JP5047433B2 - 真珠層の総ての成分を含んでなる、真珠層の抽出による組成物の製造方法、この方法を用いて得られる組成物、およびこの組成物の化粧品および皮膚科学における使用 - Google Patents
真珠層の総ての成分を含んでなる、真珠層の抽出による組成物の製造方法、この方法を用いて得られる組成物、およびこの組成物の化粧品および皮膚科学における使用 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
本発明は、真珠層（mother-of-pearl）の総ての成分、少なくとも一種類のコラーゲンおよび少なくとも一種類のプロテオグリカンを含んでなる組成物の製造方法、この方法を用いて得ることができる組成物、およびこの組成物の薬学領域および化粧品の領域における、特に皮膚および／または皮膚付属器の加齢の影響と対抗するための使用に関する。
【０００２】
哺乳類は、数層からなっているが体外環境の変化による攻撃に感受性である、高度に構造化された組織である皮膚からなるバリヤーによって、外部環境から保護されている。魚や蛙は粘液を分泌し、トリは羽毛で覆われており、哺乳類以下および哺乳類の脊椎動物は、現代のヒト科動物を除き毛髪で覆われているので、この状況は動物界で独特である。
【０００３】
ヒトはこれらの防御特性を喪失してしまっており、保護する必要があり、且つ刺激により攻撃や加齢に対抗しやすくすることができる皮膚を有する。
【０００４】
特に、加齢は、特に皮膚が薄くなり、弾力性を喪失し、特に多少深い皺を生じる生理学的現象であることが知られている。表面のたるみまたは乾燥、および無秩序な色素沈着も観察される。
【０００５】
皮膚は、表皮、真皮、および深層部である下皮の３層を含んでなる。
【０００６】
皮膚の最外層の保護エンベロープである表皮は真皮をぴったりと覆っており、その表面は角質層からなっている。角質層は、剥離を特徴とする表面の剥離層、およびバリヤーの役割を果たしている最深層である緻密層の２層からなっている。表面にあるので巨視的に観察することが容易な表皮は、多くの研究の主題となってきた。既知の応答は、体外環境のある種の薬剤によって引起されるもの、または多様な起源の活性物質の適用から生じるものである。表皮の細胞は、表皮を真皮と分離している基底膜上にある基底層の細胞の活性から生じる。
【０００７】
真皮は、細胞外マトリックスの成分を産生する繊維芽細胞の生合成活性から生じる。後者は、４種類の主要な巨大分子であるコラーゲン、エラスチン、構造糖タンパク質、およびプロテオグリカンからなっている。真皮は表皮によって与えられたシグナルに応答する能力を有し、真皮はまた応答して表皮にシグナルを送る。一般に、皮膚の様々な真皮層と表皮層との間に交換が存在し、これは細胞を再生し、外層の粘着および加湿を確実に行なうことを目的とするものである。
【０００８】
加齢による影響を防止し、または遅延させるための多くの活性薬剤が提案されてきた。
【０００９】
これらの中で、真珠層は、当初から美的なものや通常の薬物に使用されてきた。更に、真珠層は、その骨再生特性が知られている。
【００１０】
特に、真珠層または貝殻のアラゴナイトは生物起源の無機物化した構成であり、全質量の約１．７〜２％である繊維状および非繊維状物質の有機マトリックス(Taylor et al, Bulletin of the British Museum (Natural history) Zoology. Suppl. 3125pp. + 29 Plates, 1969)、および微量元素（ナトリウム、マグネシウム、ランタン、亜鉛、臭素、セシウム、鉄、マンガン、塩素、銅、カリウム、カルシウム、ストロンチウム、および硫黄）と結合したアラゴナイトと呼ばれる斜方晶系形態で結晶化した炭酸カルシウムからなっていることが知られている。更に詳細には、真珠層の全有機相は、特にヒドロキシプロリンとヒドロキシリシンを欠く祖コラーゲン(ancestral collagens)からなる繊維状タンパク質と非繊維状タンパク質とからなる有機マトリックスの形態である。真珠層の約５０％は水溶性である。残りの５０％は、脱石灰化の後にのみ得ることができる。
【００１１】
しかしながら、例えばＷＯ９７／２３２３１号公報に記載されているように、真珠層粉末を微粉状の不活性希釈剤または賦形剤と混合することによって得られる従来の製品は、粉末状（特に、その主成分であるアラゴナイトまたはＣａＣＯ３）の真珠層の存在により皮膚刺激の望ましくない現象を引起す。従って、これらの製品中の真珠層粉末の含量は、これらの刺激現象を避けるために極めて限定することが肝要である。これらの刺激の望ましくない現象は、特に皮膚と接触しているこれらの既知製品のｐＨが高塩基性であることによって引起される。また、真珠層粉末を基剤とする既知生成物は、特定の処方上の問題、特に安定性（エマルションの破壊）および低い塩基性値へのｐＨの調整の問題を有する。
【００１２】
更に、ＷＯ９７／２４１３３号公報には、真珠層粉末を純水、二回蒸留水、または発熱性物質不含水であって、場合によっては塩を補足したものから選択される水性溶媒と接触させた後、水溶性画分を分離して水性画分、従って、真珠層の水に不溶性の有機相および無機成分を本質的に欠いている画分のみを回収することにより、真珠層から生物活性物質を製造する方法が記載されている。従って、この方法では、特に真珠層の全成分、詳細には真珠層の全有機相を含んでなる組成物を製造することはできない。
【００１３】
極めて驚くべきことであり、且つ予想外なことには、特定の方法を実行することにより、真珠層の総ての成分だけでなく、真珠層の成分と、これらの活性を少なくとも増強することができ、または相乗効果を提供するある種の化合物との有利な組合せを得て、特に皮膚および／または皮膚付属器の加齢に関連する影響を防止し、および／または明らかに減少させることができることが見出された。
【００１４】
従って、本発明の主題は、
a) 真珠層を約１〜約３００μmの粒度の粉末に粉砕し、
b) このようにして得られた真珠層粉末を、少なくとも一種類のコラーゲンもしくは少なくとも一種類のプロテオグリカンまたはそれらの混合物の水−グリコール溶液の形態の抽出剤と密に接触させた後、
c) 密な接触の結果として形成される抽出混合物を回収し、所望の組成物を構成する
ことからなる工程を含んでなる、組成物の製造方法である。
【００１５】
本発明の方法により、組成物を工程b)で得た抽出混合物の形態で得ることができる。
【００１６】
本発明による方法の実施に用いられる真珠層は、真珠貝およびある種の頭足類（例えば、オウムガイ）の殻から得ることができる。特に、これは、Pinctada maximaのようなカキから得られる。
【００１７】
他の多糖類や方解石分に富む殻成分を含まない未加工の真珠層が用いられる。出発材料は好ましくは白色真珠層であり、そうでない場合には、不耐を引起すことがある色素を除去する工程を提供する必要がある。
【００１８】
これは容易に入手できる原料であり、これを用いても天然個体数には負の影響を与えない。実際に、これらのカキまたは他の真珠貝のほとんどは養殖されている。
【００１９】
更に、もう一つの利点は、原料は真珠を産生したカキ殻から得ることができ、具体的には真珠貝は多くとも３個の真珠を連続して産生した後には、優れた品質（Ａ級）の真珠層の厚い層を有するにも拘わらず、生産プールから除かれる。従って、本発明は、真珠養殖後の真珠層を使用するための特別な機会を提供する。
【００２０】
本発明の方法を実施する際に用いられる真珠層粉末の粒度は、篩法および／またはレーザー読みとり法など、当業者の知識の範囲内にある通常の手段で測定した場合に、約１〜約３００μmである。
【００２１】
本発明による方法の特定の態様によれば、真珠層は約５０〜約１００μmの粒度の粉末に粉砕される。
【００２２】
他の具体的態様によれば、真珠層は約１５〜約５０μmの粉末に粉砕され、これにより結晶単位の粒度に近づけることによって収量を向上させることができる（例えば、Pinctada maxima 由来の真珠層の成分単位は、９〜１２μmのアラゴナイトの極めて嵩高い六方晶系の結晶のバイオクリスタルである）。
【００２３】
本発明の方法の工程a)に従って真珠層を粉末に粉砕するためには、特に、以下の操作が実行される。
【００２４】
第一段階では、殻（殻皮層）の外側部分を、粉砕または任意の他の非変性法によって未加工の真珠層から取り除く。
【００２５】
次に、真珠層のシートを押し潰すことによって断片に粉砕し、微粉化ができるようにする。微粉化しようとする断片は、好ましくは長さが約２〜約５cmであり、厚みが約０．３cmである。
【００２６】
第二段階において、断片を微粉化する。
【００２７】
真珠層は、予め浄化することなしに用いることができる。予備浄化を行なう場合には、６．６％活性塩素（１２°）の次亜塩素酸ナトリウムの溶液で、断片を浸漬することなく極めて速やかな浄化洗浄を行う。乾燥を即座に行って、水を完全に除去しなければならない。
【００２８】
粉砕は、この目的にのみ取っておいたジルコニウムジャーで乾燥状態で行い、洗浄（漂白剤を含む水、すすぎの後、蒸留水で洗浄）し、予め加熱滅菌しなければならない。押し潰しは、滅菌したジルコニウムボールで行う。
【００２９】
粉末に粉砕した未加工の真珠層は、二種類の異なる方法：
２．５Mradのγ線照射による滅菌、
１００℃のオートクレーブ中での１〜２時間の加熱滅菌
で滅菌することができる。真珠層は約２５０℃からのみ分解する（無機マトリックスおよび有機マトリックス）（Balmain, Hannoyer and Lopez, 「軟体動物Pinctada maximaの殻由来の真珠層の加熱の際の無機および有機マトリックスのフーリエ変換赤外分光分析法（ＦＴＩＲ）およびＸ線回折分析(Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) and X-ray diffraction analyses of mineral and organic matrix during heating of Mother of Pearl (nacre) from the shell of the mollusc Pinctada Maxima)」, J. Biomed. Mater. Res. (Appl. Biomater.), vol. 48(5): 749-754, 1999)。従って、この滅菌は、真珠層の様々な成分を破壊しない。
【００３０】
本発明による方法の工程b)は、上記の真珠層粉末を、少なくとも一種類のコラーゲン、少なくとも一種類のプロテオグリカン、またはそれらの混合物の水−グリコール溶液の形態の抽出剤と密に接触させることからなる。
【００３１】
本発明によれば、「水−グリコール溶液」という用語は、水−グリコール溶媒、すなわち一般に水と少なくとも一種類のグリコールとの混合物の形態の溶媒を用いて得られるコラーゲンおよびプロテオグリカンの溶液を意味するものである。
【００３２】
「グリコール」という用語は、既知のように、２個のアルコール官能基を有する任意の化合物を意味するものである。特に、用いることができるグリコールは、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、およびそれらの混合物からなる群から選択される。
【００３３】
水−グリコール溶媒を形成するのに用いることができる水は、純水、二回蒸留水、発熱性物質不含水、または脱無機物水あるいは脱イオン水であることができる。
【００３４】
水−グリコール溶媒の水：グリコールの重量比は、好ましくは約１：１００〜約１００：１であり、更に特定的には約１：１〜約２０：１である。
【００３５】
抽出剤は、好ましくは少なくとも一種類のコラーゲンの水−グリコール溶液である。
【００３６】
本発明による抽出剤において水−グリコール溶液中で用いることができるコラーゲンは、動物界で入手可能な、当業者に知られている結合組織の細胞内物質を構成する任意のコラーゲンであることができる。
【００３７】
最も特定的には、海洋性コラーゲン、すなわち海洋性脊椎動物などの海洋起源の生物に由来するコラーゲンを用いるのが好ましい。特に、海洋性コラーゲンは魚類の結合組織の主要成分であり、皮膚、筋肉、腱および靱帯の構造において本質的な役割を果たしている。
【００３８】
更に特定的には、Gattefosse社（セントプリースト、フランス）から発売されており、ＩＮＣＩ名称が「Soluble Collagen」（日本では「水溶性コラーゲン」と呼ばれている；ＭＨＶ：２０８００ＣＺＹ００１００００）である海洋性コラーゲン「PANCOGENE(登録商標)MARIN」が挙げられる。これは、Teleostei 綱に属する暖流魚の未保護種の皮膚から抽出されたコラーゲンである。
【００３９】
Laboratoire Industriel de Biologie社（Soisy Sous Montmorency, フランス）から発売されており、ＣＴＦＡ名称が「Amino Collagen Amino Acid」である海洋性コラーゲン「COLLAGENE NATIF MARIN − Code 690」も挙げられる。これは、魚の皮膚から抽出された水溶性の酸性コラーゲンである。
【００４０】
好ましくは、抽出剤の総重量に対して約０．０００１〜約５０重量％、更に好ましくは約０．０１〜約１５重量％のコラーゲン濃度が用いられる。
【００４１】
抽出剤は、好ましくは少なくとも一種類のプロテオグリカンの水−グリコール溶液でもある。
【００４２】
本発明による抽出剤において水−グリコール溶液中で用いることができるプロテオグリカンは、当業者に知られている任意のプロテオグリカン、特に硫黄を含まない任意のプロテオグリカンであることができる。
【００４３】
特に、プロテオグリカンは、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、硫酸ヘパリン、ケラタン硫酸、およびそれらの混合物からなる群から選択される。
【００４４】
ヒアルロン酸が最も好ましく、例えば、Laboratoire Industriel de Biologie社（Soisy Sous Montmorency, フランス）から発売されているものが挙げられる。
【００４５】
好ましくは、抽出剤の総重量に対して約０．０００１〜約４０重量％、更に好ましくは約０．０１〜約１０重量％のプロテオグリカン濃度が用いられる。
【００４６】
当然のことであるが、抽出剤は、当業者に知られており、抽出工程自体に適した、または以下に記載するような本発明の方法によって調製される組成物の可能な用途を考慮すれば適当である任意の追加の化合物を含んでなることもできる。従って、抽出剤は、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）のような錯体形成剤を含んでなることもできる。
【００４７】
本発明の特に好ましい態様によれば、真珠層粉末と抽出剤とからなる混合物を調製し、総重量に対して約２０〜約６０重量％の工程a)で得られた上記真珠層粉末と上記のように残りの上記抽出剤を含んでなるようにすることによって、工程b)に従って真珠層粉末を抽出剤と密に接触させる。
【００４８】
真珠層粉末は、本発明の方法の工程b)に従って、特に真珠層粉末を抽出剤に激しく且つ均質な機械攪拌を行いながら懸濁させ、真珠層粒子の抽出コーティングを行うことによって抽出剤と密に接触させることができる。
【００４９】
この操作は、例えば、周囲温度、すなわち約２０℃の温度で約１時間行うことができるが、当業者であれば時間および温度を特に真珠層粉末の当初の粒度によって調整することができる。
【００５０】
他の態様によれば、接触を行う工程b)は、固定されている真珠層粉末中に抽出剤を加圧下で通過させることによって行うことができる。この固定は、例えばＨＰＬＣ型のカラムを用いて、場合によっては抽出剤をさらに良好に拡散させ且つ真珠層粉末の圧縮を回避するための充填剤と混合して行うことができる。
【００５１】
いずれか特定の理論に結びつけようとするものではないが、抽出剤にコラーゲンおよびプロテオグリカン、特に海洋性コラーゲンおよびヒアルロン酸が含まれていると、親和性の物理化学的現象により真珠層に含まれる関連化合物の抽出が促進され、更に真珠層から抽出される成分の効果が増強されると思われる。特に、真珠層からの祖コラーゲンの抽出は海洋性コラーゲンの存在によって促進され、接着タンパク質（デコリンおよびサイトカイン）およびプロテオグリカンの真珠層からの抽出は、選択されたプロテオグリカンの存在によって促進されると思われる。
【００５２】
密な接触は、それがどうあろうと、所定温度に対して、好ましくは実質的に完全な抽出を行うのに十分な時間行われる。本発明によれば、「実質的に完全な抽出」という用語は、抽出剤と接触させたときに真珠層から総ての抽出可能な成分が抽出されることを意味するものである。
【００５３】
換言すれば、特に水−グリコール液相中のコラーゲンまたはプロテオグリカンの総濃度についての平衡の生成は、上記の「実質的に完全な抽出」の達成に相当する。
【００５４】
従って、例えば水−グリコール液相中のこれらの総コラーゲンまたはプロテオグリカン濃度を規則的に測定することによって、このような抽出の「実質的に完全な」性質を決定することは、当業者の知識の範囲内にある。
【００５５】
接触を行う工程は、それがどんなものであれ、工程が終了する前の、真珠層粉末を抽出剤に懸濁したものを放置する（攪拌なし）時間を含んでなることができる。
【００５６】
接触を行うための工程b)が終了したならば、密な接触を行った結果として形成され、所望の組成物を含んでなる抽出混合物を回収する。
【００５７】
この水−グリコール懸濁液の形態の組成物は、そのまま使用まで保管することができる。後の実施（保管、輸送、製剤化など）の実用上の理由で、この組成物の液相を固相から分離することもできる。
【００５８】
従って、一つの変法によれば、本発明の方法は、工程b)の終了時に、密な接触の結果として形成された、所望の組成物を含んでなる抽出混合物を回収し、限外濾過手段、接線濾過手段(tangential filtration means)などの当業者に知られている手段によって組成物の液相を固相から分離することを特徴とする。
【００５９】
このようにして分離された固相および液相はともに、上記のようにして調製される組成物を構成する。従って、薬学上または化粧品として適当な賦形剤と共に用いる以後の製剤化において、この組成物を、製剤化の任意の工程においてそれぞれの固相および液相を製剤化の便宜上の理由から同時にまたは経時的に別々に添加することによって再構成することができると考えられる。上記のように、本発明の主題は、上記の分離工程の終了時に得られる液相でもあると理解される。同様に、本発明の主題は、上記の分離工程の終了時に得られる固相でもある。
【００６０】
本発明の主題は、上記の方法（固相および液相を含んでなり、上記のような分離工程を有するまたは有しない）を用いて得ることができる新規組成物でもある。
【００６１】
特に、この組成物は、少なくとも
アラゴナイト（ＣａＣＯ３）、
ナトリウム、マグネシウム、ランタン、亜鉛、臭素、セシウム、鉄、マンガン、塩素、銅、カリウム、カルシウム、ストロンチウム、硫黄、およびそれらの混合物からなる群から選択される微量元素、
真珠層由来の繊維状タンパク質、特に抽出剤の海洋性コラーゲンに関連する宇真珠層由来の祖コラーゲン（下記の図１を参照）、
真珠層由来の非繊維状タンパク質、特に接着タンパク質に関連するデコリンなどのタンパク質（下記の図２を参照）、ならびに、
真珠層に由来しない少なくとも一種類のコラーゲン、および／または真珠層に由来しない少なくとも一種類のプロテオグリカン
を、液相と固相の水−グリコール懸濁液の形態で含んでなる。
【００６２】
当然のことであるが、本発明によれば、「真珠層に由来しないコラーゲン」および「真珠層に由来しないプロテオグリカン」という表現は、それぞれ本発明の方法の工程b)の抽出剤について用いられるコラーゲンおよびプロテオグリカンを意味するものと理解される。同様に、「水−グリコール懸濁液」という表現は、本発明による組成物が（水−グリコール溶液中に）可溶性成分だけでなく不溶性成分（特に、アラゴナイト）も含んでなるという事実によって説明される。
【００６３】
更に、本発明の方法について上記した好ましい条件がこの組成物に当てはまることは当然である。
【００６４】
従って、特に本発明による組成物中の真珠層に由来しないコラーゲンは、好ましくは海洋性コラーゲンであり、更に特定的には「PANCOGENE(登録商標)MARIN」、「COLLAGENE NATIF MARIN - Code 690」、およびそれらの混合物からなる群から選択される海洋性コラーゲンである。同様に、真珠層に由来しないプロテオグリカンは当業者に知られている任意のプロテオグリカン、特に硫黄を含まない任意のプロテオグリカンであることができ、特にヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、硫酸ヘパリン、ケラタン硫酸、およびそれらの混合物からなる群から選択され、更に特定的にはヒアルロン酸である。
【００６５】
下記の例に更に詳細に示されるように、本発明の組成物は、皮膚および／または皮膚付属器に関して極めて有利な特性、特に例えば創傷の治癒を向上させることができる組織再生特性、および皮膚および／または皮膚付属器の加齢に対する影響を防止しおよび／または明らかに減少させることができる抗加齢特性を有する。皮膚の様々な細胞の種類に対するその作用は、修復および様々な成分間の生理学的バランスの調節の作用である。更に具体的には、その有機成分および無機成分は、数種類の濃度でケラチノサイト代謝に作用する。この組成物は表皮を再構築し、極めて深い層をさらに良好に保護するのに寄与することができる。表皮はさらに抵抗力が付き且つ厚くなり、真皮と継続的に相互作用する。更に、この組成物は、エラスチンおよびコラーゲンを多く含むことができる。皮膚は更に弾力性に富み、堅くなる。これは耐性であり、その成分は持続したリズムで再生される。更に、この組成物は色素の合成を安定化し、微小循環を促進する。最後に、この組成物は全く無害であり、且つ抗炎症作用、従って鎮静作用を有するという利点を有する。
【００６６】
従って、本発明の主題は、活性成分として本発明の方法を用いて得ることができる上記の新規組成物と、薬学上許容可能な賦形剤を含んでなる、医薬組成物でもある。
【００６７】
薬学上許容可能な賦形剤は、好ましくは皮膚科用に塗布するのに適する賦形剤である。
【００６８】
本発明の主題は、上記の方法を用いて得ることができる上記のこの新規組成物の、皮膚および／または皮膚付属器の組織再生疾患の治療を目的とする医薬製品を製造するための使用でもある。
【００６９】
更に、本発明の主題は、上記の方法を用いて得ることができる上記の新規組成物の、加齢に関連した皮膚および／または皮膚付属器の疾患の治療を目的とする医薬製品を製造するための使用である。
【００７０】
最後に、本発明の主題は、上記の方法を用いて得ることができる上記の新規組成物の、炎症性皮膚症状の治療を目的とする医薬製品を製造するための使用である。
【００７１】
本発明の主題は、化粧活性成分として本発明による方法を用いて得ることができる上記の新規組成物を含んでなり、さらに、化粧品として許容可能な賦形剤を含んでなる化粧用組成物でもある。
【００７２】
当業者に知られている任意の化粧用賦形剤を用いることができる。
【００７３】
当然のことであるが、本発明による化粧用組成物は、モイスチャーライザー、柔軟剤、または化学的または有機スクリーニング剤などの当業者に知られている化粧品用の成分を含むこともできる。
【００７４】
上記の医薬組成物および化粧用組成物は、特にクリーム、軟膏、ゲル、ローション、水中油型エマルションまたは油中水型エマルションの形態であることができ、またはリポソームなどの薬学上または化粧品として許容可能なベクターと組合わせることができる。
【００７５】
更に、本発明の主題は、本発明の方法を用いて得ることができる上記の新規組成物の、皮膚および／または皮膚付属器の組織再生のための化粧処置を目的とする化粧用組成物を製造するための使用である。
【００７６】
更に、本発明の主題は、本発明の方法を用いて得ることができる上記の新規組成物の、皮膚および／または皮膚付属器の加齢に関連した変化の化粧処置を目的とする化粧用組成物を製造するための使用である。
【００７７】
最後に、本発明の主題は、本発明の方法を用いて得ることができる上記の新規組成物を皮膚および／または皮膚付属器に適用することを特徴とする、皮膚および／または皮膚付属器の組織再生のための化粧処置の方法である。
【００７８】
更に、本発明の主題は、本発明の方法を用いて得ることができる上記の新規組成物を皮膚および／または皮膚付属器に適用することを特徴とする、皮膚および／または皮膚付属器の加齢に関連した変化の化粧処置の方法である。
【００７９】
下記の例は本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲を制限するものと解釈すべきではない。
【００８０】
例１：本発明による組成物の製造方法
用いる器具は真空下で完全に気密性の種類の器具であり、好ましくはステンレススチール製であるべきである。これを前もって洗浄して清浄に濯ぎ、細菌による汚染の危険性を完全に除くようにすべきである。
【００８１】
1.1) Pinctada maxima由来の真珠層であって、殻の外側部分（殻皮層）が既に除かれており且つ既に不規則な断片にされているものを用いる（Pharma Futura社, 10, rue de Charonne, 75012, パリ、により供給)。断片のサイズは、長さが２〜５cmであり、厚みが０．３cmである。
【００８２】
この断片を、浸漬することなく６．６％活性塩素（１２°）の次亜塩素酸ナトリウムの溶液で極めて速やかな浄化洗浄を行った後、即座に乾燥して水を完全に除去する。
【００８３】
微粉化のための粉砕は、この目的にのみ取っておいたジルコニウムジャーで乾燥状態で行い、洗浄（漂白剤を含む水＋すすぎ＋蒸留水で洗浄）し、予め加熱滅菌しなければならない。粉砕は、それ自体滅菌されているジルコニウムボールを用いて行う。
【００８４】
このようにして得られる微粉化真珠層の粒度は、５０〜１５０μmである。次に、これを２．５Mradのγ線照射によって滅菌する。
【００８５】
このようにして調製した微粉化真珠層は、下記の特性：
− 外観 微粉
− 色 白色
− 臭気 真珠層に特徴的
− 砒素 ＜１ppm
− 重金属 ＜１０ppm
を有する。
【００８６】
細菌学的分析
− 好気性微生物の数 １５５０／g
− 湿度 ０．３％
【００８７】
1.2) 下記の混合物を調製する：上記のようにして微粉化したPinctada Maxima真珠層粉末（粒度５０〜１５０μm）４００gを、抽出剤の総重量に対して海洋性コラーゲン「PANCOGENE(登録商標)MARIN」（Gattefosse社、セントプリースト、フランスから発売；ＩＮＣＩ名称「可溶性コラーゲン」（日本では「水溶性コラーゲン」と呼ばれている；ＭＨＶ：２０８００ＣＺＹ００１００００）０．１８重量％と、ヒアルロン酸（Laboratoire Industriel de Biologie社, Soisy Sous Montmorency,フランスから発売）０．２重量％を含んでなる水−グリコール溶液（水およびエチレングリコールは、それぞれ１０：１の重量比）６００mlに約４０００rpmで攪拌しながら約２０℃の温度で徐々に加える。これを加えたら、攪拌および温度を６０分間保持する。攪拌は激しく且つ均質であり、混合物の総ての粒子が接触し、抽出コーティングできるようにしなければならない。
【００８８】
次に、混合物を６時間静置する。
【００８９】
このようにして得られた組成物は、灰白色の粒状固相を液相に懸濁したものから構成され、ｐＨは約８である。
【００９０】
この組成物は、
アラゴナイト（ＣａＣＯ３）、
海洋性微量元素：ナトリウム、マグネシウム、ランタン、亜鉛、臭素、セシウム、鉄、マンガン、塩素、銅、カリウム、カルシウム、ストロンチウム、および硫黄（下記表１を参照）、
繊維状タンパク質：海洋性コラーゲンに関連する様々な種類のタンパク質であって、真珠層由来の祖コラーゲンと考えることができるもの、および海洋性コラーゲンPANCOGENE(登録商標)MARIN（下記の図１を参照）、
非繊維状タンパク質：真珠層および抽出剤由来のヒアルロン酸などのプロテオグリカン、および真珠層由来の接着タンパク質（デコリンｒｐおよびサイトカインｒｐ；ｒｐは「関連ペプチドまたはタンパク質」、すなわち後者の分子に対する抗体によって認識される限り、それぞれデコリンおよびサイトカインに関連したペプチドまたはタンパク質を意味する）
を含んでなる。
【００９１】
本発明に関するペプチドおよびタンパク質の同定に用いられる手法は、下記の文献に記載されているものである：
電気泳動−ＳＤＳ−Ｐａｇｅ法: Laenli法, Nature 1970, 227 680-682、
イムノトランスファー: Towbin H. et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76(9): 4350-4354、およびBurnette W.N. 1981, Analytical Biochemistry 112: 195-203によるウェスタンブロット法。
【００９２】
相当するウェスタンブロット法を、図１および図２に示す。
【００９３】
タンパク質相のアミノ酸分析は、アスパラギン酸、トレオニン、セリン、グルタミン酸、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、リシン、およびアルギニンの存在を示唆している。図３に、全アミノ酸組成の柱状グラフを示す。
【００９４】
上記のようにして得られた組成物を、以後「組成物Ａ」と呼ぶ。
【００９５】
【表１】
【００９６】
例２：組成物Ａの活性の研究
顕微鏡法および最新の手法を活用して免疫学的方法および免疫細胞化学的方法により物質を検出するためのイン・ビボ動物モデルまたはヒト細胞培養物を用いる組織学的および細胞学的科学的研究により、現在では細胞スケールで研究を行うことができ、このような研究をこの組成物Ａの活性物質を研究するために行った。
【００９７】
この研究は、皮膚組織の構造、機能および色素形成において重要な役割を果たしていることが知られているものとして、本質的に三種類の細胞であるケラチノサイト、繊維芽細胞およびメラニン細胞に関して行なった。ケラチノサイトおよび繊維芽細胞の細胞型はいずれも、組成物Ａの活性物質および特に真珠層に含まれている真珠層の総ての成分に特異的な受容体を有しており、真皮の最深部の層のレベルに到達することができるメッセージのカスケードに移行する。
【００９８】
この研究は、その形態学的外観のみならず、それらの主成分である核および細胞質の挙動にまで及ぶものであり、それらの合成活性およびそれらの再生能力をも調べた。ある種の活性物質の存在および分泌された構造タンパク質の存在も同定した。
【００９９】
1.1) 組成物Ａのケラチノサイトに対する活性: 組成物Ａの存在下で培養したヒトケラチノサイトによるサイトケラチンの合成
1.1.1) 方法
ケラチノサイトは、身体の最外層細胞である。それらは、身体の第一の防御バリヤーを構成する。ケラチノサイトは、受動的および能動的に作用することによって介入する。それらは、シールドの役割を果たすバリヤーを構成することによって受動防御を生成する。このシールドは、完全に乾燥しており且つ無核の細胞からなっている。これらの細胞の強力な粘着性により、極めて均質な系を提供することができる。ケラチノサイトは、それらが細胞質に保持していてこのバリヤー構造を生じる物質であるサイトケラチンを合成する。サイトケラチンは、ケラチノサイトの内部骨格を構成する。この内部骨格によりこれらの細胞の容積が決まり、細胞内連絡能が増加し、メラニン吸収が促進される。表皮中のサイトケラチン量が増加すれば、表皮は一層効果的になり且つ皮膚に一層若い外観を与えるようになる。細胞間の接触を促進することによって、サイトケラチンはＮＭＳ（天然加湿因子、例えばセラミド、コレステロールまたは脂肪酸）の喪失を防止する。
【０１００】
皮膚の積極的防御は、ケラチノサイトが外部と接触する身体の最初の細胞であるという事実に関係している。従って、それらは人体環境の条件における可能な変化を人体に報告するための一連の成分を発達させている。これを行うために、これらの細胞は真皮の下にある細胞（繊維芽細胞）を刺激するための増殖因子、特に、主としてケラチノサイトによって合成され、細胞分化因子であることが知られているＰＴＨ関連ペプチド（ＰＴＨｒｐ）を合成することができる。
【０１０１】
用いた方法は下記の通りである。この方法は、細胞質に含まれる分泌タンパク質のそれぞれの濃度を評価することができる迅速半定量法を含む。
【０１０２】
０．９cm２のチャンバー当たり４×１０４個の細胞を播種し（８−チャンバースライド, NUNC）、一晩培養する。ＨＢＳＳ緩衝液で洗浄した後、組成物Ａを１％含む培地または対照培地（組成物Ａを０％含む）を加える（４５０μl／チャンバー）。
【０１０３】
培養物を４８時間インキュベーションする。上清を取り除き、培養物を洗浄した後、細胞をパラホルムアルデヒドで４℃で３０分間固定し、次いでＰＢＳ緩衝液で洗浄する。
【０１０４】
抗サイトケラチン一次抗体２００μlを加える。インキュベーションを、室温で３０分間継続する。次に、上清を除き、細胞をＰＢＳで洗浄する。
【０１０５】
一次抗体を認識し且つ蛍光マーカー（この場合には、フルオレセイン）に結合する二次抗体２００μlを加える。室温で３０分間インキュベーションした後、上清を除き、細胞をＰＢＳで洗浄する。次に、スライドを設置し、倒立蛍光顕微鏡下で検討を行う（免疫蛍光による細胞質内のサイトケラチンの検出）。
【０１０６】
細胞によって合成され、標識したタンパク質（この場合には、サイトケラチン）の量は、免疫標識から生じる蛍光の強度に比例する。
【０１０７】
1.1.2) 結果
図４および図５に示されるように、ケラチノサイト培地に組成物Ａを０．５％添加すると、サイトケラチン合成を増加する効果が見られる。組成物Ａは、古い皮膚からケラチノサイトの活性およびこれらのケラチノサイトによるサイトケラチンの分泌を回復させる（エストラジオールの投与中止を受けたケラチノサイトに対する作用；図６、７、および８、９を参照）。
【０１０８】
更に、ケラチノサイトによるカルシウム依存性ＰＴＨｒｐ合成は、組成物Ａの存在下で刺激される。主にケラチノサイトによって合成されるＰＴＨｒｐは、組成物Ａによって供給されるカルシウムイオンの存在下で特に活性であり、組成物Ａに含まれる真珠層の完全な有機マトリックスのサイトカインと相乗的に作用する。
【０１０９】
皮膚再生における主要な接着タンパク質であるデコリンも、組成物Ａの存在下で刺激される。
【０１１０】
カルシウム依存性接着タンパク質であるカドヘリンも、粘着性に大きく関与している。それらは、組成物Ａの存在下で刺激される。
【０１１１】
1.2) 繊維芽細胞に対する組成物Ａの活性、エラスチン合成
1.2.1) 組成物Ａの存在下で培養したヒト繊維芽細胞によるエラスチン合成
用いる方法は、ケラチノサイトの研究について上記の1.1.1)節で記載したのと同じである。
【０１１２】
図１０および図１１から明らかなように、組成物Ａは１％の濃度でヒト繊維芽細胞によるエラスチン合成を強力に刺激する。
【０１１３】
1.2.2) 培養におけるヒト繊維芽細胞に対するエストロゲンとBiocrystal maxima m.の効果の比較（図１２、１３、１４および１５）
比較的不活性な成熟繊維芽細胞は形状が極めて細長く且つ濃密な核を有する。活性な繊維芽細胞は大きさが大きく且つ丸まっている核を有し、核小体は嵩張っており、合成の活性な工程を反映している。「活性な繊維芽細胞」型は、ホルモン置換療法を行っている５０歳の婦人から採取した皮膚外植片の培養で観察される。
【０１１４】
培地にエストロゲンが欠乏すると、細胞の劇的な不活性化が引起される。それらは最早接着性でも集密的でもなくなり、幾つかは核萎縮の開始を示す。
【０１１５】
図１２および図１４は、置換療法を行っている５０歳の閉経した（従って、エストロゲン分泌の減少した）婦人からの外植片由来のヒト繊維芽細胞に対する組成物Ａの効果を示す。
【０１１６】
図１３および図１５は、置換療法を行っている５０歳の閉経婦人からの外植片由来のエストラジオール投与停止を受けたヒト繊維芽細胞に対する組成物Ａの効果を示す。
【０１１７】
図１２〜１５から明らかなように、培地に１％の濃度で添加された組成物Ａは、投与停止を受けた繊維芽細胞の活性を完全に回復させる。組成物Ａの作用は顕著であり、繊維芽細胞は良好に発育した極めて明瞭な核を有し、核小体は顕著である。それらの紡錘状の細胞本体は同一方向に並んでおり且つ集密的であり、細胞交換ができる。若い皮膚の外植片由来の細胞に作用するときには、同様な結果が得られた。
【０１１８】
1.3) メラニン細胞に対する組成物Ａの活性：組成物Ａの存在下で培養したケラチノサイトによって吸収されるメラニン量の変化
1.3.1) 方法
メラニン細胞はメラニン合成に関与する色素細胞であり、メラニンは皮膚の着色を引起す色素である。メラニン細胞は、総表皮個体数の約２〜４％である。皮膚の均質な色は、メラニンがメラノソームの形態で分泌細胞（メラニン細胞）からそれを吸収する隣接ケラチノサイトへ移行することによる皮膚の全表面にわたり色素が分布することによる。
【０１１９】
この方法は、ケラチノサイト／メラニン細胞同時培養物を調製し、メラニンを分析することからなる。
【０１２０】
ケラチノサイトとメラニン細胞は、いずれも表皮に見いだされる細胞個体群である。それらは、真皮を除去して表皮を酵素消化した後の皮膚試料から得られる。このようにして単離される表皮細胞をCoulter Counter (Coultronics)で計数した後、グルタミン、ストレプトマイシン／ペニシリン、および１０％ウシ胎児血清を補足した改良Dulbeco型の通常の培地（イーグル培地）で培養する。割合は、得られる結果に応じて調節する。この培地では、メラニン細胞およびケラチノサイトが生存することができる。
【０１２１】
組成物Ａの存在下で４日間インキュベーションした後、細胞をＮａＯＨ／ＤＭＳＯ混合物で消化し、次に遠心分離の後に、上清を回収する。読みとりは４７０nmで行う。
【０１２２】
1.3.2) 結果
結果を下記表２に示し、図１６では柱状グラフによって表す。
【０１２３】
【表２】
【０１２４】
組成物Ａが１％含まれていると、ケラチノサイトによって吸収されるメラニンの分布に有意な変化が引起され、濃度の局在化が回避される（図１７および１８参照）。
【０１２５】
1.4) ケラチノサイトおよび繊維芽細胞の組成物Ａによる刺激の免疫細胞化学的実証
1.4.1) 方法
これは、細胞質に含まれるタンパク質（サイトケラチンおよびエラスチン）のそれぞれの濃度を評価することができる迅速半定量法である。０．９cm２のチャンバー当たり４×１０４個の細胞を播種し（８−チャンバースライド, NUNC）、一晩培養する。ＨＢＳＳ緩衝液で洗浄した後、組成物Ａを１％含む培地または対照培地（組成物Ａを０％含む）を加える（４５０μl／チャンバー）。培養物を４８時間インキュベーションする。上清を除き、培養物を洗浄した後、細胞をパラホルムアルデヒドで４℃で３０分間固定し、次いでＰＢＳ緩衝液で洗浄する。抗サイトケラチンおよび／または抗エラスチン抗体２００μlを加える。インキュベーションを、室温で３０分間継続する。次に、上清を除き、細胞をＰＢＳで洗浄する。フルオレセインに接合した第二の抗体２００μlを加える。室温で３０分間インキュベーションした後、上清を除き、細胞をＰＢＳで洗浄する。次に、スライドを設置し、倒立蛍光顕微鏡下で検討を行う。細胞によって合成されたエラスチンまたはサイトケラチンの量は、蛍光の強度に比例する。
【０１２６】
1.4.2) 結果
ケラチノサイト培地に組成物Ａを1％添加すると、表皮のケラチノサイト細胞によるサイトケラチン合成を増加する効果が見られる。この刺激は、０．５％の組成物Ａにおいて多量に観察される。
【０１２７】
繊維芽細胞を組成物Ａ（１％）の存在下でイン・ビトロでインキュベーションすると、４８時間後に蛍光の強度の極めて顕著な増加が観察され、真皮の繊維芽細胞によるエラスチン合成の刺激を反映している。
【０１２８】
1.5) 組成物Ａの抗炎症活性：組成物Ａで処理したＨＬ６０前骨髄細胞によって分泌されるインターロイキン１（Ｉ１−１）の分析
炎症過程中に、多数の炎症細胞の末梢血から炎症部位への移行が最初に観察された後、これらの部位におけるある種のサイトカイン、特にＩＬ−１のかなりの分泌が観察される。後者は、主要な役割を有すると考えられる。
【０１２９】
この研究では、組成物Ａの存在下で細胞系ＨＬ−６０を用いて、ＩＬ−１分泌を測定する。
【０１３０】
ＩＬ−１の産生は、ＩＬ−１分泌の強力な刺激因子であるフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）を培地に添加することによって増幅される。ＩＬ−１を、ヒトＩＬ−１に対する特異抗体を用いるＥＬＩＳＡによるイムノアッセイの通常の手法によって定量する。
【０１３１】
1.5.2) 結果
結果を下記表３に示し、図１９では柱状グラフによって表す。
【０１３２】
【表３】
【０１３３】
従って、組成物Ａが１％の存在下では、ＩＬ−１合成の有意な減少が見られ、組成物Ａの極めて顕著な抗炎症効果を反映している。移植をラットでイン・ビボで行なったときにも、このイン・ビトロでの効果が見られた。
【０１３４】
1.6) 毒性試験：組成物Ａの非細胞毒性の実証：ミトコンドリア活性のＭＴＴ試験
1.6.1) 方法
これは、生細胞のミトコンドリアＮＡＤＰＨレダクターゼによるテトラゾリウム塩（ＭＴＴ）の青−紫色ホルマザン生成物への還元に基づく比色試験である。
【０１３５】
培地２００μl中２×１０４個の細胞をそれぞれのウェルに播種した後（９６穴プレート，NUNC）、一晩インキュベーションしてプラスチックに適正に接着させる。細胞を無血清培地で洗浄した後、様々な濃度を含む培地（組成物Ａを１％、０．５％および０．１％）または対照培地（組成物Ａを０％）を２００μl／ウェルで加える。
【０１３６】
４８時間インキュベーションした後、上清を除き、細胞をＨＢＳＳ緩衝液で洗浄する。ＭＴＴ（臭化＝３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニル−テトラゾリウム；「チアゾリルブルー」）の２０％溶液を含む培地１００μlをそれぞれのウェルに加える。反応は、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーター中で２時間行う。
【０１３７】
０．０４ＮのＨＣｌ／イソプロパノールを１００μl加えて、ホルマザン結晶を良好に可溶化させた後、発色反応をマイクロプレートリーダーを用いて５７０nmの波長で読み取る。値は、光学濃度としても表される。
【０１３８】
1.6.2) 結果
結果を表４に示し、図２０では柱状グラフとして表す。
【０１３９】
【表４】
【０１４０】
従って、培地中に組成物Ａが含まれると、細胞のミトコンドリア活性が大きく増加する。この酵素活性の刺激は用量依存性であり、組成物Ａの濃度が高くなれば、活性は高くなる。しかしながら、培地中の組成物Ａの含量がどの程度であっても、細胞のミトコンドリア活性は組成物Ａで処理されていない対照細胞の活性と比較して著しく優れている。
【０１４１】
2.7) イン・ビトロで評価した組成物Ａの活性に関する結論
組成物Ａは、表皮の最表面層に直接作用する。
【０１４２】
この抽出物の有機成分および無機成分は、基底層の細胞の活性に作用することにより、ケラチノサイト代謝においていくつかのレベルで発現する。
【０１４３】
まず最初に、細胞増殖、分裂および分化を刺激した後、ケラチノサイトによる特異的合成、特にサイトケラチン、および真皮を正確に機能させるためのメディエーター、例えばＰＴＨｒｐの合成が増幅され、細胞間連絡カスケードを促進する。
【０１４４】
星形であり、次いで顆粒状となる基底ケラチノサイトの分化配列を刺激して、細胞数を増加させることなく制御する。
【０１４５】
ケラチノサイトの数を制御して増加することにより、表皮および真皮−表皮接合点の構造が改良される。表皮の再構築は、最深部層のより良好な保護に寄与する。
【０１４６】
サイトケラチンの合成などの特異的合成の改良により、色素合成が安定化し、ケラチノサイト内のメラニンを生理学的に配分し、濃度の局在化がなくなる。皮膚の保護の向上は皮膚の異常な肥厚化を誘発することなく起こり、同時に真皮−表皮接合点に積層した細胞のシートが深化する。
【０１４７】
攻撃および炎症に対する細胞の応答の改良に寄与する物質、および表皮と真皮との間で生理学的交換を行う連絡因子は、ケラチノサイトによって分泌される一群のメディエーターの中に見いだされる。４〜６週間の表皮の細胞再生は、生理学的リズムに保持される。
【０１４８】
メディエーター合成を増幅すると、一群の細胞すべての加入量が増加し、表皮レベルで組成物Ａによって供給されるデコリンはこれらのメディエーター中に包含される。
【０１４９】
2.7.1) 表皮レベル
ＰＴＨｒｐ合成を活性化することによって、組成物Ａはケラチノサイトの増殖および分化に作用する。この効果はカルシウム依存性であり、従って組成物Ａ中にイオン化したカルシウムが含まれていることが有利である。
【０１５０】
細胞分裂および胚細胞層における有糸分裂指数を誘導すると、表皮が実質的に再構築され、これは一層耐性で且つ深くなり、真皮と継続的に相互作用して、これを脱水から保護する。
【０１５１】
2.7.2) 真皮レベル
表皮で放出された局所メディエーターによって生成される刺激カスケードは、繊維芽細胞による極めて豊富な細胞外マトリックスの合成をひき起す。これは、十分に構築されている。これは、特に、プロテオグリカン、コラーゲン、および接着タンパク質、特にデコリン（皮膚の再構築（または皮膚組織再生）の現象における主要な役割を果たす接着タンパク質）から構成される。これは、サイトカインおよび他の増殖因子を捕捉する。これらの現象は、ラットでイン・ビボでも観察された。
【０１５２】
更に、繊維が結合層において更に良好な配向を示すエラスチンの、組成物Ａの効果の下での増加により、栄養不足および年齢によって、または攻撃、特にストレッチングによってひき起される生理学的分解の際に皮膚組織およびその形状が柔軟に保たれる。
【０１５３】
膨張性繊維芽細胞は、それらの作用および存在による効果が長時間継続するのに十分な数で前駆体幹細胞に補充される。この効果は、微小血管新生の増加によって保持される。
【０１５４】
皮膚はさらに弾力性に富み、且つ堅くなる。これは耐性である。その成分は、持続的リズムで再生される。
【０１５５】
皮膚の様々な種類の細胞に対する組成物Ａの作用は、様々な成分間の生理学的バランスの修復および調節の一つである。更に、これは完全に無害であり、抗炎症作用を有し、従って鎮静作用を有するという利点を有する。
【０１５６】
例３：モイスチャーライジングクリーム
【表５】
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明による方法を用いて調製した組成物のウェスタンブロットを示す図である。
【図２】 本発明による方法を用いて調製した組成物のウェスタンブロットを示す図である。
【図３】 本発明による方法を用いて調製した組成物のタンパク質相の全アミノ酸組成の柱状グラフである。
【図４】 本発明による方法を用いて調製した組成物の、ヒトケラチノサイトによるサイトケラチン合成に対する効果を示す写真である。
【図５】 本発明による方法を用いて調製した組成物の、ヒトケラチノサイトによるサイトケラチン合成に対する効果を示す写真である。
【図６】 本発明によって調製した組成物の、エストラジオールの投与停止を受けた培養物中のヒトケラチノサイトに対する効果を示す写真である。
【図７】 本発明によって調製した組成物の、エストラジオールの投与停止を受けた培養物中のヒトケラチノサイトに対する効果を示す写真である。
【図８】 本発明によって調製した組成物の、エストラジオールの投与停止を受けた培養物中のヒトケラチノサイトによるサイトケラチン合成に対する効果を示す写真である。
【図９】 本発明によって調製した組成物の、エストラジオールの投与停止を受けた培養物中のヒトケラチノサイトによるサイトケラチン合成に対する効果を示す写真である。
【図１０】 本発明によって調製した組成物の、ヒト繊維芽細胞によるエラスチン合成に対する効果を示す写真である。
【図１１】 本発明によって調製した組成物の、ヒト繊維芽細胞によるエラスチン合成に対する効果を示す写真である。
【図１２】 ヒト繊維芽細胞に対するエストロゲンの効果を示す写真である。
【図１３】 ヒト繊維芽細胞に対するエストロゲンの効果を示す写真である。
【図１４】 本発明によって調製した組成物の、エストラジオールの投与停止を受けたヒト繊維芽細胞に対する効果を示す写真である。
【図１５】 本発明によって調製した組成物の、エストラジオールの投与停止を受けたヒト繊維芽細胞に対する効果を示す写真である。
【図１６】 本発明によって調製した組成物の、組成物の存在下で培養したケラチノサイトによって吸収されるメラニンの量の変化によるメラニン細胞に対する効果を示す柱状グラフである。
【図１７】 本発明によって調製した組成物の、培養したヒトケラチノサイトによって吸収されるメラニンの量に対する効果を示す写真である。
【図１８】 本発明によって調製した組成物の、培養したヒトケラチノサイトによって吸収されるメラニンの量に対する効果を示す写真である。
【図１９】 本発明によって調製した組成物の、ＨＬ６０前骨髄細胞によるインターロイキン１（ＩＬ−１）分泌に対する効果を示す柱状グラフである。
【図２０】 本発明によって調製した組成物に細胞毒性がないことを示す柱状グラフである。
本発明は、真珠層（mother-of-pearl）の総ての成分、少なくとも一種類のコラーゲンおよび少なくとも一種類のプロテオグリカンを含んでなる組成物の製造方法、この方法を用いて得ることができる組成物、およびこの組成物の薬学領域および化粧品の領域における、特に皮膚および／または皮膚付属器の加齢の影響と対抗するための使用に関する。
【０００２】
哺乳類は、数層からなっているが体外環境の変化による攻撃に感受性である、高度に構造化された組織である皮膚からなるバリヤーによって、外部環境から保護されている。魚や蛙は粘液を分泌し、トリは羽毛で覆われており、哺乳類以下および哺乳類の脊椎動物は、現代のヒト科動物を除き毛髪で覆われているので、この状況は動物界で独特である。
【０００３】
ヒトはこれらの防御特性を喪失してしまっており、保護する必要があり、且つ刺激により攻撃や加齢に対抗しやすくすることができる皮膚を有する。
【０００４】
特に、加齢は、特に皮膚が薄くなり、弾力性を喪失し、特に多少深い皺を生じる生理学的現象であることが知られている。表面のたるみまたは乾燥、および無秩序な色素沈着も観察される。
【０００５】
皮膚は、表皮、真皮、および深層部である下皮の３層を含んでなる。
【０００６】
皮膚の最外層の保護エンベロープである表皮は真皮をぴったりと覆っており、その表面は角質層からなっている。角質層は、剥離を特徴とする表面の剥離層、およびバリヤーの役割を果たしている最深層である緻密層の２層からなっている。表面にあるので巨視的に観察することが容易な表皮は、多くの研究の主題となってきた。既知の応答は、体外環境のある種の薬剤によって引起されるもの、または多様な起源の活性物質の適用から生じるものである。表皮の細胞は、表皮を真皮と分離している基底膜上にある基底層の細胞の活性から生じる。
【０００７】
真皮は、細胞外マトリックスの成分を産生する繊維芽細胞の生合成活性から生じる。後者は、４種類の主要な巨大分子であるコラーゲン、エラスチン、構造糖タンパク質、およびプロテオグリカンからなっている。真皮は表皮によって与えられたシグナルに応答する能力を有し、真皮はまた応答して表皮にシグナルを送る。一般に、皮膚の様々な真皮層と表皮層との間に交換が存在し、これは細胞を再生し、外層の粘着および加湿を確実に行なうことを目的とするものである。
【０００８】
加齢による影響を防止し、または遅延させるための多くの活性薬剤が提案されてきた。
【０００９】
これらの中で、真珠層は、当初から美的なものや通常の薬物に使用されてきた。更に、真珠層は、その骨再生特性が知られている。
【００１０】
特に、真珠層または貝殻のアラゴナイトは生物起源の無機物化した構成であり、全質量の約１．７〜２％である繊維状および非繊維状物質の有機マトリックス(Taylor et al, Bulletin of the British Museum (Natural history) Zoology. Suppl. 3125pp. + 29 Plates, 1969)、および微量元素（ナトリウム、マグネシウム、ランタン、亜鉛、臭素、セシウム、鉄、マンガン、塩素、銅、カリウム、カルシウム、ストロンチウム、および硫黄）と結合したアラゴナイトと呼ばれる斜方晶系形態で結晶化した炭酸カルシウムからなっていることが知られている。更に詳細には、真珠層の全有機相は、特にヒドロキシプロリンとヒドロキシリシンを欠く祖コラーゲン(ancestral collagens)からなる繊維状タンパク質と非繊維状タンパク質とからなる有機マトリックスの形態である。真珠層の約５０％は水溶性である。残りの５０％は、脱石灰化の後にのみ得ることができる。
【００１１】
しかしながら、例えばＷＯ９７／２３２３１号公報に記載されているように、真珠層粉末を微粉状の不活性希釈剤または賦形剤と混合することによって得られる従来の製品は、粉末状（特に、その主成分であるアラゴナイトまたはＣａＣＯ３）の真珠層の存在により皮膚刺激の望ましくない現象を引起す。従って、これらの製品中の真珠層粉末の含量は、これらの刺激現象を避けるために極めて限定することが肝要である。これらの刺激の望ましくない現象は、特に皮膚と接触しているこれらの既知製品のｐＨが高塩基性であることによって引起される。また、真珠層粉末を基剤とする既知生成物は、特定の処方上の問題、特に安定性（エマルションの破壊）および低い塩基性値へのｐＨの調整の問題を有する。
【００１２】
更に、ＷＯ９７／２４１３３号公報には、真珠層粉末を純水、二回蒸留水、または発熱性物質不含水であって、場合によっては塩を補足したものから選択される水性溶媒と接触させた後、水溶性画分を分離して水性画分、従って、真珠層の水に不溶性の有機相および無機成分を本質的に欠いている画分のみを回収することにより、真珠層から生物活性物質を製造する方法が記載されている。従って、この方法では、特に真珠層の全成分、詳細には真珠層の全有機相を含んでなる組成物を製造することはできない。
【００１３】
極めて驚くべきことであり、且つ予想外なことには、特定の方法を実行することにより、真珠層の総ての成分だけでなく、真珠層の成分と、これらの活性を少なくとも増強することができ、または相乗効果を提供するある種の化合物との有利な組合せを得て、特に皮膚および／または皮膚付属器の加齢に関連する影響を防止し、および／または明らかに減少させることができることが見出された。
【００１４】
従って、本発明の主題は、
a) 真珠層を約１〜約３００μmの粒度の粉末に粉砕し、
b) このようにして得られた真珠層粉末を、少なくとも一種類のコラーゲンもしくは少なくとも一種類のプロテオグリカンまたはそれらの混合物の水−グリコール溶液の形態の抽出剤と密に接触させた後、
c) 密な接触の結果として形成される抽出混合物を回収し、所望の組成物を構成する
ことからなる工程を含んでなる、組成物の製造方法である。
【００１５】
本発明の方法により、組成物を工程b)で得た抽出混合物の形態で得ることができる。
【００１６】
本発明による方法の実施に用いられる真珠層は、真珠貝およびある種の頭足類（例えば、オウムガイ）の殻から得ることができる。特に、これは、Pinctada maximaのようなカキから得られる。
【００１７】
他の多糖類や方解石分に富む殻成分を含まない未加工の真珠層が用いられる。出発材料は好ましくは白色真珠層であり、そうでない場合には、不耐を引起すことがある色素を除去する工程を提供する必要がある。
【００１８】
これは容易に入手できる原料であり、これを用いても天然個体数には負の影響を与えない。実際に、これらのカキまたは他の真珠貝のほとんどは養殖されている。
【００１９】
更に、もう一つの利点は、原料は真珠を産生したカキ殻から得ることができ、具体的には真珠貝は多くとも３個の真珠を連続して産生した後には、優れた品質（Ａ級）の真珠層の厚い層を有するにも拘わらず、生産プールから除かれる。従って、本発明は、真珠養殖後の真珠層を使用するための特別な機会を提供する。
【００２０】
本発明の方法を実施する際に用いられる真珠層粉末の粒度は、篩法および／またはレーザー読みとり法など、当業者の知識の範囲内にある通常の手段で測定した場合に、約１〜約３００μmである。
【００２１】
本発明による方法の特定の態様によれば、真珠層は約５０〜約１００μmの粒度の粉末に粉砕される。
【００２２】
他の具体的態様によれば、真珠層は約１５〜約５０μmの粉末に粉砕され、これにより結晶単位の粒度に近づけることによって収量を向上させることができる（例えば、Pinctada maxima 由来の真珠層の成分単位は、９〜１２μmのアラゴナイトの極めて嵩高い六方晶系の結晶のバイオクリスタルである）。
【００２３】
本発明の方法の工程a)に従って真珠層を粉末に粉砕するためには、特に、以下の操作が実行される。
【００２４】
第一段階では、殻（殻皮層）の外側部分を、粉砕または任意の他の非変性法によって未加工の真珠層から取り除く。
【００２５】
次に、真珠層のシートを押し潰すことによって断片に粉砕し、微粉化ができるようにする。微粉化しようとする断片は、好ましくは長さが約２〜約５cmであり、厚みが約０．３cmである。
【００２６】
第二段階において、断片を微粉化する。
【００２７】
真珠層は、予め浄化することなしに用いることができる。予備浄化を行なう場合には、６．６％活性塩素（１２°）の次亜塩素酸ナトリウムの溶液で、断片を浸漬することなく極めて速やかな浄化洗浄を行う。乾燥を即座に行って、水を完全に除去しなければならない。
【００２８】
粉砕は、この目的にのみ取っておいたジルコニウムジャーで乾燥状態で行い、洗浄（漂白剤を含む水、すすぎの後、蒸留水で洗浄）し、予め加熱滅菌しなければならない。押し潰しは、滅菌したジルコニウムボールで行う。
【００２９】
粉末に粉砕した未加工の真珠層は、二種類の異なる方法：
２．５Mradのγ線照射による滅菌、
１００℃のオートクレーブ中での１〜２時間の加熱滅菌
で滅菌することができる。真珠層は約２５０℃からのみ分解する（無機マトリックスおよび有機マトリックス）（Balmain, Hannoyer and Lopez, 「軟体動物Pinctada maximaの殻由来の真珠層の加熱の際の無機および有機マトリックスのフーリエ変換赤外分光分析法（ＦＴＩＲ）およびＸ線回折分析(Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) and X-ray diffraction analyses of mineral and organic matrix during heating of Mother of Pearl (nacre) from the shell of the mollusc Pinctada Maxima)」, J. Biomed. Mater. Res. (Appl. Biomater.), vol. 48(5): 749-754, 1999)。従って、この滅菌は、真珠層の様々な成分を破壊しない。
【００３０】
本発明による方法の工程b)は、上記の真珠層粉末を、少なくとも一種類のコラーゲン、少なくとも一種類のプロテオグリカン、またはそれらの混合物の水−グリコール溶液の形態の抽出剤と密に接触させることからなる。
【００３１】
本発明によれば、「水−グリコール溶液」という用語は、水−グリコール溶媒、すなわち一般に水と少なくとも一種類のグリコールとの混合物の形態の溶媒を用いて得られるコラーゲンおよびプロテオグリカンの溶液を意味するものである。
【００３２】
「グリコール」という用語は、既知のように、２個のアルコール官能基を有する任意の化合物を意味するものである。特に、用いることができるグリコールは、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、およびそれらの混合物からなる群から選択される。
【００３３】
水−グリコール溶媒を形成するのに用いることができる水は、純水、二回蒸留水、発熱性物質不含水、または脱無機物水あるいは脱イオン水であることができる。
【００３４】
水−グリコール溶媒の水：グリコールの重量比は、好ましくは約１：１００〜約１００：１であり、更に特定的には約１：１〜約２０：１である。
【００３５】
抽出剤は、好ましくは少なくとも一種類のコラーゲンの水−グリコール溶液である。
【００３６】
本発明による抽出剤において水−グリコール溶液中で用いることができるコラーゲンは、動物界で入手可能な、当業者に知られている結合組織の細胞内物質を構成する任意のコラーゲンであることができる。
【００３７】
最も特定的には、海洋性コラーゲン、すなわち海洋性脊椎動物などの海洋起源の生物に由来するコラーゲンを用いるのが好ましい。特に、海洋性コラーゲンは魚類の結合組織の主要成分であり、皮膚、筋肉、腱および靱帯の構造において本質的な役割を果たしている。
【００３８】
更に特定的には、Gattefosse社（セントプリースト、フランス）から発売されており、ＩＮＣＩ名称が「Soluble Collagen」（日本では「水溶性コラーゲン」と呼ばれている；ＭＨＶ：２０８００ＣＺＹ００１００００）である海洋性コラーゲン「PANCOGENE(登録商標)MARIN」が挙げられる。これは、Teleostei 綱に属する暖流魚の未保護種の皮膚から抽出されたコラーゲンである。
【００３９】
Laboratoire Industriel de Biologie社（Soisy Sous Montmorency, フランス）から発売されており、ＣＴＦＡ名称が「Amino Collagen Amino Acid」である海洋性コラーゲン「COLLAGENE NATIF MARIN − Code 690」も挙げられる。これは、魚の皮膚から抽出された水溶性の酸性コラーゲンである。
【００４０】
好ましくは、抽出剤の総重量に対して約０．０００１〜約５０重量％、更に好ましくは約０．０１〜約１５重量％のコラーゲン濃度が用いられる。
【００４１】
抽出剤は、好ましくは少なくとも一種類のプロテオグリカンの水−グリコール溶液でもある。
【００４２】
本発明による抽出剤において水−グリコール溶液中で用いることができるプロテオグリカンは、当業者に知られている任意のプロテオグリカン、特に硫黄を含まない任意のプロテオグリカンであることができる。
【００４３】
特に、プロテオグリカンは、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、硫酸ヘパリン、ケラタン硫酸、およびそれらの混合物からなる群から選択される。
【００４４】
ヒアルロン酸が最も好ましく、例えば、Laboratoire Industriel de Biologie社（Soisy Sous Montmorency, フランス）から発売されているものが挙げられる。
【００４５】
好ましくは、抽出剤の総重量に対して約０．０００１〜約４０重量％、更に好ましくは約０．０１〜約１０重量％のプロテオグリカン濃度が用いられる。
【００４６】
当然のことであるが、抽出剤は、当業者に知られており、抽出工程自体に適した、または以下に記載するような本発明の方法によって調製される組成物の可能な用途を考慮すれば適当である任意の追加の化合物を含んでなることもできる。従って、抽出剤は、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）のような錯体形成剤を含んでなることもできる。
【００４７】
本発明の特に好ましい態様によれば、真珠層粉末と抽出剤とからなる混合物を調製し、総重量に対して約２０〜約６０重量％の工程a)で得られた上記真珠層粉末と上記のように残りの上記抽出剤を含んでなるようにすることによって、工程b)に従って真珠層粉末を抽出剤と密に接触させる。
【００４８】
真珠層粉末は、本発明の方法の工程b)に従って、特に真珠層粉末を抽出剤に激しく且つ均質な機械攪拌を行いながら懸濁させ、真珠層粒子の抽出コーティングを行うことによって抽出剤と密に接触させることができる。
【００４９】
この操作は、例えば、周囲温度、すなわち約２０℃の温度で約１時間行うことができるが、当業者であれば時間および温度を特に真珠層粉末の当初の粒度によって調整することができる。
【００５０】
他の態様によれば、接触を行う工程b)は、固定されている真珠層粉末中に抽出剤を加圧下で通過させることによって行うことができる。この固定は、例えばＨＰＬＣ型のカラムを用いて、場合によっては抽出剤をさらに良好に拡散させ且つ真珠層粉末の圧縮を回避するための充填剤と混合して行うことができる。
【００５１】
いずれか特定の理論に結びつけようとするものではないが、抽出剤にコラーゲンおよびプロテオグリカン、特に海洋性コラーゲンおよびヒアルロン酸が含まれていると、親和性の物理化学的現象により真珠層に含まれる関連化合物の抽出が促進され、更に真珠層から抽出される成分の効果が増強されると思われる。特に、真珠層からの祖コラーゲンの抽出は海洋性コラーゲンの存在によって促進され、接着タンパク質（デコリンおよびサイトカイン）およびプロテオグリカンの真珠層からの抽出は、選択されたプロテオグリカンの存在によって促進されると思われる。
【００５２】
密な接触は、それがどうあろうと、所定温度に対して、好ましくは実質的に完全な抽出を行うのに十分な時間行われる。本発明によれば、「実質的に完全な抽出」という用語は、抽出剤と接触させたときに真珠層から総ての抽出可能な成分が抽出されることを意味するものである。
【００５３】
換言すれば、特に水−グリコール液相中のコラーゲンまたはプロテオグリカンの総濃度についての平衡の生成は、上記の「実質的に完全な抽出」の達成に相当する。
【００５４】
従って、例えば水−グリコール液相中のこれらの総コラーゲンまたはプロテオグリカン濃度を規則的に測定することによって、このような抽出の「実質的に完全な」性質を決定することは、当業者の知識の範囲内にある。
【００５５】
接触を行う工程は、それがどんなものであれ、工程が終了する前の、真珠層粉末を抽出剤に懸濁したものを放置する（攪拌なし）時間を含んでなることができる。
【００５６】
接触を行うための工程b)が終了したならば、密な接触を行った結果として形成され、所望の組成物を含んでなる抽出混合物を回収する。
【００５７】
この水−グリコール懸濁液の形態の組成物は、そのまま使用まで保管することができる。後の実施（保管、輸送、製剤化など）の実用上の理由で、この組成物の液相を固相から分離することもできる。
【００５８】
従って、一つの変法によれば、本発明の方法は、工程b)の終了時に、密な接触の結果として形成された、所望の組成物を含んでなる抽出混合物を回収し、限外濾過手段、接線濾過手段(tangential filtration means)などの当業者に知られている手段によって組成物の液相を固相から分離することを特徴とする。
【００５９】
このようにして分離された固相および液相はともに、上記のようにして調製される組成物を構成する。従って、薬学上または化粧品として適当な賦形剤と共に用いる以後の製剤化において、この組成物を、製剤化の任意の工程においてそれぞれの固相および液相を製剤化の便宜上の理由から同時にまたは経時的に別々に添加することによって再構成することができると考えられる。上記のように、本発明の主題は、上記の分離工程の終了時に得られる液相でもあると理解される。同様に、本発明の主題は、上記の分離工程の終了時に得られる固相でもある。
【００６０】
本発明の主題は、上記の方法（固相および液相を含んでなり、上記のような分離工程を有するまたは有しない）を用いて得ることができる新規組成物でもある。
【００６１】
特に、この組成物は、少なくとも
アラゴナイト（ＣａＣＯ３）、
ナトリウム、マグネシウム、ランタン、亜鉛、臭素、セシウム、鉄、マンガン、塩素、銅、カリウム、カルシウム、ストロンチウム、硫黄、およびそれらの混合物からなる群から選択される微量元素、
真珠層由来の繊維状タンパク質、特に抽出剤の海洋性コラーゲンに関連する宇真珠層由来の祖コラーゲン（下記の図１を参照）、
真珠層由来の非繊維状タンパク質、特に接着タンパク質に関連するデコリンなどのタンパク質（下記の図２を参照）、ならびに、
真珠層に由来しない少なくとも一種類のコラーゲン、および／または真珠層に由来しない少なくとも一種類のプロテオグリカン
を、液相と固相の水−グリコール懸濁液の形態で含んでなる。
【００６２】
当然のことであるが、本発明によれば、「真珠層に由来しないコラーゲン」および「真珠層に由来しないプロテオグリカン」という表現は、それぞれ本発明の方法の工程b)の抽出剤について用いられるコラーゲンおよびプロテオグリカンを意味するものと理解される。同様に、「水−グリコール懸濁液」という表現は、本発明による組成物が（水−グリコール溶液中に）可溶性成分だけでなく不溶性成分（特に、アラゴナイト）も含んでなるという事実によって説明される。
【００６３】
更に、本発明の方法について上記した好ましい条件がこの組成物に当てはまることは当然である。
【００６４】
従って、特に本発明による組成物中の真珠層に由来しないコラーゲンは、好ましくは海洋性コラーゲンであり、更に特定的には「PANCOGENE(登録商標)MARIN」、「COLLAGENE NATIF MARIN - Code 690」、およびそれらの混合物からなる群から選択される海洋性コラーゲンである。同様に、真珠層に由来しないプロテオグリカンは当業者に知られている任意のプロテオグリカン、特に硫黄を含まない任意のプロテオグリカンであることができ、特にヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、硫酸ヘパリン、ケラタン硫酸、およびそれらの混合物からなる群から選択され、更に特定的にはヒアルロン酸である。
【００６５】
下記の例に更に詳細に示されるように、本発明の組成物は、皮膚および／または皮膚付属器に関して極めて有利な特性、特に例えば創傷の治癒を向上させることができる組織再生特性、および皮膚および／または皮膚付属器の加齢に対する影響を防止しおよび／または明らかに減少させることができる抗加齢特性を有する。皮膚の様々な細胞の種類に対するその作用は、修復および様々な成分間の生理学的バランスの調節の作用である。更に具体的には、その有機成分および無機成分は、数種類の濃度でケラチノサイト代謝に作用する。この組成物は表皮を再構築し、極めて深い層をさらに良好に保護するのに寄与することができる。表皮はさらに抵抗力が付き且つ厚くなり、真皮と継続的に相互作用する。更に、この組成物は、エラスチンおよびコラーゲンを多く含むことができる。皮膚は更に弾力性に富み、堅くなる。これは耐性であり、その成分は持続したリズムで再生される。更に、この組成物は色素の合成を安定化し、微小循環を促進する。最後に、この組成物は全く無害であり、且つ抗炎症作用、従って鎮静作用を有するという利点を有する。
【００６６】
従って、本発明の主題は、活性成分として本発明の方法を用いて得ることができる上記の新規組成物と、薬学上許容可能な賦形剤を含んでなる、医薬組成物でもある。
【００６７】
薬学上許容可能な賦形剤は、好ましくは皮膚科用に塗布するのに適する賦形剤である。
【００６８】
本発明の主題は、上記の方法を用いて得ることができる上記のこの新規組成物の、皮膚および／または皮膚付属器の組織再生疾患の治療を目的とする医薬製品を製造するための使用でもある。
【００６９】
更に、本発明の主題は、上記の方法を用いて得ることができる上記の新規組成物の、加齢に関連した皮膚および／または皮膚付属器の疾患の治療を目的とする医薬製品を製造するための使用である。
【００７０】
最後に、本発明の主題は、上記の方法を用いて得ることができる上記の新規組成物の、炎症性皮膚症状の治療を目的とする医薬製品を製造するための使用である。
【００７１】
本発明の主題は、化粧活性成分として本発明による方法を用いて得ることができる上記の新規組成物を含んでなり、さらに、化粧品として許容可能な賦形剤を含んでなる化粧用組成物でもある。
【００７２】
当業者に知られている任意の化粧用賦形剤を用いることができる。
【００７３】
当然のことであるが、本発明による化粧用組成物は、モイスチャーライザー、柔軟剤、または化学的または有機スクリーニング剤などの当業者に知られている化粧品用の成分を含むこともできる。
【００７４】
上記の医薬組成物および化粧用組成物は、特にクリーム、軟膏、ゲル、ローション、水中油型エマルションまたは油中水型エマルションの形態であることができ、またはリポソームなどの薬学上または化粧品として許容可能なベクターと組合わせることができる。
【００７５】
更に、本発明の主題は、本発明の方法を用いて得ることができる上記の新規組成物の、皮膚および／または皮膚付属器の組織再生のための化粧処置を目的とする化粧用組成物を製造するための使用である。
【００７６】
更に、本発明の主題は、本発明の方法を用いて得ることができる上記の新規組成物の、皮膚および／または皮膚付属器の加齢に関連した変化の化粧処置を目的とする化粧用組成物を製造するための使用である。
【００７７】
最後に、本発明の主題は、本発明の方法を用いて得ることができる上記の新規組成物を皮膚および／または皮膚付属器に適用することを特徴とする、皮膚および／または皮膚付属器の組織再生のための化粧処置の方法である。
【００７８】
更に、本発明の主題は、本発明の方法を用いて得ることができる上記の新規組成物を皮膚および／または皮膚付属器に適用することを特徴とする、皮膚および／または皮膚付属器の加齢に関連した変化の化粧処置の方法である。
【００７９】
下記の例は本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲を制限するものと解釈すべきではない。
【００８０】
例１：本発明による組成物の製造方法
用いる器具は真空下で完全に気密性の種類の器具であり、好ましくはステンレススチール製であるべきである。これを前もって洗浄して清浄に濯ぎ、細菌による汚染の危険性を完全に除くようにすべきである。
【００８１】
1.1) Pinctada maxima由来の真珠層であって、殻の外側部分（殻皮層）が既に除かれており且つ既に不規則な断片にされているものを用いる（Pharma Futura社, 10, rue de Charonne, 75012, パリ、により供給)。断片のサイズは、長さが２〜５cmであり、厚みが０．３cmである。
【００８２】
この断片を、浸漬することなく６．６％活性塩素（１２°）の次亜塩素酸ナトリウムの溶液で極めて速やかな浄化洗浄を行った後、即座に乾燥して水を完全に除去する。
【００８３】
微粉化のための粉砕は、この目的にのみ取っておいたジルコニウムジャーで乾燥状態で行い、洗浄（漂白剤を含む水＋すすぎ＋蒸留水で洗浄）し、予め加熱滅菌しなければならない。粉砕は、それ自体滅菌されているジルコニウムボールを用いて行う。
【００８４】
このようにして得られる微粉化真珠層の粒度は、５０〜１５０μmである。次に、これを２．５Mradのγ線照射によって滅菌する。
【００８５】
このようにして調製した微粉化真珠層は、下記の特性：
− 外観 微粉
− 色 白色
− 臭気 真珠層に特徴的
− 砒素 ＜１ppm
− 重金属 ＜１０ppm
を有する。
【００８６】
細菌学的分析
− 好気性微生物の数 １５５０／g
− 湿度 ０．３％
【００８７】
1.2) 下記の混合物を調製する：上記のようにして微粉化したPinctada Maxima真珠層粉末（粒度５０〜１５０μm）４００gを、抽出剤の総重量に対して海洋性コラーゲン「PANCOGENE(登録商標)MARIN」（Gattefosse社、セントプリースト、フランスから発売；ＩＮＣＩ名称「可溶性コラーゲン」（日本では「水溶性コラーゲン」と呼ばれている；ＭＨＶ：２０８００ＣＺＹ００１００００）０．１８重量％と、ヒアルロン酸（Laboratoire Industriel de Biologie社, Soisy Sous Montmorency,フランスから発売）０．２重量％を含んでなる水−グリコール溶液（水およびエチレングリコールは、それぞれ１０：１の重量比）６００mlに約４０００rpmで攪拌しながら約２０℃の温度で徐々に加える。これを加えたら、攪拌および温度を６０分間保持する。攪拌は激しく且つ均質であり、混合物の総ての粒子が接触し、抽出コーティングできるようにしなければならない。
【００８８】
次に、混合物を６時間静置する。
【００８９】
このようにして得られた組成物は、灰白色の粒状固相を液相に懸濁したものから構成され、ｐＨは約８である。
【００９０】
この組成物は、
アラゴナイト（ＣａＣＯ３）、
海洋性微量元素：ナトリウム、マグネシウム、ランタン、亜鉛、臭素、セシウム、鉄、マンガン、塩素、銅、カリウム、カルシウム、ストロンチウム、および硫黄（下記表１を参照）、
繊維状タンパク質：海洋性コラーゲンに関連する様々な種類のタンパク質であって、真珠層由来の祖コラーゲンと考えることができるもの、および海洋性コラーゲンPANCOGENE(登録商標)MARIN（下記の図１を参照）、
非繊維状タンパク質：真珠層および抽出剤由来のヒアルロン酸などのプロテオグリカン、および真珠層由来の接着タンパク質（デコリンｒｐおよびサイトカインｒｐ；ｒｐは「関連ペプチドまたはタンパク質」、すなわち後者の分子に対する抗体によって認識される限り、それぞれデコリンおよびサイトカインに関連したペプチドまたはタンパク質を意味する）
を含んでなる。
【００９１】
本発明に関するペプチドおよびタンパク質の同定に用いられる手法は、下記の文献に記載されているものである：
電気泳動−ＳＤＳ−Ｐａｇｅ法: Laenli法, Nature 1970, 227 680-682、
イムノトランスファー: Towbin H. et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76(9): 4350-4354、およびBurnette W.N. 1981, Analytical Biochemistry 112: 195-203によるウェスタンブロット法。
【００９２】
相当するウェスタンブロット法を、図１および図２に示す。
【００９３】
タンパク質相のアミノ酸分析は、アスパラギン酸、トレオニン、セリン、グルタミン酸、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、リシン、およびアルギニンの存在を示唆している。図３に、全アミノ酸組成の柱状グラフを示す。
【００９４】
上記のようにして得られた組成物を、以後「組成物Ａ」と呼ぶ。
【００９５】
【表１】
例２：組成物Ａの活性の研究
顕微鏡法および最新の手法を活用して免疫学的方法および免疫細胞化学的方法により物質を検出するためのイン・ビボ動物モデルまたはヒト細胞培養物を用いる組織学的および細胞学的科学的研究により、現在では細胞スケールで研究を行うことができ、このような研究をこの組成物Ａの活性物質を研究するために行った。
【００９７】
この研究は、皮膚組織の構造、機能および色素形成において重要な役割を果たしていることが知られているものとして、本質的に三種類の細胞であるケラチノサイト、繊維芽細胞およびメラニン細胞に関して行なった。ケラチノサイトおよび繊維芽細胞の細胞型はいずれも、組成物Ａの活性物質および特に真珠層に含まれている真珠層の総ての成分に特異的な受容体を有しており、真皮の最深部の層のレベルに到達することができるメッセージのカスケードに移行する。
【００９８】
この研究は、その形態学的外観のみならず、それらの主成分である核および細胞質の挙動にまで及ぶものであり、それらの合成活性およびそれらの再生能力をも調べた。ある種の活性物質の存在および分泌された構造タンパク質の存在も同定した。
【００９９】
1.1) 組成物Ａのケラチノサイトに対する活性: 組成物Ａの存在下で培養したヒトケラチノサイトによるサイトケラチンの合成
1.1.1) 方法
ケラチノサイトは、身体の最外層細胞である。それらは、身体の第一の防御バリヤーを構成する。ケラチノサイトは、受動的および能動的に作用することによって介入する。それらは、シールドの役割を果たすバリヤーを構成することによって受動防御を生成する。このシールドは、完全に乾燥しており且つ無核の細胞からなっている。これらの細胞の強力な粘着性により、極めて均質な系を提供することができる。ケラチノサイトは、それらが細胞質に保持していてこのバリヤー構造を生じる物質であるサイトケラチンを合成する。サイトケラチンは、ケラチノサイトの内部骨格を構成する。この内部骨格によりこれらの細胞の容積が決まり、細胞内連絡能が増加し、メラニン吸収が促進される。表皮中のサイトケラチン量が増加すれば、表皮は一層効果的になり且つ皮膚に一層若い外観を与えるようになる。細胞間の接触を促進することによって、サイトケラチンはＮＭＳ（天然加湿因子、例えばセラミド、コレステロールまたは脂肪酸）の喪失を防止する。
【０１００】
皮膚の積極的防御は、ケラチノサイトが外部と接触する身体の最初の細胞であるという事実に関係している。従って、それらは人体環境の条件における可能な変化を人体に報告するための一連の成分を発達させている。これを行うために、これらの細胞は真皮の下にある細胞（繊維芽細胞）を刺激するための増殖因子、特に、主としてケラチノサイトによって合成され、細胞分化因子であることが知られているＰＴＨ関連ペプチド（ＰＴＨｒｐ）を合成することができる。
【０１０１】
用いた方法は下記の通りである。この方法は、細胞質に含まれる分泌タンパク質のそれぞれの濃度を評価することができる迅速半定量法を含む。
【０１０２】
０．９cm２のチャンバー当たり４×１０４個の細胞を播種し（８−チャンバースライド, NUNC）、一晩培養する。ＨＢＳＳ緩衝液で洗浄した後、組成物Ａを１％含む培地または対照培地（組成物Ａを０％含む）を加える（４５０μl／チャンバー）。
【０１０３】
培養物を４８時間インキュベーションする。上清を取り除き、培養物を洗浄した後、細胞をパラホルムアルデヒドで４℃で３０分間固定し、次いでＰＢＳ緩衝液で洗浄する。
【０１０４】
抗サイトケラチン一次抗体２００μlを加える。インキュベーションを、室温で３０分間継続する。次に、上清を除き、細胞をＰＢＳで洗浄する。
【０１０５】
一次抗体を認識し且つ蛍光マーカー（この場合には、フルオレセイン）に結合する二次抗体２００μlを加える。室温で３０分間インキュベーションした後、上清を除き、細胞をＰＢＳで洗浄する。次に、スライドを設置し、倒立蛍光顕微鏡下で検討を行う（免疫蛍光による細胞質内のサイトケラチンの検出）。
【０１０６】
細胞によって合成され、標識したタンパク質（この場合には、サイトケラチン）の量は、免疫標識から生じる蛍光の強度に比例する。
【０１０７】
1.1.2) 結果
図４および図５に示されるように、ケラチノサイト培地に組成物Ａを０．５％添加すると、サイトケラチン合成を増加する効果が見られる。組成物Ａは、古い皮膚からケラチノサイトの活性およびこれらのケラチノサイトによるサイトケラチンの分泌を回復させる（エストラジオールの投与中止を受けたケラチノサイトに対する作用；図６、７、および８、９を参照）。
【０１０８】
更に、ケラチノサイトによるカルシウム依存性ＰＴＨｒｐ合成は、組成物Ａの存在下で刺激される。主にケラチノサイトによって合成されるＰＴＨｒｐは、組成物Ａによって供給されるカルシウムイオンの存在下で特に活性であり、組成物Ａに含まれる真珠層の完全な有機マトリックスのサイトカインと相乗的に作用する。
【０１０９】
皮膚再生における主要な接着タンパク質であるデコリンも、組成物Ａの存在下で刺激される。
【０１１０】
カルシウム依存性接着タンパク質であるカドヘリンも、粘着性に大きく関与している。それらは、組成物Ａの存在下で刺激される。
【０１１１】
1.2) 繊維芽細胞に対する組成物Ａの活性、エラスチン合成
1.2.1) 組成物Ａの存在下で培養したヒト繊維芽細胞によるエラスチン合成
用いる方法は、ケラチノサイトの研究について上記の1.1.1)節で記載したのと同じである。
【０１１２】
図１０および図１１から明らかなように、組成物Ａは１％の濃度でヒト繊維芽細胞によるエラスチン合成を強力に刺激する。
【０１１３】
1.2.2) 培養におけるヒト繊維芽細胞に対するエストロゲンとBiocrystal maxima m.の効果の比較（図１２、１３、１４および１５）
比較的不活性な成熟繊維芽細胞は形状が極めて細長く且つ濃密な核を有する。活性な繊維芽細胞は大きさが大きく且つ丸まっている核を有し、核小体は嵩張っており、合成の活性な工程を反映している。「活性な繊維芽細胞」型は、ホルモン置換療法を行っている５０歳の婦人から採取した皮膚外植片の培養で観察される。
【０１１４】
培地にエストロゲンが欠乏すると、細胞の劇的な不活性化が引起される。それらは最早接着性でも集密的でもなくなり、幾つかは核萎縮の開始を示す。
【０１１５】
図１２および図１４は、置換療法を行っている５０歳の閉経した（従って、エストロゲン分泌の減少した）婦人からの外植片由来のヒト繊維芽細胞に対する組成物Ａの効果を示す。
【０１１６】
図１３および図１５は、置換療法を行っている５０歳の閉経婦人からの外植片由来のエストラジオール投与停止を受けたヒト繊維芽細胞に対する組成物Ａの効果を示す。
【０１１７】
図１２〜１５から明らかなように、培地に１％の濃度で添加された組成物Ａは、投与停止を受けた繊維芽細胞の活性を完全に回復させる。組成物Ａの作用は顕著であり、繊維芽細胞は良好に発育した極めて明瞭な核を有し、核小体は顕著である。それらの紡錘状の細胞本体は同一方向に並んでおり且つ集密的であり、細胞交換ができる。若い皮膚の外植片由来の細胞に作用するときには、同様な結果が得られた。
【０１１８】
1.3) メラニン細胞に対する組成物Ａの活性：組成物Ａの存在下で培養したケラチノサイトによって吸収されるメラニン量の変化
1.3.1) 方法
メラニン細胞はメラニン合成に関与する色素細胞であり、メラニンは皮膚の着色を引起す色素である。メラニン細胞は、総表皮個体数の約２〜４％である。皮膚の均質な色は、メラニンがメラノソームの形態で分泌細胞（メラニン細胞）からそれを吸収する隣接ケラチノサイトへ移行することによる皮膚の全表面にわたり色素が分布することによる。
【０１１９】
この方法は、ケラチノサイト／メラニン細胞同時培養物を調製し、メラニンを分析することからなる。
【０１２０】
ケラチノサイトとメラニン細胞は、いずれも表皮に見いだされる細胞個体群である。それらは、真皮を除去して表皮を酵素消化した後の皮膚試料から得られる。このようにして単離される表皮細胞をCoulter Counter (Coultronics)で計数した後、グルタミン、ストレプトマイシン／ペニシリン、および１０％ウシ胎児血清を補足した改良Dulbeco型の通常の培地（イーグル培地）で培養する。割合は、得られる結果に応じて調節する。この培地では、メラニン細胞およびケラチノサイトが生存することができる。
【０１２１】
組成物Ａの存在下で４日間インキュベーションした後、細胞をＮａＯＨ／ＤＭＳＯ混合物で消化し、次に遠心分離の後に、上清を回収する。読みとりは４７０nmで行う。
【０１２２】
1.3.2) 結果
結果を下記表２に示し、図１６では柱状グラフによって表す。
【０１２３】
【表２】
組成物Ａが１％含まれていると、ケラチノサイトによって吸収されるメラニンの分布に有意な変化が引起され、濃度の局在化が回避される（図１７および１８参照）。
【０１２５】
1.4) ケラチノサイトおよび繊維芽細胞の組成物Ａによる刺激の免疫細胞化学的実証
1.4.1) 方法
これは、細胞質に含まれるタンパク質（サイトケラチンおよびエラスチン）のそれぞれの濃度を評価することができる迅速半定量法である。０．９cm２のチャンバー当たり４×１０４個の細胞を播種し（８−チャンバースライド, NUNC）、一晩培養する。ＨＢＳＳ緩衝液で洗浄した後、組成物Ａを１％含む培地または対照培地（組成物Ａを０％含む）を加える（４５０μl／チャンバー）。培養物を４８時間インキュベーションする。上清を除き、培養物を洗浄した後、細胞をパラホルムアルデヒドで４℃で３０分間固定し、次いでＰＢＳ緩衝液で洗浄する。抗サイトケラチンおよび／または抗エラスチン抗体２００μlを加える。インキュベーションを、室温で３０分間継続する。次に、上清を除き、細胞をＰＢＳで洗浄する。フルオレセインに接合した第二の抗体２００μlを加える。室温で３０分間インキュベーションした後、上清を除き、細胞をＰＢＳで洗浄する。次に、スライドを設置し、倒立蛍光顕微鏡下で検討を行う。細胞によって合成されたエラスチンまたはサイトケラチンの量は、蛍光の強度に比例する。
【０１２６】
1.4.2) 結果
ケラチノサイト培地に組成物Ａを1％添加すると、表皮のケラチノサイト細胞によるサイトケラチン合成を増加する効果が見られる。この刺激は、０．５％の組成物Ａにおいて多量に観察される。
【０１２７】
繊維芽細胞を組成物Ａ（１％）の存在下でイン・ビトロでインキュベーションすると、４８時間後に蛍光の強度の極めて顕著な増加が観察され、真皮の繊維芽細胞によるエラスチン合成の刺激を反映している。
【０１２８】
1.5) 組成物Ａの抗炎症活性：組成物Ａで処理したＨＬ６０前骨髄細胞によって分泌されるインターロイキン１（Ｉ１−１）の分析
炎症過程中に、多数の炎症細胞の末梢血から炎症部位への移行が最初に観察された後、これらの部位におけるある種のサイトカイン、特にＩＬ−１のかなりの分泌が観察される。後者は、主要な役割を有すると考えられる。
【０１２９】
この研究では、組成物Ａの存在下で細胞系ＨＬ−６０を用いて、ＩＬ−１分泌を測定する。
【０１３０】
ＩＬ−１の産生は、ＩＬ−１分泌の強力な刺激因子であるフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）を培地に添加することによって増幅される。ＩＬ−１を、ヒトＩＬ−１に対する特異抗体を用いるＥＬＩＳＡによるイムノアッセイの通常の手法によって定量する。
【０１３１】
1.5.2) 結果
結果を下記表３に示し、図１９では柱状グラフによって表す。
【０１３２】
【表３】
従って、組成物Ａが１％の存在下では、ＩＬ−１合成の有意な減少が見られ、組成物Ａの極めて顕著な抗炎症効果を反映している。移植をラットでイン・ビボで行なったときにも、このイン・ビトロでの効果が見られた。
【０１３４】
1.6) 毒性試験：組成物Ａの非細胞毒性の実証：ミトコンドリア活性のＭＴＴ試験
1.6.1) 方法
これは、生細胞のミトコンドリアＮＡＤＰＨレダクターゼによるテトラゾリウム塩（ＭＴＴ）の青−紫色ホルマザン生成物への還元に基づく比色試験である。
【０１３５】
培地２００μl中２×１０４個の細胞をそれぞれのウェルに播種した後（９６穴プレート，NUNC）、一晩インキュベーションしてプラスチックに適正に接着させる。細胞を無血清培地で洗浄した後、様々な濃度を含む培地（組成物Ａを１％、０．５％および０．１％）または対照培地（組成物Ａを０％）を２００μl／ウェルで加える。
【０１３６】
４８時間インキュベーションした後、上清を除き、細胞をＨＢＳＳ緩衝液で洗浄する。ＭＴＴ（臭化＝３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニル−テトラゾリウム；「チアゾリルブルー」）の２０％溶液を含む培地１００μlをそれぞれのウェルに加える。反応は、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーター中で２時間行う。
【０１３７】
０．０４ＮのＨＣｌ／イソプロパノールを１００μl加えて、ホルマザン結晶を良好に可溶化させた後、発色反応をマイクロプレートリーダーを用いて５７０nmの波長で読み取る。値は、光学濃度としても表される。
【０１３８】
1.6.2) 結果
結果を表４に示し、図２０では柱状グラフとして表す。
【０１３９】
【表４】
従って、培地中に組成物Ａが含まれると、細胞のミトコンドリア活性が大きく増加する。この酵素活性の刺激は用量依存性であり、組成物Ａの濃度が高くなれば、活性は高くなる。しかしながら、培地中の組成物Ａの含量がどの程度であっても、細胞のミトコンドリア活性は組成物Ａで処理されていない対照細胞の活性と比較して著しく優れている。
【０１４１】
2.7) イン・ビトロで評価した組成物Ａの活性に関する結論
組成物Ａは、表皮の最表面層に直接作用する。
【０１４２】
この抽出物の有機成分および無機成分は、基底層の細胞の活性に作用することにより、ケラチノサイト代謝においていくつかのレベルで発現する。
【０１４３】
まず最初に、細胞増殖、分裂および分化を刺激した後、ケラチノサイトによる特異的合成、特にサイトケラチン、および真皮を正確に機能させるためのメディエーター、例えばＰＴＨｒｐの合成が増幅され、細胞間連絡カスケードを促進する。
【０１４４】
星形であり、次いで顆粒状となる基底ケラチノサイトの分化配列を刺激して、細胞数を増加させることなく制御する。
【０１４５】
ケラチノサイトの数を制御して増加することにより、表皮および真皮−表皮接合点の構造が改良される。表皮の再構築は、最深部層のより良好な保護に寄与する。
【０１４６】
サイトケラチンの合成などの特異的合成の改良により、色素合成が安定化し、ケラチノサイト内のメラニンを生理学的に配分し、濃度の局在化がなくなる。皮膚の保護の向上は皮膚の異常な肥厚化を誘発することなく起こり、同時に真皮−表皮接合点に積層した細胞のシートが深化する。
【０１４７】
攻撃および炎症に対する細胞の応答の改良に寄与する物質、および表皮と真皮との間で生理学的交換を行う連絡因子は、ケラチノサイトによって分泌される一群のメディエーターの中に見いだされる。４〜６週間の表皮の細胞再生は、生理学的リズムに保持される。
【０１４８】
メディエーター合成を増幅すると、一群の細胞すべての加入量が増加し、表皮レベルで組成物Ａによって供給されるデコリンはこれらのメディエーター中に包含される。
【０１４９】
2.7.1) 表皮レベル
ＰＴＨｒｐ合成を活性化することによって、組成物Ａはケラチノサイトの増殖および分化に作用する。この効果はカルシウム依存性であり、従って組成物Ａ中にイオン化したカルシウムが含まれていることが有利である。
【０１５０】
細胞分裂および胚細胞層における有糸分裂指数を誘導すると、表皮が実質的に再構築され、これは一層耐性で且つ深くなり、真皮と継続的に相互作用して、これを脱水から保護する。
【０１５１】
2.7.2) 真皮レベル
表皮で放出された局所メディエーターによって生成される刺激カスケードは、繊維芽細胞による極めて豊富な細胞外マトリックスの合成をひき起す。これは、十分に構築されている。これは、特に、プロテオグリカン、コラーゲン、および接着タンパク質、特にデコリン（皮膚の再構築（または皮膚組織再生）の現象における主要な役割を果たす接着タンパク質）から構成される。これは、サイトカインおよび他の増殖因子を捕捉する。これらの現象は、ラットでイン・ビボでも観察された。
【０１５２】
更に、繊維が結合層において更に良好な配向を示すエラスチンの、組成物Ａの効果の下での増加により、栄養不足および年齢によって、または攻撃、特にストレッチングによってひき起される生理学的分解の際に皮膚組織およびその形状が柔軟に保たれる。
【０１５３】
膨張性繊維芽細胞は、それらの作用および存在による効果が長時間継続するのに十分な数で前駆体幹細胞に補充される。この効果は、微小血管新生の増加によって保持される。
【０１５４】
皮膚はさらに弾力性に富み、且つ堅くなる。これは耐性である。その成分は、持続的リズムで再生される。
【０１５５】
皮膚の様々な種類の細胞に対する組成物Ａの作用は、様々な成分間の生理学的バランスの修復および調節の一つである。更に、これは完全に無害であり、抗炎症作用を有し、従って鎮静作用を有するという利点を有する。
【０１５６】
例３：モイスチャーライジングクリーム
【表５】
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明による方法を用いて調製した組成物のウェスタンブロットを示す図である。
【図２】 本発明による方法を用いて調製した組成物のウェスタンブロットを示す図である。
【図３】 本発明による方法を用いて調製した組成物のタンパク質相の全アミノ酸組成の柱状グラフである。
【図４】 本発明による方法を用いて調製した組成物の、ヒトケラチノサイトによるサイトケラチン合成に対する効果を示す写真である。
【図５】 本発明による方法を用いて調製した組成物の、ヒトケラチノサイトによるサイトケラチン合成に対する効果を示す写真である。
【図６】 本発明によって調製した組成物の、エストラジオールの投与停止を受けた培養物中のヒトケラチノサイトに対する効果を示す写真である。
【図７】 本発明によって調製した組成物の、エストラジオールの投与停止を受けた培養物中のヒトケラチノサイトに対する効果を示す写真である。
【図８】 本発明によって調製した組成物の、エストラジオールの投与停止を受けた培養物中のヒトケラチノサイトによるサイトケラチン合成に対する効果を示す写真である。
【図９】 本発明によって調製した組成物の、エストラジオールの投与停止を受けた培養物中のヒトケラチノサイトによるサイトケラチン合成に対する効果を示す写真である。
【図１０】 本発明によって調製した組成物の、ヒト繊維芽細胞によるエラスチン合成に対する効果を示す写真である。
【図１１】 本発明によって調製した組成物の、ヒト繊維芽細胞によるエラスチン合成に対する効果を示す写真である。
【図１２】 ヒト繊維芽細胞に対するエストロゲンの効果を示す写真である。
【図１３】 ヒト繊維芽細胞に対するエストロゲンの効果を示す写真である。
【図１４】 本発明によって調製した組成物の、エストラジオールの投与停止を受けたヒト繊維芽細胞に対する効果を示す写真である。
【図１５】 本発明によって調製した組成物の、エストラジオールの投与停止を受けたヒト繊維芽細胞に対する効果を示す写真である。
【図１６】 本発明によって調製した組成物の、組成物の存在下で培養したケラチノサイトによって吸収されるメラニンの量の変化によるメラニン細胞に対する効果を示す柱状グラフである。
【図１７】 本発明によって調製した組成物の、培養したヒトケラチノサイトによって吸収されるメラニンの量に対する効果を示す写真である。
【図１８】 本発明によって調製した組成物の、培養したヒトケラチノサイトによって吸収されるメラニンの量に対する効果を示す写真である。
【図１９】 本発明によって調製した組成物の、ＨＬ６０前骨髄細胞によるインターロイキン１（ＩＬ−１）分泌に対する効果を示す柱状グラフである。
【図２０】 本発明によって調製した組成物に細胞毒性がないことを示す柱状グラフである。
Claims (25)
- a) 真珠層を１〜３００μmの粒度の粉末に粉砕し、
b) このようにして得られた真珠層粉末を、少なくとも一種類のコラーゲンもしくは少なくとも一種類のプロテオグリカンまたはそれらの混合物の水−グリコール溶液の形態の抽出剤と密に接触させた後、
c) 密な接触の結果として形成される抽出混合物を回収し、所望の組成物を構成する
ことからなる工程を含んでなる組成物の製造方法であって、
前記工程b)において、総重量に対して２０〜６０重量％の工程a)で得られた真珠層粉末と残りの抽出剤とを含んでなるように、真珠層粉末と抽出剤からなる混合物を調製することにより、真珠層粉末を抽出剤と密に接触させる、方法。 - 真珠層を５０〜１００μmの粒度の粉末に粉砕する、請求項１に記載の方法。
- 真珠層を１５〜５０μmの粒度の粉末に粉砕する、請求項１に記載の方法。
- 抽出剤の水−グリコール溶媒の水：グリコールの重量比が１：１００〜１００：１である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
- 抽出剤が少なくとも一種類のコラーゲンの水−グリコール溶液である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
- コラーゲンが海洋性コラーゲンである、請求項５に記載の方法。
- コラーゲン濃度が抽出剤の総重量に対して０．０００１〜５０重量％である、請求項５または６に記載の方法。
- 抽出剤が少なくとも一種類のプロテオグリカンの水−グリコール溶液である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
- プロテオグリカンがヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、硫酸ヘパリン、ケラタン硫酸、およびそれらの混合物からなる群から選択されるものである、請求項８に記載の方法。
- 抽出剤がヒアルロン酸の水−グリコール溶液である、請求項８または９に記載の方法。
- プロテオグリカン濃度が抽出剤の総重量に対して０．０００１〜４０重量％である、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
- 工程b)の終了時に、密な接触の結果として形成され、所望の組成物を構成する抽出混合物を回収し、組成物の液相を固相から分離する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項１２に記載の方法を用いて得られる、医薬用または化粧用の液相。
- 請求項１２に記載の方法を用いて得られる、医薬用または化粧用の固相。
- 請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法を用いて得られる、医薬用または化粧用の組成物。
- アラゴナイト（ＣａＣＯ３）、
ナトリウム、マグネシウム、ランタン、亜鉛、臭素、セシウム、鉄、マンガン、塩素、銅、カリウム、カルシウム、ストロンチウム、硫黄、およびそれらの混合物からなる群から選択される微量元素、
真珠層由来の繊維状タンパク質、
真珠層由来の非繊維状タンパク質、ならびに、
真珠層に由来しない少なくとも一種類のコラーゲン、および／または真珠層に由来しない少なくとも一種類のプロテオグリカン
を水−グリコール懸濁液の形態で少なくとも含んでなる、請求項１５に記載の組成物。 - 真珠層に由来しない少なくとも一種類の海洋性コラーゲン、ならびにヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、硫酸ヘパリン、ケラタン硫酸、およびそれらの混合物からなる群から選択される、真珠層に由来しない少なくとも一種類のプロテオグリカンを含んでなる、請求項１５または１６に記載の組成物。
- 活性成分として請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の組成物を含んでなり、さらに、少なくとも一種類の薬学上許容可能な賦形剤を含んでなる、医薬組成物。
- 薬学上許容可能な賦形剤が皮膚科用に適する賦形剤である、請求項１８に記載の医薬組成物。
- 皮膚および／または皮膚付属器の組織再生疾患の治療を目的とする医薬製品を製造するための、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の組成物の使用。
- 加齢に関連した皮膚および／または皮膚付属器の疾患の治療を目的とする医薬製品を製造するための、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の組成物の使用。
- 炎症性皮膚症状の治療を目的とする医薬製品を製造するための、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の組成物の使用。
- 化粧活性成分として請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の組成物を含んでなり、さらに、化粧品として許容可能な賦形剤を含んでなる、化粧用組成物。
- 皮膚および／または皮膚付属器の組織再生のための化粧処置を目的とする化粧用組成物を製造するための、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の組成物の使用。
- 皮膚および／または皮膚付属器の加齢に関連した変化の化粧処置を目的とする化粧用組成物を製造するための、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の組成物の使用。
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