离液上加骨髓或血液时，需要非常小心缓慢地添加，稍有不慎就会扰乱淋巴细胞分离液跟白膜层之间的界面，导致分离失败且该方法耗时长。
另外，现有技术中常见的培养体系就是采用DMEM/F12培养基加上体积比为10％的胎牛血清(FBS)进行BMSCs的体外培养与扩增，该培养体系培养得到的细胞经过几次传代后会出现部分细胞分化的现象。
发明内容
本发明的目的就是建立一种针对羊BMSCs的原代分离及扩增培养的方法。通过改进常规的密度梯度离心法，再利用改进的培养体系对分离得到的BMSCs进行了高效扩增，成功得到了具有自我更新及分化潜能的BMSCs。利用本发明方法可建立起一种羊BMSCs的快速稳定的分离方法及和高效的扩增体系。本发明在常规的密度梯度离心法的基础上，将普通的离心管换成了SepMateTM离心管。SepMateTM离心管内加上了一个插件，这个插件可在淋巴细胞分离液和骨髓之间提供一道屏障，加样时，无需小心翼翼地向淋巴细胞分离液上加入血液样本；离心后，通过倾倒即可快速而轻松地收集到分离出的单个核细胞。改用这个离心管后不仅大大降低操作难度，提高了分离的效率，也明显提高了细胞分离的效果。而在培养体系上，本发明在含10％胎牛血清的DMEM/F12的基础上添加了非必需氨基酸(NEAA)和低浓度的表皮细胞生长因子(EGF)成分，实现了羊BMSCs的高效扩增。现有技术中也有报道用EGF和bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)联合使用诱导干细胞的体外分化。
本发明目的通过以下技术方案来实现。
一种羊骨髓间充质干细胞的分离与培养方法，包括以下步骤:
(1)获取羊骨髓
(2)将离心管中的骨髓用PBS洗涤后，加入等体积的完全培养基重悬细胞，另取一离心管加入等体积的Ficoll分离液，将骨髓细胞悬液缓慢加入到Ficoll分离液上层，离心后吸取单个核细胞层，用PBS清洗，用完全培养基重悬细胞后，接种到完全培养基中贴壁培养，
(3)接种18～24h后，弃去未贴壁的细胞及培养基，用PBS清洗后，加入含5～10μg/L EGF和50～100mg/L NEAA的完全培养基继续培养，即可得到羊骨髓间充质干细胞；
完全培养基为含有10％FBS的DMEM/F12培养基，百分数为体积百分数。
优选，所述离心管是采用SepMateTM离心管，安装有插件。
优选，所述羊骨髓的获取是通过选择5个月大的健康羊，将其麻醉后用骨髓穿刺针沿髂骨缘刺入直至髓腔，接上预先置有100U肝素抗凝剂的注射器抽吸骨髓，再转移到真空采血管中，置于冰盒中保存。
优选，步骤(2)所述将离心管中的骨髓用PBS洗涤是用等体积的PBS洗涤。
优选，所述贴壁培养和步骤(3)所述培养是放置于5％CO2、37℃的培养箱中培养。
优选，步骤(2)所述离心是在700g离心20min；
优选，步骤(3)所述用PBS清洗是用PBS清洗2遍。
优选，步骤(3)所述含EGF和NEAA的培养基要求每3天更换一次。
NEAA为Invitrogen公司产品，产品目录号为11140。
步骤(2)所述接种的接种密度是1×106/mL。
本发明相对于现有技术所具有的优点及有益效果：
(1)以羊骨髓为组织来源，进行了BMSCs的分离以及培养。
(2)在常规培养体系，即含有10％FBS的DMEM/F12的基础上加入了NEAA(浓度范围50～100mg/L)以及低浓度的EGF(浓度范围5～10μg/L)成分。本发明在培养过程中加入了NEAA(50～100mg/L)以及低浓度的EGF(5～10μg/L)，不仅没有诱导该细胞的过早分化，还大幅提高了细胞增殖速度。NEAA不仅可以为细胞提供更充足的营养，促进蛋白质的合成，也在细胞信号通路传导中起着重要的作用。而低浓度的EGF可以促进该细胞的增殖，抑制细胞的分化。
(3)采用了SepMateTM离心管代替普通的离心管，提高了分离的速度跟效果，也降低了操作上的难度。
改进后的密度梯度离心法结合贴壁法，无论是跟全骨髓贴壁法或者是普通的密度梯度离心后贴壁，在技术操作和分离效果上都有了较大的提高。
利用本发明方法，可建立起羊BMSCs的快速稳定的分离方法及和高效的扩增体系。而骨髓作为一种最主要的MSC来源，在生命科学及医学领域将具有非常广阔的临床应用前景。
附图说明
图1为实施例1中分离培养得到P3代细胞的生长曲线。
图2为实施例2贴壁培养后获得的原代细胞的细胞形态图。
图3为实施例2获得的P3代细胞的细胞形态图。
图4为实施例2获得的P3代细胞的流式鉴定结果。
图5为实施例1的获得的P3代细胞采用表1的添加方式进行培养后的细胞形态对比图。
具体实施步骤：
实施例1羊BMSCs的分离与培养
1、羊骨髓采集
选择5个月大的健康羊，将其麻醉后用骨髓穿刺针沿髂骨缘刺入直至髓腔，接上预先置有100U肝素抗凝剂的注射器抽吸骨髓，再转移到真空采血管中，置于冰盒中保存。
2、羊BMSCs原代分离
在超净工作台中，将装有骨髓的采血管用酒精棉球擦拭干净，再将骨髓移入离心管中，用等体积的PBS洗涤一遍后，加入等体积的完全培养基(含10％FBS的DMEM/F12培养基)。取另一个离心管加入等体积的Ficoll分离液，将骨髓缓慢加到分离液上层，700g离心20min。离心后吸取单个核细胞层，用PBS清洗两次后用完全培养基重悬接种到培养瓶中，放置于5％CO2、37℃培养箱中培养。离心管使用SepMateTM离心管。
3、羊BMSCs原代培养
羊BMSCs在接种24h后将未贴壁的细胞及培养基弃去，再用PBS润洗2遍，最后加入含EGF 5μg/L、NEAA 50mg/L的完全培养基，继续置于培养箱中培养。以后每3天换一次新鲜的完全培养基。
4、羊BMSCs传代培养
当观察到原代细胞生长融合度达到80～90％后，用胰酶消化吹打下来，根据1：3的细胞比例进行传代，并标记为P1代。当细胞生长融合度达到80～90％即可再次进行传代。
取实施例1中分离培养得到的P3代细胞，采用胰酶消化后用完全培养基按1×104/mL接种到二十四孔板上，每孔1mL体系。每隔24h取三孔细胞分别进行胰酶消化和细胞收集，并进行细胞计数算出三个孔细胞数量的平均值。连续进行细胞计数七天，再根据实验结果，绘制出该细胞的生长曲线。实验结果见图1，由图1可以看出该细胞的生长曲线呈“S”型，可分为3个生长时期：1～2天为迟缓期，细胞增殖较慢：3～5天为对数生长期，细胞增殖速度变快，呈对数生长；6～7天为平台期，细胞增殖减缓。通过该生长曲线，可看出该细胞的生长及增殖情况符合MSC细胞的生长特点。
实施例2羊BMSCs细胞鉴定
1、羊骨髓采集
选择5个月大的健康羊，将其麻醉后用骨髓穿刺针沿髂骨缘刺入直至髓腔，接上预先置有100U肝素抗凝剂的注射器抽吸骨髓，再转移到真空采血管中，置于冰盒中保存。
2、羊BMSCs原代分离
在超净工作台中，将装有骨髓的采血管用酒精棉球擦拭干净，再将骨髓移入离心管中，用等体积的PBS洗涤一遍后，加入等体积的完全培养基(含10％FBS的DMEM/F12培养基)。取另一个离心管加入等体积的Ficoll分离液，将骨髓缓慢加到分离液上层，700g离心20min。离心后吸取单个核细胞层，用PBS清洗两次后用完全培养基重悬接种到培养瓶中，放置于5％CO2、37℃培养箱中培养。离心管使用SepMateTM离心管。
3、羊BMSCs原代培养
羊BMSCs在接种18h后将未贴壁的细胞及培养基弃去，再用PBS润洗2遍，最后加入含EGF(10μg/L)、NEAA(50mg/L)的完全培养基，继续置于培养箱中培养。以后每3天换一次新鲜的完全培养基。
4、羊BMSCs传代培养
当观察到原代细胞生长融合度达到80～90％后，用胰酶消化吹打下来，根据1：3的细胞比例进行传代，并标记为P1代。当细胞生长融合度达到80～90％即可再次进行传代。
1、形态学观察
定期在倒置显微镜下观察实施例2获得的原代细胞以及传代后每一代细胞的生长情况及形态变化，初步判定细胞的类型及纯度。细胞的形态见图2及图3；图2为羊BMSCs贴壁后的原代细胞，细胞呈集落式生长，形态为梭形成纤维状，符合间充质干细胞的形态特点。
图3为羊BMSCs P3代细胞，由图可见细胞状态较好，为梭形、成纤维状，形态均一可初步判定该细胞纯度较高。
2、流式检测表面标志物
选择P3代的羊BMSCs细胞，采用胰酶消化收集后制成单细胞悬液，取一定量细胞加入带有免疫荧光的抗体进行孵育，进行MSC表面标记物的流式检测。加入的抗体分别为CD34(阴性表达)、CD45(阴性表达)、CD44(阳性表达)、CD29(阳性表达)。
流式结果见附图4
图4为羊BMSCs P3代细胞的流式鉴定结果。本次实验挑选了四个MSC细胞的特异性标记，分别是CD34、CD44、CD45、CD29。流式结果显示CD34-CD44+的细胞比例高达96.5％，CD45-CD29+的细胞比例高达95.3％。说明采用本发明方法分离培养得到的牛脐带MSC细胞表面表达的特异性标记符合MSC的特性，并且纯度较高。
实施例3低浓度的EGF以及NEAA在羊BMSCs培养过程中的作用
取实施例1中分离培养得到的P3代细胞，采用胰酶消化后用含有10％FBS的DMEM/F12培养基按1×104/mL接种到六孔板上，每孔2mL体系。NEAA及EGF按照不同的添加方式及浓度进行添加，添加的方案如表1。重复进行三次平行实验。定期观察细胞生长状态及形态变化，每3天进行一次换液，第7天对细胞进行拍照，并用胰酶消化收集细胞，用细胞计数仪进行细胞计数，并用三次平行实验的计数结果算出平均值。细胞计数的平均结果见表2。
表1
表2
| (1)64×104cell | (2)79×104cell | (3)71×104cell |
| (4)85×104cell | (5)87×104cell | (6)88×104cell |
可得出以下结论：
由(1)(2)组可以得出，NEAA对于羊BMSCs的细胞增殖有着明显的促进作用。NEAA可以为细胞提供更充足的营养，促进蛋白质的合成，从而促进该细胞的增殖。
由(1)(2)(3)(4)组可以得出，NEAA与EGF均能促进该细胞的增殖，但NEAA对于细胞增殖的促进作用比EGF明显。而在NEAA与EGF联合使用时，功能上相互促进，细胞增殖效果明显大幅提升，细胞增殖的促进效果大大优于NEAA或者EGF单独使用时的促进作用，有显著性差异，说明两者有协同作用。
图5为各组细胞形态图，图A为(1)组、图B为(2)组、图C为(3)组、图D为(4)组、图E为(5)组、图F为(6)组，结合附图5，我们可以发现加入了5μg/L EGF的(3)(4)组以及加入了10μg/L EGF的(5)组，这三组的细胞的形态较好，为梭形、成纤维状，形态较均一。而没有加入EGF的(1)(2)组细胞的形态以及加入了20μg/L EGF的(6)组细胞形态均有明显的改变，表明该细胞已有部分分化现象。
由本实施例，我们可以得出，低浓度的EGF(5～10μg/L)与50mg/L NEAA联用时，具有协同作用，对于羊BMSCs不仅有促进增殖的作用，还有明显的抑制其体外分化的功能。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。
Claims (10)
1.一种羊骨髓间充质干细胞的分离与培养方法，其特征在于，包括以下步骤:
(1)获取羊骨髓
(2)将离心管中的骨髓用PBS洗涤后，加入等体积的完全培养基重悬细胞，另取一离心管加入等体积的Ficoll分离液，将骨髓细胞悬液缓慢加入到Ficoll分离液上层，离心后吸取单个核细胞层，用PBS清洗，用完全培养基重悬细胞后，接种到完全培养基中贴壁培养；
(3)接种18～24h后，弃去未贴壁的细胞及培养基，用PBS清洗后，加入含5～10μg/L EGF和50～100mg/L NEAA的完全培养基继续培养，即可得到羊骨髓间充质干细胞；
完全培养基为含有10％FBS的DMEM/F12培养基，百分数为体积百分数。
2.根据权利要求1所述的分离与培养方法，其特征在于，所述离心管是采用SepMateTM离心管，安装有插件。
3.根据权利要求1所述的分离与培养方法，其特征在于，所述羊骨髓的获取是通过选择5个月大的健康羊，将其麻醉后用骨髓穿刺针沿髂骨缘刺入直至髓腔，接上预先置有100U肝素抗凝剂的注射器抽吸骨髓，再转移到真空采血管中，置于冰盒中保存。
4.根据权利要求1所述的分离与培养方法，其特征在于，步骤(2)所述将离心管中的骨髓用PBS洗涤是用等体积的PBS洗涤。
5.根据权利要求1所述的分离与培养方法，其特征在于，步骤(2)所述贴壁培养和步骤(3)所述培养是放置于5％CO2、37℃的培养箱中培养。
6.根据权利要求1所述的分离与培养方法，其特征在于，步骤(2)所述离心是在700g离心20min。
7.根据权利要求1所述的分离与培养方法，其特征在于，步骤(3)所述用PBS清洗是用PBS清洗2遍。
8.根据权利要求1所述的分离与培养方法，其特征在于，步骤(3)所述含5～10μg/L EGF和50～100mg/L NEAA的培养基要求每3天更换一次。
9.根据权利要求1所述的分离与培养方法，其特征在于，所述NEAA为Invitrogen公司产品，产品目录号为11140。
10.根据权利要求1所述的分离与培养方法，其特征在于，步骤(2)所述接种的接种密度是1×106/mL。
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