CN113481271B - 一种可有效减轻皮肤晒伤的海洋生物活性肽及其制备方法和应用 - Google Patents

一种可有效减轻皮肤晒伤的海洋生物活性肽及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可有效减轻皮肤晒伤的海洋生物活性肽及其制备方法和应用。所述海洋生物活性肽分子量小、皮肤相容性好，能显著减少紫外线照射细胞凋亡和坏死，降低真皮炎性渗出与弹性纤维降解。所述海洋生物活性肽制备方法为取鲜活海洋贝类软体部，经蛋白酶酶解、超滤、葡聚糖凝胶分离，弃去最后一个洗脱单峰后，分别收集或混合其它洗脱组分，冻干而成。该方法简单、成本低廉、绿色环保、生产周期短、适用于工业生产，制备的活性肽对皮肤晒伤既有预防又有修复功效，可应用于化妆品和生物医用材料中，化妆品剂型有膏霜、乳液、凝胶、啫喱、水剂和喷雾等，生物医用材料剂型有洗剂、溶液、敷料(薄膜、水胶体、水凝胶、海绵、喷雾)、软膏和针剂等。

Description

一种可有效减轻皮肤晒伤的海洋生物活性肽及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种可有效减轻皮肤晒伤的海洋生物活性肽及其制备方法和应用。
背景技术
随着臭氧层遭到破坏，皮肤长期过量接触紫外线，导致光线性皮肤病、基底细胞癌、鳞状细胞癌等发病率逐年增加。紫外线诱导皮肤癌形成和发生是一个复杂而连续的生物学行为，其中波长为280-320nm中波紫外线(UVB)正好位于DNA、蛋白质吸收峰附近，能引起DNA和蛋白质损伤，最具致癌性或突变性。紫外线对表皮角质形成细胞DNA损伤是诱发皮肤癌的基础，如果损伤后DNA发生错误无限制修复，则会引起原癌基因和抑癌基因突变，最终导致肿瘤形成。
而正常皮肤在日光中受紫外线过度照射后，也常会出现局部急性光毒性皮炎，还易激发多形性日光疹、单纯疱疹、日光性荨麻疹、多形红斑、迟发性皮肤卟啉病、红斑狼疮、白癜风、毛细血管扩张和日射病等。因此，寻觅多种措施以有效降低紫外线照射引起皮肤损伤及癌变发生已显得非常重要。
除内服超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽过氧化物酶、维生素C、维生素E、类胡萝卜素、谷胱甘肽、尿酸、辅酶Q和泛醌等内源性抗氧化物外，外涂防晒化妆品也可有效预防皮肤光损伤、减少皮肤癌发生。而防晒化妆品中的防晒剂多含有苯环与不饱和侧链，紫外线照射后也时有变应性接触性皮炎等不良反应发生，一定程度上限制了其广泛使用。
而临床上可使用的药物也多是用于预防治疗皮肤光老化，比如维A酸类药物、异维A酸、他扎罗汀、视黄醇、抗氧化药(维生素C、维生素E、β-胡萝卜素、辅酶Q10、超氧化物歧化酶SOD等)、脱色剂(氢醌、熊果苷等)、角质剥落剂(α-羟基酸、β-羟基酸等)、细胞因子(表皮生长因子EGF、成纤维细胞生长因子FGF、血小板衍生化生长因子PDGF等)、天然生物提取成分(表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG、花色苷等)、微量元素(硒)、性激素等，针对皮肤晒伤防护的制剂和药物相对较少。因此，寻找一种天然、安全、环保的皮肤晒伤防护功能物对保障人体皮肤健康具有十分重要的意义和应用前景。
海洋生境独特，蕴藏着丰富的生物资源，是寻找珍贵药物的资源宝库。尤其在海洋细菌、真菌及动植物中，含有诸如类胡萝卜素、维生素、多酚、黄酮、皂甙、萜、生物碱、多糖、功能肽等结构独特新颖、功能特殊高效的活性物。如在蓝藻(Gloeocapsa sp.CU2556)、藻青菌(Nostoc sp.R76DM)和藻类中，类菌孢素氨基酸可吸收大量紫外线进而修复皮肤晒伤。太平洋鳕鱼皮肤水解物可显著抑制紫外线照射后小鼠皮肤MMP-1、MMP-3、明胶酶上调，并下调MAPK信号通路p-ERK、p-p38、c-Jun、c-Fos水平，缓解皮肤光老化。鳕鱼皮胶原肽(GEIGPSGGRGKPGKDGDAGPK、GFSGLDGAKGD)对UVB照射小鼠成纤维细胞基质金属蛋白酶MMP-1、pERK、p-p38均有显著抑制作用，其中前者还可明显抑制MAPK信号通路中的p-JNK，进而拮抗皮肤光老化。
海洋贝类肽在抗氧化、修复皮肤晒伤方面表现也十分突出。太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)酶解物可有效提高抗氧化酶活性，调节MAPK/AP-1信号通路和促炎细胞因子水平，抑制MMP表达，进而降低UVB照射小鼠皮肤皱纹长度、深度和表皮厚度。来源于马氏珠母贝(Pinctada fucata)蛋白的抗氧化肽可提高皮肤组织中抗氧化酶活性，并抑制脂质过氧化，延缓UVB照射小鼠皮肤皱纹形成及弹性下降。波纹巴非蛤(Paphia undulate)活性肽也可提高小鼠皮肤SOD、CAT、GPx等抗氧化酶活性，延缓皮肤光衰老。
从栉孔扇贝(Chlamys farreri)中制备获得的CFP肽(VPSIDDQEELM，DAQEKLE，EELDNALN，VPSIDDQEELM，DAQEKLE，EELDNALN，VPSIDDQEELM，VPSIDDQEELM)，可有效清除DPPH自由基。从扇贝裙边中制备获得两个肽(PVDKNAGVVGAPPKRG、RGGRGITDYLT)具有较高的抗氧化活性，来源于扇贝内脏多肽PCF(Pro-Asn-Thr-Hyl-Ser-Cys-Arg-Gly，分子量879Da)在修复皮肤紫外线损伤方面也表现优异。该扇贝多肽PCF可调控Bcl-2、NOS等基因表达，提高抗氧化酶活性及羟脯胺酸等含量，减少Ⅰ型胶原降解，减轻小鼠和豚鼠皮肤光损伤，并增强人成纤维细胞、角质形成细胞抗氧化能力，抑制凋亡发生。
然而，以上具有抗氧化或皮肤晒伤防护功效的活性物质多为组成成分简单或氨基酸序列较明确的活性肽，适用于实验室少量制备和科学研究。因为所涉及的制备方法较为复杂，加之受高效液相色谱等高精度分离技术样品处理量的限制，导致最终获得的活性肽产率低、制备成本高，难以进行大规模工业生产和应用。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种海洋生物活性肽，该活性肽能有效预防皮肤晒伤，还能有效促进晒伤皮肤修复。该海洋生物活性肽皮肤相容性好，能显著提高紫外线照射后表皮细胞的活力，减少细胞凋亡和坏死发生，并降低真皮炎性浸润与弹性纤维降解，减轻皮肤晒伤。
本发明的另一个目的在于提供一种通过酶解、超滤、葡聚糖凝胶G-15分离制备海洋生物活性肽的方法。该方法简单、成本低廉、绿色环保、生产周期短，适用于大批量工业生产。
本发明还有一个目的在于提供一种海洋生物活性肽的应用。该活性肽可应用于化妆品中，化妆品剂型可包括膏霜、乳液、凝胶、啫喱、水剂、喷雾等；该活性肽还可应用于生物医用材料中，生物医用材料剂型可包括洗剂、溶液、敷料、软膏、针剂等，敷料类型可包括薄膜、水胶体、水凝胶、海绵、喷雾等。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
一方面，本发明提供了一种海洋生物活性肽，该活性肽水溶性和皮肤相容性好，分子量为300Da-3000Da，含3-30个氨基酸。
上述海洋生物活性肽是海洋贝类软体部经过蛋白酶酶解所得的产物。
这些海洋贝类可以包括但不限于牡蛎、波纹巴非蛤、海蚬、贻贝、马氏珠母贝、扇贝、文蛤中的一种或几种的组合。优选地，海洋贝类来源于扇贝。
而所使用的蛋白酶可以是能将蛋白进行酶解的酶，包括但不限于木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶中的一种或几种的组合。优选地，蛋白酶为中性蛋白酶。
此前发明人将海洋贝类活性肽用于护肤、护发研究获得了良好的效果。然而由于紫外线照射的皮肤与未经紫外线照射皮肤在生理状态和结构上存在明显差异，目前无报道用于普通皮肤护理的物质也可直接用于紫外线照射皮肤的护理。
紫外线照射后的皮肤组织学改变过程主要有炎性渗出和增生两个阶段：(1)紫外线照射后，真皮毛细血管数量增多，扩张明显，血管内皮细胞间隙增宽，导致血管通透性增加，液体渗出，白细胞游出。此后，血管内皮细胞破坏，血管周围出现淋巴细胞、多行核细胞等炎性细胞浸润。表皮基底层出现灶状液化，而棘层出现“晒斑细胞”，这是一种变性细胞，其胞质呈现嗜酸性染色，均匀一致，胞核深染、皱缩。(2)皮肤红斑消退后，组织学改变进入增生期，水肿消退，整个表皮增厚，角化过度，棘细胞层黑素颗粒增加，基底层再生活跃，此时皮肤表现为色素沉着和脱屑。
基于以上对紫外线照射引起皮肤损伤作用机理、皮肤晒伤修复过程与机制等的了解，发明人首次将去除葡聚糖凝胶G-15最后一个洗脱单峰组分后获得的海洋生物活性肽用于紫外线照射皮肤的护理上。
作为一种可选的实施方案，海洋生物活性肽的制备方法为海洋贝类软体部通过蛋白酶酶解、超滤，再经葡聚糖凝胶G-15分离，弃去最后一个洗脱单峰组分后，分别收集或合并各个洗脱峰组分，冻干制得海洋生物活性肽。
在一些实施方案中，可将海洋贝类软体部蛋白酶解液经过截留分子量10kDa超滤膜处理，获得的滤过液(小于10kDa)直接通过葡聚糖凝胶G-15分离。
在一些实施方案中，可将海洋贝类软体部蛋白酶解液依次经过截留分子量10kDa、3kDa超滤膜处理，获得的滤过液(小于3kDa)再通过葡聚糖凝胶G-15分离。
在一些实施方案中，可将海洋贝类软体部蛋白酶解液依次经过截留分子量10kDa、3kDa超滤膜处理，获得的截留液(3kDa-10kDa)再经过葡聚糖凝胶G-15分离。
具体如下：鲜活海洋贝类去壳，取软体部匀浆，加入2.5-4倍体积水或PBS缓冲液稀释，加入蛋白酶(2000U/g贝肉-4000U/g贝肉)，在温度37℃-50℃，pH值6.5-7.5，酶解4h-6h，沸水浴灭酶10min，6000×g-9000×g离心10min-15min，离心上清液经过截留分子量10kDa超滤膜超滤，滤过液可不经或再次经过截留分子量3kDa超滤膜超滤。将小于10kDa的活性肽、3kDa-10kDa的活性肽、小于3kDa的活性肽溶液分别浓缩，再经过葡聚糖凝胶G-15分离，弃去最后一个洗脱单峰组分后，分别收集或合并其它各个洗脱峰组分，冻干制得海洋生物活性肽。
优选地，所述的洗脱峰组分为第一洗脱峰组分、第二洗脱峰组分、第三洗脱峰组分、第四洗脱峰组分、第五洗脱峰组分或这几种洗脱峰组分的任意组合。
优选地，收集的洗脱峰组分为3kDa-10kDa的活性肽组分经葡聚糖凝胶G-15分离后收集的洗脱峰组分(例如实施例1中N1(3kDa-10kDa)分离组分F1、F2、F3、F4、F5以及实施例2中N1(3kDa-10kDa)分离组分F1(含F1a、F1b)、F2(含F2a、F2b、F2c))时，对UVB照射HaCaT细胞的细胞存活率最佳。进一步优选，实施例1中N1分离组分F3。更进一步优选，终浓度为800μg/mL的实施例1中N1分离组分F3。
例如，更具体地，将鲜活栉孔扇贝去壳，取软体部匀浆，加入3倍体积PBS缓冲液(0.01M，pH7.5)、中性蛋白酶(3000U/g贝肉)，温度45℃，酶解4h。酶解液煮沸10min，7000×g离心12min。离心上清液依次通过截留分子量10kDa、3kDa的超滤膜超滤。其中，3kDa-10kDa组分记为N1，小于3kDa组分记为N2。将N1、N2组分分别浓缩至浓度约100mg/mL，再经葡聚糖凝胶G-15(100×4.0cm)分离，上样量15mL，流动相为蒸馏水，流速10mL/min，检测波长220nm、280nm。将N1(3kDa-10kDa)组分经葡聚糖凝胶G-15分离，分别收集5个洗脱峰组分(弃去最后一个洗脱单峰组分F6)，浓缩、冻干，制得海洋生物活性肽(N1分离组分F1、F2、F3、F4、F5)。同样地，将N2(小于3kDa)组分经葡聚糖凝胶G-15分离(弃去最后一个洗脱单峰组分F7)，分别收集、浓缩、冻干，制得海洋生物活性肽(N2分离组分F1、F2、F3、F4、F5、F6)。
再例如，将鲜活栉孔扇贝去壳，取软体部匀浆，加入4倍体积去离子水，调pH值至6.5，加入中性蛋白酶(4000U/g贝肉)，在温度37℃，酶解6h。酶解液煮沸10min，9000×g离心10min。上清液通过截留分子量10kDa超滤膜超滤，滤过液(小于10kDa)组分记为N。N组分浓缩至浓度约100mg/mL，再经葡聚糖凝胶G-15(100×4.0cm)分离，上样量16mL，流动相为蒸馏水，流速10mL/min，检测波长220nm、280nm。将N(小于10kDa)组分经葡聚糖凝胶G-15分离，分别收集5个洗脱峰组分(弃去最后一个洗脱单峰组分F6)，浓缩、冻干，制得海洋生物活性肽(N分离组分F1、F2、F3、F4、F5)。
另一方面，本发明提供了一种可有效减轻皮肤晒伤的海洋生物活性肽的应用。给药终浓度优选为50μg/mL-1600μg/mL。进一步优选为100μg/mL-800μg/mL。
作为一种可选的实施方案，海洋生物活性肽可用于预防皮肤晒伤。
作为一种可选的实施方案，海洋生物活性肽还可用于治疗皮肤晒伤。
在本发明的一种优选的实施方案中，海洋生物活性肽可用于化妆品中；优选地，该活性肽尤其适用于可有效预防皮肤晒伤的化妆品中，所述的化妆品剂型包括膏霜、乳液、凝胶、啫喱、水剂、喷雾等。
当用于化妆品中时，海洋生物活性肽在化妆品中的质量分数为0.005％-0.5％。作为一种优选的实施方式，该活性肽在化妆品中的质量分数为0.005％-0.16％。
当用于化妆品中时，海洋生物活性肽可与化妆品基质复配，还可与防晒剂复配，所述的防晒剂是指UVA防护剂和/或UVB防护剂。
所述的UVA防护剂优选为2,2′-双-(1,4-亚苯基)1H-苯并咪唑-4,6-二磺酸的二钠盐、亚甲基双-苯并三唑基四甲基丁基酚、对苯二亚甲基二樟脑磺酸、双-乙基己氧苯酚甲氧苯基三嗪中的一种或几种的组合，其用量为，按化妆品总质量的百分比计，2,2′-双-(1,4-亚苯基)1H-苯并咪唑-4,6-二磺酸的二钠盐0.1％-4.5％、亚甲基双-苯并三唑基四甲基丁基酚0.1％-3.5％、对苯二亚甲基二樟脑磺酸0.1％-4.5％、双-乙基己氧苯酚甲氧苯基三嗪0.2％-4.5％。
所述的UVB防护剂优选为苯基苯并咪唑磺酸及其钾、钠和三乙醇胺盐、甲氧基肉桂酸乙基己酯、甲酚曲唑三硅氧烷、TiO2中的一种或几种的组合，其用量为，按占化妆品总质量的百分比计，苯基苯并咪唑磺酸及其钾、钠和三乙醇胺盐0.1％-3％、甲氧基肉桂酸乙基己酯0.02％-8％、甲酚曲唑三硅氧烷0.2％-8％、TiO2 0.5％-6％。
上述UVA防护剂、UVB防护剂和化妆品基质均可市购。
在本发明的一种优选的实施方案中，海洋生物活性肽还可用于生物医用材料中；优选地，该活性肽尤其适用于可有效修复皮肤晒伤的生物医用材料中，所述的生物医用材料剂型包括洗剂、溶液、敷料、软膏、针剂等，所述的敷料类型包括薄膜、水胶体、水凝胶、海绵、喷雾等。
当用于生物医用材料中时，海洋生物活性肽在生物医用材料中的质量分数为0.005％-0.5％。作为一种优选的实施方式，该活性肽在生物医用材料中的质量分数为0.01％-0.5％。
值得一提的是，本发明提供的海洋生物活性肽作为功能性成分，其不会引起皮肤过敏和光敏性反应，还可明显降低紫外线照射表皮细胞中活性氧水平，稳定胞内钙离子浓度及线粒体膜电位，改善细胞周期阻滞，减少表皮细胞凋亡和坏死。该活性肽还可显著提高紫外线照射皮肤中CAT等抗氧化酶的活性，使皮肤组织中8-OHdG等DNA氧化损伤产物大幅减少，表皮增厚、真皮炎性浸润与胶原降解等症状明显缓解，具有显著的减轻皮肤晒伤作用。
因此，当本发明海洋生物活性肽应用于化妆品或生物医用材料中时，对于化妆品基质成分、生物医用材料原料的种类、用量、制备工艺等的选择较为宽泛。化妆品和生物医用材料中所使用的所有成分应是皮肤可接受且不影响本发明原有海洋生物活性肽的性能，即当与人的皮肤接触时或者与其他组分配伍时，不会导致不适当的毒性、不相容性、不稳定性和变应性反应等。
本发明的解决方案是基于发明人对皮肤晒伤与修复机制、海洋生物活性肽构效关系、皮肤光敏性等的了解，结合现代化妆品、生物医用材料和药理学的研究成果，通过大量创造性实验，寻找、挖掘、制备并优选出与皮肤相容性好、无致敏性和光敏性，且具有显著预防和治疗皮肤晒伤功效的海洋生物活性肽。
本发明具有如下突出的有益效果：
(1)率先挖掘海洋生物活性肽对皮肤晒伤的预防和治疗作用。从牡蛎、波纹巴非蛤、海蚬、贻贝、马氏珠母贝、扇贝、文蛤等众多海洋贝类中，优选出扇贝，并选取鲜活扇贝软体部，利用蛋白酶酶解、超滤、葡聚糖凝胶分离技术，制备获得海洋生物活性肽。该活性肽可迅速渗入皮肤表层，发挥防晒、减轻炎症、晒伤修复等多重功效。该活性肽在极低剂量(50μg/mL)时，仍能显著提高皮肤天然屏障功能与抵御紫外线能力，有效减轻皮肤晒伤。
(2)本发明的海洋生物活性肽的制备工艺简单、成本低廉、绿色环保、生产周期短，适用于大批量工业生产，具有极大的应用前景。根据海洋贝类组成结构、蛋白酶专一性及作用位点等特点，从木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶等众多蛋白酶中，优选出中性蛋白酶将海洋贝类软体部进行定向酶解，酶解液再经过截留分子量10kDa和/或3kDa超滤膜处理，可将水溶性差、分子量大、无显著提高紫外线照射细胞活性的成分(可能含盐类、游离氨基酸、脂肪酸等)剔除，使获得的活性肽生理功效更好，排放的环境污染物也极少。
(3)本发明的海洋生物活性肽水溶性与皮肤相容性好、不引起皮肤刺激、不致敏、无光敏性且功效显著，可在化妆品和生物医用材料中广泛应用。通过葡聚糖凝胶G-15分离，将分子量更小、活性差的洗脱成分剔除，可使活性肽进一步高度富集，在提高生理功效的同时，大幅减少其用量，进而有效降低在化妆品和生物医用材料配制过程中对该活性肽的稳定性、配伍性等的要求和操作难度。
(4)本发明通过建立的中波紫外线照射表皮细胞损伤实验模型，对制备的各个活性肽组分进行高通量活性评价，最终优选出的海洋生物活性肽在细胞和动物水平均表现出优异的减轻皮肤晒伤功效，说明利用该晒伤细胞实验模型可精准指导本发明海洋生物活性肽的定向分离与高度富集。
附图说明
图1是实施例1中N1(3kDa-10kDa)组分葡聚糖凝胶G-15分离图谱。
图2是实施例1中N2(小于3kDa)组分葡聚糖凝胶G-15分离图谱。
图3是实施例1中N1各分离组分对UVB照射HaCaT细胞活性的影响；注：与UVB模型组比较，提高细胞活性*p<0.05，**p<0.01；降低细胞活性，#p<0.05，##p<0.01。
图4是实施例1中N2各分离组分对UVB照射HaCaT细胞活性的影响；注：与UVB模型组比较，提高细胞活性*p<0.05，**p<0.01；降低细胞活性，#p<0.05，##p<0.01。
图5是实施例2中N1(3kDa-10kDa)组分葡聚糖凝胶G-15分离图谱。
图6是实施例2中N1(3kDa-10kDa)分离组分F1对UVB照射HaCaT细胞活性的影响。
图7是实施例4中N1(3kDa-10kDa)分离组分F3的RP-HPLC分离图谱。
图8是实施例7中实施例1的N1(3kDa-10kDa)分离组分F1对UVB照射HaCaT细胞存活状态的影响。
图9是实施例8中实施例2的N1(3kDa-10kDa)分离组分F1对UVB照射HaCaT细胞凋亡状态的影响。
图10是实施例9中N1(3kDa-10kDa)分离组分F1对UVB照射BALB/c小鼠皮肤病理状态的影响。
图11是实施例11制备的海洋生物医用材料(凝胶)对UVB照射BALB/c小鼠皮肤外观的影响。
图12是实施例12制备的海洋生物医用材料(针剂)对UVB照射BALB/c小鼠皮肤外观、病理状态、抗氧化酶活性及DNA的影响；A：皮肤外观；B：紫外线造模第5天皮肤组织HE染色；C：紫外线造模第5天皮肤组织Masson’s trichrome染色；D：紫外线造模第5天血清中DNA损伤产物8-OHdG含量测定；E：紫外线造模第5天皮肤组织过氧化氢酶CAT活性测定。
具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步说明，但本发明的实施方式不局限于以下的实施例介绍，凡依照本发明的方法所作的等同的变化或变通都应视为本发明保护的范畴。以下所用原料，除特殊指明外，均为市售。
在本发明的一种实施方案中，将海洋生物活性肽与生理盐水混合制成溶液(水剂)，对皮肤湿敷。结果显示，与不含活性肽的对照品(UVB模型组，敷贴仅有生理盐水的纱布)相比，敷贴浸有海洋生物活性肽的纱布后，紫外线照射后第2天，皮肤损伤程度明显减轻，仅表现为表皮肥厚、角化过度、真皮层炎细胞浸润(UVB模型组：可见表皮及真皮组织浅层或中层坏死，大量胶原纤维断裂、排列紊乱，毛囊及皮脂腺上皮坏死，全层炎细胞浸润)；紫外线照射后第5天，仅表现为表皮肥厚，炎细胞数量已恢复正常(UVB模型组：仍见表皮增厚、角化过度、结痂，棘细胞增生，真皮及皮下组织炎细胞浸润)；紫外线照射后第7天，小鼠皮肤与空白对照组无明显差异(UVB模型组：仍可见表皮增厚，真皮层炎细胞数量减少、新生毛囊数量增加明显)。
在本发明的优选实施方案中，以海洋生物活性肽为功能成分，可以配以常规化妆品基质，制成化妆品作为实验样品；对照样品为不含有海洋生物活性肽的化妆品基质。结果显示，与对照样品相比，含有海洋生物活性肽的实验样品所处理的小鼠皮肤表皮厚度降低21.17％(约6.9μm)、成纤维细胞数量增加46.67％(约14个/视野)。
在本发明的优选实施方案中，以海洋生物活性肽为功能成分，还可以配以常规生物医用材料基质，制成生物医用材料为实验样品；对照样品为不含有海洋生物活性肽的生物医用材料基质。结果显示，与对照样品相比，含有海洋生物活性肽的实验样品所处理的小鼠皮肤在紫外线照射后第5天损伤程度明显变轻(与空白对照组无明显差异)，表皮无炎性渗出、脱屑、结痂等现象。
为了进一步阐明本发明的方案，以及便于使用，以下实施例以制备溶液(水剂)、乳液、凝胶、针剂为例，辅以化妆品或生物医用材料基质与海洋生物活性肽进行复配。但本领域技术人员应当认可的是这些例子所含的组分并不能作为本发明方案的限制，而仅仅是一种可实施的可替代的方式。
本发明所采用的海洋生物活性肽通过常规工艺与任意多种化妆品或生物医用材料基质组分均质或混合，即可制成可有效减轻皮肤晒伤的化妆品或生物医用材料。例如，将实施例9、10、11中除了海洋生物活性肽之外的其他物质进行常规替换，制成其他类型或相同类型的化妆品；将实施例9、11、12中除了海洋生物活性肽之外的其他物质进行常规替换，制成其他类型或相同类型的生物医用材料，也将具有类似的有益效果。
实施例1
取符合我国相关海产品使用标准的鲜活栉孔扇贝去壳，将软体部匀浆，并加入3倍体积PBS缓冲液(0.01M，pH7.5)、中性蛋白酶(3000U/g贝肉)，温度45℃，酶解4h。酶解液煮沸10min，7000×g离心12min。上清液依次通过截留分子量10kDa、3kDa的超滤膜超滤。其中，3kDa-10kDa活性肽组分记为N1，小于3kDa活性肽组分记为N2。将N1、N2组分分别浓缩至浓度约100mg/mL，再经葡聚糖凝胶G-15(100×4.0cm)分离：上样量15mL，流动相为蒸馏水，流速10mL/min，检测波长220nm、280nm。
将N1(3kDa-10kDa)组分经葡聚糖凝胶G-15分离，依次收集第一到第六洗脱峰组分，浓缩、冻干，分别制得N1分离组分F1、F2、F3、F4、F5、F6(图1)。同样地，将N2(小于3kDa)组分经葡聚糖凝胶G-15分离，依次收集第一到第七洗脱峰组分，浓缩、冻干，分别制得N2分离组分F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7(图2)。
利用紫外线照射表皮细胞损伤模型(具体实验方法见实施例6)，对获得的这13个分离组分进行功效评价，研究其对中波紫外线UVB照射人角质形成细胞HaCaT活性的影响。研究发现，N1分离组分F6、N2分离组分F7给药后，细胞活性进一步降低。而其它11个组分(N1分离组分F1、F2、F3、F4、F5，N2分离组分F1、F2、F3、F4、F5、F6)给药后，细胞活性提升明显(与UVB模型组相比，有显著性差异)(图3和4)。
由此可见，这11个分离组分(N1分离组分F1-F5，N2分离组分F1-F6)对UVB照射HaCaT细胞活性均有显著的改善作用。可将N1(3kDa-10kDa)分离组分F1、F2、F3、F4、F5，N2(小于3kDa)分离组分F1、F2、F3、F4、F5、F6单独使用，也可进行组合或合并，用于减轻皮肤晒伤。
值得一提的是，在N1(3kDa-10kDa)分离组分中，给药终浓度分别为50μg/mL、100μg/mL时，F4处理组细胞存活率均明显高于F1、F2、F3、F5处理组；给药终浓度分别为200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL、1600μg/mL时，F3处理组细胞存活率均明显高于F1、F2、F4、F5处理组。可优选N1(3kDa-10kDa)分离组分F3或F4，单独使用或进行组合，用于减轻皮肤晒伤。也可将N1(3kDa-10kDa)分离组分F1、F2、F3、F4、F5进行组合或合并，用于皮肤晒伤。
此外，在N2(小于3kDa)分离组分中，给药终浓度分别为50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL时，F4、F5处理组细胞存活率均明显高于F1、F2、F3、F6处理组。可优选N2(小于3kDa)分离组分F4或F5，单独使用或进行组合，用于减轻皮肤晒伤。也可将N2(小于3kDa)分离组分F1、F2、F3、F4、F5、F6进行组合或合并，用于减轻皮肤晒伤。
实施例2
取符合我国相关海产品使用标准的鲜活栉孔扇贝去壳，将软体部匀浆，加入2.5倍体积蒸馏水，调pH值至7.0，加入中性蛋白酶(2000U/g贝肉)，温度50℃，酶解5h。酶解液煮沸10min，6000×g离心15min。上清液依次通过截留分子量10kDa、3kDa的超滤膜超滤。其中，3kDa-10kDa活性肽组分记为N1，小于3kDa活性肽组分记为N2。将N1、N2组分分别浓缩至浓度约200mg/mL，再经葡聚糖凝胶G-15(100×4.0cm)分离：上样量7mL，流动相为蒸馏水，流速10mL/min，检测波长220nm、280nm。
将N1(3kDa-10kDa)组分经葡聚糖凝胶G-15分离，分别收集第一和第二洗脱峰组分，第三到第五洗脱峰组分，第六洗脱峰组分，浓缩、冻干，分别制得N1分离组分F1(含F1a、F1b)、F2(含F2a、F2b、F2c)、F3(图5)。同样地，将N2(小于3kDa)组分经葡聚糖凝胶G-15分离，分别收集第一和第二洗脱峰组分，第三到第五洗脱峰组分，第六洗脱峰组分，浓缩、冻干，分别制得N2分离组分F1(含F1a、F1b)、F2(含F2a、F2b、F2c)、F3。
利用紫外线照射表皮细胞损伤模型(具体实验方法见实施例6)，对获得的这6个分离组分进行功效评价，研究其对细胞活性的影响。研究发现，N1分离组分F3、N2分离组分F3给药后，细胞活性进一步降低。而其它4个分离组分(N1分离组分F1、F2，N2分离组分F1、F2)给药后，细胞活性提升明显(与UVB模型组相比，有显著性差异)(图6)。
由此可见，这4个分离组分(N1分离组分F1、F2，N2分离组分F1、F2)对UVB照射HaCaT细胞活性均有显著的改善作用。可将N1分离组分F1、F2，N2分离组分F1、F2单独使用，也可进行组合或合并，用于减轻皮肤晒伤。
值得一提的是，给药终浓度分别为50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL、1600μg/mL时，N1(3kDa-10kDa)分离组分F1、F2处理组细胞存活率均明显优于N2(小于3kDa)分离组分F1、F2处理组。可优选N1(3kDa-10kDa)分离组分F1或F2，单独使用或进行组合，用于减轻皮肤晒伤。
实施例3
取符合我国相关海产品使用标准的鲜活栉孔扇贝去壳，取软体部匀浆，加入4倍体积去离子水，调pH值至6.5，加入中性蛋白酶(4000U/g贝肉)，在温度37℃，酶解6h。酶解液煮沸10min，9000×g离心10min。上清液通过截留分子量10kDa超滤膜超滤，滤过液(小于10kDa活性肽组分)记为N。将N组分浓缩至浓度约100mg/mL，再经葡聚糖凝胶G-15(100×4.0cm)分离：上样量16mL，流动相为蒸馏水，流速10mL/min，检测波长220nm、280nm。
将N(小于10kDa)组分经葡聚糖凝胶G-15分离后，依次收集第一到第六洗脱峰组分，浓缩、冻干，分别制得N分离组分F1、F2、F3、F4、F5、F6。
利用紫外线照射表皮细胞损伤模型(具体实验方法见实施例6)，对获得的这6个分离组分进行功效评价，研究其对细胞活性的影响。研究发现，N分离组分F6给药后，细胞活性进一步降低。而其它5个分离组分(N分离组分F1、F2、F3、F4、F5)给药后，细胞活性提升明显(与UVB模型组相比，有显著性差异)。
由此可见，这5个分离组分(N分离组分F1-F5)对UVB照射HaCaT细胞活性均有显著的改善作用。可将这5个分离组分分别使用，也可进行组合或合并，用于减轻皮肤晒伤。
值得一提的是，给药终浓度分别为50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL、1600μg/mL时，N(小于10kDa)分离组分F2、F3、F4、F5处理组细胞存活率均明显优于F1处理组，其中分离组分F3提升紫外线照射细胞活力和增殖能力最为显著。可优选N(小于10kDa)分离组分F3单独使用，也可将N(小于10kDa)分离组分F2、F3、F4、F5进行组合或合并，用于减轻皮肤晒伤。
实施例4
采用RP-HPLC技术，可将海洋生物活性肽进一步分离和精制。
利用高效液相色谱仪Agilent 1260，结合YMC Triart C18柱(250×10mm，S-5μm，12nm)，进行活性肽的分离与精制。流动相A：水(含0.1％甲酸)；流动相B：乙腈(含0.1％甲酸)，温度40℃。样品浓度150mg/mL，上样量50μL，流速2.5mL/min，检测波长200nm、220nm、254nm、280nm。
因本发明海洋生物活性肽各个组分的洗脱条件略有不同，现以实施例1中N1(3kDa-10kDa)分离组分F3为例，加以说明。洗脱条件为：0-7min，100％A；7-37min，100％-80％A；37-44min，80％-65％A；44-50min，65％-30％A；50-51min，30％-10％A；51-56min，10％A；56-58min，10％-100％A。在该洗脱条件下，可分别收集6个组分：R1(4-7min)、R2(7-22min)、R3(22-37min)、R4(37-44min)、R5(44-50min)、R6(50-56min)。将各个组分分别浓缩、冻干，制得N1(3kDa-10kDa)F3分离组分R1、R2、R3、R4、R5、R6(图7)。
利用紫外线照射表皮细胞损伤模型(具体实验方法见实施例6)，对制备的这6个组分(R1、R2、R3、R4、R5、R6)进行功效评价，研究其对细胞活性的影响。研究发现，这6个分离组分给药后，细胞活性提升明显(与UVB模型组相比，具有显著性差异)。
由此可见，这6个分离组分对UVB照射HaCaT细胞活性均有显著的改善作用。可将N1(3kDa-10kDa)F3组分直接用于减轻皮肤晒伤，而无需经RP-HPLC技术进一步分离和精制。
实施例5
采用LC-ESI-Q-TOF-MS/MS技术，可将制备获得的海洋生物活性肽进行成分分析和氨基酸序列测定。
将HPLC系统(Agilent 1260，USA)与配备有电喷雾离子源的Bruker Q-TOFPremier质谱仪连接。电喷雾电离(ESI)质谱仪以m/z 100-2000正离子模式，毛细管电压4500V，电离挡板电压500V，雾化器压力0.8bar，干燥气体温度180℃，流量5.0L/min。四极离子能和碰撞诱导离解能分别设置为5.0eV、10.0eV。分析柱为YMC Triart C18(250×4.6mm，S-5μm，12nm)，温度40℃。流动相A：水(含0.1％甲酸)；流动相B：乙腈(含0.1％甲酸)。
因本发明海洋生物活性肽各个组分的洗脱条件、氨基酸序列组成各不相同，现以实施例2中N1分离组分F1为例，加以说明。洗脱条件为：0-5min，100％A；5-55min，100％-70％A；55-58min，70％-10％A；58-60min，10％-100％A。样品浓度100mg/mL，上样量10μL，流速1.0mL/min。
采集到LC-ESI-Q-TOF MS/MS数据后，利用Mascot Distiller软件(MatrixScience，Boston，MA，v2.6.0)，对数据进行分析并在Swiss-Prot和NCBInr等数据库中搜索、比对，获得本发明海洋生物活性肽氨基酸序列(显著性阈值p<0.05)。研究发现，本发明海洋生物活性肽分子量为300-3000Da，含有3-30个氨基酸。经peptide2.0分析，大部分pI<7，亲水性较好。
其中，实施例2中N1分离组分F1鉴定出活性肽的氨基酸序列具体见表1。
表1实施例2中N1(3kDa-10kDa)分离组分F1鉴定出活性肽的氨基酸序列
实施例6
建立中波紫外线(UVB)照射表皮细胞损伤实验模型，研究各实施例中制备获得的海洋生物活性肽对细胞活性的影响。
UVB照射HaCaT细胞损伤造模：使用皮肤光老化试验仪HOPE-MED 8140A(天津开发区合普工贸有限公司)，UVB-313EL灯管(波长290-315nm)，照射剂量20mJ·s/cm2。
采用CCK-8法测定细胞活性：将密度为6×104个/mL的HaCaT细胞悬液接种于96孔培养板中(100μL/孔)，置37℃、5％CO2培养箱中培养24h。每孔吸弃50μL，非细胞损伤模型组(阴性对照组)用锡纸包住培养板，与细胞损伤模型各组(UVB+样品组、UVB模型组)一起按照20mJ·s/cm2剂量进行UVB照射。UVB照射结束后，UVB+样品组加入相应浓度样品溶液(终浓度分别为50、100、200、400、800、1600μg/mL，需经孔径0.22μm针头式过滤器除菌)，50μL/孔。阴性对照组和UVB模型组则分别加入DMEM完全培养液，50μL/孔。各组置于CO2培养箱中继续培养24h后，采用荧光倒置相差显微镜CKX41(日本奥林巴斯公司)，观察细胞形态。随后，每孔加入10μL CCK-8溶液，继续培养4h，采用酶标仪Multiskan GO(Thermo FisherScientific公司)，测定每孔吸光度，测定波长450nm，参考波长650nm，每组6个平行孔。
按照上述实验步骤，将本发明实施例1、2、3制备获得的各个组分均进行功效评价。研究发现，经葡聚糖凝胶G-15分离获得的最后一个洗脱单峰组分(实施例1中N1分离组分F6、N2分离组分F7，实施例2中N1分离组分F3、N2分离组分F3，实施例3中N分离组分F6)给药后，细胞活性进一步降低。而其它分离组分给药后，细胞的活性提升明显(与UVB模型组相比，有显著性差异)。
由此可见，在弃去葡聚糖凝胶G-15最后一个洗脱单峰组分后，制备获得的各活性肽分离组分可有效提升紫外线照射后细胞的活力和增殖能力。
实施例7
按照实施例6的实验方法，进行UVB照射HaCaT细胞损伤造模。利用Calcein-AM/PI细胞双染试剂盒，研究实施例中制备获得的海洋生物活性肽对UVB照射HaCaT细胞存活状态的影响。
将密度为0.9×105个/mL的细胞悬液接种于6孔培养板中，2mL/孔，置37℃、5％CO2培养箱中培养24h。吸弃培养基，加入新鲜完全培养液，1.5mL/孔。非UVB损伤模型组用锡纸包住，与UVB损伤模型各组(UVB+样品组、UVB模型组)一起置入皮肤光老化试验仪，紫外照射前用紫外辐照计测定皮肤光老化试验仪的紫外强度，根据公式换算出20mJ·s/cm2紫外剂量对应的照射时间。照射结束后，每孔补加500μL新鲜完全培养液或含样品培养液(需经孔径0.22μm针头式过滤器除菌)，置CO2培养箱中继续培养24h。吸弃培养液，PBS洗涤1次，2mL/孔。吸弃PBS，每孔加入1mL Calcein AM检测工作液，于培养箱中避光孵育30min，吸弃上清液，每孔1mL PI染色液，避光孵育5min，吸弃上清液荧光显微镜下观察，拍照，用Image J计算荧光强度。
按照上述实验步骤，将本发明实施例1、2、3制备获得的各个组分均进行了活性评价。研究发现，经葡聚糖凝胶G-15分离获得的最后一个洗脱单峰组分(实施例1中N1分离组分F6、N2分离组分F7，实施例2中N1分离组分F3、N2分离组分F3，实施例3中N分离组分F6)对UVB照射HaCaT细胞存活状态并无改善作用，死细胞的比例进一步增加。而其它分离组分给药后，细胞存活状态发生明显改善(活细胞的比例显著高于UVB模型组(不加样品)；图8)。
由此可见，弃去葡聚糖凝胶G-15最后一个洗脱单峰组分后制备获得的本发明海洋生物活性肽可明显改善紫外线照射细胞的存活状态，提高活细胞的比例。
实施例8
按照实施例6的实验方法，进行UVB照射HaCaT细胞损伤造模。利用流式细胞术，研究实施例中制备获得的海洋生物活性肽对UVB照射HaCaT细胞凋亡状态的影响。
将密度为0.9×105个/mL的细胞悬液接种于6孔培养板中，2mL/孔，置37℃、5％CO2培养箱中培养24h后，吸弃培养基，加入新鲜完全培养液，1.5mL/孔，非UVB损伤模型组用锡纸包住，与UVB损伤模型各组(UVB+样品组、UVB模型组)一起置入皮肤光老化试验仪，紫外照射前用紫外辐照计测定皮肤光老化试验仪的紫外强度，根据公式换算出20mJ·s/cm2紫外剂量对应的照射时间。紫外照射后，每孔补加500μL新鲜完全培养液或含药培养液(需经孔径0.22μm针头式过滤器除菌)，置CO2培养箱中继续培养24h，收集细胞培养液，用0.25％胰酶(不含EDTA)消化收集细胞，加入收集的细胞培养液终止细胞消化，收集细胞，1000rpm离心5min，弃去上清液，每管加入1mLPBS重悬细胞，1000rpm离心5min洗涤2次，弃去上清液，每管加入5μLFITC-AnnexinV结合液轻轻重悬细胞，室温避光孵育15min，依次再加入10μL PI，轻轻混匀，4℃避光孵育5min，染色后用流式细胞仪进行检测，采用软件FlowJo 7.6.1对数据进行分析。
按照上述实验步骤，将本发明实施例1、2、3制备获得的各个组分均进行了活性评价。研究发现，经葡聚糖凝胶G-15分离获得的最后一个洗脱单峰组分(实施例1中N1分离组分F6、N2分离组分F7，实施例2中N1分离组分F3、N2分离组分F3，实施例3中N分离组分F6)处理后，细胞凋亡早期(Q3)、晚期(Q2)以及坏死细胞(Q1)的比例均高于UVB模型组。而其它分离组分给药后，细胞凋亡早期(Q3)、晚期(Q2)以及坏死细胞(Q1)比例均显著低于UVB模型组(图9)。
由此可见，在弃去葡聚糖凝胶G-15最后一个洗脱单峰组分后制备获得的本发明海洋生物活性肽可明显减少紫外线照射引起的细胞凋亡和坏死。
实施例9
选取实施例2制备的海洋生物活性肽组分(共4个：N1分离组分F1、F2，N2分离组分F1、F2)，利用UVB照射BALB/c小鼠皮肤损伤实验模型，进行功效评价。
本试验涉及的与动物试验相关的内容和程序遵从实验动物使用和管理的相关法律法规及本机构实验动物伦理委员会的相关规定，保证实验动物的福利。
从广东省医学实验动物中心购入SPF级BALB/c小鼠80只，雄性，16-18g。检疫3天，每天观察1次，发现不健康的动物立即剔除。分组：空白对照组(5只)、UVB模型组(15只)、UVB+样品组(共60只，15只/样品)。动物饲养条件：3只/箱，群养。饲养温度与湿度：20℃-26℃，40％-70％，采用12h：12h昼夜间断照明；饲养室条件始终保持稳定，小鼠自由进食饮水。
脱毛：day 1，动物检疫合格、分组后，用剃毛器剃去动物背部被毛，面积约为2×2cm2。试验过程中，若发现动物毛发生长至影响给予样品和观察的操作，亦需进行剃毛操作。脱毛过程应轻柔，避免损伤皮肤。
给予样品：动物脱毛后第2天开始给药。UVB+样品组，取0.8mL(1只小鼠的用量)样品(浓度1.6mg/mL，溶剂为生理盐水)润湿面积约为2×2cm2的三层纱布，将该纱布敷贴在小鼠脱毛皮肤上后用玻璃纸覆盖，再用胶带固定，敷贴持续3小时。结束后撤去胶布、玻璃纸和纱布，并用清水洗净残留样品。空白对照组、UVB模型组动物根据同样操作方法给予生理盐水。每天给药1次，连续6天(Day 2-Day 7)。
照射UVB：day 8，动物给药30min后，UVB模型组、UVB+样品组动物均腹腔注射戊巴比妥钠麻醉(剂量为60mg/kg体重)，麻醉后固定于皮肤光老化试验仪HOPE-MED 8140A(天津开发区合普工贸有限公司)内进行UVB照射，UVB照射强度为0.174mW/cm2，照射时长28.7min，累积照射剂量为300mJ。照射过程用纱布遮盖小鼠眼部，避免眼睛受到紫外线伤害。照射完毕30min后，动物再次按照上述方法给药。
UVB照射后第2、5、7天(即Day 10、Day 13、Day 15)，UVB模型组、UVB+样品组各取5只动物，颈椎脱臼处死。取小鼠背部经脱毛、给药、照射的皮肤，置于中性甲醛固定，作石蜡切片并HE染色，进行病理检测(图10)。
研究发现，空白对照组皮肤组织结构未见异常，表现为表皮被覆1-2层角化鳞状上皮细胞，真皮层胶原纤维排列紧密有序，皮脂腺及毛囊清晰可见，皮下组织内血管未见扩张。略有表皮增厚、角化活跃等现象，可能因剃毛等刺激引起。
与空白对照组相比，UVB模型组小鼠背部皮肤经紫外线照射后第2天可见皮肤损伤，表现为表皮及真皮组织浅层或中层坏死，真皮层大量胶原纤维断裂、排列紊乱，毛囊及皮脂腺上皮坏死，皮肤全层炎细胞浸润；紫外线照射后第5天可见皮肤一定程度的修复，表现为表皮增厚、角化过度、结痂，棘细胞增生，真皮及皮下组织炎细胞浸润；紫外线照射后第7天可见皮肤进一步程度的修复，主要表现为表皮增厚，真皮层炎细胞数量减少、新生毛囊数量增加。
与UVB模型组相比，实施例2制备获得的海洋生物活性肽(N1分离组分F1、F2，N2分离组分F1、F2)各处理组的小鼠背部皮肤，经紫外线照射后第2天损伤程度明显减轻，主要表现为表皮肥厚、角化过度、真皮层炎细胞浸润；UVB照射后第5天表现为表皮肥厚，炎细胞数量恢复正常；紫外线照射第7天小鼠皮肤与空白对照组无明显差异。该实验结论与实施例6中细胞实验结论一致。
由此可见，本发明制备获得的海洋生物活性肽可有效缓解紫外线照射引起皮肤红斑、炎性浸润、弹性纤维降解、脱屑、结痂等不良反应。
实施例10
选取实施例3制备获得的海洋生物活性肽N分离组分(合并F1-F5，弃去F6)为原料，制备化妆品。
组成化妆品的成分，按质量分数100％计，包括：
A相：4-甲基苄亚基樟脑0.5％、脂肪醇聚氧乙烯醚3％、C12-15苯甲酸酯(CAS#:68411-27-8)9％、碳酸二辛酯2％、微晶蜡0.8％、水解丝蛋白/PG-丙基甲基二羟基硅氧烷交聚物0.5％、VE醋酸酯0.7％。
B相：去离子水68.8％、1，3-丁二醇5％、丙二醇4％、EDTA-2Na0.1％、亚甲基双-苯并三唑基四甲基丁基酚3.5％、PEG-40氢化蓖麻油0.2％、NaCl 0.8％。
C相：海洋生物活性肽N分离组分0.1％、尿囊素0.4％、VC磷酸酯镁0.3％。
D相：香精0.2％、尼泊金丁酯0.1％。
工艺过程：分别混合加热A相、B相到80℃，搅拌条件下将A相加入到B相中，均质10min。冷却至60℃时加入C相。冷却至40℃后加入D相，混匀制得化妆品。
将制备的上述海洋生物化妆品(记为A)及其对照样(记为a，用去离子水替代海洋生物活性肽，其它基质成分及用量均与A相同)进行功效评价。
取40只BALB/c小鼠，随机分为4组：空白对照组、UVB模型组、UVB+海洋生物化妆品、UVB+对照样，10只/组。按照实施例9的方法，进行脱毛和UVB造模处理。给药方式(UVB照射前给药)则由湿敷改为涂抹给药，给药剂量200mg化妆品/只小鼠。空白对照组、UVB模型组不给药。涂抹后玻璃纸覆盖，再用胶带固定，敷贴持续3小时，结束后撤去胶布、玻璃纸和纱布，并用清水洗净残留，1次/日。UVB照射后第2天，将小鼠颈椎脱臼处死，取背部经脱毛、给药、照射的皮肤，置于中性甲醛固定。
将封固试样置于10倍镜下观察皮肤整体形态，再于40倍镜下从视野观察到的皮肤最上端开始拍第一张图片，之后每移动标尺2mm拍取一张，拍取5张后用显微图像分析系统选取每张图片上的5个点，测量其表皮厚度，每张图片共测量25个点，取平均值记为表皮厚度。每张图片取6个视野，计数每个视野内成纤维细胞数，取平均值记为每个视野真皮层成纤维细胞数(表2)。
表2海洋生物化妆品对UVB照射BALB/c小鼠表皮厚度与真皮成纤维细胞的影响
注：与空白对照比较，*p<0.05，**p<0.01；与UVB模型组比较，#p<0.05，##p<0.01
研究发现，与空白对照组相比，UVB模型组小鼠表皮厚度明显增加，而真皮层成纤维细胞数量显著降低。而与UVB模型组、UVB+对照样组相比，UVB+海洋生物化妆品组小鼠表皮厚度明显降低，而真皮层成纤维细胞数量显著提高，其与空白对照组无显著性差异。
由此可见，应用本发明海洋生物活性肽制备的化妆品可有效缓解紫外线照射引起的真皮炎性浸润、弹性纤维降解、表皮角化过度等不良反应，可用于预防皮肤晒伤。
实施例11
选取实施例3制备获得的海洋生物活性肽N分离组分(合并F1-F5，弃去F6)为原料，制备生物医用材料。
组成本发明海洋生物医用材料(凝胶样品)的成分，按质量分数100％计，包括：中等粘度海藻酸钠(麦克林，CP，粘度200±20mpa.s)2％、海洋生物活性肽N分离组分0.5％、去离子水97.5％。先称取海洋生物活性肽N分离组分，加入去离子水，搅匀后，再加入海藻酸钠，缓慢溶解并搅匀，制成凝胶。
凝胶基质：2％中等粘度海藻酸钠溶液(用去离子水替代同等含量的海洋生物活性肽N分离组分)。
取15只BALB/c小鼠，随机分为3组：空白对照组(5只)、UVB+凝胶基质(5只)、UVB+本发明海洋生物医用材料(凝胶样品)(5只)。按照实施例10的方法，进行BALB/c小鼠饲养、脱毛、造模和给药(UVB照射后才给药，给药剂量200mg凝胶/只小鼠，每天给药一次)。空白对照组不给药。在UVB照射后第2、5、7天(即Day 10、Day 13、Day 15)，观察动物的一般临床体征(体形、被毛、皮肤、粪便、肌肉张力、步态、精神、呼吸等)，并对各组小鼠背部皮肤进行拍照。
研究发现，与UVB+凝胶基质组相比，UVB+本发明海洋生物医用材料(凝胶样品)组小鼠皮肤在紫外线照射第5、7天损伤程度明显变轻，表皮无明显炎性渗出、脱屑、结痂等现象，与空白对照组无显著差异。
由此可见，应用本发明海洋生物活性肽制备的生物医用材料可有效缓解紫外线照射引起的真皮炎性渗出、弹性纤维降解、表皮角化过度等不良反应，可用于皮肤晒伤修复。
实施例12
选取实施例1中制备的N1分离组分F3(简称CFP)，进行功效评价。
组成本发明海洋生物医用材料(针剂)的成分，按质量分数100％计，包括：海洋生物活性肽CFP 0.08％、生理盐水注射液99.92％。先称取海洋生物活性肽CFP，加入生理盐水注射液，搅匀后经孔径0.22μm针头式过滤器除菌。
取45只BALB/c小鼠，动物检疫合格，随机分为3组：空白对照、UVB模型、UVB+CFP，15只/组。
Day 1，用剃毛器剃去动物背部被毛，面积约为2×2cm2，脱毛过程应轻柔，避免损伤皮肤。
Day 2，在小鼠背部皮肤脱毛处选择4个点进行皮内注射，25μL/点，即皮内注射100μL/只小鼠。其中，UVB+CFP组给药浓度800μg/mL(无菌，现配现用)；空白对照组与UVB模型组则在相同部位给予同等体积生理盐水注射液(无菌)。
Day 3，UVB模型组、UVB+CFP组动物腹腔注射3mg/mL戊巴比妥钠麻醉(注射体积：20mL/kg体重)，麻醉后固定于皮肤光老化试验仪内进行UVB照射累积剂量300mJ。照射过程用纱布遮盖小鼠眼部，避免眼睛受到紫外线伤害。空白对照组动物仅注射戊巴比妥钠麻醉，但不进行UVB照射。空白对照、UVB模型、UVB+CFP组动物紫外线照射完毕30min后，给药方式同上：分别在小鼠背部皮肤脱毛处选择4个点进行皮内注射给药，25μL/点，即皮内注射100μL/只小鼠，每天注射1次，并观察动物的存活、体形、被毛、皮肤、粪便、肌肉张力、步态、精神等状况。
紫外线照射后第2、5、14天(即Day 4、Day 7、Day 16)，从各组分别取5只动物，剃去背部毛发后，拍照，取冻存的血清用试剂盒检测其中8-OHdG含量。同时，剪取背部造模、给药区域的皮肤组织：部分置于中性甲醛固定液中固定，随后分别进行HE染色、Masson’strichrome染色；部分液氮速冻后，-80℃冻存，测定过氧化氢酶CAT活性(图12)。
研究发现，紫外线照射后小鼠背部表皮出现明显损伤：UVB模型组表皮层厚度不一，部分出现严重萎缩或再生，个别角质形成细胞不典型再生，黑素细胞一定程度核异型并不规则分布在基底膜上方，朗格汉斯细胞数目明显减少，表真皮连接处境界清，表皮突消失等。真皮层在经紫外线照射后，血管周围巨噬细胞、肥大细胞、炎性递质及细胞因子被激活，导致组织溶解酶释放，进而缓慢溶解真皮成分，出现明显炎症反应。而在皮内注射CFP溶液后，紫外线照射小鼠皮肤炎性浸润和损伤程度明显减轻，表皮略增厚但较均一，与真皮界限清晰且趋于波浪状，真皮胶原纤维束增多变厚，排列紧密且较均匀，提示海洋生物活性肽CFP可显著改善紫外线照射引起小鼠表皮增生与真皮炎症反应。
此外，皮肤经紫外线照射最具特征性的变化是真皮成分的改变。采用Masson’strichrome染色(胶原纤维呈绿色，肌纤维、胞质、纤维素呈红色至紫红色，红细胞呈水红色)。研究发现，UVB模型组出现真皮弹性纤维变性、胶原束减少及氨基多糖裂解，表现为大部分真皮乳头上部出现嗜酸性染色境界带，其下是被降解、紊乱、异常的蓝灰色条带——异常弹性纤维样物质。而在皮内注射CFP溶液后，小鼠皮肤弹性纤维数量明显上升，弹性纤维断裂情况减少，且排列有序并呈长条形，部分恢复网状交织结构，提示海洋生物活性肽CFP可显著减轻紫外线诱导小鼠真皮胶原降解，并促进胶原生成。
生物的新陈代谢及理化因素均可产生氧自由基，后者具有极强的氧化能力，可使生物膜中不饱和脂类发生氧化，最终使其硬化而导致通透性降低，影响细胞物质交换，继而使之破裂死亡。氧自由基在紫外线照射所致DNA损伤中发挥着重要的作用，氧化性DNA损伤包括DNA链断裂、5,6-二羟基二氢胸腺嘧啶、8-羟基鸟嘌呤(8-OHdG)。其中，8-OHdG可使DNA出现G→T突变。在H2O2存在条件下，8-OHdG随DNA在紫外线中的暴露将呈线性增加。
对紫外线照射小鼠血清8-OHdG含量和皮肤组织过氧化氢酶(CAT)活性进行检测。研究发现，皮内注射扇贝肽溶液后，紫外线照射小鼠血清8-OHdG含量大幅降低，而皮肤组织CAT活性明显升高，提示海洋生物活性肽CFP可能通过提高抗氧化酶CAT等的活性，促进H2O2等氧自由基分解，进而减少8-OHdG等DNA氧化损伤产物生成，减轻皮肤晒伤。
由此可见，应用本发明生物活性肽制备的生物医用材料(针剂)可有效缓解紫外线照射引起的真皮炎性渗出、弹性纤维降解、表皮增生、角化过度、结痂等不良反应，可用于皮肤晒伤防护。

Claims (4)

1.一种海洋生物活性肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将栉孔扇贝去壳，将软体部匀浆，加入pH7.5的PBS缓冲液,按3000U/g贝肉加入中性蛋白酶，在温度45℃，酶解4h，酶解液煮沸10min，7000×g离心12min，上清液依次通过截留分子量10kDa、3kDa的超滤膜超滤，其中，3kDa-10kDa活性肽组分记为N1，小于3kDa活性肽组分记为N2，将N1、N2组分分别浓缩至浓度100mg/mL，再经规格100×4.0cm葡聚糖凝胶G-15分离：上样量15mL，流动相为蒸馏水，流速10mL/min，检测波长220nm、280nm，其中N1收集10-80min的组分，即为海洋生物活性肽，其中N2收集10-110min的组分，即为海洋生物活性肽；或者将栉孔扇贝去壳，将软体部匀浆，加入蒸馏水，调pH值至7.0，按2000U/g贝肉加入中性蛋白酶，在温度50℃，酶解5h，酶解液煮沸10min，6000×g离心15min，上清液依次通过截留分子量10kDa、3kDa的超滤膜超滤，其中，3kDa-10kDa活性肽组分记为N1，小于3kDa活性肽组分记为N2，将N1、N2组分分别浓缩至浓度200mg/mL，再经规格
100×4.0cm葡聚糖凝胶G-15分离：上样量7mL，流动相为蒸馏水，流速10mL/min，检测波长220nm、280nm，其中N1收集10-50min的组分，即为海洋生物活性肽。
2.权利要求1所述的海洋生物活性肽的制备方法制备得到的海洋生物活性肽。
3.权利要求2所述的海洋生物活性肽在制备预防和/或治疗皮肤晒伤的化妆品或生物医用材料中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的化妆品剂型包括膏霜、乳液、凝胶、啫喱、水剂或喷雾，所述的海洋生物活性肽在化妆品中的质量分数为0.005％-0.16％；所述的生物医用材料剂型包括洗剂、溶液、敷料、软膏或针剂，所述的海洋生物活性肽在生物医用材料中的质量分数为0.01％-0.5％。
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