KR20180131158A

KR20180131158A - 줄기세포로부터 엑소좀 분비를 촉진시키는 방법 및 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 기능성 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20180131158A
Application number: KR1020170067805A
Authority: KR
Inventors: 김윤배; 최은경; 서다움
Original assignee: 충북대학교 산학협력단; 주식회사 디자인셀
Priority date: 2017-05-31
Filing date: 2017-05-31
Publication date: 2018-12-10
Also published as: KR101985941B1

Abstract

본 발명은 줄기세포로부터 엑소좀 분비를 촉진시키는 방법 및 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 기능성 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 줄기세포 배양액에 TNF-α를 처리하고 1~8%의 산소농도 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포로부터 엑소좀을 대량 생산하는 방법, 줄기세포로부터 엑소좀의 분비를 증가시키는 방법 및 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

줄기세포로부터 엑소좀 분비를 촉진시키는 방법 및 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 기능성 화장료 조성물{Method for stimulating the secretion of exosome by stem cell and cosmetic composition comprising thereof}

본 발명은 줄기세포로부터 엑소좀 분비를 촉진시키는 방법 및 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 개선, 주름개선 및 미백활성을 갖는 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다.

최근 도시인들의 생활환경이 변화함에 따라 집안의 카펫에 서식하는 진드기, 습도 저하로 인한 먼지, 주변국의 사막화 및 공업화에 의해 날아오는 황사, 미세먼지, 애완동물의 털, 꽃가루, 새로운 과일 및 음식, 식품첨가물 등 면역 과민반응을 유발하는 다양한 알러젠에 노출되는 기회가 점차 커지고 있다. 이중 아토피 피부염(atopic dermatitis)은 영유아에서 10-20%, 성인에서 1-3%의 비율로 발병하고 있으며 최근 유병율이 꾸준히 증가하는 추세이다. 웰빙을 추구하는 현대인들에 있어서 피부주름 개선, 보습, 미백 등은 피부미용적인 측면에서 자외선을 차단하고 노화를 방지해 줄 수 있는 다양한 기능성 화장품류의 사용으로 상당한 효과를 얻을 수 있지만, 아토피 피부염은 지속적인 항원의 작용으로 인해 심각한 피부염과 가려움증은 물론 그로 인한 심리적 스트레스가 유발되는 중증 질환으로 치료가 매우 어렵고 치료 및 개선을 위해서는 장기간의 시간이 필요하다.

또한, 알러지 반응은 우리 몸의 과도한 면역반응으로, 기전적으로 4가지 유형 중 하나이다. 제1형 과민반응으로 알려진 아토피는 면역글로불린 E (immunoglobulin E, IgE)에 의해 비만세포(mast cells) 등이 과도하게 활성화되는 것이 특징인데, 면역글로불린 E에 의해 매개되는 담마진이나 혈관부종과는 다르게 병리현상 발현에 있어서 세포매개와 면역글로불린 E 매개기전 모두가 관여한다.

초기단계에서 아토피 과민반응을 유발하는 알러젠은 interleukin-4 (IL-4)와 같은 사이토카인(cytokines)을 분비하는 2형 helper T 세포(Th2 cells)을 유도한다. 이어 면역글로불린 E를 포함하는 항체를 생산하는 B-세포와 반응한다. 알러젠이 비만세포 표면의 Fcε receptor I (FcεRI)에 교차연결되어 있는 면역글로불린 E와 반응하면 비만세포로부터 히스타민(histamine)이 유리되어 즉각적인 과민반응, 즉 아나필락시스 쇼크반응(anaphylaxis)이 유발된다. 아토피 피부염에서 Th2 세포가 IL-4를 다량으로 생산하고, 이는 형질세포(plasma cells)로 하여금 면역글로불린 E 생산을 촉진시킨다. 그러므로 가장 효과적인 항알러지 및 항아토피 후보물질로는 비만세포로부터의 히스타민 유리를 억제함은 물론, 초기 Th2 세포와 후기 Th1 세포를 포함한 Th 세포의 활성화를 차단하는 물질이 될 수 있다.

한편, 최근에는 줄기세포(stem cells)가 세포대체, 뇌보호 및 면역조절 기전을 통해 비가역적 뇌손상을 개선시켜 주는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 신경줄기세포(neural stem cells, NSC)를 혈관 내로 주사했을 때 말초 면역계를 조절함으로써 자가면역질환인 다발성 경화증 모델동물의 임상증상을 완화시키는 것으로 보고되었고, 또한 뇌실 내로 주사한 신경줄기세포는 뇌세포를 보호하고 손상된 세포를 대체함으로써 중주이상을 개선시켜 주는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 줄기세포가 면역조절 기능을 통해 자가면역질환 및 과민반응을 개선해 줄 수 있다는 것을 시사한다. 따라서 줄기세포는 제1형 과민반응이며 Th1과 Th2 세포가 관여하는 피부과민반응인 아토피 피부염을 예방하고 치료해 줄 수 있을 것으로 기대된다.

나아가 줄기세포 또는 줄기세포의 배양액은 항산화 및 창상치유 효능을 가지고 있는 것으로 알려져 있고, 특히 지방줄기세포는 콜라겐 생성을 촉진시키고 분해를 억제하여 피부주름을 개선해 줌은 물론, 최근에는 피부미백 효능이 알려져 피부미용을 위한 새로운 소재로 관심을 모으고 있다.

하지만 줄기세포의 주름개선 및 미백효능은 줄기세포 자체를 피하에 주사하여 얻어진 결과이며, 줄기세포 배양액(conditioned medium, CM)을 피부에 도포하여 효능을 확인한 연구결과는 아직 없다. 이는 줄기세포 배양액 내 유효성분이 주로 단백질로 구성되어 있어 피부를 잘 침투하지 못하기 때문이다. 따라서 피부 침투율의 개선을 위해 유효 단백질을 리포좀(liposomes)으로 싸주도록 하여 피부침투율을 향상시키고자 하는 연구가 진행되고 있다. 하지만 배양액 내에 낮은 농도로 녹아 있는 유효 단백질을 리포좀 지질층으로 포집하는 기술은 아직 개발이 미비하며 포집율이 저조하여 실용성이 낮은 것이 현재의 실정이다.

이에 본 발명자들은 줄기세포로부터 피부 개선, 주름 개선, 미백활성 및 아토피 피부염의 기능을 갖는 유효성분을 다량 확보하고 피부 침투율을 향상시킬 수 있는 방법으로서, 줄기세포로부터 유효성분이 분비될 때에 피부 침투효과가 우수한 엑소좀 형태로의 분비를 촉진시키는 방법을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.

대한민국 특허출원 제10-2016-0061004호

본 발명에서는 줄기세포로부터 엑소좀의 분비를 향상시킬 수 있는 최적의 조건을 확립하였고, 본 발명에서 수득한 다량의 엑소좀 형태의 유효성분이 비만세포 및 아토피 피부염 모델동물에서 히스타민 분비와 피부염증을 효과적으로 완화시킬 수 있으며, 콜라겐 분해효소인 MMP-1 (matrix metalloproteinase-1)과 티로시나제(tyrosinase)를 억제함으로써 피부 주름개선 및 미백 효능이 우수함을 확인하였다.

따라서 본 발명의 목적은 줄기세포로부터 엑소좀을 대량 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 줄기세포로부터 엑소좀의 분비를 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명의 방법으로 수득한 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 기능성 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 본 발명의 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 줄기세포 배양액에 tumor-necrosis factor-α (TNF-α)를 5~500 ng/mL의 농도로 처리하고 1~8%의 산소농도 조건 하에서 12~72시간 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포로부터 엑소좀을 대량 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 줄기세포는 신경줄기세포, 희소돌기교전구세포, 지방줄기세포, 양막줄기세포, 양수줄기세포, 태반줄기세포 및 제대혈 줄기세포로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 줄기세포 배양액은 DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 배지일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 줄기세포는 1x10⁴~1x10⁶세포수일 수 있다.

또한, 본 발명은 신경줄기세포, 희소돌기교전구세포, 지방줄기세포, 양막줄기세포, 양수줄기세포, 태반줄기세포 또는 제대혈 줄기세포 배양액에 TNF-α를 5~500 ng/mL의 농도로 처리하고 1~8%의 산소농도 조건 하에서 12~72시간 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포로부터 엑소좀의 분비를 증가시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명의 방법으로 수득한 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 줄기세포 유래 엑소좀은 아토피 피부염 개선효과, 피부주름 개선효과 또는 피부미백 효과를 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화장료는 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 세안제, 트리트먼트, 미용액, 미용팩, 연고제, 겔제, 리니멘트제, 액제, 패치 및 분무제로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형일 수 있다.

또한, 본 발명은 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 줄기세포 배양액에 TNF-α를 5~500 ng/mL의 농도로 처리하고 1~8%의 산소농도 조건 하에서 12~72시간 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포로부터 엑소좀을 대량 생산하는 방법, 줄기세포로부터 엑소좀의 분비를 증가시키는 방법 및 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 기능성 화장료 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 방법은 피부개선, 피부미백 및 아토피 피부염 개선 효과를 갖는 줄기세포 유래 유효성분들이 효과적으로 피부에 침투될 수 있고 그 기능을 온전히 발휘할 수 있도록 줄기세포로부터 엑소좀의 분비를 최대화 할 수 있는 최적 조건을 확립하였고, 줄기세포 유래 엑소좀 함유 조성물이 우수한 피부개선, 피부미백 및 아토피 피부염 개선 효과가 있어 기능성 화장품의 제조에 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 히스타민(His)으로 유도된 가려움증에 대한 줄기세포 배양액의 개선 정도를 분석한 결과를 나타낸 것으로, 빗금 그래프는 대조군 줄기세포 배양액을 나타낸 것이고, 회색의 그래프는 본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액을 나타낸 것이며, AFSC는 양수줄기세포를, AMSC는 양막줄기세포를, PSC는 태반줄기세포를, UCBSC는 제대혈 줄기세포를, NSC는 신경줄기세포를, OPC는 희소돌기교전구세포를, ASC는 지방줄기세포를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액과 대조군 줄기세포 배양액에 대한 히스타민으로 유도된 피부 출혈반응(Evan’s blue 누출)의 개선 정도를 분석한 결과이다.
도 3은 본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액과 대조군 줄기세포 배양액에 대한 난백알부민으로 유발된 만성 아토피 피부염 모델에서의 피부염 완화정도를 분석한 결과이다.
도 4는 본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액과 대조군 줄기세포 배양액에 대한 난백알부민으로 유발된 만성 아토피 피부염 모델에서 혈청 IgE의 억제 효과를 분석한 결과이다.
도 5는 본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액과 대조군 줄기세포 배양액에 대한 난백알부민으로 유발된 만성 아토피 피부염 모델에서 히스타민 억제 효과를 분석한 결과이다.
도 6은 본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액과 대조군 줄기세포 배양액에 대한 난백알부민으로 유발된 만성 아토피 피부염 모델에서 혈청 내 인터루킨-4 (IL-4) 억제 효과를 분석한 결과이다.
도 7은 MMP-1 (matrix metalloproteinase-1) 활성도에 대한 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액과 대조군 줄기세포 배양액의 억제 효과를 분석한 결과이다.
도 8은 티로시나제 활성도에 대한 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액과 대조군 줄기세포 배양액의 억제 효과를 분석한 결과이다.
도 9는 멜라노사이트에서 멜라닌 생산에 대한 본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액과 대조군 줄기세포 배양액의 억제 효과를 분석한 결과이다.
참고로 본 발명의 도면에서 빗금 그래프는 대조군 줄기세포 배양액 처리군을 나타낸 것이고, 회색의 그래프는 본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액 처리군을 나타낸 것이다.

본 발명은 줄기세포를 기능성 화장품의 원료로 사용함에 있어서, 피부 침투율의 향상과 줄기세포 또는 줄기세포 유래 유효성분의 효능 증진을 위한 방법으로써, 줄기세포로부터 엑소좀의 분비를 증가시키는 최적의 조건을 확립한 점에 특징이 있다.

본 발명에 따른 줄기세포로부터 엑소좀의 분비를 증가시킬 수 있는 조건은, 줄기세포 배양액에 TNF-α를 처리하고 저산소 농도 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하며, 바람직하게는 TNF-α를 5~500 ng/mL의 농도로 처리하고 1~8%의 산소농도 조건 하에서 12~72시간 배양하는 단계를 포함한다. 더욱 바람직하게는 줄기세포 배양액에 TNF-α를 50 ng/mL의 농도로 처리하고 5%의 산소농도 조건 하에서 24시간 배양하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 ‘줄기세포’는 특정 세포로 분화가 진행되지 않은 세포로서 필요한 경우, 신경, 혈액, 연골 등 신체를 구성하는 모든 종류의 세포로 분화할 능력을 가진 세포를 말한다.

본 발명에서 엑소좀이 분비될 수 있는 줄기세포의 종류로는 이에 제한되지는 않으나, 신경줄기세포, 희소돌기교전구세포, 지방줄기세포, 양막줄기세포, 양수줄기세포, 태반줄기세포 또는 제대혈 줄기세포일 수 있다.

한편, ‘엑소좀(exosome)’은 정교한 RNA 및 단백질 운반물질이 들어있는 작은크기(30~150 nm)의 소포로서, 여러 종류의 세포들로부터 분비되는 막 구조의 소낭체이다. 엑소좀의 분비, 흡수, 조성에 대한 정확한 분자기전과 기능은 아직까지 연구가 미비한 실정이며 다만, 다른 세포 및 조직에 결합하는 막 구성요소, 단백질 및 RNA를 전달하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

이에 본 발명자들은 줄기세포 또는 줄기세포 배양액의 유효성분에 대한 피부 흡수율을 높이기 위해 지질로 구성된 리포좀을 유효성분과 접목시키는 종래 기술에 비해 더욱 효과적인 방법으로서 줄기세포로부터 엑소좀이 다량 분비될 수 있는 조건을 규명하였고, 이러한 조건을 적용할 경우, 리포좀 접목 방법에 따른 별도의 처리과정, 외부 물질의 오염 및 리포좀 포접 시 배양액 성분의 변질과 같은 문제점을 해결할 수 있음을 알 수 있었다.

따라서 본 발명에서 규명한 줄기세포 배양액에 TNF-α를 5~500 ng/mL의 농도로 처리하고 1~8%의 산소농도 조건 하에서 12~72시간 배양할 경우, 줄기세포로부터 엑소좀의 분비를 증가시킬 수 있어 줄기세포로부터 엑소좀이 풍부하게 함유된 배양액을 생산할 수 있고, 동시에 줄기세포로부터 엑소좀을 대량생산할 수 있다.

특히 본 발명자들은 줄기세포로부터 엑소좀의 분비를 촉진할 수 있는 촉진제를 연구하던 중, 많은 물질들 중에서 TNF-α가 효과적으로 엑소좀 분비를 촉진하는 것을 알 수 있었고, 최대 엑소좀 분비를 위한 TNF-α의 적정 처리량은 5~500 ng/mL의 농도로 처리하는 것이 바람직하다는 것을 알 수 있었다.

상기 범위를 초과하여 처리할 경우, 줄기세포에 손상을 주어 세포가 정상적인 기능을 발휘하지 못하는 문제점이 생길 수 있고, 반면 상기 범위에 미치지 못하는 양으로 처리할 경우 엑소좀의 분비량이 충분치 못하는 문제점이 생긴다.

줄기세포는 대식세포(macrophages)와 마찬가지로 TNF-α에 의해 이동하고 활성화된다. 활성화된 대식세포는 활성산소 라디칼(active oxygen radicals)을 분비하여 체내에 유입된 미생물과 종양을 공격하는 데 비해, 활성화된 줄기세포는 성장인자(growth factors, GF)와 신경성장인자(neurotrophic factors, NF)를 분비하여 조직을 보호하고 재생한다. 이러한 GF/NF 단백질은 엑소좀에 싸여 분비되는 것으로 밝혀졌다. 따라서 본 발명에서는 줄기세포 배양과정에서 TNF-α를 처리할 경우, 다량의 GF/NF 함유 엑소좀의 분비를 촉진시킬 수 있음을 규명하였고, 또한 다량의 GF/NF 함유 엑소좀을 수득할 수 있음을 규명하였다.

또한, 줄기세포로부터 다량의 엑소좀 분비를 유도할 수 있는 요건으로 정상농도(약 20%)보다 현저히 낮은 산소농도 하에서의 배양이 필요함을 확인하였는데, TNF-α 처리 후 1~8%의 저산소 조건 하에서 12~72시간 배양하는 것이 바람직함을 알 수 있었다. 산소농도 조건이 1% 미만일 경우 세포의 정상적인 증식 및 성장에 문제를 발생시킬 수 있으며, 8%를 초과할 경우 엑소좀 분비가 충분하지 않을 수 있다. 따라서 1~8%의 저산소 조건 하에서 수행하는 것이 바람직하고 더욱 바람직하게는 5%의 산소 농도로 배양하는 것이 좋다.

또한, 본 발명에 따른 방법에서 상기 줄기세포 배양액은 줄기세포를 배양하는 배지라면 모두 사용가능하며, 본 발명의 일실시예에서는 DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 배지를 사용하였다.

상기 TNF-α를 5~500 ng/mL의 농도로 처리되어지는 줄기세포는 바람직하게 1x10⁴~1x10⁶세포수의 줄기세포일 수 있다.

이와 같이 본 발명의 조건으로 줄기세포를 배양할 경우, 줄기세포가 증식하는 과정에서 분비되는 줄기세포의 세포증식, 분화, 재생관련 유전자, 단백질, 성장인자 등 생리활성 물질들을 함유하고 있는 엑소좀의 분비를 촉진 및 증진시킬 수 있으며, 일반 줄기세포 배양액 수득 방법(즉 TNF-α 및 저산소 조건 하에서의 배양을 수행하지 않은 방법)에 비해 엑소좀의 분비 및 생산량을 월등히 증가시킬 수 있음을 알 수 있었다.

나아가 본 발명은 상기 본 발명의 방법으로 수득한 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 화장료 조성물을 제공함에 특징이 있다.

본 발명의 일실시예에 의하면, 본 발명의 방법으로 수득한 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액과 대조군 줄기세포 배양액에 대해 피부염 아토피 개선효과를 분석한 결과, 일반 줄기세포 배양으로 수득한 배양액에 비해 엑소좀이 풍부한 본 발명의 줄기세포 배양액이 월등히 우수한 아토피 개선 효과가 있는 것을 알 수 있었다.

뿐만 아니라, 본 발명의 다른 일실시에에 의하면, 본 발명의 방법으로 수득한 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액과 대조군 줄기세포 배양액에 대해 피부 주름 개선과 피부 미백 효과를 분석한 결과, 피부 주름의 원인이 되는 MMP-1의 억제를 본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액이 대조군 배양액에 비해 월등히 우수한 억제 효과를 보임을 알 수 있었고, 티로시나제 및 멜라닌 생성 억제 효과도 매우 우수한 것을 알 수 있었다.

따라서 본 발명에 따른 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물은 피부 주름 개선, 피부 미백 활성 또는 아토피 피부염 개선을 위한 화장료 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 상기 화장료는 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 세안제, 트리트먼트, 미용액, 미용팩, 연고제, 겔제, 리니멘트제, 액제, 패치 및 분무제로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형인 것이나, 특정 제형에 한정되는 것은 아니고 통상적인 화장료 조성물의 제형을 가질 수 있다.

상기 각각의 제형에 첨가물 역시 한정되지 않으며 화장료 분야의 일반적인 첨가물이 첨가될 수 있다. 상기 화장료 분야의 일반적인 첨가물의 예로는 항생제, 결합제, 붕해제, 희석제, 활택제, 안정제, 보존료, 향료, 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소 및 방부제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 들 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물은 아토피 피부염 치료 및 예방을 위한 약학적 조성물로도 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 약학 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 본 발명의 약학 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose), 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다. 본 발명에서 사용된 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 사용된 특정 유효성분의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50 mg/kg 또는 0.001 내지 50 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

재료 및 실험방법

(1) 줄기세포

본 발명의 실시예에서 사용한 줄기세포는 다음과 같다. 양수줄기세포(AFSC), 신경줄기세포(NSC) 및 희소돌기교전구세포(OPC)는 충북대학교(CBNU)에서 기존에 확립한 줄기세포주로서 각각 CBNU-AFSC, CBNU-NSC 및 CBNU-NSC.olig2 세포주를 사용하였고, 양막줄기세포(AMSC), 태반줄기세포(PSC) 및 제대혈줄기세포(UCBSC)는 정상적인 출산 후 기관윤리위원회의(Institutional Review Board, IRB) 심의를 거쳐 본인의 동의서를 받아 채취한 것을 사용하였고, 지방줄기세포(ASC)는 53세의 정상인 여성으로부터 복부 지방흡입술을 통해 기관윤리위원회 심의를 거쳐 본인의 동의서를 받아 채취한 것을 사용하였다.

(2) 줄기세포 배양 및 엑소좀 풍부 배양액의 채취

줄기세포(1 x 10⁶ 세포/mL)를 DMEM 배지를 이용하여 5% 이산화탄소(CO₂) 공급 배양기에서 37℃의 온도로 24시간 동안 배양하였다. 이후 줄기세포로부터 엑소좀이 풍부하게 함유된 배양액(ERCM)을 수득하기 위해, 상기 배양 배지에 TNF-α를 50 ng/mL의 농도로 첨가하고 산소 농도를 5%로 낮춘 후, 24시간 동안 배양한 다음, 배양액을 채취하여 필터로 거른 후 저온에서 10배 농축하여 본 발명에 따른 엑소좀 풍부 배양액을 수득하였다. 이때 대조군인 일반 배양액(CM) 수득을 위해 상기 실험에 사용한 동일 줄기세포를 대상으로 세포 배양을 37℃의 온도에서 산소(O₂) 농도를 21%가 유지된 상태로 24시간 배양 후 배양액을 채취하여 필터로 거른 후 저온에서 10배 농축하였다.

(3) β- Hexosaminidase 분비 억제효능 분석

비만세포 과립 분비를 과립의 지표인 β-hexosaminidase를 분석하여 측정하였다. 이를 위해, 비만세포주인 RBL-2H3 세포를 48-웰 플레이트에 2.5×10⁵cells/well수로 분주하고, 12시간 동안 1 μg/mL의 IgE를 처리한 후 HEPES 버퍼로 4회 세척하였다. 이후 배양세포에 시험물질인 상기(2)의 방법으로 수득한 대조군 줄기세포 배양액(CM) 및 본 발명에 따른 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액(ERCM)의 10배 농축액을 각각 1%가 되도록 첨가하고, 이어 0.1% BSA 함유 extracellular buffer에 희석한 DNP-BSA (400 ng/mL)를 처리하고 37^oC에서 1시간 동안 배양하였다. 이후 상층액을 수득하고 50 μL의 상층액에 200 μL의 1 mM p-nitrophenyl N-acetyl-beta-D-glucosamine를 첨가하여 37^oC에서 3시간 반응시켰고, 500 μL의 0.05 M sodium carbonate buffer를 첨가하여 효소반응을 정지시킨 후, 405 nm에서 흡광도로 β-hexosaminidase의 분비량을 측정하였다.

(4) 아토피 피부염 개선효능 평가

a) 실험동물 준비

암컷 ICR 마우스(6주령, 25-30 g)를 코아텍(경기도 평택)으로부터 공급받아 약 1주간 실험실 순화과정을 거친 후 사용하였다. 동물을 마우스용 케이지에 5마리씩 수용하고, 동물실험실의 환경을 온도 23±2℃, 상대습도 55±10%, 환기횟수 12 회/시간, 조명주기 12시간(07:00-19:00), 조도 150-300 lux로 조절하였다. 실험동물용 펠렛형 고형사료인 Purina Rat Chow^®를 바이오피아(경기도 군포)로부터 공급받아 급여하였으며, 음수는 멸균정제수를 자유롭게 섭취하도록 하였다. 본 실험은 충북대학교 실험동물연구지원센터의 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 승인 하에 동 기관의 표준작업지침서(Standard Operation Procedures, SOP)에 따라 수행되었다.

b) Compound 48/80 유도 전신성 아나필락시스 쇼크 억제효능 분석

마우스에 시험물질인 상기(2)의 방법으로 수득한 대조군 줄기세포 배양액(CM) 및 본 발명에 따른 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액(ERCM)의 10배 농축액(0.1 mL/mouse)을 각각 복강 내로 주사하고, 30분 후 비만세포 탈과립인자(mast cell degranulator)인 Compound 48/80 (8 mg/kg)를 복강 내로 주사하였다. 1시간 동안 전신적인 아나필락시스 쇼크 반응에 따른 동물의 사망률을 기록하였다.

c) 히스타민 유도 가려움증 및 피부출혈 억제효능 분석

마우스의 등 부위를 제모하고, 상기(2)의 방법으로 수득한 대조군 줄기세포 배양액(CM) 및 본 발명에 따른 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액(ERCM)의 10배 농축액(50 μL)과 동량(50 μL)의 histamine dihydrochloride (0.5 μg/site) 혼합액을 피하로 각각 주사하고, 이어 0.25 mL의 Evan’s blue 용액(0.5%)을 혈관 내로 주사하였다. 30분 동안 가려움증으로 인해 뒷발로 긁는 횟수(scratching behavior)를 측정하였다. 가려움증 측정 후 피부를 절제하여 Evan’s blue를 formamide로 추출하여 혈관 누출량을 측정하였다.

d) 만성 아토피 유발 및 시험물질 투여

마우스에 10 μg ovalbumin/4 mg aluminum hydroxide (OVA/alum in 200 μL saline)를 1주일 간격으로 총 3회(0, 7 및 14일) 복강 내로 투여함으로써 감작을 유도하였다. 마지막 감작 7일 후(21일) 대조군 줄기세포 배양액 및 본 발명의 엑소좀 풍부 배양액(ERCM)의 10배 농축액(100 μL)과 동량(100 μL)의 OVA (100 μg)를 sterile gauze patch (1.5 x 1.5 cm)에 점적하여 제모한 마우스의 등에 각각 적용하고 transparent dressing을 이용하여 고정하였다. Patch는 2일에 한 번씩 교체하였으며 총 14일(21~35일) 동안 유지하였다.

e) 피부병변의 평가

피부병변은 patch를 제거하고 24시간 후 다음의 지표에 따라 점수화하였다. 증상(symptoms): 0, 무증상(no sign); 1, 발적 및 출혈(erythema & hemorrhage); 2, 부종(edema); 3, 찰과장 및 미란(excoriation & erosion); 4, 건조(dryness). 정도(score): 0, 무증상(no sign); 1, 미약(mild); 2, 중등도(moderate); 3, 심함(severe). 각각의 증상에 대한 score의 합을 개체별 dermatitis score로 하였다.

f) 조직병리학적 평가

부검 시 피부 병변부위의 일부를 채취하여 Bouin's solution에 고정한 후 paraffin 절편을 만들어 hematoxylin & eosin (H&E)으로 염색하였다. 광학현미경을 이용하여 염증세포의 침윤정도를 평가하였다. Epidermal hyperplasia를 평가하기 위해 epidermal thickness를 Image analysis software program (ImagePartner, Seoul, Korea)을 이용하여 측정하였다. 또 비만세포의 침윤정도를 평가하기 위해 조직절편을 acidic toluidine blue (pH 4.0)로 염색하고, 1,000 배율 하에서 20개 시야의 비만세포를 계수하였다.

g) 혈청 total IgE , IL4 및 히스타민 농도 측정

부검 시 복대정맥으로부터 채혈한 혈액을 3,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 혈청을 얻었다. 혈청 내 total IgE는 mouse IgE ELISA kit (Immunology Consultant Laboratory, Inc., Newberg, USA)로, interleukin-4 (IL4)는 mouse IL4 ELISA kit (Koma Biotechnology, Inc., Seoul, Korea)로, 그리고 히스타민 농도를 histamine ELISA kit (Labor Diagnostika Nord GmbH & Co. KG, Eichenhain, Germany)을 이용하여 분석하였다.

(5) 피부주름 개선효능 평가

피부 주름 개선효능은 콜라겐을 분해하여 소멸시키는 콜라게나제(collagenase) 효소 중의 하나인 MMP-1(matrix metalloproteinase-1)에 대한 억제효능으로 평가하였다. Bovine tendon collagen (25 mg)을 0.05 M tris(hydroxymethyl)-methyl-2-aminoethane sulfonate (TES) 버퍼에 녹인 후 37℃에서 15분간 정치시켰다. 이어 콜라게나제 타입-1과 시험물질인 대조군 줄기세포 배양액(CM) 및 본 발명의 엑소좀 풍부 배양액(ERCM) 10배 농축액의 1%를 첨가한 뒤 5시간 동안 추가 반응시켰다. 반응액 0.2 mL를 취하여 1 mL의 A buffer [4% ninhydrin in Methyl Cellosolve^® (2-methoxyethanol) + 0.2 M sodium citrate with 0.71 mM stannous chloride, pH 0.5]에 첨가하였다. 20분간 끓인 뒤 n-propanol을 첨가하고, 15분간 정치한 후 600 nm에서 흡광도로 효소의 활성도를 측정하였다.

(6) 피부 미백효능 평가

a) 티로시나제 억제효능

티로신(tyrosine)으로부터 멜라닌(melanin)의 생산에 관여하는 효소인 티로시나제에 대한 줄기세포 배양액의 억제효능을 평가하였다. 시험관에 0.1 M phosphate-buffered saline (PBS), 시험물질인 줄기세포 CM 및 ERCM 10배 농축액의 1% 및 mushroom tyrosinase (1,500~2,000 U/mL)를 순서대로 넣고, 이 용액에 1.5 mM tyrosine 용액을 첨가한 후, 37℃에서 15분 동안 반응시켰다. ELISA reader를 이용하여 490 nm에서 흡광도로 효소의 활성도를 측정하였다.

b) 세포 내 멜라닌 생산 억제효능

Murine melanoma B16 F10 세포를 10% fetal bovine serum (FBS)이 함유된 DMEM 배지로 6-well plate에 1×10⁵ cells/well로 접종한 후 37℃에서 세포가 well 바닥에 약 80% 이상 부착될 때까지 배양하였다. 배지를 제거하고 시험물질인 대조군 줄기세포 배양액(CM) 및 본 발명의 엑소좀 풍부 배양액(ERCM) 10배 농축액의 1%가 함유된 DMEM 배지로 교체한 후 72시간 동안 추가로 배양하였다. 배지를 제거한 세포를 PBS로 세척하고, 트립신으로 처리하여 세포를 회수하였다. Hemacytometer를 이용하여 세포수를 측정한 후 10,000 rpm으로 10분간 원심분리한 다음 상등액을 제거하여 pellet을 확보하였다. 세포 pellet을 60℃에서 건조한 후 10% dimetyl sulfoxide (DMSO)가 함유된 1 M NaOH 용액(100 μL)을 melanin을 용출시켰다. Microplate reader로 490 nm에서 흡광도를 측정하여 세포수당 melanin의 양을 구하였다.

(7) 통계학적 분석

상기 실험에서 수행한 모든 시험결과는 mean±SEM으로 표시하였고, 집단 간 차이는 oneway analysis of variance (ANOVA) (SPSS 12.0 version)을 이용하여 분석하였으며 P value<0.05 미만일 때 통계학적으로 유의성이 있다고 판단하였다.

<실시예 2>

본 발명에 따른 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액의 IgE에 의한 β-hexosaminidase 유리 억제효과 분석

비만세포주인 RBL-2H3 세포를 IgE (1 μg/mL)로 감작시켰을 때 분비되는 βhexosaminidase에 대해, 양수줄기세포(AFSC), 양막줄기세포(AMSC), 태반줄기세포(PSC), 제대혈줄기세포(UCBSC), 신경줄기세포(NSC), 희소돌기교전구세포(OPC) 또는 지방줄기세포(ASC)로부터 수득한 대조군 줄기세포 배양액(CM)을 10배 농축액의 1% 양으로 RBL-2H3 세포에 처리한 결과, 상기 줄기세포 종류에 대해 각각 31.2%, 30.7%, 23.3%, 26.6%, 34.2%, 38.8% 및 19.5%의 억제효과를 나타내었다. 즉, 희소돌기교전구세포 > 신경줄기세포 > 양수줄기세포 > 양막줄기세포 > 제대혈줄기세포 > 태반줄기세포 > 지방줄기세포의 순으로 효과적인 것으로 나타났다. 이에 비해 본 발명의 방법으로 수득한 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액 농축액(ERCM)을 처리한 경우는 양수줄기세포, 양막줄기세포, 태반줄기세포, 제대혈줄기세포, 신경줄기세포, 희소돌기교전구세포 및 지방줄기세포에서 각각 60.5%, 59.2%, 45.7%, 51.3%, 62.4%, 65.8% 및 39.3%의 억제효과를 나타냄에 따라 대조군에 비해 월등히 우수한 비만세포 분비 억제효능을 보여 주었으며, 이러한 효능은 희소돌기교전구세포 > 신경줄기세포 > 양수줄기세포 ≥ 양막줄기세포 > 제대혈줄기세포 > 태반줄기세포 > 지방줄기세포의 순으로 나타났다(하기 표 1 참조).

< 실시예 3>

본 발명에 따른 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액의 전신성 아나필락시스 쇼크반응 억제효과 분석

RBL-2H3 세포에서 탈과립 억제효과에 근거하여 동물에서의 전신성 아나필락시스 쇼크반응 억제효능을 평가하였다. 비만세포 탈과립 인자로 알려진 compound 48/80를 8 mg/kg의 용량으로 복강 내로 투여했을 때 모든 동물이 쇼크로 사망하였는데, 본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액에 대한 동물 쇼크 사망 정도를 분석하였다.

그 결과, 상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 양수줄기세포, 양막줄기세포, 태반줄기세포, 제대혈줄기세포, 신경줄기세포, 희소돌기교전구세포 또는 지방줄기세포의 대조군 배양액(CM)의 10배 농축액을 0.1 mL/mouse의 용량으로 사전에 투여했을 때에는 각각 50%, 50%, 66.7%, 66.7%, 50%, 33.3% 및 66.7%의 동물이 사망하여 희소돌기교전구세포 > 양수줄기세포 = 양막줄기세포 = 신경줄기세포 > 태반줄기세포 = 제대혈줄기세포 > 지방줄기세포의 순으로 동물쇼크 사망정도를 억제하는 것으로 나타났다. 그러나 본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액의 농축액을 투여했을 때에는 희소돌기교전구세포에서는 모든 동물이 생존하였고, 양수줄기세포, 양막줄기세포, 태반줄기세포, 제대혈줄기세포, 신경줄기세포 및 지방줄기세포에서는 16.7%만이 사망하여 본 발명의 엑소좀풍부 배양액이 대조군 배양액에 비해 전신성 아나필락시스 쇼크 반응을 억제하는 활성이 있음을 알 수 있었다.

<실시예 4>

본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액에 대한 히스타민 유도 가려움증 개선효과 분석

나아가 본 발명자들은 히스타민(histamine)으로 유도된 가려움증에 대한 줄기세포 배양액의 완화효과를 평가하였다. 컨트롤 군으로서 히스타민(0.5 μg/site)을 마우스의 피하로 주사했을 때 30분간 평균 75회의 긁는 횟수를 나타냈으며, 이러한 가려움증에 대해 대조군 줄기세포 배양액 및 본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액을 각각 처리할 경우, 가려움 개선 정도를 분석하였다.

분석 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 양수줄기세포, 양막줄기세포, 태반줄기세포, 제대혈줄기세포, 신경줄기세포, 소돌기교전구세포 또는 지방줄기세포의 대조군 줄기세포 배양액(CM)의 10배 농축액(50 μL)을 투여했을 때는 긁는 횟수가 각각 46회, 51회, 63회, 61회, 43회, 39회 및 65회로 줄어들어 희소돌기교전구세포 > 신경줄기세포 > 양수줄기세포 > 양막줄기세포 > 제대혈줄기세포 > 태반줄기세포 > 지방줄기세포의 순으로 효과를 보였지만, 본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액의 농축액을 투여했을 때에는 양수줄기세포, 양막줄기세포, 태반줄기세포, 제대혈줄기세포, 신경줄기세포, 희소돌기교전구세포 및 지방줄기세포에서 각각 15회, 22회, 35회, 29회, 17회, 12회 및 38회로 가려움 증상이 현저하게 감소된 것으로 나타났고, 이러한 개선 정도는 대조군 줄기세포 배양액을 처리하였을 때보다 월등히 감소된 숫자이다. 또한 본 발명의 엑소좀 줄기세포 배양액 처리에 따른 가려움증 개선 정도는 희소돌기교전구세포 > 양수줄기세포 > 신경줄기세포 > 양막줄기세포 > 제대혈줄기세포 > 태반줄기세포 > 지방줄기세포의 순으로 나타났다.

<실시예 5>

본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액에 대한 히스타민으로 유도된 피부 출혈반응 개선효과 분석

히스타민으로 가려움증이 유발된 마우스 피부에서 본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액이 피부 출혈반응을 억제하는 효과가 있는지를 Evan’s blue 누출량으로 정량하여 분석하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 히스타민만을 투여한 경우 3.04 μg/site의 Evan’s blue가 누출되었는데, 양수줄기세포, 양막줄기세포, 태반줄기세포, 제대혈줄기세포, 신경줄기세포, 희소돌기교전구세포 또는 지방줄기세포로부터 수득한 대조군 배양액의 농축액(10배 농축)을 투여했을 때는 누출량이 각각 2.20, 2.01, 2.53, 2.72, 2.10, 1.81 및 2.76 μg/site로 줄어든 것으로 나타났고, 희소돌기교전구세포 > 양막줄기세포 > 신경줄기세포 > 양수줄기세포 > 태반줄기세포 > 제대혈줄기세포 > 지방줄기세포의 순으로 효과적인 것으로 나타났다.

한편, 본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액의 농축액을 투여했을 때는 양수줄기세포, 양막줄기세포, 태반줄기세포, 제대혈줄기세포, 신경줄기세포, 희소돌기교전구세포 및 지방줄기세포에서 각각 1.01, 0.85, 1.50, 1.40, 0.92, 0.83 및 1.62 μg/site로 줄어들어 대조군 배양액에 비해 훨씬 높은 출혈반응 억제효과를 보여 주었으며, 이러한 효능은 희소돌기교전구세포 ≥ 양막줄기세포 > 신경줄기세포 > 양수줄기세포 > 제대혈줄기세포 > 태반줄기세포 > 지방줄기세포의 순으로 나타났다.

<실시예 6>

아토피 피부염 완화 효과 분석

난백알부민(Ovalbumin; OVA)으로 유발시킨 만성 아토피 피부염 마우스 동물 모델에서 홍반, 부종, 인설, 건조증상의 피부병변 정도를 dermatitis score로 평가하였고, 아토피 피부염 증상에 대한 본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액의 완화정도를 분석하였다.

그 결과, 아토피 피부염 발생에 따른 증상은 dermatitis score로 3.88점에 달하는 것으로 나타났으며, 대조군 줄기세포 배양액을 피부 병변에 도포했을 때의 피부 병변은 각각 3.11, 2.87, 3.11, 3.65, 3.12, 2.83 및 3.71점으로 완화되었으며, 희소돌기교전구세포 > 양막줄기세포 > 양수줄기세포 = 태반줄기세포 = 신경줄기세포 > 제대혈줄기세포 > 지방줄기세포의 순인 것으로 나타났다. 하지만 희소돌기교전구세포 외에는 통계학적으로 유의한 효과를 보여 주지 못했다.

이에 비해 본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액 농축액을 도포했을 때는 양수줄기세포, 양막줄기세포, 태반줄기세포, 제대혈줄기세포, 신경줄기세포, 희소돌기교전구세포 및 지방줄기세포에서 각각 1.30, 1.10, 1.83, 1.72, 1.22, 1.13 및 1.97점으로 완화되어 대조군 배양액에 비해 훨씬 높은 피부병변 완화효과를 보여 주었으며, 이러한 효능은 양막줄기세포 = 희소돌기교전구세포 > 신경줄기세포 > 양수줄기세포 > 제대혈줄기세포 > 태반줄기세포 > 지방줄기세포의 순으로 나타났고, 모든 줄기세포의 종류로부터 수득한 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액이 유의한 정도로 개선 효과를 보였다(도 3 참조).

<실시예 7>

만성 아토피 피부염 모델에서 상피세포의 두께 완화 및 비만세포 침윤 억제효과 분석

난백알부민(OVA)으로 유발한 만성 아토피 피부에서 OVA 첩포 부위에 상피증식(epidermal hyperplasia)과 함께 진피(dermis)의 염증세포 침윤(inflammatory cell infiltration)이 확인되었다. 특히 톨루이딘 블루(toluidine blue)로 염색했을 때 dermis 조직 내에 많은 수의 비만세포가 분포하여 면역 과민반응이 확인되었다.

한편, 알러지 반응에 대해 본 발명의 줄기세포 배양액 처리 시 증상 완화 효과가 있는지 확인한 결과, 하기 표 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액 농축액의 피부 알러지반응 완화효과는 대조군 줄기세포 배양액에 비해 월등히 우수한 것으로 나타났고, 특히 상피세포 두께 완화는 희소돌기교전구세포 > 양수줄기세포 > 신경줄기세포 = 양막줄기세포 > 지방줄기세포 > 제대혈줄기세포 > 태반줄기세포의 순이 효과적인 것으로 나타났으며, 비만세포 침윤 억제효과는 희소돌기교전구세포 > 양수줄기세포 > 신경줄기세포 > 양막줄기세포 > 지방줄기세포 > 제대혈줄기세포 > 태반줄기세포의 순으로 효과적인 것으로 나타났다.

< 실시예 8>

만성 아토피 피부염 모델에서 본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액 처리에 따른 혈청 내 IgE , 히스타민 및 인터루킨-4의 억제 효과 분석

만성 아토피 피부에서 난백알부민 감작 마우스의 혈청 내 총 IgE, 히스타민 및 IL-4 농도를 분석하였다.

분석 결과, 본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액을 처리한 군이 대조군 줄기세포 배양액을 처리한 군에 비해 알러지 인자들인 혈청 내 총 IgE, 히스타민 및 IL-4를 유의적으로 억제하는 것으로 나타났으며, 특히 혈청 IgE 억제는 대조군 배양액에서는 유의미한 효과를 보이지 못했고 반면 본 발명의 엑소좀 풍부 배양액은 양수줄기세포 > 제대혈줄기세포 > 양막줄기세포 > 태반줄기세포 > 희소돌기교전구세포 > 신경줄기세포 > 지방줄기세포의 순으로 유의적인 효과를 나타내었다(도 4 참조).

또한, 혈청 내 히스타민 분석 결과, 엑소좀 풍부 배양액은 양수줄기세포 > 제대혈줄기세포 > 양막줄기세포 > 태반줄기세포 > 희소돌기교전구세포 > 신경줄기세포 > 지방줄기세포의 순으로 효과적인 것으로 나타났다(도 5 참조).

나아가, 혈청 내 IL-4 분석 결과, 엑소좀 풍부 배양액은 양수줄기세포 > 제대혈줄기세포 > 양막줄기세포 > 태반줄기세포 > 희소돌기교전구세포 > 신경줄기세포 > 지방줄기세포의 순으로 효과적이었다(도 6 참조).

이러한 결과를 통해 본 발명자들은 혈액 내 모든 알러지반응 지표들에 대해 본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액이 효과적으로 이들 지표물질들의 생성을 억제하여 아토피 피부염을 개선 및 치료할 수 있음을 알 수 있었다.

<실시예 9>

본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액의 피부 주름 개선 효과 분석

콜라겐을 분해하여 피부주름의 원인을 제공하는 MMP-1의 활성에 대한 본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액의 억제효과를 분석하였다.

분석 결과, 대조군 줄기세포 배양액은 양수줄기세포, 양막줄기세포, 태반줄기세포, 제대혈줄기세포, 신경줄기세포, 희소돌기교전구세포 및 지방줄기세포의 대조군 배양액에 의해 MMP-1의 활성이 각각 63.1%, 59.2%, 71.0%, 72.5%, 53.2%, 57.0% 및 62.1%로 감소되는 것으로 나타난 반면, 본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액에 의해서는 양수줄기세포, 양막줄기세포, 태반줄기세포, 제대혈줄기세포, 신경줄기세포, 희소돌기교전구세포 및 지방줄기세포에서 각각 33.2%, 29.1%, 43.3%, 48.0%, 26.2%, 25.3% 및 33.7%로 감소되어 대조군 배양액에 비해 월등히 우수한 MMP-1 억제활성을 나타내었다. 특히 이러한 효능은 희소돌기교전구세포 > 신경줄기세포 > 양막줄기세포 > 양수줄기세포 = 지방줄기세포 > 태반줄기세포 > 제대혈줄기세포의 순으로 나타났다(도 7 참조).

따라서 본 발명자는 본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액을 피부 주름 개선을 위한 화장료 조성물의 용도로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

<실시예 10>

본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액의 피부 미백효과 분석

티로신(tyrosine)으로부터 멜라닌(melanin)의 생산에 관여하는 티로시나제의 활성 억제 효과를 측정하여, 본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액이 피부 미백 활성이 있는지의 여부를 분석하였다.

그 결과, 양수줄기세포, 양막줄기세포, 태반줄기세포, 제대혈줄기세포, 신경줄기세포, 희소돌기교전구세포 및 지방줄기세포의 대조군 배양액은 각각 75.1%, 73.2%, 85.0%, 88.1%, 43.5%, 47.8% 및 69.0%로 티로시나제 활성이 감소되는 것으로 나타난 반면, 본 발명의 엑소좀 풍부 배양액은 양수줄기세포, 양막줄기세포, 태반줄기세포, 제대혈줄기세포, 신경줄기세포, 희소돌기교전구세포 및 지방줄기세포에서 각각 55.0%, 49.2%, 63.3%, 68.0%, 21.0%, 20.2% 및 42.3%로 감소되어 대조군 배양액에 비해 티로시나제 활성 억제효과가 월등히 우수한 것으로 나타났고, 특히 본 발명의 배양엑에 대한 피부 미백 효과(티로시나제 활성 억제효과)는 희소돌기교전구세포 ≥ 신경줄기세포 > 지방줄기세포 > 양막줄기세포 > 양수줄기세포 > 태반줄기세포 > 제대혈줄기세포의 순으로 나타났다(도 8 참조).

또한, 멜라노사이트에서의 직접적인 멜라닌 생산에 대한 억제효능을 분석하였는데, 그 결과, 대조군 줄기세포 배양액은 양수줄기세포, 양막줄기세포, 태반줄기세포, 제대혈줄기세포, 신경줄기세포, 희소돌기교전구세포 및 지방줄기세포 유래 배양액에 의해 각각 80.1%, 77.2%, 83.2%, 91.1%, 49.0%, 52.8% 및 74.2%로 줄어들어 신경줄기세포 ≥ 희소돌기교전구세포 > 지방줄기세포 > 양막줄기세포 > 양수줄기세포 > 태반줄기세포 > 제대혈 줄기세포의 순으로 효과적임이 확인되었다. 한편, 본 발명에 따른 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액은 대조군 배양액에 비해 월등히 우수한 멜라닌 생성 억제효과를 나타내었는데, 구체적으로 양수줄기세포, 양막줄기세포, 태반줄기세포, 제대혈줄기세포, 신경줄기세포, 희소돌기교전구세포 및 지방줄기세포에서 각각 64.1%, 59.0%, 73.0%, 77.2%, 31.1%, 28.2% 및 52.0%로 감소된 것으로 나타났고, 희소돌기교전구세포 ≥ 신경줄기세포 > 지방줄기세포 > 양막줄기세포 > 양수줄기세포 > 태반줄기세포 ≥ 제대혈줄기세포의 순으로 나타났다(도 9 참조).

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에 따른 방법으로 수득한 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액은 멜라닌 생성 억제 효과 및 티로시나제 활성 억제효과가 우수하여 피부 미백을 위한 화장품의 제조에 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

줄기세포 배양액에 TNF-α를 처리하고 1~8%의 산소농도 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는,
줄기세포로부터 엑소좀을 대량 생산하는 방법.
제1항에 있어서,
TNF-α는 5~500 ng/ml의 농도로 처리하고, 상기 배양은 12~72시간 배양하는 것을 특징으로 하는, 줄기세포로부터 엑소좀을 대량 생산하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 줄기세포는 신경줄기세포, 희소돌기교전구세포, 지방줄기세포, 양막줄기세포, 양수줄기세포, 태반줄기세포 및 제대혈 줄기세포로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 줄기세포로부터 엑소좀을 대량 생산하는 방법.
제1항에 있어서,
줄기세포 배양액은 DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 배지인 것을 특징으로 하는, 줄기세포로부터 엑소좀을 대량 생산하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 줄기세포는 1x10⁴~1x10⁶세포수인 것을 특징으로 하는, 줄기세포로부터 엑소좀을 대량 생산하는 방법.
신경줄기세포, 희소돌기교전구세포, 지방줄기세포, 양막줄기세포, 양수줄기세포, 태반줄기세포 또는 제대혈 줄기세포 배양액에 TNF-α를 5~500ng/ml의 농도로 처리하고, 1~8%의 산소농도 조건 하에서 12~72시간 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포로부터 엑소좀의 분비를 증가시키는 방법.
제1항의 방법으로 수득한 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 화장료 조성물.
제7항에 있어서,
상기 줄기세포는 신경줄기세포, 희소돌기교전구세포, 지방줄기세포, 양막줄기세포, 양수줄기세포, 태반줄기세포 및 제대혈 줄기세포로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
제7항에 있어서,
상기 줄기세포 유래 엑소좀은 아토피 피부염 개선효과, 피부주름 개선효과 또는 피부미백 효과를 갖는 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
제7항에 있어서,
상기 화장료는 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 세안제, 트리트먼트, 미용액, 미용팩, 연고제, 겔제, 리니멘트제, 액제, 패치 및 분무제로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항의 방법으로 수득한 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.