WO2021020726A1 - 새로운 엑소좀의 생산방법 및 이의 응용 - Google Patents

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interferon
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조병성
하대현
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주식회사 엑소코바이오
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing exosomes, and to a method for producing exosomes having enhanced physiological activity and/or capable of improving the productivity of exosomes.
  • the present invention relates to a method for enhancing the productivity of exosomes, a method for enhancing physiological activity, and a medium therefor.
  • the present invention relates to the application of exosomes with enhanced physiological activity obtained by the production method as described above.
  • Extracellular vesicles are sometimes called cell membrane-derived vesicles, ectosomes, shedding vesicles, microparticles, exosomes, etc., and in some cases, they are used separately from exosomes.
  • Exosomes are vesicles having a size of tens to hundreds of nanometers consisting of a double phospholipid membrane identical to the structure of a cell membrane, and contain proteins and nucleic acids (mRNA, miRNA, etc.) called exosomes cargo (cargo).
  • Exosomal cargo contains a wide range of signaling factors, and these signaling factors are known to be specific to the cell type and are regulated differently depending on the environment of the secretory cell.
  • Exosomes are intercellular signaling mediators secreted by cells, and various cellular signals transmitted through them regulate cellular behavior including activation, growth, migration, differentiation, dedifferentiation, apoptosis, and necrosis of target cells. Is known.
  • Exosomes contain specific genetic material and bioactive factors depending on the nature and state of the derived cell. In the case of proliferating stem cell-derived exosomes, cell behaviors such as cell migration, proliferation and differentiation are regulated, and the characteristics of stem cells related to tissue regeneration are reflected (Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579).
  • exosomes which are called cell avatars, contain bioactive factors such as growth factors, similar to cells, and serve as a carrier that carries bioactive factors between cells and cells, that is, the communication between cells and cells.
  • Exosomes are known to be released not only from animal cells such as stem cells, immune cells, fibroblasts, and cancer cells, but also from cells of various organisms such as plants, bacteria, fungi, and algae. .
  • exosome separation techniques include ultracentrifugation, density gradient centrifugation, ultrafiltration, tangential flow filtration (TFF), and size exclusion chromatography. (size exclusion chromatography), ion exchange chromatography, immunoaffinity capture, microfluidics-based isolation, exosome precipitation, total exosome extraction kit (total) exosome isolation kit), or polymer based precipitation.
  • Another object of the present invention is to provide a method for enhancing the productivity of exosomes and a method for enhancing physiological activity.
  • Another object of the present invention is to provide a medium for enhancing productivity and/or enhancing physiological activity of exosomes.
  • Another object of the present invention is to provide various applications of exosomes with enhanced physiological activity obtained by the production method as described above.
  • the inventors of the present invention have been conducting intensive research on the production method of exosomes that can improve the productivity of exosomes and have enhanced efficacy, and when using a combination of TNF- ⁇ and interferon- ⁇ , per unit culture medium (or unit cell)
  • the present invention was completed by confirming that the production amount of exosomes was increased and the physiological activity of the produced exosomes was improved.
  • the present invention provides a method for producing exosomes comprising culturing animal-derived cells in a medium containing TNF- ⁇ and interferon- ⁇ .
  • extracellular vesicles generally encompasses membrane-derived vesicles (membrane vesicles), ectosomes, shedding vesicles, microparticles, or equivalents thereof. It is used in the sense of Depending on the separation environment, conditions, and methods, extracellular vesicles may have the same meaning as exosomes, and may have the same or similar size as exosomes, but may have a meaning including nanovesicles that do not have the composition of exosomes. Meanwhile, the term exosomes used in relation to productivity in the present specification is used in the sense of encompassing the extracellular vesicles.
  • exosomes refers to vesicles having a size of tens to hundreds of nanometers (preferably about 30 to 200 nm) composed of a double phospholipid membrane identical to the structure of the cell membrane (however, the separation object is The particle size of the exosomes may vary depending on the cell type, separation method, and measurement method. (Vasiliy S. Chernyshev et al., "Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes", Anal Bioanal Chem, (2015) DOI 10.1007/s00216-015-8535-3). Exosomes contain proteins and nucleic acids (mRNA, miRNA, etc.) called exosome cargo (cargo).
  • Exosomal cargo contains a wide range of signaling factors, and these signaling factors are known to be specific to the cell type and are regulated differently depending on the environment of the secretory cell.
  • Exosomes are intercellular signaling mediators secreted by cells, and various cellular signals transmitted through them regulate cellular behavior including activation, growth, migration, differentiation, dedifferentiation, apoptosis, and necrosis of target cells. Is known.
  • exosome has a nano-sized vesicle structure secreted from animal-derived cells and released into the extracellular space and has a composition similar to that of exosomes (eg, exosomes -It means to include all similar vegetables).
  • the type of the animal-derived cell from which the exosome is derived is not limited, but as an example that does not limit the present invention, it may be a stem cell or an immune cell.
  • the stem cells may be embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells (iPSC), adult stem cells, mesenchymal stem cells derived from embryonic stem cells, or mesenchymal stem cells derived from induced pluripotent stem cells.
  • the immune cells may be T cells, B cells, NK cells, cytotoxic T cells, dendritic cells or macrophages.
  • the adult stem cells are at least one adult selected from the group consisting of mesenchymal stem cells, human tissue-derived mesenchymal stromal cells, human tissue-derived mesenchymal stem cells, and multipotent stem cells. It may be a stem cell.
  • the mesenchymal stem cells may be mesenchymal stem cells derived from at least one tissue selected from the group consisting of umbilical cord, cord blood, bone marrow, fat, muscle, nerve, skin, amniotic membrane, Wharton jelly, and placenta.
  • the adult stem cells may be mesenchymal stem cells, for example, stem cells derived from fat, bone marrow, umbilical cord or umbilical cord blood, and more preferably stem cells derived from fat.
  • the type of the stem cell or the immune cell is not limited as long as there is no risk of infection by a pathogen and does not cause an immune rejection reaction, but it may be preferably a human stem cell or a human immune cell.
  • the fat stem cells used in the examples described below should be understood as an example of animal cells that can be used in the present invention, and the present invention is not limited thereto.
  • pre-treatment means culturing animal-derived cells in a medium containing TNF- ⁇ and interferon- ⁇
  • pre-treatment exosomes are derived from animals in a medium containing TNF- ⁇ and interferon- ⁇ . It means an exosome obtained by culturing cells.
  • No treatment refers to culturing animal-derived cells in a medium that does not contain TNF- ⁇ and interferon- ⁇
  • untreated exosomes or untreated control refers to any of the cell culture steps and exosome production steps
  • TNF- ⁇ and interferon- ⁇ refers to an exosome obtained without treatment.
  • serum-free medium or "SFM” is a culture medium in which serum such as Fetal Bovine Serum (FBS) is not added to, for example, a basal medium (optionally including antibiotics and/or antifungal agents) Means
  • EDM is a platelet lysate, preferably a human platelet lysate, more preferably a platelet lysate-derived exosome and an extracellular vesicle-derived human platelet lysate added to the basic medium. It means a culture medium (optionally including antibiotics and/or antifungal agents).
  • the basic medium is ⁇ -MEM, DMEM, DMEM F12, 199 medium, RPMI-1640, L-15, Hum F-10, Hum F-12, DM-160, DM-170, etc. I can.
  • the present invention provides a method for improving the productivity of exosomes comprising the step of culturing animal-derived cells in a medium containing TNF- ⁇ and interferon- ⁇ .
  • the method for improving the productivity of exosomes of an embodiment of the present invention includes the steps of: (a) culturing animal-derived cells in a medium containing TNF- ⁇ and interferon- ⁇ , and (b) the animal-derived cells Washing, (c) culturing the washed animal-derived cells in a serum-free medium and collecting a culture solution, and (d) separating the exosomes from the collected culture solution may be included.
  • platelet lysate may be added to the serum-free medium of step (c).
  • the platelet lysate may preferably be a human platelet lysate, and more preferably, a platelet lysate-derived exosome and a human platelet lysate from which extracellular vesicles are removed.
  • the TNF- ⁇ and interferon- ⁇ are each at a concentration of about 1 ng/mL to 100 ng/mL, preferably about 10 ng/mL to 30 It may be included at a concentration of ng/mL, for example, may be included at a concentration of about 20 ng/mL.
  • the cultivation may be performed for about 12 hours to 48 hours, for example, for 24 hours.
  • the productivity may be defined as the number of exosome particles per mL of the culture solution (or the number of exosome particles per unit cell).
  • the present invention provides a method for enhancing physiological activity of exosomes comprising culturing animal-derived cells in a medium containing TNF- ⁇ and interferon- ⁇ .
  • the method for enhancing physiological activity of exosomes includes the steps of (a) culturing animal-derived cells in a medium containing TNF- ⁇ and interferon- ⁇ , and (b) the animal-derived cells And (c) culturing the washed animal-derived cells in a serum-free medium and collecting a culture solution, and (d) separating exosomes from the collected culture solution.
  • a platelet lysate may be added to the serum-free medium of step (c).
  • the platelet lysate may preferably be a human platelet lysate, and more preferably, a platelet lysate-derived exosome and a human platelet lysate from which extracellular vesicles are removed.
  • the TNF- ⁇ and interferon- ⁇ are each at a concentration of about 1 ng/mL to 100 ng/mL, preferably about 10 ng/mL to It may be included at a concentration of 30 ng/mL, for example, may be included at a concentration of about 20 ng/mL.
  • the culture may be performed for about 12 to 48 hours, for example, for 24 hours.
  • the physiological activity enhancement may be an increase in elastin synthesis, and may be, for example, at least one of enhancing skin elasticity or enhancing wrinkles.
  • the present invention provides a medium for enhancing the productivity of exosomes derived from animal cells or a medium for enhancing physiological activity, including TNF- ⁇ and interferon- ⁇ .
  • the TNF- ⁇ and interferon- ⁇ are each at a concentration of about 1 ng/mL to 100 ng/mL in the medium. , Preferably, it may be included in a concentration of about 10 ng/mL to 30 ng/mL, for example, it may be included in a concentration of about 20 ng/mL.
  • the present invention provides a composition
  • a composition comprising, as an active ingredient, exosomes having enhanced elastin synthesis increasing efficacy obtained by culturing animal-derived cells in a medium containing TNF- ⁇ and interferon- ⁇ .
  • the composition may be, for example, a composition for improving skin elasticity or wrinkles.
  • the composition of one embodiment of the present invention comprises the steps of (a) culturing animal-derived cells in a medium containing TNF- ⁇ and interferon- ⁇ , and (b) washing the animal-derived cells, (c) culturing the washed animal-derived cells in a serum-free medium and collecting a culture solution, and (d) separating exosomes from the collected culture solution.
  • a platelet lysate may be added to the serum-free medium of step (c).
  • the platelet lysate may preferably be a human platelet lysate, and more preferably, a platelet lysate-derived exosome and a human platelet lysate from which extracellular vesicles are removed.
  • the TNF- ⁇ and interferon- ⁇ are each at a concentration of about 1 ng/mL to 100 ng/mL, preferably about 10 ng/mL to 30 ng/mL in the medium. It may be included as, for example, may be included in a concentration of about 20 ng / mL.
  • the cultivation may be performed for about 12 to 48 hours, for example, may be performed for 24 hours.
  • a composition comprising exosomes obtained according to the method for producing exosomes of an embodiment of the present invention may be prepared as a quasi-drug, cosmetic composition, or skin external preparation.
  • the quasi-drug or the external preparation for skin may be a liquid, ointment, cream, spray, patch, gel, or aerosol.
  • the cosmetic composition may be, for example, a lotion or cream.
  • composition of one embodiment of the present invention is prepared as a quasi-drug, external skin preparation and/or cosmetic composition
  • it is usually used in a quasi-drug, external skin preparation and/or cosmetic composition within the scope of not impairing the effect of the present invention.
  • Ingredients for example, moisturizers, antioxidants, oily ingredients, ultraviolet absorbers, emulsifiers, surfactants, thickeners, alcohols, powder ingredients, colorants, aqueous ingredients, water, various skin nutrients, etc. can be appropriately blended as needed.
  • the quasi-drug, skin external preparation, and/or cosmetic composition of one embodiment of the present invention impairs its action (for example, skin elasticity improvement and/or wrinkle improvement, etc.) in addition to exosomes with enhanced physiological activity.
  • Skin elasticity improving agents, anti-wrinkle agents, and/or moisturizing agents may be mixed together and used as long as they are not required.
  • the composition comprising the exosomes with enhanced physiological activity of the present invention as an active ingredient may be applied to at least one of a hydrogel, hyaluronic acid, hyaluronic acid salt (eg, sodium hyaluronate), or hyaluronic acid gel. It can be supported or mixed.
  • the type of the hydrogel is not limited, but it may be preferably a hydrogel obtained by dispersing a gelling polymer in a polyhydric alcohol.
  • the gelling polymer is at least one selected from the group consisting of pluronic, purified agar, agarose, gellan gum, alginic acid, carrageenan, cassia gum, xanthan gum, galactomannan, glucomannan, pectin, cellulose, guar gum, and locust bean gum.
  • the polyhydric alcohol may be at least one selected from the group consisting of ethylene glycol, propylene glycol, 1,3-butylene glycol, isobutylene glycol, dipropylene glycol, sorbitol, xylitol, and glycerin.
  • the quasi-drug, skin external preparation and/or cosmetic composition of one embodiment of the present invention is, for example, a patch, a mask pack, a mask sheet, a cream, a tonic, an ointment, a suspension, an emulsion, a paste, a lotion, a gel, an oil, a pack, a spray. , Aerosol, mist, foundation, powder, oil paper, etc. can be applied in various forms.
  • the quasi-drug, skin external preparation and/or cosmetic composition may be applied or deposited on at least one surface of a patch, mask pack, or mask sheet.
  • the cosmetic composition of one embodiment of the present invention may be used for the purpose of improving skin elasticity and/or wrinkles, and the cosmetic formulation may be prepared in any formulation conventionally prepared in the art.
  • the quasi-drug, skin external preparation and/or cosmetic composition of one embodiment of the present invention includes components commonly used in quasi-drugs, external skin preparations and/or cosmetic compositions, such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and fragrances It may include conventional adjuvants and carriers such as.
  • components commonly used in quasi-drugs, external skin preparations and/or cosmetic compositions such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and fragrances It may include conventional adjuvants and carriers such as.
  • other ingredients may be appropriately selected and blended by a person skilled in the art without difficulty according to the type or purpose of use of the quasi-drug, external skin preparation and/or cosmetic composition.
  • the method for producing exosomes of the present invention can economically and efficiently produce exosomes with enhanced physiological activity that are commercially and/or clinically useful in high yield, and in particular, have much superior physiological activity compared to conventional methods. It has the advantage of being able to mass-produce exosomes.
  • NTA nanoparticle tracking analysis
  • FIG. 2 is a comparative graph showing that the productivity of exosomes was significantly increased compared to the productivity of the control group without TNF- ⁇ and interferon- ⁇ when TNF- ⁇ and interferon- ⁇ were pretreated according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2A is a graph comparing the number of exosome particles in the culture medium (CM) before performing ultra-fine filtration on the culture medium (CM)
  • Figure 2B is a graph obtained after performing ultra-fine filtration on the culture medium (CM). It is a graph comparing the number of exosome particles in the solution
  • FIG. 2C is a graph showing the comparison results of FIGS. 2A and 2B together.
  • NTA nanoparticle tracking analysis
  • FIG. 4 is a comparative graph showing that the productivity of exosomes was significantly increased when TNF- ⁇ and interferon- ⁇ were pretreated according to an embodiment of the present invention compared to the productivity of the control group without TNF- ⁇ and interferon- ⁇ .
  • Figure 4A is a graph comparing the number of exosome particles in the culture medium (CM) before performing ultracentrifugation on the culture medium (CM)
  • Figure 4B is a graph obtained after ultracentrifugation on the culture medium (CM). It is a graph comparing the number of exosome particles in the solution (EXO)
  • FIG. 4C is a graph showing the comparison results of FIGS. 4A and 4B together.
  • Figure 5 shows the content of the CD63 marker (exosome specific marker) in the experimental group pretreated with TNF- ⁇ and interferon- ⁇ according to an embodiment of the present invention (reflecting the content and productivity of exosomes) untreated control, interferon It is a comparative graph showing that the content of the CD63 marker was significantly increased in the - ⁇ alone treatment group and the TNF- ⁇ alone treatment group.
  • Figure 6 is a case in which the pre-treatment exosomes according to an embodiment of the present invention are treated on human fibroblasts, as compared to the case where the exosomes are not treated (control), elastin synthesis is significantly increased as well as untreated exosomes (general exo A little), is a comparative graph showing that the effect of increasing elastin synthesis is remarkable than that of interferon- ⁇ alone-treated exosomes and TNF- ⁇ -only-treated exosomes.
  • FIG. 7 is a process of pre-treating TNF- ⁇ and interferon- ⁇ in the proliferation stage during the cell culture process in order to produce exosomes with enhanced physiological activity of an embodiment of the present invention, and the cells after washing the cells are SFM medium or EDM. It is a schematic diagram showing a process of recovering a culture medium containing exosomes secreted by culture in a medium.
  • Figure 8 shows that after pretreatment of TNF- ⁇ and interferon- ⁇ according to an embodiment of the present invention, exosomes produced in EDM medium significantly increase elastin synthesis in human fibroblasts compared to exosomes produced in SFM medium. Indicates that.
  • FBS Fetal Bovine Serum
  • penicillin-streptomycin purchased from ThermoFisher Scientific
  • MEM- ⁇ Minimum Essential Medium alpha; purchased from ThermoFisher Scientific
  • stem cells were cultured for 24 hours by treatment with TNF- ⁇ and IFN- ⁇ in the culture medium at a concentration of 20 ng/mL, respectively (Fig. 7 Refer to "1. Cell proliferation stage”). After incubation for 24 hours, both the stem cells treated with TNF- ⁇ and IFN- ⁇ and the stem cells without TNF- ⁇ and IFN- ⁇ were washed with phosphate-buffered saline ("2. Cells in FIG. 7"). Washing”), replaced with a serum-free medium or EDM medium, and cultured for 24 hours, and the supernatant (hereinafter, culture medium) was recovered (see "3.
  • EDM medium was obtained by collecting the permeate obtained after tangential flow filtration of human platelet lysates (hPL) to obtain a human platelet lysate from which extracellular vesicles and exosomes were removed, and the obtained platelet It can be prepared by adding the lysate to the basic medium.
  • hPL human platelet lysates
  • exosomes produced in a serum-free medium after TNF- ⁇ and interferon- ⁇ were pretreated, and in Example 6, TNF- ⁇ and interferon- ⁇ were pretreated and then EDM. It is described that the exosomes produced in the medium are superior to the exosomes produced in the SFM medium to increase the efficacy of elastin synthesis.
  • Example 2-1 Separation using ultra-fine filtration
  • Ultrafiltration was used to separate and concentrate exosomes from the culture medium recovered in Example 1.
  • a centrifugal filter purchased from Millipore
  • Centrifugal filters can be selected by various molecular weight cutoffs (MWCO). The exosomes were selectively separated and concentrated by the selected MWCO, and particles, proteins, lipids, nucleic acids, and low-molecular compounds smaller than MWCO were removed.
  • MWCO molecular weight cutoffs
  • a centrifugal filter of MWCO 30,000 Da (Dalton) was used. While the culture medium was concentrated to a volume of about 1/200 using an ultra-fine filtration method, substances smaller than MWCO were removed to separate exosomes.
  • a method for separating exosomes from animal-derived cell culture media including stem cells in addition to the above-described separation method, various methods known in the art may be used. For example, for the separation of exosomes, ultracentrifugation, density gradient centrifugation, tangential flow filtration (TFF), size exclusion chromatography, ion Ion exchange chromatography, immunoaffinity capture, microfluidics-based isolation, exosome precipitation, total exosome isolation kit, or polymer Known separation methods such as polymer based precipitation may be used. However, the method of separating exosomes is not limited to the methods as described above, and of course, various separation methods that are used in the art or may be used in the future can be adopted.
  • Example 2-2 Separation of exosomes using ultracentrifugation
  • exosomes were separated from the culture medium recovered in Example 1 using ultracentrifugation.
  • the recovered culture was sequentially centrifuged at 4°C to separate exosomes.
  • centrifugation was performed at 300 ⁇ g for 10 minutes, and then a supernatant was taken.
  • the supernatant was taken after centrifugation at 2,000 ⁇ g for 20 minutes.
  • the supernatant was taken after centrifugation at 16,500 ⁇ g for 10 minutes.
  • the finally obtained supernatant was centrifuged at 120,000 ⁇ g for 120 minutes, then the supernatant was removed and the pellet was taken, and the pellet was washed with phosphate-buffered saline, and again 120,000 ⁇ g. After removing the supernatant by centrifuging at for 120 minutes, the pellet was suspended in a phosphate buffer solution to separate exosomes.
  • Example 3-1 Characterization of exosomes isolated according to ultrafiltration and evaluation of productivity
  • Fig. 1 shows a graph of the NTA results of exosomes isolated according to Example 2-1.
  • pre-treatment exosomes obtained by using an ultrafiltration method (“TNF - ⁇ , IFN- ⁇ treated") is an untreated exosome obtained by culturing stem cells in a medium not containing TNF- ⁇ and interferon- ⁇ ("Untreated” in FIG. It was found that the particle size distribution was uniform compared to).
  • the present invention can economically and efficiently produce exosomes having a uniform particle size distribution in a high yield by performing a pretreatment process of culturing stem cells in a medium containing a combination of TNF- ⁇ and interferon- ⁇ .
  • Example 3-2 Characterization of exosomes isolated by ultracentrifugation and evaluation of productivity
  • the exosomes isolated according to Example 2-2 were measured for particle size and concentration by nanoparticle tracking analysis ( NTA; purchased from Malvern).
  • Fig. 3 shows a graph of the NTA results of exosomes isolated according to Example 2-2.
  • pretreatment exosomes obtained using ultracentrifugation (“TNF - ⁇ , IFN- ⁇ treated") is an untreated exosome obtained by culturing stem cells in a medium that does not contain TNF- ⁇ and interferon- ⁇ (“Untreated” in FIG. 3 ). It was found that the particle size distribution was uniform compared to).
  • the present invention can economically and efficiently produce exosomes having a uniform particle size distribution in a high yield by performing a pretreatment process of culturing stem cells in a medium containing a combination of TNF- ⁇ and interferon- ⁇ .
  • Example 4 Analysis of increase in productivity of exosomes by pretreatment of culturing stem cells in a medium containing a combination of TNF- ⁇ and interferon- ⁇
  • Untreated control group an experimental group in which exosomes were obtained according to Example 2-2 after culturing stem cells in a medium not containing TNF- ⁇ and interferon- ⁇ ;
  • Interferon- ⁇ alone treatment group (IFN- ⁇ treated): an experimental group in which exosomes were obtained according to Example 2-2 after culturing stem cells in a medium containing interferon- ⁇ ;
  • TNF- ⁇ alone treatment group (TNF- ⁇ treated): an experimental group in which exosomes were obtained according to Example 2-2 after culturing stem cells in a medium containing TNF- ⁇ ;
  • TNF- ⁇ and interferon- ⁇ pretreatment group (TNF- ⁇ , IFN- ⁇ treated): After culturing stem cells in a medium containing TNF- ⁇ and interferon- ⁇ , exosomes according to Example 2-2 The experimental group obtained.
  • CD63 is a representative positive marker of exosomes
  • the content of CD63 and the content of exosomes have linearity with each other, and an increase in CD63 content means a proportional increase in the content of exosomes.
  • human CD63 protein by concentration was prepared by serial dilution of human CD63 protein of known concentration, and human CD63 protein by concentration and exosome-human CD63 flow detection reagent (Exosome-Human CD63 Flow Detection) were prepared. Reagent) (InvitrogenTM) was mixed overnight and then reacted with PE mouse anti-Human CD63 (BD ProgenTM), and PE mean fluorescence intensity (mean) using flow cytometry. fluorescence intensity; MFI) was measured.
  • MFI fluorescence intensity
  • the exosome content (CD63 content) measured in the experimental group (4) pretreated with TNF- ⁇ and interferon- ⁇ of the present invention was the untreated control group of the experimental group (1), and the interferon- ⁇ alone treatment of the experimental group (2) It was confirmed that the content of exosomes measured in the group, and the TNF- ⁇ alone treatment group of the experimental group (3) was significantly higher (see FIG. 5). Accordingly, the present invention can dramatically increase the productivity of exosomes by performing a pretreatment process of culturing stem cells in a medium containing a combination of TNF- ⁇ and interferon- ⁇ .
  • Example 5 Evaluation of the efficacy of increasing elastin synthesis of pre-treated exosomes 1
  • control experimental group in which exosomes were not treated with human fibroblasts
  • Untreated exosomes (general exosomes) treatment group human fibroblasts in which the general exosomes of the experimental group (1) of Example 4 were treated at a concentration of 2.26 ⁇ 10 10 particles/mL (in FIG. 6) Marked "Untreated”);
  • IFN- ⁇ alone-treated exosomes treated group human fibroblasts in which the exosomes of the experimental group (2) of Example 4 were treated at a concentration of 2.26 ⁇ 10 10 particles/mL (“IFN- ⁇ Marked with ");
  • TNF- ⁇ alone-treated exosomes treated group the experimental group in which the exosomes of the experimental group (3) of Example 4 were treated at a concentration of 2.26 ⁇ 10 10 particles/mL on human fibroblasts (“TNF- ⁇ Marked with ");
  • TNF- ⁇ and IFN- ⁇ pre-treatment exosome treatment group TNF- ⁇ and IFN- ⁇ pre-treatment exosomes of experimental group (4) of Example 4 in human fibroblasts at a concentration of 2.26 ⁇ 10 10 particles/mL Treated experimental group (indicated as "TNF- ⁇ , IFN- ⁇ treated" in FIG. 6).
  • Human fibroblasts were suspended in HDF growth medium supplemented with 10% growth supplement and 1% penicillin-streptomycin (purchased from Cellbio, Seoul, Korea) and then 3.0 ⁇ 10 4 cells in a 48-well plate Inoculated at a density of / well, and incubated for 24 hours in a 37°C, 5% CO 2 incubator.
  • human fibroblasts were treated according to the conditions of the experimental groups (1) to (5), and human fibroblasts were cultured in an incubator at 37°C and 5% CO 2 for 72 hours. After 72 hours, the culture supernatant of human fibroblasts was collected, and the amount of elastin synthesis in the culture supernatant was measured using an Elastin ELISA kit (purchased from CUSABIO). The measured amount of elastin synthesis was normalized by dividing by the number of cells of the final human fibroblasts measured with an MTT assay kit (purchased from Sigma).
  • the present invention can dramatically increase the efficacy of increasing elastin synthesis of exosomes by performing a pretreatment process of culturing stem cells in a medium containing a combination of TNF- ⁇ and interferon- ⁇ .
  • the method for producing exosomes of the present invention not only can improve the productivity of exosomes isolated from cell culture fluid, but also is excellent in enhancing physiological activity such as increasing elastin synthesis of exosomes. Therefore, the method for producing exosomes of the present invention is suitable for the production of exosomes with enhanced physiological activity such as increased elastin synthesis, and the exosomes produced accordingly are effective ingredients of skin elasticity improvement, wrinkle improvement and/or anti-aging cosmetic composition. It can be used usefully.
  • SFM exosomes SFM medium
  • EDM exosomes EDM medium
  • control experimental group in which exosomes were not treated with human fibroblasts
  • SFM exosome treatment group an experimental group in which SFM exosomes were treated at a concentration of 1.09 ⁇ 10 11 particles/mL on human fibroblasts (indicated as “SFM” in FIG. 8);
  • EDM exosome treatment group an experimental group in which EDM exosomes were treated at a concentration of 1.09 ⁇ 10 11 particles/mL in human fibroblasts (indicated as “EDM” in FIG. 8).
  • Human fibroblasts were suspended in HDF growth medium supplemented with 10% growth supplement and 1% penicillin-streptomycin (purchased from Cellbio, Seoul, Korea) and then 3.0 ⁇ 10 4 cells in a 48-well plate Inoculated at a density of / well, and incubated for 24 hours in a 37°C, 5% CO 2 incubator.
  • human fibroblasts were treated according to the conditions of the experimental groups (1) to (3), and human fibroblasts were cultured in an incubator at 37° C. and 5% CO 2 for 72 hours. After 72 hours, the culture supernatant of human fibroblasts was collected, and the amount of elastin synthesis in the culture supernatant was measured using an Elastin ELISA kit (purchased from CUSABIO). The measured amount of elastin synthesis was normalized by dividing by the number of cells of the final human fibroblasts measured with an MTT assay kit (purchased from Sigma).
  • EDM exosomes produced using EDM medium in the process of culturing and recovering the culture medium for exosome production after pretreatment with TNF- ⁇ and interferon- ⁇ (IFN- ⁇ ) according to the present invention have increased efficacy of elastin synthesis. It can be seen that it is very good. Therefore, EDM exosomes are more effective in enhancing physiological activity related to increased elastin synthesis than SFM exosomes, for example, improving skin elasticity, wrinkles and/or anti-aging effects, and improving skin elasticity, wrinkles, and/or anti-aging effects. These more enriched exosomes can be economically and efficiently produced with high yield, and are therefore commercially and/or clinically useful.
  • the EDM exosomes with enhanced elastin synthesis increasing efficacy of the present invention can be usefully used as an active ingredient in a cosmetic composition for improving skin elasticity, wrinkles, and/or anti-aging.

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Abstract

본 발명은 동물 유래 세포를 TNF-α와 인터페론-γ를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 엑소좀의 생산방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 세포배양액으로부터 분리되는 엑소좀의 생산성을 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라 엑소좀의 엘라스틴 합성 증가와 같은 생리활성을 강화시킬 수 있는 우수한 효과를 나타낼 수 있다. 따라서, 본 발명의 엑소좀의 생산방법은 상업적 및/또는 임상적으로 유용한 생리활성이 강화된 엑소좀을 높은 수율로 경제적이면서 효율적으로 생산할 수 있고, 특히 종래의 방법과 비교하여 생리활성이 훨씬 우수한 엑소좀을 대량으로 생산할 수 있는 장점이 있다.

Description

새로운 엑소좀의 생산방법 및 이의 응용
본 발명은 엑소좀의 생산방법에 관한 것으로서, 엑소좀의 생산성을 향상시킬 수 있고/있거나 생리활성이 강화된 엑소좀의 생산방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 엑소좀의 생산성 향상 방법 및 생리활성 강화 방법, 그리고 이를 위한 배지에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 전술한 바와 같은 생산방법에 의해 수득된 생리활성이 강화된 엑소좀의 응용에 관한 것이다.
최근 세포 분비물(secretome)에 세포의 행동(behavior)을 조절하는 다양한 생체활성인자가 포함되어 있다는 연구가 보고되고 있으며, 특히 세포 분비물 내에는 세포 간 신호전달 기능을 갖는 엑소좀(exosome) 또는 세포외 소포체(extracellular vesicle)가 포함되어 있어 그 성분과 기능에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다.
세포는 세포외 환경에 다양한 막(membrane) 유형의 소포체를 방출하는데, 통상 이러한 방출 소포체들을 세포외 소포체(Extracellular vesicles, EVs)라고 부르고 있다. 세포외 소포체는 세포막 유래 소포체, 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 엑소좀 등으로 불려지기도 하며, 경우에 따라서는 엑소좀과는 구별되어 사용되기도 한다.
엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터 크기의 소포체로서 내부에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다. 엑소좀은 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어 있다. 증식하는 줄기세포 유래 엑소좀의 경우 세포의 이동, 증식 및 분화와 같은 세포 행동을 조절하고, 조직 재생과 관련된 줄기세포의 특성이 반영되어 있다(Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579).
즉, 세포의 아바타라고 불리는 엑소좀은 세포와 유사하게 성장인자와 같은 생체활성 인자들이 포함되어 있는데, 생체활성 인자들을 세포와 세포 간에 실어 나르는 전달체 역할, 즉, 세포와 세포 간의 교신 역할을 한다. 엑소좀은 줄기세포, 면역세포, 섬유아세포 및 암세포 등의 동물세포로부터 방출될 뿐만 아니라 식물, 세균(bacteria), 균류(fungi), 조류(algae) 등 다양한 생물의 세포로부터도 방출되는 것으로 알려져 있다.
이와 같은 엑소좀을 분리하는 종래 기술로는 초원심분리법(ultracentrifugation), 밀도구배원심법(density gradient centrifugation), 초미세여과법(ultrafiltration), 접선흐름여과법(Tangential Flow Filtration; TFF), 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 이온교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography), 면역친화성 분리법(immunoaffinity capture), 미세유체기술 분리법(microfluidics-based isolation), 침전법(exosome precipitation), 총엑소좀 추출 키트(total exosome isolation kit), 또는 폴리머 기반 침전법(polymer based precipitation) 등이 있다.
그러나, 전술한 바와 같이 다양한 엑소좀 분리방법이 제안되고 있음에도 불구하고 다른 기술분야와 마찬가지로 엑소좀의 생산과 관련한 기술분야에서도 끊임없는 개선이 이루어질 수 있는 것이다. 예를 들어, 세포배양액 당 엑소좀의 생산량을 향상시키고 엑소좀의 생리활성 인자들과 관련된 효능을 향상시킬 수 있는 새로운 엑소좀 생산기술의 제공이 필요하다.
한편, 상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 본 발명의 "선행 기술"로서 이용될 수 있다는 승인으로서 인용한 것은 아님을 이해하여야 한다.
본 발명의 목적은 엑소좀의 생산성을 향상시킬 수 있고/있거나 생리활성이 강화된 엑소좀의 생산방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 엑소좀의 생산성 향상 방법 및 생리활성 강화 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 엑소좀의 생산성 향상용 및/또는 생리활성 강화용 배지를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 바와 같은 생산방법에 의해 수득된 생리활성이 강화된 엑소좀의 다양한 응용을 제공하는데 있다.
그러나, 전술한 바와 같은 본 발명의 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명자들은 엑소좀의 생산성을 향상시킬 수 있고 효능이 강화된 엑소좀의 생산방법에 대해 예의 연구를 거듭하던 중, TNF-α와 인터페론-γ의 조합을 이용할 경우 단위 배양액(또는 단위 세포) 당 엑소좀의 생산량이 증대하고 생산된 엑소좀의 생리활성이 향상되는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 동물 유래 세포를 TNF-α와 인터페론-γ를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 엑소좀의 생산방법을 제공한다.
본 명세서에서 용어, "세포외 소포체(Extracellular vesicles, EVs)"는 통상 세포막 유래 소포체(membrane vesicles), 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 또는 이의 등가물을 포괄하는 의미로 사용된다. 분리 환경, 조건 및 방법 등에 따라 세포외 소포체는 엑소좀과 동일한 의미를 가질 수도 있고 엑소좀과 크기는 동일 내지는 유사하지만 엑소좀의 조성을 갖지 않는 나노베지클까지 포함하는 의미를 가질 수도 있다. 한편, 본 명세서에서 생산성과 관련하여 사용되는 엑소좀이라는 용어는 상기 세포외 소포체를 포괄하는 의미로 사용된다.
본 명세서에서 용어, "엑소좀(exosomes)"은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터(바람직하게는 대략 30~200 nm) 크기의 소포체를 의미한다(단, 분리 대상이 되는 세포 종류, 분리방법 및 측정방법에 따라 엑소좀의 입자 크기는 가변될 수 있음)(Vasiliy S. Chernyshev et al., "Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes", Anal Bioanal Chem, (2015) DOI 10.1007/s00216-015-8535-3). 엑소좀에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다.
한편, 본 명세서에서 사용된 "엑소좀"이란 용어는 동물 유래 세포에서 분비되어 세포외 공간으로 방출된 나노 크기의 베지클 구조를 갖고 있고 엑소좀과 유사한 조성을 갖는 베지클(예를 들어, 엑소좀-유사 베지클)을 모두 포함하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 엑소좀이 유래하는 동물 유래 세포의 종류는 제한되지 않으나, 본 발명을 한정하지 않는 하나의 예시로서, 줄기세포 또는 면역세포일 수 있다. 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC), 성체줄기세포, 배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포, 또는 유도만능 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포일 수 있다. 상기 면역세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell), 수지상 세포 또는 대식 세포일 수 있다.
본 발명을 한정하지 않는 예시로서, 상기 성체줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포, 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 및 다분화능 줄기세포로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 성체 줄기세포일 수 있다. 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막, 와튼젤리 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포일 수 있다. 바람직하게는 상기 성체줄기세포는 중간엽 줄기세포, 예를 들어 지방, 골수, 제대 또는 제대혈 유래 줄기세포일 수 있으며, 보다 바람직하게는 지방 유래 줄기세포일 수 있다. 상기 줄기세포 또는 상기 면역세포의 종류는 병원체에 의한 감염의 위험이 없고 면역 거부 반응을 일으키지 않는 것이라면 제한되지 않으나, 바람직하게는 인간 유래 줄기세포 또는 인간 유래 면역세포일 수 있다.
그러나 인체에 불리한 작용을 일으키지 않는 것이라면 당업계에서 사용되고 있거나 향후 사용될 수 있는 다양한 동물세포를 사용할 수 있음은 물론이다. 예를 들어, HEK 293 세포나 HEK 293T 세포의 사용도 가능하다. 따라서, 후술하는 실시예들에서 사용된 지방줄기세포는 본 발명에서 사용될 수 있는 동물세포의 일례로서 이해되어야 하며, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아님을 명백히 밝혀 둔다.
본 명세서에서 용어, "전처리"는 TNF-α와 인터페론-γ를 포함하는 배지에서 동물 유래 세포를 배양하는 것을 의미하고 "전처리 엑소좀"은 TNF-α와 인터페론-γ를 포함하는 배지에서 동물 유래 세포를 배양하여 얻은 엑소좀을 의미한다. "무처리"란 TNF-α와 인터페론-γ를 포함하지 않는 배지에서 동물 유래 세포를 배양하는 것을 의미하고, "무처리 엑소좀 또는 무처리 대조군"은 세포배양 단계 및 엑소좀 생산 단계 중 어떠한 단계에서도 TNF-α와 인터페론-γ이 처리되지 않고 수득된 엑소좀을 의미한다.
본 명세서에서 용어, "무혈청 배지" 또는 "SFM"이란 예를 들어 기본배지(Basal medium)에 FBS(Fetal Bovine Serum)와 같은 혈청이 첨가되지 않은 배양배지(선택적으로 항생제 및/또는 항진균제 포함)를 의미하고, "EDM"이란 기본배지에 혈소판 용해물, 바람직하게는 인간 혈소판 용해물, 더욱 바람직하게는 혈소판 용해물(platelet lysate) 유래 엑소좀 및 세포외 소포체를 제거한 인간 혈소판 용해물이 첨가된 배양배지(선택적으로 항생제 및/또는 항진균제 포함)를 의미한다. 본 발명을 한정하지 않는 예시로서, 기본배지는 α-MEM, DMEM, DMEM F12, 199 배지, RPMI-1640, L-15, Hum F-10, Hum F-12, DM-160, DM-170 등일 수 있다.
본 발명은 동물 유래 세포를 TNF-α와 인터페론-γ를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 엑소좀의 생산성 향상 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 일 구체예의 엑소좀의 생산성 향상 방법은, (a) 동물 유래 세포를 TNF-α와 인터페론-γ를 포함하는 배지에서 배양하는 단계와, (b) 상기 동물 유래 세포를 세척하는 단계와, (c) 상기 세척된 동물 유래 세포를 무혈청 배지에서 배양하고 배양액을 수집하는 단계와, (d) 상기 수집된 배양액에서 엑소좀을 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀의 생산성 향상 방법에 있어서, 상기 (c) 단계의 무혈청 배지에는 혈소판 용해물(platelet lysate)이 첨가될 수 있다. 상기 혈소판 용해물은 바람직하게는 인간 혈소판 용해물일 수 있고, 더욱 바람직하게는 혈소판 용해물(platelet lysate) 유래 엑소좀 및 세포외 소포체를 제거한 인간 혈소판 용해물일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀의 생산성 향상 방법에 있어서, 상기 TNF-α와 인터페론-γ는 각각 배지 내에 약 1 ng/mL 내지 100 ng/mL의 농도, 바람직하게는 약 10 ng/mL 내지 30 ng/mL의 농도로 포함될 수 있고, 예를 들어 약 20 ng/mL의 농도로 포함될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀의 생산성 향상 방법에 있어서, 상기 배양은 약 12시간 내지 48시간 동안 수행될 수 있고, 예를 들어 24시간 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀의 생산성 향상 방법에 있어서, 상기 생산성은 상기 배양액 mL 당 엑소좀 입자수(또는 단위 세포 당 엑소좀 입자수)로 정의될 수 있다.
본 발명은 동물 유래 세포를 TNF-α와 인터페론-γ를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 엑소좀의 생리활성 강화 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 일 구체예의 엑소좀의 생리활성 강화 방법은, (a) 동물 유래 세포를 TNF-α와 인터페론-γ를 포함하는 배지에서 배양하는 단계와, (b) 상기 동물 유래 세포를 세척하는 단계와, (c) 상기 세척된 동물 유래 세포를 무혈청 배지에서 배양하고 배양액을 수집하는 단계와, (d) 상기 수집된 배양액에서 엑소좀을 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀의 생리활성 강화 방법에 있어서, 상기 (c) 단계의 무혈청 배지에는 혈소판 용해물이 첨가될 수 있다. 상기 혈소판 용해물은 바람직하게는 인간 혈소판 용해물일 수 있고, 더욱 바람직하게는 혈소판 용해물(platelet lysate) 유래 엑소좀 및 세포외 소포체를 제거한 인간 혈소판 용해물일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀의 생리활성 강화 방법에 있어서, 상기 TNF-α와 인터페론-γ는 각각 배지 내에 약 1 ng/mL 내지 100 ng/mL의 농도, 바람직하게는 약 10 ng/mL 내지 30 ng/mL의 농도로 포함될 수 있고, 예를 들어 약 20 ng/mL의 농도로 포함될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀의 생리활성 강화 방법에 있어서, 상기 배양은 약 12시간 내지 48시간 동안 수행될 수 있고, 예를 들어 24시간 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀의 생리활성 강화 방법에 있어서, 상기 생리활성 강화는 엘라스틴 합성 증가일 수 있고, 예를 들어 피부탄력개선 강화 또는 주름개선 강화 중 적어도 하나일 수 있다.
본 발명은 TNF-α와 인터페론-γ를 포함하는, 동물세포 유래의 엑소좀의 생산성 향상용 배지 또는 생리활성 강화용 배지를 제공한다.
본 발명의 일 구체예의 동물세포 유래의 엑소좀의 생산성 향상용 배지 또는 생리활성 강화용 배지에 있어서, 상기 TNF-α와 인터페론-γ는 각각 배지 내에 약 1 ng/mL 내지 100 ng/mL의 농도, 바람직하게는 약 10 ng/mL 내지 30 ng/mL의 농도로 포함될 수 있고, 예를 들어 약 20 ng/mL의 농도로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 동물 유래 세포를 TNF-α와 인터페론-γ를 포함하는 배지에서 배양하여 수득된 엘라스틴 합성 증가 효능이 강화된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 예를 들어 피부탄력개선 또는 주름개선용 조성물일 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 일 구체예의 조성물은, (a) 동물 유래 세포를 TNF-α와 인터페론-γ를 포함하는 배지에서 배양하는 단계와, (b) 상기 동물 유래 세포를 세척하는 단계와, (c) 상기 세척된 동물 유래 세포를 무혈청 배지에서 배양하고 배양액을 수집하는 단계와, (d) 상기 수집된 배양액에서 엑소좀을 분리하는 단계를 수행하여 수득될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 조성물에 있어서, 상기 (c) 단계의 무혈청 배지에는 혈소판 용해물이 첨가될 수 있다. 상기 혈소판 용해물은 바람직하게는 인간 혈소판 용해물일 수 있고, 더욱 바람직하게는 혈소판 용해물(platelet lysate) 유래 엑소좀 및 세포외 소포체를 제거한 인간 혈소판 용해물일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 조성물에 있어서, 상기 TNF-α와 인터페론-γ는 각각 배지 내에 약 1 ng/mL 내지 100 ng/mL의 농도, 바람직하게는 약 10 ng/mL 내지 30 ng/mL의 농도로 포함될 수 있고, 예를 들어 약 20 ng/mL의 농도로 포함될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 조성물에 있어서, 상기 배양은 약 12시간 내지 48시간 동안 수행될 수 있고, 예를 들어 24시간 동안 수행될 수 있다.
본 발명을 한정하지 않는 예시로서, 본 발명의 일 구체예의 엑소좀의 생산방법에 따라 수득된 엑소좀을 포함하는 조성물은 의약 외품, 화장료 조성물 또는 피부외용제로 제조될 수 있다. 상기 의약외품 또는 상기 피부외용제는 액제, 연고제, 크림제, 스프레이제, 패취제, 겔제, 또는 에어로졸제일 수 있다. 또한, 상기 화장료 조성물은, 예를 들어, 로션이나 크림일 수 있다.
한편, 본 발명의 일 구체예의 조성물이 의약 외품, 피부외용제 및/또는 화장료 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 효과를 손상하지 않는 범위내에서 통상 의약 외품, 피부외용제 및/또는 화장료 조성물에 이용되는 성분, 예를 들면 보습제, 산화방지제, 유성성분, 자외선 흡수제, 유화제, 계면활성제, 증점제, 알콜류, 분말성분, 색재, 수성성분, 물, 각종 피부영양제 등을 필요에 따라 적절히 배합할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구체예의 의약외품, 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 생리활성이 강화된 엑소좀 이외에, 그 작용(예를 들어, 예를 들어, 피부탄력개선 및/또는 주름개선 등)을 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용된 피부탄력개선제, 주름방지제 및/또는 보습제를 함께 혼합하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 생리활성이 강화된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물은 하이드로겔, 히알루론산, 히알루론산 염(예를 들어 히알루론산 나트륨 등), 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종에 담지되거나 혼합될 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 의약외품, 피부외용제 및/또는 화장료 조성물에서, 상기 하이드로겔의 종류는 제한되지 않으나, 바람직하게는 겔화 고분자를 다가 알코올에 분산시켜 얻은 하이드로겔일 수 있다. 상기 겔화 고분자는 플루로닉, 정제한천, 아가로오스, 젤란검, 알긴산, 카라기난, 카시아검, 잔탄검, 갈락토만난, 글루코만난, 펙틴, 셀룰로오스, 구아검 및 로커스트빈검으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있고, 상기 다가 알코올은 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 이소부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 소르비톨, 자일리톨 및 글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 의약외품, 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 예를 들면, 패취, 마스크팩, 마스크시트, 크림, 토닉, 연고, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 로션, 젤, 오일, 팩, 스프레이, 에어졸, 미스트, 파운데이션, 파우더, 기름 종이 등의 다양한 형태에 적용할 수 있다. 예를 들어, 상기 의약외품, 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 패취, 마스크팩 또는 마스크시트의 적어도 일면(一面)에 도포되거나 침적될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물은 피부탄력개선 및/또는 주름개선 등의 목적으로 사용될 수 있으며, 화장품 제형은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어 패취, 마스크팩, 마스크시트, 유연화장수, 영양화장수, 수렴화장수, 영양크림, 마사지크림, 아이크림, 클렌징크림, 에센스, 아이에센스, 클렌징로션, 클렌징폼, 클렌징워터, 선스크린, 립스틱, 비누, 샴푸, 계면활성제-함유 클렌징, 입욕제, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 바디세정제, 염모제, 헤어토닉 등으로 제형화할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예의 의약외품, 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 의약외품, 피부외용제 및/또는 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 그리고 담체를 포함할 수 있다. 또한, 의약외품, 피부외용제 및/또는 화장료 조성물에 대한 각각의 제형에 있어서, 다른 성분들은 의약외품, 피부외용제 및/또는 화장료 조성물의 종류 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.
본 발명에 따르면, 세포배양액으로부터 분리되는 엑소좀의 생산성을 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라 엑소좀의 엘라스틴 합성 증가와 같은 생리활성을 강화시킬 수 있는 우수한 효과를 나타낼 수 있다. 따라서, 본 발명의 엑소좀의 생산방법은 상업적 및/또는 임상적으로 유용한 생리활성이 강화된 엑소좀을 높은 수율로 경제적이면서 효율적으로 생산할 수 있고, 특히 종래의 방법과 비교하여 생리활성이 훨씬 우수한 엑소좀을 대량으로 생산할 수 있는 장점이 있다.
한편, 전술한 바와 같은 효과들에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
도 1은 TNF-α와 인터페론-γ를 포함하지 않는 배지에서 줄기세포를 배양한 후 초미세여과법(ultrafiltration)을 이용하여 수득된 무처리 엑소좀과, TNF-α와 인터페론-γ를 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양한 후 초미세여과법을 이용하여 수득된 전처리 엑소좀 각각에 대해 NTA(nanoparticle tracking analysis)를 수행하여 얻은 입자 크기 분포와 입자수를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 구체예에 따라 TNF-α와 인터페론-γ가 전처리된 경우 엑소좀의 생산성이 TNF-α와 인터페론-γ 무처리 대조군의 생산성에 비해 현저하게 증가한 것을 나타내는 비교 그래프이다. 도 2A는 배양액(CM)에 대해 초미세여과를 수행하기 전에 배양액(CM) 내의 엑소좀 입자수를 측정하여 비교한 그래프이고, 도 2B는 배양액(CM)에 대해 초미세여과를 수행한 후에 얻은 용액 내의 엑소좀 입자수를 측정하여 비교한 그래프이며, 도 2C는 도 2A 및 도 2B의 비교 결과를 함께 나타내는 그래프이다.
도 3은 TNF-α와 인터페론-γ를 포함하지 않는 배지에서 줄기세포를 배양한 후 초원심분리법을 이용하여 수득된 무처리 엑소좀과, TNF-α와 인터페론-γ를 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양한 후 초원심분리법을 이용하여 수득된 전처리 엑소좀 각각에 대해 NTA(nanoparticle tracking analysis)를 수행하여 얻은 입자 크기 분포와 입자수를 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 구체예에 따라 TNF-α와 인터페론-γ가 전처리된 경우 엑소좀의 생산성이 TNF-α와 인터페론-γ 무처리 대조군의 생산성에 비해 현저하게 증가한 것을 나타내는 비교 그래프이다. 도 4A는 배양액(CM)에 대해 초원심분리를 수행하기 전에 배양액(CM) 내의 엑소좀 입자수를 측정하여 비교한 그래프이고, 도 4B는 배양액(CM)에 대해 초원심분리를 수행한 후에 얻은 용액(EXO) 내의 엑소좀 입자수를 측정하여 비교한 그래프이며, 도 4C는 도 4A 및 도 4B의 비교 결과를 함께 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 구체예에 따라 TNF-α와 인터페론-γ가 전처리된 실험군에서의 CD63 마커(엑소좀 고유 마커)의 함량(엑소좀의 함량 및 생산성 반영함)이 무처리 대조군, 인터페론-γ 단독 처리군 및 TNF-α 단독 처리군에서의 CD63 마커의 함량에 비해 현저하게 증가한 것을 나타내는 비교 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 구체예에 따른 전처리 엑소좀을 인간 섬유아세포에 처리한 경우, 엑소좀을 처리하지 않은 경우(control)에 비해 엘라스틴 합성을 현저히 증가시킬 뿐만 아니라 무처리 엑소좀(일반 엑소좀), 인터페론-γ 단독 처리 엑소좀 및 TNF-α 단독 처리 엑소좀 보다 엘라스틴 합성 증가 효과가 현저한 것을 나타내는 비교 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 구체예의 생리활성이 강화된 엑소좀을 생산하기 위해, 세포배양과정 중 증식단계에서 TNF-α 및 인터페론-γ를 전처리하는 과정과, 세포 세척 후 세포를 SFM 배지 또는 EDM 배지에서 배양하여 분비된 엑소좀을 함유하는 배양액을 회수하는 과정을 나타내는 모식도이다.
도 8은 본 발명의 일 구체예에 따라 TNF-α 및 인터페론-γ가 전처리된 후 EDM 배지에서 생산된 엑소좀이 SFM 배지에서 생산된 엑소좀에 비해 인간 섬유아세포에서 엘라스틴 합성을 현저하게 증가시키는 것을 나타낸다.
이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌들은 본 발명에 참고로서 통합된다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
실시예
실시예 1: 세포의 배양
당해 발명이 속하는 기술분야에 알려진 세포배양 방법에 따라 5% CO2, 37℃ 조건에서 10% FBS(Fetal Bovine Serum; ThermoFisher Scientific에서 구입) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(ThermoFisher Scientific에서 구입)이 첨가된 MEM-α (Minimum Essential Medium alpha; ThermoFisher Scientific에서 구입) 배지로 지방 유래 줄기세포를 배양하였다. TNF-α 및 인터페론-γ(IFN-γ)를 처리하지 않는 경우, 줄기세포는 24시간 배양을 유지하였다. TNF-α 및 인터페론-γ(IFN-γ)를 처리하는 경우, 상기 배양 배지에 TNF-α 및 IFN-γ를 각각 20 ng/mL 농도로 처리하여 줄기세포를 24시간 동안 배양하였다(도 7의 "1.세포증식단계" 참조). 24시간 배양 후, TNF-α 및 IFN-γ를 처리한 줄기세포와 TNF-α 및 IFN-γ 무처리 줄기세포 모두 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline)으로 세척 후(도 7의 "2.세포세척" 참조), 무혈청 배지 또는 EDM 배지로 교체하여 24시간 배양하고 그 상층액(이하, 배양액)을 회수하였다(도 7의 "3.엑소좀 생산을 위한 배양 및 배양액 회수" 참조). 한편, EDM 배지는 인간 혈소판 용해물(human platelet lysates; hPL)을 접선흐름여과 후 얻은 투과액(permeate)을 수거하여 세포외 소포체 및 엑소좀이 제거된 인간 혈소판 용해물을 수득하고, 수득된 혈소판 용해물을 기본배지에 첨가하여 준비할 수 있다.
후술하는 실시예 2 내지 실시예 5에서는 TNF-α 및 인터페론-γ가 전처리된 후 무혈청 배지에서 생산된 엑소좀에 대해 설명하고, 실시예 6에서는 TNF-α 및 인터페론-γ가 전처리된 후 EDM 배지에서 생산된 엑소좀이 SFM 배지에서 생산된 엑소좀 보다 엘라스틴 합성 증가 효능이 우수한 것을 설명한다.
실시예 2: 엑소좀의 분리 및 정제
실시예 2-1: 초미세여과법을 이용한 분리
실시예 1에서 회수한 배양액으로부터 엑소좀의 분리, 농축을 위해 초미세여과법(ultrafiltration)을 사용하였다. 초미세여과법을 위한 필터로는 원심분리 필터(centrifugal filter; Millipore에서 구입)를 사용하였다. 원심분리 필터는 다양한 분자량 차단(molecular weight cutoff; MWCO)에 의해 선택될 수 있다. 선택된 MWCO에 의해 선별적으로 엑소좀을 분리, 농축하였고, MWCO 보다 작은 입자나 단백질, 지질, 핵산, 저분자 화합물 등은 제거하였다.
엑소좀을 분리, 농축하기 위하여 MWCO 30,000 Da(Dalton)의 원심분리 필터를 사용하였다. 배양액을 초미세여과법을 이용하여 1/200 정도의 부피가 될 때까지 농축하면서, MWCO 보다 작은 물질들은 제거하여 엑소좀을 분리하였다.
한편, 줄기세포를 포함한 동물 유래 세포 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 방법으로는 전술한 바와 같은 분리방법 외에도 당업계에 알려진 다양한 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 엑소좀의 분리를 위해, 초원심분리법(ultracentrifugation), 밀도구배원심법(density gradient centrifugation), 접선흐름여과법(Tangential Flow Filtration; TFF), 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 이온교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography), 면역친화성 분리법(immunoaffinity capture), 미세유체기술 분리법(microfluidics-based isolation), 침전법(exosome precipitation), 총엑소좀 추출 키트(total exosome isolation kit), 또는 폴리머 기반 침전법(polymer based precipitation) 등 공지의 분리방법을 사용할 수 있다. 그러나 엑소좀의 분리방법은 전술한 바와 같은 방법들에 제한되는 것이 아니며, 당업계에서 사용되고 있거나 향후 사용될 수 있는 다양한 분리 방법이 채택가능한 것임은 물론이다.
실시예 2-2: 초원심분리법을 이용한 엑소좀의 분리
또한, 초원심분리법(ultracentrifugation)을 사용하여 실시예 1에서 회수한 배양액으로부터 엑소좀을 분리하였다. 회수한 배양액은 4℃에서 순차적으로 원심분리하여 엑소좀을 분리하였다. 우선, 회수한 배양액으로부터 세포를 제거하기 위하여 300×g에서 10분 동안 원심분리를 한 후 상층액을 취하였다. 그리고, 상기 상층액으로부터 세포 잔해물(debris)을 제거하기 위해 2,000×g에서 20분 동안 원심분리를 후 상층액을 취하였다. 또한, 상기 상층액으로부터 마이크로베지클(Microvesicles)을 제거하기 위해 16,500×g에서 10분 동안 원심분리를 한 후 상층액을 취하였다. 최종적으로 수득한 상층액에 대해 120,000×g에서 120분 동안 원심분리를 수행한 후 상층액을 제거하고 펠렛을 취한 다음, 펠렛을 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline)으로 세척하였고, 다시 120,000×g에서 120분 동안 원심분리를 하여 상층액을 제거한 후 펠렛을 인산염 완충용액에 부유시켜 엑소좀을 분리하였다.
실시예 3: 분리된 엑소좀의 특성 분석 및 생산성 평가
실시예 3-1: 초미세여과법에 따라 분리된 엑소좀의 특성 분석 및 생산성 평가
실시예 2-1에 따라 분리된 엑소좀은 나노입자 트랙킹 분석(nanoparticle tracking analysis:　NTA; Malvern에서 구입)에 의해 입자의 크기와 농도를 측정하였다. 실시예 2-1에 따라 분리된 엑소좀의 NTA 결과 그래프를 도 1에 도시하였다. 도 1에 도시된 바와 같이 본 발명의 일 구체예에 따라 TNF-α와 인터페론-γ를 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양한 후 초미세여과법을 이용하여 수득된 전처리 엑소좀(도 1에서 "TNF-α, IFN-γ treated"로 표시됨)은 TNF-α와 인터페론-γ를 포함하지 않는 배지에서 줄기세포를 배양한 후 초미세여과법을 이용하여 수득된 무처리 엑소좀(도 1에서 "Untreated"로 표시됨)에 비해 입자 크기 분포가 균일한 것을 알 수 있었다.
또한, 도 2A, 도 2B 및 도 2C에 도시된 바와 같은 NTA 비교 분석 결과, TNF-α와 인터페론-γ로 전처리한 경우(도 2A, 도 2B 및 도 2C에서 "TNF-α, IFN-γ treated"로 표시됨) 엑소좀 생산성은 TNF-α와 인터페론-γ 무처리 대조군(도 2A, 도 2B 및 도 2C에서 "Untreated"로 표시됨)의 엑소좀 생산성 보다 대략 2~3배 이상 증가하였다.
즉, 배양액(CM)에 대해 초미세여과를 수행하기 전에 배양액(CM) 내의 엑소좀 입자수를 측정하여 비교하면, TNF-α와 인터페론-γ가 전처리된 경우 엑소좀의 생산성이 TNF-α와 인터페론-γ 무처리 대조군의 생산성에 비해 현저하게 증가하였다(도 2A 및 도 2C). 또한, 배양액(CM)에 대해 초미세여과를 수행한 후에 얻은 용액 내의 엑소좀 입자수를 측정하여 비교하면, TNF-α와 인터페론-γ가 전처리된 경우 엑소좀의 생산성이 TNF-α와 인터페론-γ 무처리 대조군의 생산성에 비해 현저하게 증가하였다(도 2B 및 도 2C).
따라서, 본 발명은 TNF-α와 인터페론-γ의 조합을 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 전처리 과정을 수행함으로써 입자크기 분포가 균일한 엑소좀을 높은 수율로 경제적이면서 효율적으로 생산할 수 있다.
실시예 3-2: 초원심분리법에 따라 분리된 엑소좀의 특성 분석 및 생산성 평가
실시예 2-2에 따라 분리된 엑소좀은 나노입자 트랙킹 분석(nanoparticle tracking analysis:　NTA; Malvern에서 구입)에 의해 입자의 크기와 농도를 측정하였다. 실시예 2-2에 따라 분리된 엑소좀의 NTA 결과 그래프를 도 3에 도시하였다. 도 3에 도시된 바와 같이 본 발명의 일 구체예에 따라 TNF-α와 인터페론-γ를 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양한 후 초원심분리법을 이용하여 수득된 전처리 엑소좀(도 3에서 "TNF-α, IFN-γ treated"로 표시됨)은 TNF-α와 인터페론-γ를 포함하지 않는 배지에서 줄기세포를 배양한 후 초원심분리법을 이용하여 수득된 무처리 엑소좀(도 3에서 "Untreated"로 표시됨)에 비해 입자 크기 분포가 균일한 것을 알 수 있었다.
또한, 도 4A, 도 4B 및 도 4C에 도시된 바와 같은 NTA 비교 분석 결과, TNF-α와 인터페론-γ로 전처리한 경우(도 4A, 도 4B 및 도 4C에서 "TNF-α, IFN-γ treated"로 표시됨) 엑소좀 생산성은 TNF-α와 인터페론-γ 무처리 대조군(도 4A, 도 4B 및 도 4C에서 "Untreated"로 표시됨)의 엑소좀 생산성 보다 대략 2~3배 이상 증가하였다.
즉, 배양액(CM)에 대해 초원심분리를 수행하기 전에 배양액(CM) 내의 엑소좀 입자수를 측정하여 비교하면, TNF-α와 인터페론-γ가 전처리된 경우 엑소좀의 생산성이 TNF-α와 인터페론-γ 무처리 대조군의 생산성에 비해 현저하게 증가하였다(도 4A 및 도 4C). 또한, 배양액(CM)에 대해 초원심분리를 수행한 후에 얻은 용액(EXO) 내의 엑소좀 입자수를 측정하여 비교하면, TNF-α와 인터페론-γ가 전처리된 경우 엑소좀의 생산성이 TNF-α와 인터페론-γ 무처리 대조군의 생산성에 비해 현저하게 증가하였다(도 4B 및 도 4C).
따라서, 본 발명은 TNF-α와 인터페론-γ의 조합을 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 전처리 과정을 수행함으로써 입자크기 분포가 균일한 엑소좀을 높은 수율로 경제적이면서 효율적으로 생산할 수 있다.
실시예 4: TNF-α와 인터페론-γ의 조합을 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 전처리 과정에 의한 엑소좀의 생산성 증가 분석
추가로, 정확한 엑소좀의 생산성 비교 분석을 위해, 엑소좀 생산을 위한 줄기세포 배양에서 TNF-α 및/또는 인터페론-γ가 포함되는지 여부에 따라 실험군을 다음과 같이 분류하였다:
(1) 무처리 대조군(Untreated): TNF-α와 인터페론-γ를 포함하지 않는 배지에서 줄기세포를 배양한 후 실시예 2-2에 따라 엑소좀을 수득한 실험군;
(2) 인터페론-γ 단독 처리군(IFN-γ treated): 인터페론-γ를 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양한 후 실시예 2-2에 따라 엑소좀을 수득한 실험군;
(3) TNF-α 단독 처리군(TNF-α treated): TNF-α를 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양한 후 실시예 2-2에 따라 엑소좀을 수득한 실험군;
(4) TNF-α와 인터페론-γ 전처리군 (TNF-α, IFN-γ treated): TNF-α와 인터페론-γ를 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양한 후 실시예 2-2에 따라 엑소좀을 수득한 실험군.
상기 실험군 (1)~(4) 각각의 엑소좀과 엑소좀-휴먼 CD63 플로우 검출 시약(Exosome-Human CD63 Flow Detection Reagent)(Invitrogen™)을 하룻밤 동안(overnight) 혼합 후 PE 마우스 항-인간 CD63(Mouse anti-Human CD63)(BD Parmigen™)과 반응시키고 유세포분석(flow cytometry)을 이용하여 PE 평균 형광 강도(mean fluorescence intensity; MFI)를 측정하였다.
한편, CD63은 엑소좀의 대표적인 포지티브 마커이므로 CD63의 함량과 엑소좀의 함량은 서로 선형성을 갖고 CD63 함량의 증가는 엑소좀 함량의 비례적인 증가를 의미한다. 이러한 원리에 따라, 농도를 알고 있는 인간 CD63 단백질을 연속 희석(serial dilution)하여 농도별 인간 CD63 단백질을 준비하고, 농도별 인간 CD63 단백질과 엑소좀-휴먼 CD63 플로우 검출 시약(Exosome-Human CD63 Flow Detection Reagent)(Invitrogen™)을 하룻밤 동안(overnight) 혼합 후 PE 마우스 항-인간 CD63(Mouse anti-Human CD63)(BD Parmigen™)과 반응시키고 유세포분석(flow cytometry)을 이용하여 PE 평균 형광 강도(mean fluorescence intensity; MFI)를 측정하였다. 그리고 인간 CD63 단백질 농도값 및 이에 대응하는 MFI 측정값에 대해 선형 회귀 분석을 하여 선형성 0.99 이상을 만족하는 표준 정량분석 그래프를 생성한 후, 생성된 표준 정량분석 그래프를 이용하여 상기 실험군 (1)~(4) 각각의 CD63 함량을 결정하였다.
그 결과, 본 발명의 TNF-α와 인터페론-γ로 전처리한 실험군 (4)에서 측정된 엑소좀 함량(CD63 함량)이 실험군 (1)의 무처리 대조군, 실험군 (2)의 인터페론-γ 단독 처리군, 및 실험군 (3)의 TNF-α 단독 처리군에서 측정된 엑소좀 함량 보다 현저하게 높은 것을 확인할 수 있었다(도 5 참조). 따라서, 본 발명은 TNF-α와 인터페론-γ의 조합을 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 전처리 과정을 수행함으로써 엑소좀의 생산성을 획기적으로 높일 수 있다.
실시예 5: 전처리 엑소좀의 엘라스틴 합성 증가 효능 평가 1
인간 섬유아세포(Human dermal fibroblast; HDF)에서, TNF-α 및/또는 인터페론-γ(IFN-γ)로 전처리한 줄기세포 유래 엑소좀의 엘라스틴 합성 증가 효능을 다음과 같이 확인하였다. 이를 위해 실험군을 다음과 같이 분류하였다:
(1) 음성 대조군(control): 인간 섬유아세포에 엑소좀이 처리되지 않은 실험군;
(2) 무처리 엑소좀(일반 엑소좀) 처리군: 인간 섬유아세포에 실시예 4의 실험군 (1)의 일반 엑소좀이 2.26×1010 입자/mL의 농도로 처리된 실험군(도 6에서 "Untreated"로 표시);
(3) IFN-γ 단독 처리 엑소좀 처리군: 인간 섬유아세포에 실시예 4의 실험군 (2)의 엑소좀이 2.26×1010 입자/mL의 농도로 처리된 실험군(도 6에서 "IFN-γ"로 표시);
(4) TNF-α 단독 처리 엑소좀 처리군: 인간 섬유아세포에 실시예 4의 실험군 (3)의 엑소좀이 2.26×1010 입자/mL의 농도로 처리된 실험군(도 6에서 "TNF-α"로 표시);
(5) TNF-α와 IFN-γ 전처리 엑소좀 처리군: 인간 섬유아세포에 실시예 4의 실험군 (4)의 TNF-α와 IFN-γ 전처리 엑소좀이 2.26×1010 입자/mL의 농도로 처리된 실험군(도 6에서 "TNF-α, IFN-γ treated"로 표시).
인간 섬유아세포를 10% 성장 보충 물질(growth supplement) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 HDF 성장배지 (대한민국 서울시 소재의 주식회사 세포바이오에서 구입)에 현탁시킨 후 48웰 플레이트에 3.0×104 세포/웰의 밀도로 접종하고, 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다.
그 후, 상기 실험군 (1)~(5)의 조건에 따라 인간 섬유아세포를 처리하고, 인간 섬유아세포를 37℃, 5% CO2 배양기에서 72시간 동안 배양하였다. 72시간 후 인간 섬유아세포의 배양 상등액(culture supernatant)을 수거하여, 배양 상등액 내의 엘라스틴 합성량을 엘라스틴 ELISA 키트(Elastin ELISA kit)(CUSABIO에서 구입)를 이용하여 측정하였다. 측정된 엘라스틴 합성량은 MTT 어세이 키트(Sigma에서 구입)로 측정된 최종 인간 섬유아세포의 세포수로 나누어 정규화하였다.
도 6에 도시된 바와 같이, 본 발명의 TNF-α와 IFN-γ 전처리 엑소좀을 인간 섬유아세포에 처리한 실험군 (5)의 경우, 일반 엑소좀을 인간 섬유아세포에 처리한 실험군 (2), IFN-γ 단독 처리 엑소좀을 인간 섬유아세포에 처리한 실험군 (3), 그리고 TNF-α 단독 처리 엑소좀을 인간 섬유아세포에 처리한 실험군 (4)에 비해 엘라스틴 합성을 현저히 증가시켰다.
따라서, 본 발명은 TNF-α와 인터페론-γ의 조합을 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 전처리 과정을 수행함으로써 엑소좀의 엘라스틴 합성 증가 효능을 획기적으로 높일 수 있다.
이러한 결과는 본 발명의 엑소좀 생산방법이 세포배양액으로부터 분리되는 엑소좀의 생산성을 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라 엑소좀의 엘라스틴 합성 증가라는 생리활성 강화 측면에서 우수하다는 것을 보여주고 있다. 따라서, 본 발명의 엑소좀의 생산방법은 엘라스틴 합성 증가라는 생리활성이 강화된 엑소좀의 생산에 적합하고 이에 따라 생산된 엑소좀은 피부탄력개선, 주름개선 및/또는 항노화 화장료 조성물의 유효성분으로 유용하게 활용될 수 있다.
실시예 6: 전처리 엑소좀의 엘라스틴 합성 증가 효능 평가 2
TNF-α 및 인터페론-γ(IFN-γ)로 전처리된 후 엑소좀 생산을 위한 배양 및 배양액 회수 과정(도 7 참조)에서 SFM 배지를 사용하여 생산된 엑소좀(이하, "SFM 엑소좀"이라 함)과 EDM 배지를 사용하여 생산된 엑소좀(이하, "EDM 엑소좀"이라 함)의 엘라스틴 합성 증가 효능을 다음과 같이 확인하였다. 단, SFM 엑소좀 및 EDM 엑소좀 모두 실시예 2-2에 따라 분리하였다. 이를 위해 실험군을 다음과 같이 분류하였다:
(1) 음성 대조군(control): 인간 섬유아세포에 엑소좀이 처리되지 않은 실험군;
(2) SFM 엑소좀 처리군: 인간 섬유아세포에 SFM 엑소좀이 1.09×1011 입자/mL의 농도로 처리된 실험군(도 8에서 "SFM"으로 표시);
(3) EDM 엑소좀 처리군: 인간 섬유아세포에 EDM 엑소좀이 1.09×1011 입자/mL의 농도로 처리된 실험군(도 8에서 "EDM"으로 표시).
인간 섬유아세포를 10% 성장 보충 물질(growth supplement) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 HDF 성장배지 (대한민국 서울시 소재의 주식회사 세포바이오에서 구입)에 현탁시킨 후 48웰 플레이트에 3.0×104 세포/웰의 밀도로 접종하고, 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다.
그 후, 상기 실험군 (1)~(3)의 조건에 따라 인간 섬유아세포를 처리하고, 인간 섬유아세포를 37℃, 5% CO2 배양기에서 72시간 동안 배양하였다. 72시간 후 인간 섬유아세포의 배양 상등액(culture supernatant)을 수거하여, 배양 상등액 내의 엘라스틴 합성량을 엘라스틴 ELISA 키트(Elastin ELISA kit)(CUSABIO에서 구입)를 이용하여 측정하였다. 측정된 엘라스틴 합성량은 MTT 어세이 키트(Sigma에서 구입)로 측정된 최종 인간 섬유아세포의 세포수로 나누어 정규화하였다.
도 8에 도시된 바와 같이, EDM 엑소좀을 인간 섬유아세포에 처리한 실험군 (3)의 경우, SFM 엑소좀을 인간 섬유아세포에 처리한 실험군 (2)에 비해 엘라스틴 합성을 현저히 증가시켰다.
이러한 결과로부터 본 발명에 따라 TNF-α 및 인터페론-γ(IFN-γ)로 전처리된 후 엑소좀 생산을 위한 배양 및 배양액 회수 과정에서 EDM 배지를 사용하여 생산된 EDM 엑소좀은 엘라스틴 합성 증가 효능 측면에서 매우 우수하다는 것을 알 수 있다. 따라서, EDM 엑소좀은 SFM 엑소좀 보다도 엘라스틴 합성 증가와 관련된 생리활성 강화, 예를 들어 피부탄력개선, 주름개선 및/또는 항노화 효능이 우수하고, 피부탄력개선, 주름개선 및/또는 항노화 효능이 더욱 강화된 엑소좀을 높은 수율로 경제적이면서 효율적으로 생산할 수 있어 상업적 및/또는 임상적으로 유용하다.
따라서, 본 발명의 엘라스틴 합성 증가 효능이 더욱 강화된 EDM 엑소좀은 피부탄력개선, 주름개선 및/또는 항노화용 화장료 조성물의 유효성분으로 유용하게 활용될 수 있다.
이상, 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.

Claims (23)

  1. 동물 유래 세포를 TNF-α와 인터페론-γ를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 엑소좀의 생산성 향상 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 TNF-α와 인터페론-γ는 각각 배지 내에 1 ng/mL 내지 100 ng/mL의 농도로 포함되는, 엑소좀의 생산성 향상 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 배양은 12시간 내지 48시간 동안 수행되는, 엑소좀의 생산성 향상 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배양 후 상기 동물 유래 세포를 세척하고, 상기 세척된 동물 유래 세포를 무혈청 배지에서 배양하고 배양액을 수집하며, 상기 수집된 배양액에서 엑소좀을 분리하는 단계를 더 포함하는, 엑소좀의 생산성 향상 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 무혈청 배지에는 혈소판 용해물이 첨가되는 것을 특징으로 하는, 엑소좀의 생산성 향상 방법.
  6. 동물 유래 세포를 TNF-α와 인터페론-γ를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 엑소좀의 생리활성 강화 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 TNF-α와 인터페론-γ는 각각 배지 내에 1 ng/mL 내지 100 ng/mL의 농도로 포함되는, 엑소좀의 생리활성 강화 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 배양은 12시간 내지 48시간 동안 수행되는, 엑소좀의 생리활성 강화 방법.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생리활성 강화는 엘라스틴 합성 증가인, 엑소좀의 생리활성 강화 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 생리활성 강화는 피부탄력개선 강화 또는 주름개선 강화 중 적어도 하나인, 엑소좀의 생리활성 강화 방법.
  11. TNF-α와 인터페론-γ를 포함하는, 동물세포 유래의 엑소좀의 생산성 향상용 배지.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 TNF-α와 인터페론-γ는 각각 배지 내에 1 ng/mL 내지 100 ng/mL의 농도로 포함되는, 동물세포 유래의 엑소좀의 생산성 향상용 배지.
  13. TNF-α와 인터페론-γ를 포함하는, 동물세포 유래의 엑소좀의 생리활성 강화용 배지.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 TNF-α와 인터페론-γ는 각각 배지 내에 1 ng/mL 내지 100 ng/mL의 농도로 포함되는, 동물세포 유래의 엑소좀의 생리활성 강화용 배지.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서,
    상기 생리활성 강화는 엘라스틴 합성 증가인, 동물세포 유래의 엑소좀의 생리활성 강화용 배지.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 생리활성 강화는 피부탄력개선 강화 또는 주름개선 강화 중 적어도 하나인, 동물세포 유래의 엑소좀의 생리활성 강화용 배지.
  17. 동물 유래 세포를 TNF-α와 인터페론-γ를 포함하는 배지에서 배양하여 수득된 엘라스틴 합성 증가 효능이 강화된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 엘라스틴 합성 증가용 조성물.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 TNF-α와 인터페론-γ는 각각 배지 내에 1 ng/mL 내지 100 ng/mL의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는, 엘라스틴 합성 증가용 조성물.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 배양은 12시간 내지 48시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 엘라스틴 합성 증가용 조성물.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배양 후 상기 동물 유래 세포를 세척하고, 상기 세척된 동물 유래 세포를 무혈청 배지에서 배양하고 배양액을 수집하며, 상기 수집된 배양액에서 엑소좀을 분리하는 단계를 더 포함하여 수득된, 엘라스틴 합성 증가용 조성물.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 무혈청 배지에는 혈소판 용해물이 첨가되는 것을 특징으로 하는, 엘라스틴 합성 증가용 조성물.
  22. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    피부탄력개선 효능 또는 주름개선 효능 중 적어도 하나를 강화하는, 엘라스틴 합성 증가용 조성물.
  23. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    의약외품, 피부 외용제 또는 화장료 조성물인, 엘라스틴 합성 증가용 조성물.
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