CN105950550A - 一种间充质干细胞无血清培养基、细胞分离培养方法 - Google Patents

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CN105950550A CN201610578158.6A CN201610578158A CN105950550A CN 105950550 A CN105950550 A CN 105950550A CN 201610578158 A CN201610578158 A CN 201610578158A CN 105950550 A CN105950550 A CN 105950550A
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Abstract

本发明提供了一种间充质干细胞无血清培养基，它包括如下体积配比的成分：DMEM/F12 94～97份、人血小板裂解物2～5份、非必需氨基酸1份。本发明还提供了所述培养基的用途，及一种间充质干细胞的分离培养方法。本发明的无血清培养基，可用于有效分离培养胎盘及脐带来源的间充质干细胞，效果优于市售培养基，而且成本低、安全性高，应用前景良好。

Description

一种间充质干细胞无血清培养基、细胞分离培养方法
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种间充质干细胞无血清培养基、细胞分离培养方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一类来源于中胚层的多能干细胞，具有高度自我更新和多系分化潜能，它在特定诱导条件下可分化为多种类型的组织细胞，是细胞移植和组织工程的良好种子细胞，应用前景非常广阔。
根据来源划分，MSCs可分为两大类：一类是成体组织来源的MSCs，如骨髓和脂肪组织；另一类是胎儿/围产期组织来源的MSCs，如胎盘、脐带等。成体组织来源的MSCs由于增殖潜能有限很难大规模生产用于临床治疗，而胎儿/围产期组织来源的MSCs则不存在这样的缺陷，更有可能为临床应用提供理想的间充质干细胞来源。
现有的从胎盘、脐带中获取间充质干细胞的技术尚不完善，仍存在分离使用的培养基成分复杂或含有胎牛血清等动物源性成分、分离成功率低、分离成本高等缺点，使分离的细胞不利于临床应用。例如公开号为CN103243071A的专利申请公开了一种用于间充质干细胞分离及培养的培养基，虽然其不含有血清，但培养基中含有多种维生素、金属离子及其它成分，配制复杂，且成本高。公开号为CN103805562A的专利申请也面临同样的高成本问题。
因此，目前迫切需要对分离培养间充质干细胞的培养基及培养方法进行改进，以满足实际应用的需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种间充质干细胞无血清培养基及细胞分离培养方法。
本发明提供了一种间充质干细胞无血清培养基，它包括如下体积配比的成分：DMEM/F1294～97份、人血小板裂解物2～5份、非必需氨基酸1份。
其中，它包括如下体积配比的成分：DMEM/F1297份、人血小板裂解物2份、非必需氨基酸1份。
进一步地，所述人血小板裂解物购自Millipore公司；所述非必需氨基酸购自Gibco公司。
DMEM/F12：为液体培养基，可通过购买市售产品获得；也可购买干粉培养基配制；也可将F12培养基和DMEM培养基以1：1混合制备。
人血小板裂解物(HPL)、非必需氨基酸可通过购买市售产品获得，也可采用现在文献报道方法制备。
本发明还提供了上述无血清培养基在分离培养人胎盘或脐带间充质干细胞中的用途。
其中，所述胎盘间充质干细胞为胎盘羊膜、绒毛膜和/或基蜕膜来源的间充质干细胞。
本发明还提供了一种间充质干细胞的分离培养方法，它包括如下步骤：
a、取人胎盘组织或脐带组织，无菌条件下，将所取组织剪成小块；
b、清洗步骤a的小块组织，剪碎，加入上述无血清培养基，贴壁培养6天；
c、换液，此后每4天换液，直至细胞汇合度达到80～90％，即可。
其中，步骤c后，还包括消化传代步骤：取细胞进行胰酶消化传代，培养至第三代细胞，即可。
其中，步骤a中，所述胎盘组织为胎盘的羊膜、绒毛膜和/或基蜕膜。
其中，步骤b中，所述清洗用生理盐水；所述剪碎为剪成1～3mm3的碎块；优选地，剪碎为手动进行。
人工手动方式将胎盘组织或脐带组织剪成极小的碎块(1-3mm3)，既与组织剪碎机获得的小碎块无显著差异，又避免了组织在剪碎机机械剪碎时过热影响到细胞活性，极为利于直接接种到培养皿之后细胞向组织外地游移，从而实现贴壁生长。
其中，步骤b中，所述培养是在温度为37℃、体积分数为5％的CO2、饱和湿度条件下的培养箱中进行。
本发明的间充质干细胞无血清培养基，可用于有效分离培养胎盘及脐带来源的间充质干细胞，效果甚至优于市售培养基。而且本发明培养基成分简单，不使用动物血清，完全排除了动物源成分的干扰，安全性高，方便应用于临床。
本发明间充质干细胞的分离培养方法，可以从人胎盘、脐带中高效获得间充质干细胞；而且本发明方法操作简单、制备时间短；成本低、不使用任何蛋白酶制剂；分离培养效率高，适用于大规模细胞制备，应用前景良好。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为绒毛膜间充质干细胞形态图；
图2为绒毛膜间充质干细胞流式表型图；
图3为绒毛膜间充质干细胞成脂、成骨和成软骨分化图；成脂分化用油红O染色，成骨分化用茜素红染色，成软骨分化用阿尔新蓝染色；
图4为羊膜间充质干细胞形态图；
图5为基蜕膜间充质干细胞形态图；
图6为羊膜间充质干细胞流式表型图；
图7为基蜕膜间充质干细胞流式表型图；
图8为羊膜间充质干细胞成脂、成骨和成软骨分化图；成脂分化用油红O染色，成骨分化用茜素红染色，成软骨分化用阿尔新蓝染色；
图9为基蜕膜间充质干细胞成脂、成骨和成软骨分化图；成脂分化用油红O染色，成骨分化用茜素红染色，成软骨分化用阿尔新蓝染色；
图10为脐带间充质干细胞形态图；
图11为脐带间充质干细胞流式表型图；
图12为脐带间充质干细胞成脂、成骨和成软骨分化图；成脂分化用油红O染色，成骨分化用茜素红染色，成软骨分化用阿尔新蓝染色；
图13为羊膜(AM)、绒毛膜(CP)和脐带(HU)来源间充质干细胞分别用市售无血清培养基(Lonza)和本发明培养基(HPL培养基)培养图，从第5代培养到第9代的平均群体倍增时间比较。
具体实施方式
下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。
本发明所用的实验试剂与仪器如下：
实验试剂：DMEM/F12培养基(Gibco，货号：11039-021)、人血小板裂解物(HPL，Millipore，货号：SCM141)、非必需氨基酸(Gibco，货号：11140-050)、生理盐水、0.25％的胰酶-EDTA(Gibco，货号：25200-056)、成脂分化诱导培养基(Gibco，货号：A10070-01)、成骨分化诱导培养基(Gibco，货号：A10072-01)、成软骨分化诱导培养基(Gibco，货号：A10071-01)
仪器及器材：生物安全柜、敷料镊、组织镊、不锈钢敷料盒、电动移液器、移液管、离心管、培养皿、眼科剪。
实施例1本发明无血清培养基的配制
取DMEM/F12基础培养基97mL，加入人血小板裂解物2mL、非必需氨基酸1mL，无菌过滤，即可，于4℃保存。
实施例2本发明无血清培养基的配制
取DMEM/F12基础培养基94mL，加入人血小板裂解物5mL、非必需氨基酸1mL，无菌过滤，即可，于4℃保存。
实施例3本发明间充质干细胞的分离培养及鉴定(胎盘)
一、分离培养方法
1、采集人类胎盘(在产妇签署知情同意书的前提下，剖腹产和顺产皆可，不做无菌要求)，低温冰盒运送。
2、胎盘绒毛膜板取材和接种：
1)高温消毒手术器械和大号不锈钢敷料盒，同时紫外线消毒生物安全柜；
2)严格筛选供者，血液化验排除传染病(包括艾滋病，甲、乙、丙型肝炎和梅毒)；
3)将胎盘浸泡于装有预冷生理盐水的大号不锈钢敷料盒，以下步骤均在无菌条件下进行，剥除绒毛膜板上的羊膜后，从绒毛膜板上剪下5×5cm的方块，用生理盐水清洗组织数次，洗干净绒毛膜板残留血液；
4)将清洗干净的绒毛膜板组织转移至无菌的100mm培养皿中，手动剪碎成1mm3的碎块，分别铺匀于其余10个100mm培养皿中，小心加入少量完全培养基(即实施例1制备的无血清培养基)，使培养液既能覆盖绒毛膜组织碎片，又不至于使其漂浮起来，置于37℃、饱和湿度5％CO2培养箱中培养。
3、胎盘间充质干细胞的扩增与传代：
1)培养过程中观察可见细胞从组织块边缘逐渐游移出来，并进一步实现贴壁生长和增殖，在培养的第7天全部更换新鲜培养基继续培养；
2)此后每4天换一次培养液，直到细胞长满80～90％培养皿底面积，便进行胰酶消化传代；
3)胰酶消化传代：吸弃培养液，用生理盐水清洗细胞两次，尽量去除贴壁的组织块，每皿加入1毫升质量百分数为0.25％的胰酶-EDTA在37℃消化5分钟左右，待细胞悬浮后每个培养皿加入1毫升完全培养基以中和胰酶反应，1500转/分离心5分钟，再悬浮于完全培养基中，按照5000～10000个细胞/cm2培养底面积接种传代到新T75培养瓶中；传代培养即可。
二、胎盘间充质干细胞的冷冻保存和复苏
步骤如下：
1、取培养至第三代的胎盘间充质干细胞(细胞长满90～100％培养瓶底面积)，用生理盐水洗两次以洗掉HPL残留，0.25％胰酶-EDTA消化，每瓶T75用2毫升，37℃，5分钟，待细胞悬浮后每个T75加入2毫升完全培养基以中和胰酶反应。在1500转/分离心5分钟；
2、再按细胞密度1.2～2×106/mL左右悬浮于细胞冻存液中，分装到2mL冻存管中，使用程控降温仪缓慢降温冻存，再转移到液氮罐中长期保存备用；所述细胞冻存液组成：总质量10％的DMSO，总质量90％的完全培养基；
3、使用细胞前，将冻存管中细胞在37℃水浴中迅速解冻，再转移至装有10mL预冷完全培养基的离心管中，在1500转/分离心5分钟，吸弃上清，再用生理盐水洗两遍，最后用完全培养基重悬，接种到新T75培养瓶中，置于37℃、饱和湿度5％CO2培养箱中培养。
三、胎盘间充质干细胞的鉴定
1、鉴定方法
胰酶消化传到第三代时，用显微镜鉴定所获细胞的形态，用流式细胞仪鉴定培养细胞的纯度：
胎盘间充质干细胞的标记物包括：阳性标记物有CD73，CD90和CD105，阴性标记物有CD14，CD34，CD45和HLA-DR；
(间充质干细胞的标记物参见文献Dominici M et al.，Minimal criteria fordefining multipotentmesenchymal stromal cells.The International Society forCellular Therapy position statement，Cytotherapy，2006，8(4)：315-317)
分化鉴定：成脂、成骨和成软骨分化；
成脂、成骨和成软骨分化：以4×104细胞/孔接种于6孔板内，培养24小时后细胞贴壁，弃去培养液。分别按下述方式诱导：
1)加入成脂分化诱导培养基继续培养。每3天换液1次，共诱导21天。弃掉培养液，PBS洗2次，10％甲醛固定30分钟。PBS再洗3次。加入0.2％油红O染液，37℃染色30分钟。吸出染液回收，PBS洗3次。显微镜下观察并照相。
2)加入成骨分化诱导培养基继续培养。每3天换液1次，共诱导21天。弃上清，PBS清洗1遍，4％多聚甲醛室温固定30min。弃多聚甲醛，PBS清洗2遍，2％茜素红(pH4.2，使用前过滤)室温30min。弃茜素红，PBS清洗至上清无颜色或浅色，最后加入PBS，显微镜下观察并拍照。
3)加入成软骨分化诱导培养基继续培养。每3天换液1次，共诱导21天。弃上清，PBS清洗1遍，4％多聚甲醛室温固定30min。弃多聚甲醛，PBS清洗2遍，0.1N HCL室温润洗5min。弃0.1N HCL，1％阿尔新蓝室温30min。弃亚甲基蓝，0.1N HCL润洗3次，加入蒸馏水中和酸性，显微镜下观察并拍照。
2、鉴定结果
1)形态学鉴定
显微镜下可观察到细胞贴壁生长，形态为典型的纺锤形(见图1)，符合间充质干细胞的细胞形态。
2)细胞活率及表面标记鉴定
流式细胞仪鉴定细胞活率达到90％以上，阳性标记纯度达到95％以上，阴性标记纯度在2％以下(见图2)，符合间充质干细胞表面标记。
3)分化能力鉴定
本发明所获得的细胞可以通过诱导向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞定向分化(见图3)，具备间充质干细胞的多系分化能力。
可见，本发明得到的细胞为间充质干细胞。
实施例4本发明间充质干细胞的分离培养及鉴定(胎盘)
一、分离培养方法
1、采集人类胎盘(在产妇签署知情同意书的前提下，剖腹产和顺产皆可，不做无菌要求)，低温冰盒运送。
2、胎盘羊膜和基蜕膜的取材和接种：
1)高温消毒手术器械和大号不锈钢敷料盒，同时紫外线消毒生物安全柜；
2)严格筛选供者，血液化验排除传染病(包括艾滋病，甲、乙、丙型肝炎和梅毒)；
3)胎盘羊膜的取材和接种
将胎盘浸泡于装有预冷生理盐水的大号不锈钢敷料盒，以下步骤均在无菌条件下进行，将胎盘脐带面向上，剥除绒毛膜板上的羊膜后，从羊膜上剪下5×5cm的方块，用生理盐水清洗组织数次，洗干净残留血液；
将清洗干净的羊膜组织转移至无菌的100mm培养皿中，手动剪碎成1mm3的碎块，分别铺匀于其余10个100mm培养皿中，小心加入少量完全培养基(即实施例1制备的无血清培养基)，使培养液既能覆盖羊膜组织碎片，又不至于使其漂浮起来，置于37℃、饱和湿度5％CO2培养箱中培养；
4)胎盘基蜕膜的取材和接种
再将胎盘脐带面向下，小心剥除绒毛膜上的基蜕膜，收集到足够量(7g)的基蜕膜后，用生理盐水清洗组织数次，洗干净残留血液；
将清洗干净的基蜕膜组织转移至无菌的100mm培养皿中，手动剪碎成1mm3的碎块，分别铺匀于其余10个100mm培养皿中，小心加入少量完全培养基(即实施例1制备的无血清培养基)，使培养液既能覆盖基蜕膜组织碎片，又不至于使其漂浮起来，置于37℃、饱和湿度5％CO2培养箱中培养。
3、胎盘间充质干细胞的扩增与传代
1)培养过程中观察可见细胞从组织块边缘逐渐游移出来，并进一步实现贴壁生长和增殖，在培养的第7天全部更换新鲜培养基继续培养；
2)此后每4天换一次培养液直到细胞长满80～90％培养皿底面积，便进行胰酶消化传代；
3)胰酶消化传代：吸弃培养液，用生理盐水清洗细胞两次，尽量去除贴壁的组织块，每皿加入1毫升质量百分数为0.25％的胰酶-EDTA在37℃消化5分钟左右，待细胞悬浮后每个培养皿加入1毫升完全培养基以中和胰酶反应，1500转/分离心5分钟，再悬浮于完全培养基中，按照5000～10000个细胞/cm2培养底面积接种传代到新T75培养瓶中；传代培养即可。
二、胎盘间充质干细胞的冷冻保存和复苏
步骤如下：
1、取培养至第三代的胎盘间充质干细胞(细胞长满90～100％培养瓶底面积)，用生理盐水洗两次以洗掉HPL残留，0.25％胰酶-EDTA消化，每瓶T75用2毫升，37℃，5分钟，待细胞悬浮后每个T75加入2毫升完全培养基以中和胰酶反应。在1500转/分离心5分钟；
2、再按细胞密度1.2～2×106/mL左右悬浮于细胞冻存液中，分装到2mL冻存管中，使用程控降温仪缓慢降温冻存，再转移到液氮罐中长期保存备用；所述细胞冻存液组成：总质量10％的DMSO，总质量90％的完全培养基；
3、使用细胞前，将冻存管中细胞在37℃水浴中迅速解冻，再转移至装有10mL预冷完全培养基的离心管中，在1500转/分离心5分钟，吸弃上清，再用生理盐水洗两遍，最后用完全培养基重悬，接种到新T75培养瓶中，置于37℃、饱和湿度5％CO2培养箱中培养。
三、胎盘间充质干细胞的鉴定
胰酶消化传到第三代时，用显微镜鉴定所获细胞的形态，用流式细胞仪鉴定培养细胞的纯度：
胎盘间充质干细胞的标记物包括：阳性标记物有CD73，CD90和CD105，阴性标记物有CD14，CD34，CD45和HLA-DR；
分化鉴定：成脂、成骨和成软骨分化；
成脂、成骨和成软骨分化：以4×104细胞/孔接种于6孔板内。培养24小时后细胞贴壁，弃去培养液。分别按下述方式诱导：
1)加入成脂分化培养基继续培养。每3天换液1次，共诱导21天。弃掉培养液，PBS洗2次，10％甲醛固定30分钟。PBS再洗3次。加入0.2％油红O染液，37℃染色30分钟。吸出染液回收，PBS洗3次。显微镜下观察并照相。
2)加入成骨分化培养基继续培养。每3天换液1次，共诱导21天。弃上清，PBS清洗1遍，4％多聚甲醛室温固定30min。弃多聚甲醛，PBS清洗2遍，2％茜素红(pH4.2，使用前过滤)室温30min。弃茜素红，PBS清洗至上清无颜色或浅色，最后加入PBS，显微镜下观察并拍照。
3)加入成软骨分化培养基继续培养。每3天换液1次，共诱导21天。弃上清，PBS清洗1遍，4％多聚甲醛室温固定30min。弃多聚甲醛，PBS清洗2遍，0.1N HCL室温润洗5min。弃0.1N HCL，1％阿尔新蓝室温30min。弃亚甲基蓝，0.1N HCL润洗3次，加入蒸馏水中和酸性，显微镜下观察并拍照。
2、鉴定结果
1)形态学鉴定
显微镜下可观察到细胞贴壁生长，形态为典型的纺锤形(见图4、5)，符合间充质干细胞的细胞形态。
2)细胞活率及表面标记鉴定
流式细胞仪鉴定细胞活率达到90％以上，阳性标记纯度达到95％以上，阴性标记纯度在2％以下(见图6、7)，符合间充质干细胞表面标记。
3)分化能力鉴定
本发明所获得的细胞可以通过诱导向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞定向分化(见图8、9)，具备间充质干细胞的多系分化能力。
可见，本发明得到的细胞为间充质干细胞。
实施例5本发明间充质干细胞的分离培养及鉴定(脐带)
一、分离培养方法
1、采集人类脐带(在产妇签署知情同意书的前提下，剖腹产和顺产皆可，不做无菌要求)，低温冰盒运送。
2、脐带取材和接种：
1)高温消毒手术器械，同时紫外线消毒生物安全柜；
2)严格筛选供者，血液化验排除传染病(包括艾滋病，甲、乙、丙型肝炎和梅毒)；
3)将脐带浸泡于装有预冷生理盐水的100mm培养皿中，以下步骤均在无菌条件下进行，从脐带上剪下2cm长的一段，用生理盐水清洗组织数次，洗干净残留血液；
4)将清洗干净的脐带组织转移至无菌的100mm培养皿中，手动剪碎成2～3mm3的碎块，分别铺匀于其余5个100mm培养皿中，小心加入少量完全培养基(即实施例1制备的无血清培养基)，使培养液既能覆盖脐带组织碎片，又不至于使其漂浮起来，置于37℃、饱和湿度5％CO2培养箱中培养。
3、脐带间充质干细胞的扩增与传代
1)培养过程中观察可见细胞从组织块边缘逐渐游移出来，并进一步实现贴壁生长和增殖，在培养的第7天全部更换新鲜培养基继续培养；
2)此后每4天换一次培养液，直到细胞长满80～90％培养皿底面积，便进行胰酶消化传代；
3)胰酶消化传代：吸弃培养液，用生理盐水清洗细胞两次，尽量去除贴壁的组织块，每皿加入1毫升质量百分数为0.25％的胰酶-EDTA在37℃消化5分钟左右，待细胞悬浮后每个培养皿加入1毫升完全培养基以中和胰酶反应，1500转/分离心5分钟，再悬浮于完全培养基中，按照5000～10000个细胞/cm2培养底面积接种传代到新T75培养瓶中；传代培养即可。
二、脐带间充质干细胞的冷冻保存和复苏
步骤如下：
1、取培养至第三代的脐带间充质干细胞(细胞长满90～100％培养瓶底面积)，用生理盐水洗两次以洗掉HPL残留，0.25％胰酶-EDTA消化，每瓶T75用2毫升，37℃，5分钟，待细胞悬浮后每个T75加入2毫升完全培养基以中和胰酶反应。在1500转/分离心5分钟；
2、再按细胞密度1.2～2×106/mL左右悬浮于细胞冻存液中，分装到2mL冻存管中，使用程控降温仪缓慢降温冻存，再转移到液氮罐中长期保存备用；所述细胞冻存液组成：总质量10％的DMSO，总质量90％的完全培养基；
3、使用细胞前，将冻存管中细胞在37℃水浴中迅速解冻，再转移至装有10mL预冷完全培养基的离心管中，在1500转/分离心5分钟，吸弃上清，再用生理盐水洗两遍，最后用完全培养基重悬，接种到新T75培养瓶中，置于37℃、饱和湿度5％CO2培养箱中培养。
三、脐带间充质干细胞的鉴定
1、鉴定方法
胰酶消化传到第三代时，用显微镜鉴定所获细胞的形态，用流式细胞仪鉴定培养细胞的纯度：
脐带间充质干细胞的标记物包括：阳性标记物有CD73，CD90和CD105，阴性标记物有CD14，CD34，CD45和HLA-DR；
分化鉴定：成脂、成骨和成软骨分化；
成脂、成骨和成软骨分化：以4×104细胞/孔接种于6孔板内，培养24小时后细胞贴壁，弃去培养液。分别按下述方式诱导：
1)加入成脂分化诱导培养基继续培养。每3天换液1次，共诱导21天。弃掉培养液，PBS洗2次，10％甲醛固定30分钟。PBS再洗3次。加入0.2％油红O染液，37℃染色30分钟。吸出染液回收，PBS洗3次。显微镜下观察并照相。
2)加入成骨分化诱导培养基继续培养。每3天换液1次，共诱导21天。弃上清，PBS清洗1遍，4％多聚甲醛室温固定30min。弃多聚甲醛，PBS清洗2遍，2％茜素红(pH4.2，使用前过滤)室温30min。弃茜素红，PBS清洗至上清无颜色或浅色，最后加入PBS，显微镜下观察并拍照。
3)加入成软骨分化诱导培养基继续培养。每3天换液1次，共诱导21天。弃上清，PBS清洗1遍，4％多聚甲醛室温固定30min。弃多聚甲醛，PBS清洗2遍，0.1N HCL室温润洗5min。弃0.1N HCL，1％阿尔新蓝室温30min。弃亚甲基蓝，0.1N HCL润洗3次，加入蒸馏水中和酸性，显微镜下观察并拍照。
2、鉴定结果
1)形态学鉴定
显微镜下可观察到细胞贴壁生长，形态为典型的纺锤形(见图10)，符合间充质干细胞的细胞形态。
2)细胞活率及表面标记鉴定
流式细胞仪鉴定细胞活率达到90％以上，阳性标记纯度达到95％以上，阴性标记纯度在2％以下(见图11)，符合间充质干细胞表面标记。
3)分化能力鉴定
本发明所获得的细胞可以通过诱导向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞定向分化(见图12)，具备间充质干细胞的多系分化能力。
可见，本发明得到的细胞为间充质干细胞。
以下用实验例的方式说明本发明的有益效果：
实验例1本发明培养基与市售无血清培养基的效果比较
用本发明培养基与市售无血清培养基(品牌：Lonza，货号：00192125)同时培养羊膜、绒毛膜和脐带间充质干细胞，分别检测从第5代开始培养到第9代的平均群体倍增时间、细胞形态。
结果：本发明培养基，与市售无血清培养基相比，培养的细胞在形态上保持一致，无明显差异。
在群体倍增时间上，用本发明培养基培养的脐带间充质干细胞的平均群体倍增时间与市售无血清培养基培养的同类组织细胞相当；而羊膜和绒毛膜间充质干细胞的平均群体倍增时间显著低于用市售无血清培养基培养的同类组织细胞(见图13)。
结果表明，使用本发明培养基，可促进羊膜和绒毛膜间充质干细胞快速增殖，更适于间充质干细胞生长，总体效果优于市售无血清培养基。
综上，本发明的间充质干细胞无血清培养基，可用于有效分离培养胎盘及脐带来源的间充质干细胞，效果优于市售培养基，而且成本低、安全性高。本发明的分离培养方法，可以从人胎盘、脐带中高效获得间充质干细胞，适用于大规模细胞制备，应用前景良好。

Claims (10)

1.一种间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，它包括如下体积配比的成分：
DMEM/F1294～97份、人血小板裂解物2～5份、非必需氨基酸1份。
2.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于：它包括如下体积配比的成分：
DMEM/F1297份、人血小板裂解物2份、非必需氨基酸1份。
3.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于：所述人血小板裂解物购自Millipore公司；所述非必需氨基酸购自Gibco公司。
4.权利要求1-3任意一项所述的无血清培养基在分离培养人胎盘或脐带间充质干细胞中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述胎盘间充质干细胞为胎盘羊膜、绒毛膜和/或基蜕膜来源的间充质干细胞。
6.一种间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于：它包括如下步骤：
a、取人胎盘组织或脐带组织，无菌条件下，将所取组织剪成小块；
b、清洗步骤a的小块组织，剪碎，加入权利要求1-3任意一项所述的无血清培养基，贴壁培养6天；
c、换液，此后每4天换液，直至细胞汇合度达到80～90％，即可。
7.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于：步骤c后，还包括消化传代步骤：取细胞进行胰酶消化传代，培养至第三代细胞，即可。
8.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于：步骤a中，所述胎盘组织为胎盘的羊膜、绒毛膜和/或基蜕膜。
9.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于：步骤b中，所述清洗用生理盐水；所述剪碎为剪成1～3mm3的碎块；优选地，剪碎为手动进行。
10.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于：步骤b中，所述培养是在温度为37℃、体积分数为5％的CO2、饱和湿度条件下的培养箱中进行。
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