RU2195955C2

RU2195955C2 - ПРИМЕНЕНИЕ БИЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ, ЭКСТРАГИРОВАННЫХ ИЗ РАСТЕНИЙ СЕМЕЙСТВА Dictyotacea ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПОЗИЦИЙ, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫХ ДЛЯ МОДИФИКАЦИИ СИНТЕЗА ГЛИКОЗИЛИРОВАННЫХ ЭЛЕМЕНТОВ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ МАТРИЦЫ ТКАНЕЙ ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА И КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ИХ

Info

Publication number: RU2195955C2
Application number: RU97117177/14A
Authority: RU
Inventors: Жилль ГЮТЬЕРРЕЗ
Original assignee: Тексенфин С.А.; Лаборатуар Ляфаль
Priority date: 1996-01-18
Filing date: 1997-01-20
Publication date: 2003-01-10
Also published as: ATE241996T1; DE69722514T2; CN1183045A; FR2743723A1; PL322310A1; AU1448097A; HUP9900952A2; AU724083B2; US5961981A; CA2216600A1; AP9701085A0; KR19980703075A; CN100536858C; ES2219748T3; DE69722514D1; WO1997025998A1; JPH11502235A; BR9704626A; FR2743723B1; NZ326391A

Abstract

Изобретение относится к медицине, биологическим веществам и, в частности, к применению биологически активных веществ, экстрагированых из растений семейства Dictyotacea для получения фармацевтических, косметических и/или пищевых композиций для воздействия на синтез гликозилированных элементов в экстрацеллюлярной матрице тканей животных и человека. Композиция включает одно или несколько активных веществ и носитель или эксципиент. Изобретение позволяет реализовать указанное назначение. 2 с. и 3 з.п. ф-лы, 3 табл.

Description

Изобретение относится к области биологии и более точно к биологически активным веществам морского происхождения.

Данное изобретение относится к новым биологически активным веществам, экстрагированным из растений семейства Dictyotales, способу получения этих веществ и композициям, содержащим их.

Композиции данного изобретения предназначаются для модификации синтеза гликозилированных элементов экстрацеллюларный матрицы (ЕСМ) тканей животных и человека.

Термин "растения семейства Dictyotales" следует понимать в его непосредственном значении, более точно это растения, способные фиксировать, конденсировать, осаждать карбонат кальция или влиять на синтез на их талломах карбоната кальция в кристаллической форме, которую называют арагонитом.

Термин "растения" может относиться к высушенному или свежему, измельченному или необработанному растению.

Растениями, из которых экстрагируют биологически активные вещества данного изобретения, являются Pheophyсеае, класс Fucophyceae, отряд Dictyotales, семейство Dictyotaceae. Только несколько родов относятся к семейству Dictyotales, этими родами являются Padina, Zonaria или Dictyota. Род Padina включает наиболее распространенные виды. К примеру, в зоне Средиземного моря можно встретить виды pavonica, boyana (P.Tenuis) и boergesenii, в зоне Тихого океана (кроме уже упомянутых) arborescens, australis, boryana, caulens, commersonii, concrescens, crasse, durvillei, elegans, fernandeziona, frasori u gymnospora и, кроме того, в зоне Атлантического океана встречаются glabra, haitensis, distromatica, dubia.

Эти виды являются также типичными видами Индийского океана. Одним из характерных признаков этих растений является способность фиксировать слои карбоната кальция - арагонита или орторобмического типа на поверхности талломов. Этот признак определяется при помощи рентгеноструктурного анализа порошка, полученного из этих растений. Дифракция рентгеновских лучей показывает, что порошок этих растений дает пики значительной интенсивности при углах 2θ: -3,393^o, -2,268^o, -2,699^o, -2,682^o, -2,371^o, -2,336^o (дуплет), -1,976^o и -1,877^o (дуплет). Эти углы дифракции являются характерными для арагонита.

Данное изобретение относится к новым биологически активным веществам, модифицирующим синтез гликозилированных элементов экстрацеллюлярной матрицы тканей животных и человека, которые экстрагируют из растений семейства Dictyotales.

Эти новые биологически активные вещества характеризуются, в частности, полициклической структурой, содержащей боковую прямую или разветвленную цепь, которая включает от 4 до 10 атомов углерода и одну или две двойные связи.

Новые вещества характеризуются также более точными аналитическими данными.

Данное изобретение относится также к способу получения биологически активных веществ, экстрагированных из растений семейства Dictyotales.

На первой стадии растение семейства Dictyotales после сбора подвергают сушке, если это возможно, то в отсутствие света, чтобы сохранить его фармакологические свойства.

Медленная сушка со значительным освещением приводит к получению веществ, которые являются не очень активными и не стабильны в процессе получения. Поэтому предпочтительно использовать сушку более подходящими способами, основным условием которых является получение активных веществ.

По этой причине сушку измельченных или необработанных растений проводят с помощью обдувания (вентиляции) без нагрева и таким образом получают растительный материал темно-каштанового цвета, на котором четко проступают белые полоски карбоната кальция.

Другой способ, хотя и менее экономичный, также является приемлемым, он включает сушку растений до высокой степени, затем сушку их в отсутствие воздуха. Лиофилизация измельченного или неизмельченного растения приводит к получению нужного безводного продукта.

В результате этих двух последних методов получают материал темного зеленовато-коричневого цвета, который является очень упругим и легко измельчается в порошок, что облегчает экстракцию его растворителем с получением биологически активных веществ.

Преимущество растения, высушенного до высокой степени, состоит в том, что получают растительный материал, который хорошо сохраняется (в отсутствие влаги) и из которого можно с помощью полярного растворителя легко экстрагировать стабилизированное или нестабилизированное активное вещество или вещества. Кроме того, полностью высушенные растения легче измельчаются в порошок.

Процесс получения биологически активных веществ характеризуется тем, что растение семейства Dictyotales подвергают сушке и/или лиофилизации, помолу с последующей одной или большим количеством экстракций растительного материала органическим растворителем, выбранным из группы, включающей низшие алканолы (этанол...), алифатические кетоны (ацетон...), алканы (пентан, гексан, гептан. . . ), циклоалканы (циклогексан. . . ), галогенированные растворители (хлороформ, метиленхлорид. . . ), ароматические растворители, сложные эфиры (этилацетат. ..), простые эфиры и т.п., с получением органического экстракта растения, органический экстракт сушат путем выпаривания растворителя и высушенный органический экстракт очищают в одну или более стадий, проводимых последовательно контактированием вида "жидкость/жидкость", способом колоночной хроматографии под вакуумом или под высоким давлением или способом высокоэффективной жидкостной хроматографии с получением активных веществ растений семейства Dictyotales.

Органические растворители могут использоваться как таковые или в различных сочетаниях. Обычно можно использовать смешивающиеся с водой органические растворители, а также растворители, способные экстрагировать активные вещества из талломов растения.

Растворители предпочтительно выбирать из группы, включающей летучие растворители, так как это необходимо для получения биологически активных веществ, не содержащих растворителя. В самом деле, летучие растворители, в которых растворены биологически активные вещества, могут быть выпарены из основы, такой как целлюлоза или ее производные, коллоидный диоксид кремния, высокомолекулярные алканы, такие как парафины; амфифильные растворители, такие как полиэтиленгликоль (PEG) или пропиленгликоль, а также инертные продукты, такие как глицерин и т.п.

Предпочтительные органические растворители представляют собой ацетон или этанол.

Используемое соотношение предпочтительно составляет 1 г высушенного растительного материала на 5 мл растворителя, и время контакта растительного материала и органического растворителя составляет предпочтительно 4-5 дней.

Однако в процессе мацеризации хорошие результаты получают при очень разных соотношениях высушенного материала и растворителя. Объемы, используемые для одного и того же количества высушенного материала, изменяются от 1 до 50. Кроме того, время контакта органического растворителя и растительного материала изменяется от 12 ч до 5 дней.

Более того, удовлетворительные результаты дают водные экстракты в аммонийной среде, хотя работать с ней труднее.

Для проведения экстракции биологически активных веществ необходимо мацерировать растительный материал в выбранном растворителе и можно пропускать растворитель непрерывно над порошком (перколяция). Достаточно регулировать скорость потока и концентрировать экстракт для получения раствора выбранной активности.

В данном случае растения семейства Dictyotales, высушенные и/или лиофилизированные и измельченные, подвергают одной или более экстракций контактированием растения с ацетоном в течение от 4 до 5 дней в соотношениях 1 г материала на 5 мл ацетона.

Полученный ацетоновый экстракт сушат выпариванием растворителя и затем очищают при помощи стадий очистки, которые определены ниже.

Первую стадию очистки проводят контактированием типа жидкость/жидкость. Высушенный ацетоновый остаток или экстракт переносят в смесь метанол/вода в контакте с гексаном. На второй стадии после упаривания и разбавления водой водно-метанольную фазу вводят в контакт с эфиром. В данном способе конечная эфирная фаза является биологически активной.

Вторую стадию проводят методом колоночной хроматографии под низким давлением. В качестве носителя используют гель марки Sephadex LH 20^®. Градиентное элюирование проводят смесью хлороформ/метанол. Биологически активные фракции элюируют смесью хлороформ/ метанол в соотношении 97/3 (объем/объем). В процессе промывания колонки смесью хлороформ/метанол (70/30) элюируют вторую остаточную активную фракцию.

Следующие стадии очистки проводят с помощью полупрепаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Размеры колонки: длина 250 мм, диаметр 100 мм. Используемые носители: С₁₈-привитой диоксид кремния и диол-привитой диоксид кремния. Скорость протекания 8 мл/мин.

На носителе, представляющем собой диол-привитой диоксид кремния, при использовании в качестве элюента смеси гексан/изопропанол (92/8) активные фракции элюируют в интервале от 20 до 25 мин и от 35 до 40 мин. На носителе, представляющем собой С₁₈-привитой диоксид кремния, при использовании в качестве элюента смеси ацетанитрил/ вода (85/15) активные фракции элюируют в интервале между 15 и 17 мин, а при использовании в качестве элюента смеси ацетонитрил/вода/уксусная кислота (85/15/0,05) активные фракции элюируют между 17 и 20 мин и между 30 и 40 мин.

По окончании этих стадий очистки получают биологически активное вещество желтовато-зеленого цвета.

Для характеристики биологически активного вещества или веществ, экстрагированных из растений семейства Dic-tyotales, используют различные методы анализа (УФ-, ИК-, ЯМР- спектроскопию, тонкослойную хроматографию...).

УФ-спектр конечной активной фракции, записанный в метаноле, характеризуется несколькими полосами поглощения, расположенными при 202 нм с плечом при 228 нм, между 260 нм и 270 нм, между 400 и 460 нм и при 630 нм.

По завершении этих стадий очистки проводят также тонкослойную хроматографию (ТСХ) с химическим проявлением (используемыми проявляющими реагентами являются сернокислотный анисальдегид, сернокислый ванилин, фосфомолибдат и этанольная серная кислота). После проявления отмечается присутствие нескольких пятен. Время фронтального удерживания равно: Rf=0,15 и 0,90, 0,95 и соответствует биологически активным зонам, полученным с помощью препаративной ТСХ, проводимой в тех же условиях, которая представляет собой так называемую тонкослойную хроматографию на пластике с диол-привитым диоксидом кремния с элюированием смесью гексан/изопропанол 85/15.

Масс-спектр, ИК-спектр и спектр протонного магнитного резонанса или [¹³С] -ЯМР спектр включают также полные данные относительно структуры новых биологически активных веществ, экстрагированных из растений семейства Dictyotales, в соответствии с данным изобретением. В частности, анализ [¹³С]-ЯМР спектра показывает, что присутствует боковая прямая или разветвленная цепь, содержащая от 4 до 10 атомов углерода и включающая от одной до двух двойных связей, которая находится в полициклической структуре.

Можно также получить биологически активные вещества, экстрагированные из растений семейства Dictyotales, мацерацией или выщелачиванием 1 г высушенного растительного материала в 5 мл чистого этанола в течение 12 ч.

Этанол представляет собой растворитель, который хорошо воспринимается клетками и полностью смешивается с водными внутренними растворами, в которые импрегнированы клетки.

Затем проводят следующие стадии очистки.

Хроматографию под высоким давлением проводят в обычной колонке с диоксидом кремния. 20 мк биологически активной фракции впрыскивают в хроматограф высокого давления и затем фракцию элюируют смесью гептан/эфир (90/10) при скорости протекания 2 мл/мин. Все активные вещества, экстрагированные из растений семейства Dictyotales, содержались во фракции, элюированной между 6,9 и 8,5 мин.

Можно проводить высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) тем же самым образом. Колонку для ВЭЖХ наполняют С₁₈-привитым диоксидом кремния, в качестве элюента используют смесь метанол/вода (80-20), и скорость протекания составляет 4 мл/мин. Активные экстрагированные вещества затем концентрируют во фракции, элюированной после времени удерживания между 16 и 18 мин.

Хроматограмма, полученная способом определения величины светорассеяния, показывает при данном времени удерживания некоторое количество вещества, которое составляет активную фракцию растения, при условии, что хроматографию проводят под пониженным давлением так, что испарение подвижной фазы с уносом активной фракции не происходит.

Таким образом, новые биологически активные вещества, экстрагированные из растений семейства Dictyotales, в процессе постадийной очистки исследуются с получением характеристических данных и, если экстракции проводят с использованием ацетона, они имеют следующие характеристики:
- время удерживания в полупрепаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии на носителе, представляющем собой диол-привитой диоксид кремния, с применением в качестве элюента смеси гексан/изопропанол (92/8), заключается в интервале от 20 до 25 мин и от 35 до 40 мин;
- время удерживания в полупрепаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием в качестве носителя C₁₈-привитого диоксида кремния, а в качестве элюента смеси ацетонитрил/вода 85/15 заключается в интервале между 15 и 17 мин;
- время удерживания в полупрепаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии при использовании в качестве носителя C₁₈-привитого диоксида кремния и в качестве элюента смеси ацетонитрил/вода/уксусная кислота (85/15/0,05) заключается в интервалах между 17 и 20 мин и между 30 и 40 мин. В процессе стадии очистки при проведении экстракции этанолом получают следующие характеристики:
- время удерживания в методе хроматографии под высоким давлением в обычной колонке с диоксидом кремния и при использовании в качестве элюента смеси гептан/эфир (90/10) заключается в интервале между 6,9 и 8,5 мин,
- время удерживания в методе высокоэффективной жидкостной хроматографии в колонке, наполненной C₁₈-привитым диоксидом кремния, и при использовании в качестве элюента смеси метанол/вода (80/20), заключается в интервале между 16 и 18 мин.

Биологически активные вещества исследуются с получением характеристических данных и после стадии очистки и, если экстракции выполняют ацетоном, они имеют следующие характеристики:
- УФ спектр в метаноле содержит несколько полос поглощения, расположенных при 202 нм, с плечом при 228 нм, между 260 и 270 нм, между 400 и 460 нм и при 630 нм,
- время фронтального удерживания в методе тонкослойной хроматографии (ТСХ) с химическим проявлением (сернокислый анисальдегид, сернокислый ванилин, фосфомолибдат, этанольная серная кислота) составляет 0,15, 0,90 и 0,95.

С веществами, экстрагированными органическими растворителями, зачастую трудно работать (ввиду испарения, гидратации, риска дефлеграции...). Поэтому необходимо наносить их на твердый носитель или носители, такие как органический абсорбентный полимер, такой как, например, целлюлоза, абсорбентные минералы или композиции минералов или абсорбенты (коллоидный диоксид кремния.. . ), продукты, которые более инертны, такие как парафины, полиэтиленгликоли (PEG), пропиленгликоли, поливинилпирролидон и т.д. Все инертные носители с низкой степенью насыщения кислородом являются подходящими.

Характеристики фиксированных веществ могут различаться в значительной степени, в зависимости от условий экстракции веществ из растений семейства Dictyo-tales, материала, используемого в качестве носителя, условий стабилизации и материала, на который наносится растворитель экстракции. Таким образом, изменяется консистенция, и цвет может изменяться от чистого зеленого до темно-бордового.

Данное изобретение относится также к биологически активным веществам, абсорбированным на инертном минеральном или органическом материале и затем десольватированным.

Биологически активные вещества в соответствии с данным изобретением, экстрагированные из растений семейства Dictyotales, проявляют очень интересные фармакологические свойства и, как результат, применяются в терапии, в косметике, в пище, в диетологии человека и ветеринарной диетологии, в имплантологии, в костной или суставной хирургии. Эти вещества предназначаются для применения в форме фармацевтических, косметических и/или пищевых композиций или имплантата.

Биологически активные вещества, экстрагированные из растений семейства Dictyotales, предназначаются для модификации синтеза гликозилированных элементов экстрацеллюлярной матрицы (ЕМС) тканей животного или человека. Эти вещества стимулируют синтез гликозаминогликанов (GAG), таких как гиалуроновая кислота, хондроитин, хондроитин-серные кислоты, дерматан-серная кислота, гепаран-серная кислота, гепарин и кератин-серная кислота, и синтез протеогликанов, таких как аггрекан (аggrесаn), декорин (dacorin), бигликан (biglycan), версикан (versican), фибромодулин (fibromodulin), фиброгликан (fibroglycan), синдекан (syndecan), бетагликан (beta-glycan ) и глипикан (glypican).

Таким образом, биологически активные вещества в соответствии с данным изобретением используются для приготовления композиций, предназначенных для модификации синтеза гликозилированных элементов экстрацеллюлярной матрицы (ЕМС) тканей животных и человека и, в частности, для стимулирования синтеза гликозаминогликанов (GAG) и протеогликанов экстрацеллюлярной матрицы (ЕМС) тканей животных и человека.

Вещества данного изобретения используются, в частности, для приготовления косметических или дерматологических композиций, предназначенных для улучшения гликозилированных синтезов гликозаминогликанов и протеогликанов в коже.

Вещества данного изобретения стимулируют белковые и гликозидные синтезы клеток соединительной ткани или мезенхимы. Вещества используются для получения композиций для местного применения, предназначенных для непрямой реконструкции активности соединительных или мезенхимальных клеток непрямым воздействием на клетки эпителия.

Вещества, экстрагированные из растений семейства Dictyotales, стимулируют голгиальные и мембранные синтезы гликозаминогликанов ЕСМ и голгиальные синтезы протеогликанов ЕМС. Следовательно, эти вещества повышают, например, синтез коллагенов, хондроитин-серной кислоты, дерматан-серной кислоты, гиалуроновой кислоты...

Эти вещества используются для приготовления композиций, предназначенных для стимулирования голгиальных и мембранных синтезов гликозаминогликанов ЕМС и голгиальных синтезов протеогликанов ЕМС. Вещества данного изобретения активны в отношении клеток кожи (фибробласты, кератиноциты), в отношении клеток кости (остеобласты, хондроциты) и в отношении клеток ткани некостных сочленений (синовиоциты).

У людей потребление биологически активных веществ, экстрагированных из растений семейства Dictyotales, подобно растениям в высушенном виде, вызывает повышение синтеза гликозилированных элементов ЕСМ мезенхимальных тканей и более точно кожи (дермис и эпидермис) и кости (хрящ, губчатый слой кости, губчатая кость, соединительный хрящ...).

Таким образом, вещества, экстрагированные из растений семейства Dictyotales, применяются, в частности, для приготовления фармацевтических композиций, предназначенных для профилактики и/или лечения повреждений тканей кожи, кости или хряща. Обычно эти вещества используются для приготовления композиций, предназначенных для профилактики и/или лечения состояний, в которых задействованы гликозилированные элементы экстрацеллюларной матрицы тканей животных и человека.

Заявитель в данном исследовании показывает, что эта активность отличается от активности, индуцируемой большинством активирующих веществ, таких как эстрадиол и витамин D₃(1-25-(ОН)D₃), витамин С и т.д. Активное вещество или вещества, находящиеся в растениях, проявляют активность даже в присутствии вредных агентов, таких как интерлейкины (например, 1L-1), и, следовательно, эти биологически активные вещества обладают восстанавливающей активностью.

Эти биологически активные вещества также обладают непрямой активностью на клетки, действуя с помощью посредника мессенджеров, такого как цитокинин, ростовой фактор или гормон, секретируемый первой клеточной популяцией, достигаемой активными веществами, экстрагированными из растений и предназначенными для целевых клеток.

Активность веществ, экстрагированных из растений семейства Dictyotales, выражается на клетках, происходящих из тех видов животных, которые принадлежат к таким различным линиям, как the Annelidae (кольчатые черви), the Ascidiae, the Arthropoda, моллюски, двустворчатые (Conchifera), иглокожие (Echinodermata), птицы и млекопитающие.

Биологическая активность веществ, экстрагированных из растений семейства Dictyotales, также используется для приготовления пищевых композиций, предназначенных для улучшения разведения Artrodopora и Conchifera, а также качества скорлупы яиц.

Вещества, экстрагированные из растений семейства Dictyotales, обладают значительным преимуществом для применения в области костной хирургии. Действительно, эти вещества сохраняют фенотип остеобластов человека во время трансплантации и могут быть введены с биоматериалом, имплантированным вблизи сустава для регенерации кости и поверхностей сочленений. Таким образом, вещества используются также для приготовления композиций, предназначенных для профилактики и/или лечения заболеваний суставов.

Вещества данного изобретения используются также для приготовления композиций для местного применения, предназначенных для профилактики и/или лечения локально-региональных заболеваний, в которых задействованы гликозилированные элементы экстрацеллюларной матрицы.

Биологически активные вещества также используются для приготовления композиций, предназначенных для профилактики и/или лечения состояний, связанных с дегенерацией экстрацеллюларной матрицы, а также для регенерации хрящевой ткани или для добавления в пищу.

Данное изобретение относится также к фармацевтическим, косметическим и/или пищевым композициям, которые модифицируют синтез гликозилированных элементов экстрацеллюлярной матрицы тканей животных и человека, отличающимся тем, что они включают, в качестве активного начала одно или большее количество биологически активных веществ, экстрагированных из растений семейства Dictyo-tales, в сочетании или в виде смеси с инертным нетоксичным наполнителем или разбавителем, подходящим для предусмотренного применения, и, если это подходит, одно или более активных начал, обладающих комплементарным действием.

Фармацевтические, косметические и/или пищевые композиции в соответствии с данным изобретением предназначаются для дигестивного, парентерального, чрескожного, местного или ректального введения, таким образом, композиции изготавливаются в форме не покрытых или покрытых оболочкой таблеток, драже, капсул, мягких желатиновых капсул, пилюль, таблеток, саше, сиропов, порошков для орального и внутреннего применения, адъювантных композиций для послеоперационного рубцевания, для ожогов или травм; суппозиториев; водных растворов или суспензий, введенных в ампулы; кремов, гелей или помад; или в виде растворов для чрескожного применения в проникающем полярном растворителе.

Композиции для кожного применения, но обладающие системными действиями, являются особенно новыми, так как показано, что в этих условиях биологически активные вещества, экстрагированные из растений семейства Dictyo-tales, при применении на каратиноцитах (кожный эпидермис) способны стимулировать секрецию фактора посредством действия на хондроциты, синовиоциты, остеобласты и, без сомнения, на другие мезенхимальные клетки.

Данное изобретение относится также к имплантатам, характеризуемым тем, что они включают в качестве активного начала одно или большее количество биологически активных веществ, экстрагированных из растений семейства Dictyotales в сочетании или в форме смеси с инертным нетоксичным наполнителем или разбавителем, подходящим для предусмотренного применения, и, если это подходит, одним или большим количеством активных начал, обладающих комплементарным действием.

Приведенные далее примеры и результаты иллюстрируют данное изобретение, не ограничивают его объема.

Пример I
Изучение активности веществ, экстрагированных из растений семейства Dictyotales.

1) Изучение активности
Изучение активности проводят на всех фракциях, которые могут быть выделены в процессе высокоэффективной жидкостной хроматографии или хроматографии под высоким давлением, для того, чтобы показать, что наблюдаемые эффекты в самом деле могут быть приписаны специфике биологически активных веществ, полученных из растений.

Заявитель использует два полуколичественных метода оценки для изучения активности этих растений.

Из тканевой или клеточной культуры определяют составляющую экстрацеллюлярной матрицы, выбранной либо введением иммунометки в клетки, фиксируемые благодаря их специфическому антителу; либо после разрушения клеток, с помощью хроматографии на геле или электрофореза (хроматографии под электрическим полем) с раскрытием и идентификацией вещества посредством специфического антитела.

В обоих случаях специфическое антитело обнаруживают с помощью второго антитела, которое является связанным либо с флуоресцентной молекулой, либо с ферментом, активность которого усилена хромофором, внесенным при помощи субстрата.

Определение относительных количеств может быть проведено методом иммунофлуоресценции или простой спектрометрией, когда используют окрашенный субстрат (Wextern Blot). Когда необходимо проведение иммунофлуоресцентного анализа, используют анализатор марки ВIOСОМ 200, который обсчитывает результаты с нескольких негативов, полученных на нескольких культурах клеток. В каждом случае величины выражают в виде относительных величин (полуколичественная оценка), то есть величин, отнесенных к контролю и/или к общему количеству синтезированных белков. Полуколичественная оценка позволяет получать сравнимые результаты. Тем не менее невозможно сравнить синтез компонента с другим, ввиду того, что сродство антител, которые хотя и являются специфическими, но не являются одними и теми же для двух пар антиген-антитело. Результаты являются сравнимыми между каждым другим (компонентом) для одного и того же антитела.

Синтез матриц изолированных клеток изучают на фрагментах тканей, выделенных во время хирургических операций. Культуры получают в монослойной первичной культуре, и результаты подтверждаются с помощью трехмерных культур клеток. На культурах фрагментов тканей кожи, суставов, костей получили такие же результаты.

2) Результаты
Результаты выражают числом, соответствующим обнаруживаемой сигнальной величине.

В приведенных табл. 1-3 аббревиатурой "ВАЗ" обозначаются биологически активные вещества, экстрагированные из растений семейства " Dictyotales.

3) Контроль активности
Данный контроль проводят в соответствии с литературными данными, относящимися к трехмерным культурам.

Используют гель альгиновой кислоты.

Такие же результаты получают с культурами остеобластов, выделенными из образцов костей, на других видах млекопитающих.

Кроме того, для подтверждения этих результатов биологически активные вещества, экстрагированные из растений семейства Dictyotales, наносят на культуры тканей нормальных или поврежденных хрящей. Замечают, что в поврежденном хряще протекает слабый синтез, и он имеет небольшие запасы гликозаминогликанов сульфатхондроитинового типа и типа гиалуроновой кислоты. Поврежденные хрящи, обработанные биологически активными веществами, экстрагированными из растений семейства Dictyotales, демонстрируют большие скорости синтеза по сравнению со здоровыми контрольными образцами, не обработанными активными веществами.

3) Фармакологическое действие биологически активных веществ
Фармакологическое действие биологически активных веществ, экстрагированных из растений семейства Dictyotales, подтверждаются следующими показателями:
а) Целебные (оздоровительные) активности веществ в присутствии вредного ингибиторного агента экстрацеллюлярной матрицы.

б) Непрямое действие веществ через мессенджер, такой как цитокин, фактор роста или гормон.

В настоящее время в литературе описываются большинство явлений артроза как результат разрушения (дегенерации) суставного пространства.

а) Целебные (оздоровительные) активности
Терапевтическая активность веществ рассматривается через возможность ответа на вредное действие биологического вмешательства, ответственного за патологический процесс. Интерлейкин 1 (1L-1) является наибольшим физиологическим вмешательством.

По этой причине активность биологически активных веществ, экстрагированных из растений семейства Dictyota-les, оценивают по выработке гликозаминогликанов, вырабатываемых мезенхимальными клетками, выращенными в присутствии 1L-1.

Результаты исследования культур в присутствии 1L-1 (см. табл.3).

Результаты такого же порядка получают с клеточными типами, а также в экплантатных культурах. Полуколичественная оценка в опыте с экстплантатами затруднена ввиду того, что необходимо принимать во внимание плоскости сечения.

б) Непрямое действие:
Было обнаружено, что инкубированные клетки с биологически активными веществами (ВАS), экстрагированными из растений семейства Dictyotales, чувствительны к передаче другим клеткам сигнала, который улавливается последними при контакте с биологически активными веществами. Эти биологически активные вещества, таким образом, могут стимулировать секрецию второго мессенджера. Этот мессенджер достигает других клеточных типов и стимулирует синтез протеогликанов.

Чтобы подчеркнуть это явление, проводят следующий опыт.

В культуру кератиноцитов (клеток кератина) (клетки эпидермиса человека) добавляют биологически активные вещества в культуральной среде. После инкубации в течение нескольких часов несколько раз промывают для удаления остатка биологически активных веществ (ВАS). Затем добавляют новую среду (например, КЕМ или Mac Coy), не содержащую сыворотки теленка или взрослого животного. После новой инкубации эту среду повторно поглощают. Кондиционированную среду, полученную таким образом, лиофилизируют. Полученный лиофилизат затем разбавляют на 1/4 или 1/10 специфической средой, где он действует как вторичная культура (например, DMEM для фибробластов, Mac СОУ для остеобластов). В культурах клеток, обработанных кондиционированной средой, полученной из клеток кератина, повышается синтез протеогликанов в тех же пропорциях, что и в том случае, когда их обрабатывают непосредственно биологически активными веществами, в то время как в культурах, которые инкубируют в присутствии среды, кондиционированной клетками кератина без биологически активных веществ, практически не происходит модифицирования их синтеза.

Кроме того, ответ кондиционированной среды изменяется в зависимости от того, вводится ли повторно лиофилизат перед разбавлением, которое выполняют спиртовой или водной средой.

В некоторые условиях эксперимента остеобласты показывают наилучший ответ в том случае, когда среда, кондиционированная клетками кератина, повторно поглощается спиртом, в то время как такая же обработка между фибробластами с одной стороны и остеобластами с другой стороны дает лучший ответ, если лиофилизат повторно поглощается непосредственно средой. Это приводит к предположению, что мессенджеры, секретируемые клетками и дающие тот же сигнал для той же популяции, являются разными. Этот опыт позволяет заявителю предусмотреть возможность модификации синтеза протеогликанов из тканей, более глубоких, чем кожа, нанесением композиции, которая содержит активные компоненты, на клетки кератина кожи или на эпителиальные ткани.

Пример II
Композиции
1) В качестве примера приготавливают экстракты (которые содержат биологически активные вещества), г:
Высушенное растение - 200
Циклогексан - 1000
или
Высушенное растение - 200
Этанол - 1000
Нанесение экстракта, который содержит биологически активные вещества (ВАS ), на носитель, г:
Органический раствор - 200
Гидроксипропилметилцеллюлоза - 1000
Органический раствор выпаривают на носителе - производном целлюлозы, г:
Органический раствор - 20
Полиэтиленгликоль (PEG) 4000 или 6000 - 1000
Органический раствор перегоняют в жидкий или твердый PEG. Соотношение органический раствор/ носитель изменяется значительно и зависит от ожидаемого эффекта (масс-эффект, композиция замедленного действия, непосредственное действие, общее системное действие и т.п.).

2) Композиция для общего применения
Композиции в виде капсул и таблеток, где активные вещества экстрагируют этанолом и наносят на инертный носитель, являются самыми простыми композициями. Для их изготовления биологически активные вещества, экстрагированные этанолом, смешивают с микрокристаллической целлюлозой, смазывающим агентом, таким как тальк, и с адъювантом прессования, таким как глицеролбехенат (glycerolbehenat).

Капсулы получают при использовании абсорбента биологически активных веществ, экстрагированных этанолом, на полиэтиленгликоле 4000 или 6000 разбавлением его коллоидным диоксидом кремния марки Aerosil^® или Sippemat^®.
Композицию для чрескожного способа введения приготавливаются классическим способом в резервуаре и без него с использованием классических наполнителей марки Transcuto^®.
Введение способом инъекции осуществляют с использованием чистых биологически активных веществ, которые получают в виде раствора в подходящей жидкости для инъекций в форме раствора или суспензии.

Примеры композиций:
а) Капсулы на основе биологически активных веществ (ВАS ), экстрагированных из растений семейства Dictyotales, %:
BAS, нанесенный на полиэтиленгликоль - 95
Диоксид кремния - 5
Наполнение капсул проводят обычным способом.

б) Таблетки на основе биологически активных веществ (ВАS), экстрагированных из растений семейства Dictyotales, %:
BAS, нанесенный на целлюлозу - 25
Целлюлоза - 65
Тальк - 1,5
Глицеролбехенат - 8,5
Предпочтительные композиции для фармацевтического применения представляют собой формы, которые могут вводиться перорально, такие как таблетки, драже, капсулы, и которые содержат в качестве активного ингредиента, по меньшей мере, одно биологически активное вещество, экстрагированное из растений семейства Dictyotales, или абсорбат биологически активных веществ на инертном носителе в сочетании или в смеси с инертным нетоксичным, подходящим для фармацевтического применения разбавителем или наполнителем и, возможно, одним или несколькими активными ингредиентами, обладающими комплементарным действием.

Для пищевого применения биологически активные вещества, экстрагированные из растений семейства Dictyotales, следует разбавить в пищевом носителе, таком как пища или в инертном носителе, такое как целлюлоза или препарате на основе целлюлозы.

Эти композиции, в частности, применяются при разведении водных животных, имеющих панцирь, например, креветок.

Пример выращивания креветок:
BAS - 12,1
Dulectin Дулектин - 23,9
Карбонат кальция - 5,0
Asperella Асперелла - 1,0
Пшеничная мука - 54,04
Sippermat Сиррернат - 3,95
Данную композицию вводят в дозе 1,5 кг в течение месяца в пруд со 180000 креветок, что приводит к заметному улучшению воспроизводящего выживания и повышению веса организмов при полном развитии на 10%±2%.

Таким образом, биологически активные вещества могут улучшать средний вес животных, и животные достигают полного развития за более короткое время.

Аналогичный опыт по кладке яиц курами показывает, что количество разбитых яиц в процессе второго цикла снижается на 2%.

3) Локально-региональное применение композиций
Используемые имплантаты (пеллеты: небольшие таблетки, помещенные под кожу) являются уже классическими. Они находят широкое применение в лечении, которое заменяет гормональное. Это позволяет применять длительное лечение. Предусматривается введение с помощью шприца в биоматериалы, такие как синтетические полимеры (полимолочная кислота, полиакриловая кислота), минералы: гидроксиапатит, фосфат кальция, биоматериалы: перламутр, коралл...., импрегнированные активными ингредиентами, представляющими собой биологически активные вещества, экстрагированные из растений семейства Dictyotales, и это несомненно приводит к интересным результатам по стимулированию синтеза протеогликанов экстрацеллюлярной матрицы.

4) Композиции для местного применения, предназначенные для использования с общеоздоровительной, дерматологической или косметической целью.

Для косметического или дерматологического применения предпочтительно будут использоваться кремы и гели, применение которых в данной области наиболее удобно и эффективно. Без ограничения в этих композициях используют эмульсии типа "масло в воде" или "вода в масле". Эти эмульсии называются лосьонами, дневными или ночными кремами, в некоторых случаях применения в косметологии и в дерматологии они представляют собой мази, гели, смешенные гелево-кремовые композиции.

В качестве примера можно привести состав эмульсии; все эти композиции содержат, по меньшей мере, три составляющих компонента: воду, жировые компоненты, поверхностно-активные компоненты. Очевидно, в конечной формуле могут присутствовать и другие вещества, такие как красители, агенты, регулирующие текстуру, активные ингредиенты в смеси или как таковые консерванты, агенты, стабилизирующие рН и предохраняющие от окисления. Мази являются композициями, в которых содержатся только липофильные агенты. Гели представляют собой композиции, имеющие прозрачный вид, в которых вода и иногда липофильные компоненты (или силикон) находятся в коллоидном или коллоидно-суспензионном состоянии.

Концентрации биологически активных веществ (ВАS) могут изменяться в широкой области соотношений в интервале от 0,01 до 20% массы эмульсии, где 0,01% является дозой порога чувствительности. Может предусматриваться также применение инкапсулированных форм биологически активных веществ (липосомы, наносферы, нанокапсулы...) ввиду того, что они способны улучшить активность. При содержании 20% активного ингредиента необходимо значительно модифицировать композицию, причем активность, вероятно, выходит на плато.

Современными формами композиции являются гели. Большинство их них приготавливаются с помощью полимеров, полученных из акриловой кислоты и называемых карбомерами. Другие типы молекул, такие как целлюлоза и ее производные, коллоидные диоксиды кремния, полимеры ароновой кислоты, маннан, галактоманнаты, ксантановые смолы и т.д., также могут приводить к получению гелей.

Пример: Крем типа "масло в воде", который содержит активные вещества, экстрагированные предварительно высушенным этанолом:
Tefose 2000 - 11
Ланолиновый воск - 3,5
Geleol^® - 3,5
Вода - 76,7
Консервант - qs
ВАS (растворимый в воде) - 5,0
Вкусовой агент - 0,3
ВАS в форме пузырьков (липосомы) - 0,5
Карбомер - 0,5
Раствор NаОН (10%) - QSpH 6,5
Вода - QSP 100 мл
Консервант, краситель
Очевидно, можно рассмотреть и другие композиции для местного, фармацевтического и косметического применений, такие как губки, бляшки с локальными действиями, порошки, липучки (Lipstick).

Claims

1. Применение биологически активных веществ, экстрагированных из растений семейства Dictyotacea, в качестве действующего начала в фармацевтической, косметической и/или пищевой композиции, предназначенной для модификации синтеза гликозилированных элементов внеклеточной матрицы тканей животных или человека, в сочетании или в смеси с инертным, нетоксичным и приемлемым для предполагаемого применения эксципиентом или носителем и, в случае необходимости, с одним или несколькими действующими началами комплементарного действия.

2. Применение по п. 1, отличающееся тем, что биологически активные вещества имеют полициклическую структуру с боковой цепью, содержащей от 4 до 10 атомов углерода в прямой или разветвленной цепи и включающей одну или две двойные связи.

3. Применение по п. 1, отличающееся тем, что биологически активные вещества имеют следующие характеристические показатели: время удерживания в методе полупрепаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии при использовании в качестве носителя диол-привитого диоксида кремния, а в качестве элюента смеси гексан/изопропанол в соотношении 92/8, находится в интервале от 20 до 25 мин и от 35 до 40 мин, в случае экстрагирования ацетоном; время удерживания в методе полупрепаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии при использовании в качестве носителя С₁₈-привитого диоксида кремния и в качестве элюента смеси ацетонитрил/вода в соотношении 85: 15 находится в интервале от 15 до 17 мин, в случае экстрагирования ацетоном; время удерживания в методе полупрепаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии при использовании в качестве носителя С₁₈-привитого диоксида кремния и в качестве элюента смеси ацетонитрил/вода/уксусная кислота в соотношении 85: 15: 0,5 находится в интервале от 17 до 20 мин и от 30 до 40 мин, в случае экстрагирования ацетоном; время удерживания в методе жидкостной хроматографии под высоким давлением на колонке, наполненной обычным диоксидом кремния, при использовании в качестве элюента смеси гептан/простой эфир (90: 10) находится в интервале от 6,9 до 8,5 мин, в случае экстрагирования этанолом; время удерживания в методе высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонне с С₁₈-привитым диоксидом кремния при использовании в качестве элюента смеси метанол/вода (80: 20) находится в интервале от 16 до 18 мин, в случае экстрагирования этанолом.

4. Фармацевтическая, косметическая и/или пищевая композиция для модификации синтеза гликозилированных элементов внеклеточной матрицы тканей животных или человека, отличающаяся тем, что она содержит в качестве действующего начала одно или несколько биологически активных веществ, экстрагированных из растений семейства Dictyotacea по пп. 1-3 в смеси или в сочетании с инертным нетоксичным подходящим для предполагаемого применения носителем или эксципиентом, и в случае необходимости, с одним или несколькими действующими началами комплементарного действия.

5. Композиция по п. 4, в которой инертный носитель или эксципиент представляет собой один из носителей или эксципиентов, подходящих для введения через пищеварительный тракт, парентеральным, чрескожным, местным или ректальным путем.