CN101815498B - 木酚素化合物用于抗皱治疗的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从肉豆蔻(nutmeg)或肉豆蔻假种皮(aril of nutmeg)分离和纯化得到的木酚素化合物用于抗皱的新用途，更详细地说，本发明涉及肉豆蔻提取物或肉豆蔻假种皮提取物、法拉格林A(fragrinA)、奥斯托百木酚素7(austobailignan 7)、利卡灵E(licarin E)以及肉豆蔻衣木酚素(macelignan)用于抗皱的新用途。本发明的提取物以及木酚素化合物具有抑制胶原分解酶-1(MMP-1，基质金属蛋白酶-1)以及生成新胶原(I型原胶原)的活性，从而具有抑制由光老化引起的皱纹的效果。因此本发明的提取物以及木酚素化合物可用于预防或治疗由光老化引起的皱纹。

Description

木酚素化合物用于抗皱治疗的用途
技术领域
本申请要求以2007年6月20日提交的韩国专利申请第10-2007-0060178号作为优先权基础，其公开内容通过引用的方式纳入本文。
本发明涉及从肉豆蔻(nutmeg)或肉豆蔻假种皮(aril of nutmeg)分离和纯化的木酚素化合物用于减少皱纹的新用途，更详细地说，本发明涉及一种新的抗皱组合物，包含作为有效成分的由通式1表示的法拉格林A(fragrin A)、由通式2表示的奥斯托百木酚素7(austobailignan 7)、由通式3表示的利卡灵E(licarin E)以及通由式4表示的肉豆蔻衣木酚素(macelignan)，所述提取物或化合物用于减少皮肤皱纹、诱导胶原合成和抑制胶原分解的用途，以及通过使用上述提取物或化合物来抑制皱纹、诱导胶原合成和抑制胶原分离的方法。
背景技术
一般来说，皱纹是自然老化的一部分，它是由肌肉的长期反复收缩所造成的。皮肤老化在广义上可分为内因性老化即自然老化以及外因性老化。自然老化是由遗传因素决定，很难调节，而外因性老化主要受环境因素影响，很容易进行人为调节。因此，一直进行着对外因性老化的预防研究，特别受到瞩目的是防止外因性光老化导致的皱纹形成的研究，所述外因性光老化过程是由于长期UV辐射导致的(Gilchre st B.A.，J.Am.Acad.Dermatol.，1989：21：610-613)。
光老化即外因性皮肤老化的临床特征是皮肤变得粗糙并且失去弹性、产生不规则的色素沉积并且深层皱纹增加。特别是，已经发现作为美容重要部位的脸面和头部的皱纹形成，其受光老化的影响非常大，因此，作为抗皱化妆品开发的基础研究，正在积极地进行对人皮肤或动物模型中的光老化和皱纹形成的研究。对于光老化和皱纹形成，目前报道了对诸如胶原(collagen)的合成和分解等的基础生理代谢变化的研究结果(Lavker R.M.，Blackwell science Inc.，1995：123-135)。
对皮肤老化产生影响的外部因子中包括风、温度、湿度、烟雾、环境污染和紫外线辐射，特别是把紫外线辐射引起的老化叫做“光老化”。当皮肤暴露于大量紫外线辐射时，皮肤中就会产生高浓度活性氧簇(reactive oxygen species)，从而破坏皮肤的酶和非酶抗氧化防御体系。因此皮肤组织的主要蛋白成分——胶原会明显减少而对胶原的减少产生重大影响的是基质金属蛋白酶-1(MMP-1)。基质金属蛋白酶-1(MMP-1)为一种参与细胞外基质和基底膜分解的酶，并且已经报道当紫外线照射时皮肤内的基质金属蛋白酶-1活性增强以大量分解胶原，因此基质金属蛋白酶-1对胶原降解有重要作用，并且在皱纹形成中起非常重要的作用(Sim G.S.，Kim J.H et al.，Kor.J.Biotechnol.Bioeng.，2005：20(1)：40-45)。
目前开发的一些抗皱活性成分存在的问题在于其不能用作化妆品原料，所述活性成分非常不稳定性并且不容易到达皮肤，使得需要一种特别的稳定系统和递送系统，并且其减少皮肤皱纹的效果并不可观。因此最近含类维生素A(retinoid)的护肤剂正逐渐受到关注。目前，类维生素A被用作解决光老化现象的一种手段，所述光老化现象例如日光产生的皱纹、皮肤增厚、皮肤下垂以及皮肤弹力减少。但是类维生素A的问题在于其是非常不稳定的化合物，对紫外线、水分、热和氧非常敏感使得其容易产生化学变化。为了解决这一问题，已经集中进行了开发源于天然物的有效成分的研究。
发明内容
技术问题
因此，本发明的各位发明人已经进行了长期的研究以找到一种天然化合物，其可有效用于减少皱纹，并且已经找到了一种肉豆蔻提取物或肉豆蔻假种皮提取物，以及从所述肉豆蔻提取物或肉豆蔻假种皮提取物分离和纯化得到的木酚素化合物——法拉格林A(fragrin A)、奥斯托百木酚素7(austobailignan 7)、利卡灵E(licarin E)和肉豆蔻衣木酚素(macelignan)，上述物质对减少皱纹有明显效果，从而完成了本发明。
因此，本发明的一个目的在于提供肉豆蔻提取物或肉豆蔻假种皮提取物以及木酚素化合物——法拉格林A、奥斯托百木酚素7、利卡灵E以及肉豆蔻衣木酚素的一种全新用途，所述木酚素化合物分离自肉豆蔻提取物或肉豆蔻假种皮提取物。
技术方案
为了达到上述目的，本发明提供一种抗皱用组合物，其含有一种作为有效成分的木酚素化合物，所述木酚素化合物选自由通式1表示的法拉格林A、由通式2表示的奥斯托百木酚素7、由通式3表示的利卡灵E以及由通式4表示的肉豆蔻衣木酚素。
此外，本发明提供上述木酚素化合物用于制备减少皱纹、诱导胶原合成和抑制胶原分解的试剂的用途。
此外，本发明提供一种减少皱纹、诱导胶原合成和抑制胶原分解的方法，包括将有效量的所述木酚素化合物给予或者涂抹于有需要的受试者。
此外，本发明提供一种抗皱组合物，包含作为有效成分的肉豆蔻提取物或肉豆蔻假种皮提取物。
此外，本发明提供了肉豆蔻提取物或肉豆蔻假种皮提取物用于制备减少皱纹、诱导胶原合成和抑制胶原分解的试剂的用途。
此外，本发明提供一种减少皱纹、诱导胶原合成和抑制胶原分解的方法，包括将有效量的肉豆蔻提取物或肉豆蔻假种皮提取物给予或者涂抹于有需要的受试者。
下面详细说明本发明。
本发明的特征在于提供了肉豆蔻提取物或肉豆蔻假种皮提取物以及木酚素化合物——由通式1表示的法拉格林A、由通式2表示的奥斯托百木酚素7、由通式3表示的利卡灵E以及由通式4表示的肉豆蔻衣木酚素的全新用途，所述木酚素化合物分离和纯化自肉豆蔻提取物或肉豆蔻假种皮提取物。
[通式1]
Figure GPA00001027113800041
[通式2]
Figure GPA00001027113800042
[通式3]
Figure GPA00001027113800051
[通式4]
Figure GPA00001027113800052
肉豆蔻是热带地域种植的多年生植物肉豆蔻树(Myristicafragrans)的果实，其在很久以前即开始作为香料使用。此外，肉豆蔻的假种皮为所述肉豆蔻树的皮区域，并且被报道具有抑制幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)成长(In Vivo.，17；541-4，2003)、激活肝的解毒作用(Food Chem.Toxicol.，31；517-211993)、皮肤疣的化学预防作用(Cancer Lett.，56；59-63，1991)、消炎活性(Jpn.J.Pharmacol.，49；155-63，1999)的作用。但是到现在为止对肉豆蔻或肉豆蔻假种皮的抗皱效果还没有报告。
本发明的木酚素化合物可利用常规提取和色谱方法从肉豆蔻或肉豆蔻假种皮分离和纯化得到。
从肉豆蔻或肉豆蔻假种皮进行的提取可以单独或混合使用如下物质来完成，例如水、有机溶剂如C1-C6有机溶剂(乙醇、甲醇、丙醇、异丙醇和丁醇)、丙酮、乙醚、氯仿、乙酸乙酯、二氯甲烷、己烷、环己烷、石油醚、二乙醚、苯等。优选使用水或C1-C6有机溶剂进行提取。
提取时肉豆蔻或肉豆蔻假种皮与溶剂的比例虽然没有特别规定，但可以向肉豆蔻或肉豆蔻假种皮粉末添加量为所述粉末重量1-20倍的溶剂。优选地，为了提高提取效率，向所述粉末中添加量为该粉末重量2-5倍的溶剂。
提取过程优选地在常压室温条件下进行为宜，并且提取时间为6-96小时，优选36到72小时，但是提取时间会根据提取温度而变化。另外在提取过程中，可使用搅拌机(shaker)来进一步提高提取效率。
在用于所述提取过程中之前，可将肉豆蔻或肉豆蔻假种皮在收获后洗涤或洗涤后干燥。所述干燥过程可以采用晒干、阴干、热风烘干以及自然干燥中的任何一种来进行。为了增加提取效率，肉豆蔻或肉豆蔻的假种皮可以在用粉碎机粉碎后再使用。
肉豆蔻提取物或肉豆蔻假种皮提取物的制备是通过例如如下方式进行的，即将干燥的肉豆蔻或肉豆蔻假种皮倒入提取装置中，提取溶剂的重量为其重量的4-10倍，将其置于提取装置中1-5天，用浓缩机浓缩以及干燥，最终可以得到提取物。
利用硅胶柱色谱(silica gel column chromatography)对上文得到的提取物进行处理以获取有极性的级分，并且对特定的分离级分进行反相柱色谱(reverse phase column chromatography)以及高效液相色谱(HPLC)处理，从而从所述级分中分离出法拉格林A、奥斯托百木酚素7、利卡灵E和肉豆蔻衣木酚素。所述法拉格林A、奥斯托百木酚素7、利卡灵E和肉豆蔻衣木酚素全部分离和纯化自肉豆蔻或肉豆蔻假种皮。但是，用于活性成分的提取以及分离的方法不受限于上述方法。
上述本发明的肉豆蔻提取物、肉豆蔻假种皮提取物以及从所述提取物分离和纯化得到的法拉格林A、奥斯托百木酚素7、利卡灵E和肉豆蔻衣木酚素浓度依赖地抑制紫外线照射导致的人体皮肤成纤维细胞中基质金属蛋白酶-1(MMP-1)的生成，并且增加I型前胶原(type-Iprocollagen)的合成。另外，当用本发明的组合物处理经UV辐射的无毛小鼠时，所述小鼠中胶原的合成同样增加。
因此，本发明提供一种抗皱组合物，包含作为有效成分的肉豆蔻提取物、肉豆蔻假种皮提取物以及分离和纯化自肉豆蔻和肉豆蔻假种皮的法拉格林A、奥斯托百7、利卡灵E和肉豆蔻衣木酚素。所述组合物可以为化妆品组合物或食品组合物。
所述化妆品组合物可通过本领域中公知的方法制备，它不仅包含肉豆蔻提取物、肉豆蔻假种皮提取物以及分离和纯化自肉豆蔻和肉豆蔻假种皮的法拉格林A、奥斯托百7、利卡灵E和肉豆蔻衣木酚素，还包含一种或多种常规赋形剂和添加剂。
更详细地说，本发明的化妆品组合物含有作为有效成分的肉豆蔻提取物、肉豆蔻假种皮提取物以及分离和纯化自肉豆蔻和肉豆蔻假种皮的法拉格林A、奥斯托百7、利卡灵E和肉豆蔻衣木酚素，并且可与皮肤学上可使用的赋形剂一起制备成基础化妆品(化妆水、化妆膏精华液、洁面乳如泡沫洁面乳和洁面水、面膜、按摩油、按摩膏)、调色化妆品(粉底、口红、睫毛膏、隔离霜)、护发产品(洗发水、润丝、护发素、发胶)以及香皂等形式。所述赋形剂可包括但不限于皮肤柔软剂、皮肤浸透增强剂、着色剂、芳香剂、乳化剂、稠化剂或溶剂。此外，还可以添加香料、色素、杀菌剂、防氧化剂、防腐剂以及保湿剂等，可以添加用于提高物理性质的增稠剂、无机盐类或合成聚合物。
比如，在制备含有肉豆蔻提取物肉、豆蔻假种皮提取物以及从上述提取物分离和纯化得到的法拉格林A、奥斯托百7、利卡灵E和肉豆蔻衣木酚素的洁面乳和香皂时，它们可以通过向普通洁面乳或香皂基质中添加本发明提取物或木酚素化合物很容易地来制备。在制备化妆膏时，它可以通过向常规水包油化妆膏基质中添加本发明提取物的提取物或木酚素化合物来制备。此外，可添加香料、螯合剂、色素、防氧化剂、防腐剂等，并且可以添加用于提高物理性质的蛋白质、矿物质或合成聚合物。
本发明的的肉豆蔻提取物、肉豆蔻假种皮提取物以及从所述提取物分离和纯化得到的法拉格林A、奥斯托百7、利卡灵E和肉豆蔻衣木酚素可被适宜地包含在化妆品组合物形式中，其含量范围是总制剂重量的0.005重量％到10重量％，优选是0.01到5重量％。如果所加入的组合物的量在0.005重量％以下，则它的抗皱作用很低，如果其加入量为10重量％以上，则其在抗皱作用方面没有显著差异，而仅仅是增加了它们的添加量。
另外，本发明的肉豆蔻提取物、肉豆蔻假种皮提取物以及从所述提取物分离和纯化得到的法拉格林A、奥斯托百7、利卡灵E和肉豆蔻衣木酚素可以以食品组合物形式提供。本发明的食品组合物包括功能性食品(functional food)、营养补品(nutritional supplement)、保健食品(health food)以及食品添加剂(food additives)等所有形式。前述类型的食品组合物可通过本领域公知的常规方法制备成多种形式。
比如，作为保健食品，可以把本发明的肉豆蔻提取物、肉豆蔻假种皮提取物以及从所述提取物分离和纯化得到的法拉格林A、奥斯托百7、利卡灵E和肉豆蔻衣木酚素制备成供饮用的茶、果汁和饮料，或者将其制备成用于摄取的颗粒、胶囊或粉末。此外，本发明的肉豆蔻提取物、肉豆蔻假种皮提取物以及从肉豆蔻和肉豆蔻假种皮分离和纯化得到的法拉格林A、奥斯托百7、利卡灵E和肉豆蔻衣木酚素可以与已知有减少和预防皱纹效果的常规活性成分混合在一起以制备组合物。
此外，为制备功能性食品，可以将本发明的肉豆蔻提取物、肉豆蔻假种皮提取物以及从肉豆蔻和肉豆蔻假种皮分离和纯化得到的法拉格林A、奥斯托百7、利卡灵E和肉豆蔻衣木酚素添加到饮料(包括酒精饮料)、水果以及其加工食品(例如罐装水果、瓶装水果、果酱、千捣酱等)、鱼类、肉类以及其加工食品(例如火腿、香肠、咸牛肉等)、面包类以及面条类(例如日本面条、小麦面条、中国面条、意大利实心面条、意大利通心面等)、果汁、各种饮料、小甜饼、麦芽糖、乳制品(例如黄油、干酪等)、植物油、人造黄油、植物蛋白、蒸煮食品、冷冻食品、各种调味料(例如豆酱、酱油、芥末酱等)等以制备组合物。
另外，本发明的提取物或木酚素化合物以食品添加剂形式使用时可以被制备为粉末或浓缩液形式。
本发明的食品组合物中含有的本发明提取物或木酚素化合物的浓度优选地占整个食品重量的0.0001-50重量％。
另外，本发明提供了肉豆蔻提取物、肉豆蔻假种皮提取物以及从肉豆蔻和肉豆蔻假种皮分离和纯化得到的法拉格林A、奥斯托百7、利卡灵E和肉豆蔻衣木酚素用于制备减少皱纹的试剂的用途。此外，本发明还提供了本发明肉豆蔻提取物、肉豆蔻假种皮提取物以及从肉豆蔻和肉豆蔻假种皮分离和纯化得到的法拉格林A、奥斯托百7、利卡灵E和肉豆蔻衣木酚素用于制备诱导胶原合成或抑制胶原分解的试剂的用途。
此外，本发明还提供一种减少皱纹的方法，所述方法包括将有效量的肉豆蔻提取物、肉豆蔻假种皮提取物以及从肉豆蔻和肉豆蔻假种皮分离和纯化得到的法拉格林A、奥斯托百7、利卡灵E和肉豆蔻衣木酚素给予或涂抹于有需要的受试者。本发明还提供一种用于诱导胶原合成或抑制胶原分解的方法，所述方法包括将有效量的肉豆蔻提取物、肉豆蔻假种皮提取物以及从肉豆蔻和肉豆蔻假种皮分离和纯化得到的法拉格林A、奥斯托百7、利卡灵E和肉豆蔻衣木酚素给予或涂抹于有需要的受试者。
这里，肉豆蔻提取物、肉豆蔻假种皮提取物以及从肉豆蔻和肉豆蔻假种皮分离和纯化得到的法拉格林A、奥斯托百7、利卡灵E和肉豆蔻衣木酚素在上文中已被充分地描述，而本文所用的“有效量”是指肉豆蔻提取物、肉豆蔻假种皮提取物以及从肉豆蔻和肉豆蔻假种皮分离和纯化得到的法拉格林A、奥斯托百7、利卡灵E和肉豆蔻衣木酚素可以在所述受试者中产生减少皱纹、诱导胶原合成或抑制胶原分解的效果的给药量，并且所述“受试者”是指包括哺乳动物特别是人类在内的动物。所述受试者可以是需要抗皱治疗的患者。
本发明肉豆蔻提取物、肉豆蔻假种皮提取物以及从肉豆蔻和肉豆蔻假种皮分离和纯化得到的法拉格林A、奥斯托百7、利卡灵E和肉豆蔻衣木酚素可以一直给药，直到获得上面所记载效果中的所需效果为止，而且可以通过本领域中公知的经口或肠胃外给药。
有益效果
如上文所述，本发明的肉豆蔻提取物、肉豆蔻假种皮提取物以及从肉豆蔻和肉豆蔻假种皮分离和纯化得到的法拉格林A、奥斯托百7、利卡灵E和肉豆蔻衣木酚素抑制皱纹形成中的重要因素——胶原分解酶-1(MMP-1，基质金属蛋白酶-1)，以此遏制胶原的分解和激活新原胶原(I型原胶原)的生成，并且具有提高的抑制由光老化导致的皱纹的效果。从而本发明的肉豆蔻提取物、肉豆蔻假种皮提取物以及从肉豆蔻和肉豆蔻假种皮分离和纯化得到的法拉格林A、奥斯托百7、利卡灵E和肉豆蔻衣木酚素可以用于治疗或预防光老化引发的皱纹。
附图说明
图1示出了从肉豆蔻假种皮分离法拉格林A以及奥斯特百木酚素7的工艺图。
图2是示出了肉豆蔻假种皮的75％甲醇提取物抑制胶原分解酶-1活性的图。
图3是示出了法拉格林A抑制胶原分解酶-1活性的图。
图4是示出了奥斯托百木酚素7抑制胶原分解酶-1活性的图。
图5示出了从肉豆蔻假种皮分离利卡灵E的工艺图。
图6示出了从肉豆蔻分离肉豆蔻衣木酚素的工艺图。
图7是确证了把本发明提取物以及木酚素化合物涂抹在皮肤时的抗皱效果的照片。
图8是确证了把本发明提取物以及木酚素化合物经口给药时的抗皱效果的照片。
具体实施方式
下面参照实施例对本发明进行详细说明。但应理解，下面的实施例只是处于举例说明的目的，而不应被理解为对本发明范围的限制。
实施例1：从肉豆蔻假种皮分离和纯化法拉格林A以及奥斯托百 木酚素7并且确定其结构
<1-1>法拉格林A以及奥斯托百木酚素7的分离和纯化
将100g干燥且经粉碎的肉豆蔻假种皮加入到400ml 75％甲醇中，并且在室温状态下放置两天。过滤所提取的溶液后进行真空浓缩，从而制备了肉豆蔻假种皮的75％甲醇提取物13.26g。把上述提取溶液用乙酸乙酯、丁醇和水进行分级分离。将乙酸乙酯级分(10.29g)利用硅胶柱色谱以氯仿与乙酸乙酯(9∶1(vv))的混合溶液洗脱以得到级分V(0.52g)和级分VI(0.19g)。对级分V以氯仿、乙酸乙酯和丙酮(24∶0.3∶1(v/v/v))的混合溶剂进行柱色谱得到了级分V-C(0.05g)。之后利用循环高效液相色谱以100％甲醇对级分V-C进行洗脱得到了单一物质级分V-C-2法拉格林A(0.03g)。对级分VI以氯仿、乙酸乙酯和丙酮的(30∶1∶2(v/v/v))混合溶剂进行柱色谱得到了级分VI-B(0.52g)。之后利用循环高效液相色谱以100％甲醇对级分VI-B进行洗脱得到了单一物质级分VI-B-5奥斯特百木酚素7(0.011g)。图1中图示了上述分离工艺。
<1-2>单一物质V-C-2的结构分析
为了分析上述分离的单一物质V-C-2的结构，分别在600MHz和150MHz对该物质的1H-NMR光谱和13C-NMR光谱(溶剂：CDCl3)进行测量。1H-NMR和13C-NMR的综合分析结果总结在下表1中。
【表1】
  位置   13C-NMR   1H-NMR
  1   134.5
  2   112.4   6.77(1H，d)
  3   146.3   3.82(3H，s，3-OMe)
  4   144.0   5.48(1H，s，-OH)
  5   114.1   6.82(1H，d)
  6   122.3   6.70(1H，dd)
α 43.0   2.72(1H，dd)3.12(1H，dd)
  β   79.8   4.33(1H，dd)
  γ   19.6   1.20(3H，d)
  1′   135.6
  2′   153.8   3.80(6H，s)
  3′   105.7   6.40(2H，d′，5′-H)
  4′   131.2
  5′   105.7   6.40(2H，3′，5′-H)
6′ 153.8   3.80(6H，s，2′-OMe，6′-OMe)
  α   40.5   3.34(2H，d)
  β   137.4   5.92-6.02(1H，m)
  γ   115.8   5.07-5.15(2H，m)
-OMe   56.056.2
为了以13C-NMR光谱和1H-NMR光谱的结果为基础测定1H-1H的相关关系(correlation)和1H-13C的相关关系，测定了1H-1HCOSY光谱和1H-13C HMBC光谱。在FAB/MS中在m/z 358观测到单一物质的[M]+，表明了分子量为358且分子式为C21H26O5。
根据上面的1H-NMR、13C-NMR、1H-1H COSY、1H-13C HMBC以及FAB/MS的结果和之前出版的参考文献(Chem.Pharm.Bull.，35，2，668，1987)，可以确认分离的单一物质是用通式1表示的法拉格林A：2-(4-烯丙基-2，6-二甲氧基苯氧基)-1-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-丙烷(2-(4-allyl-2，6-dimethoxyphenoxy)-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-propane))。
[通式1]
<1-3>单一物质VI-B-5的结构分析
为了确定上述分离的单一物质VI-B-5的结构，分别在600MHz和150MHz对所述单一物质的1H-NMR光谱和13C-NMR光谱(溶剂：CDCl3)进行测量。1H-NMR和13C-NMR的综合分析结果总结在下表2中。
【表2】
  位置   13C-NMR   1H-NMR
  1   137.4
  2   108.9   6.92(1H，d)
  3   148.1
  4   147.1
  5   106.7   6.78(1H，d)
  6   119.8   6.82(1H，dd)
  α   85.9   4.61(1H，d)
  β   43.7   2.39-2.43(2H，m)
  γ   12.0   1.00(3H，d)
  1′   132.7
  2′   119.0   6.91(1H，d)
  3′   114.2
  4′   144.5   5.54(1H，s，-OH)
  5′   146.5   6.88(1H，d)
  6′   108.2   6.77(1H，dd)
  α′   85.0   5.42(1H，d)
  β′   47.9   2.39-2.43(2H，m)
  γ′   9.6   0.61(3H，d)
  -OMe   56.2   3.89(3H，s)
-OCH2O- 101.1   5.94(1H，d)5.95(1H，d)
为了以13C-NMR光谱和1H-NMR光谱的结果为基础测定1H-1H的相关关系和1H-13C的相关关系，测定了1H-1H COSY光谱和1H-13C HMBC光谱。在FAB/MS中在m/z 342上观测所分离的单一物质的[M]+，表明了分子量为342且分子式为C20H22O5。
根据上面的1H-NMR、13C-NMR、1H-1H、COSY1H-13C、HMBC以及FAB/MS的结果和之前出版的参考文献(Aust.J.Chem.，28，81，1975)，可以确认分离的单一物质是用通式2表示的奥斯托百木酚素7：
[通式2]
实施例2：细胞增殖效果
为了检查细胞增殖效果，从而证明减少皮肤皱纹效果，使用成纤维细胞进行了MTT测定[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑溴化物还原法]。
首先把人体正常成纤维细胞(human normal fibroblasts)铺在96孔板上，浓度为2×105个细胞/孔，并且在含有10％FBS(牛胎血清)的DMEM培养基中以37℃、5％CO2的条件原代培养24小时。经原代培养后，将所述细胞用各种浓度的本发明样品处理。然后用没有血清的培养基替换所述培养基，并且将所述细胞传代培养48小时。传代培养步骤后，向培养基添加MTT溶液100μl。然后将所得溶液放置4个小时，之后去除培养基。向每个孔分别添加二甲亚砜溶液100μl并且搅拌20分钟，之后利用微板读数器在540nm测定了每孔的吸光度。
测试实施例1：法拉格林A及奥斯特百木酚素7的细胞增殖效果
按上述实施例2的方法，测定了肉豆蔻假种皮的75％甲醇提取物和从其分离和纯化得到的法拉格林A和奥斯特百木酚素7的细胞增殖效果。在上述MTT测定中，使用未经所述样品处理的培养基作为对照组并且测量其吸光度，分析结果如表3所示。
【表3】
  增殖效果(％)   增殖效果(％)   增殖效果(％)
浓度(μg/ml)   肉豆蔻假种皮的75％甲醇提取物 法拉格林A 奥斯特百木酚素7
  3   103   101   104
  5   102   104   105
  10   106   108   110
如表3所示，本发明肉豆蔻假种皮提取物、法拉格林A以及奥斯特百木酚素7与对照组相比具有优秀的细胞增殖效果。
实施例3：测定紫外光照射的成纤维细胞中的基质金属蛋白酶-1 (MMP-1)
把成纤维细胞以2×105细胞/ml的浓度在60mm培养皿中培养，直到达到约85％汇合为止。在照射紫外线(UV)之前，去除培养基，并且用PBS清洗细胞以除去血清成分，然后以20J/cm2剂量的紫外线照射。在将成纤维细胞用紫外线照射后，将所述细胞用每种所述样品进行处理并且用没有添加血清的DMEM培养基培养48小时。
为了测定基质金属蛋白酶-1(MMP-1)的表达水平，利用了蛋白质印迹，并且使用布拉德福(bradford)法定量其中含有所培养的成纤维细胞的培养基中的蛋白质总量。
把提取的蛋白质在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳，之后将其转移到硝酸纤维素膜上。将所述膜用5％脱脂奶粉在常温下封闭1小时以防止其被其他未知蛋白所污染。把基质金属蛋白酶-1的一抗体以1∶1000的比例稀释到封闭溶液中，并且使之在常温下与膜反应2小时。与一抗体反应后，将所述膜用Tris缓冲盐水Tween20(TBST)振荡洗涤三次，每次10分钟。将识别基质金属蛋白酶-1的一抗的二抗以1∶1000比例稀释到5％脱脂奶粉中，并且使之在常温下与所述膜反应1小时。然后，将所述膜用Tris缓冲盐水Tween20振荡洗涤三次，每次10分钟，方式与一抗反应的方式相同，之后利用化学发光法进行显像。
测试实施例2：使用肉豆蔻假种皮提取物处理时细胞中基质金属 蛋白酶-1(MMP-1)的表达水平的测量
为了检测肉豆蔻假种皮的75％甲醇提取物对基质金属蛋白酶-1(MMP-1)的活性抑制效果，利用上述实施例3的蛋白质印迹测定法分析了基质金属蛋白酶-1(MMP-1)的表达水平。这里相比的对象为用不同浓度(3，5及10μg/ml)的肉豆蔻假种皮提取物处理的实验组、经0.01％二甲亚砜处理的阴性对照组以及经0.01％二甲亚砜和20J/cm2紫外线处理的阳性对照组。
其结果如图2所示，肉豆蔻假种皮的提取物以剂量依赖方式抑制了基质金属蛋白酶-1的表达，并且与20J/cm2紫外线处理的阳性对照组相比，每个处理浓度下均显示出了显著差异(＊＊，p＜0.01；＊，p＜0.05)。比如当分别以10μg/ml处理时，作为比较化合物的维生素C对基质金属蛋白酶-1的表达抑制与阴性对照组相比高出20％，而对于本发明的肉豆蔻假种皮提取物而言，抑制活性则高出60％。因此，本发明人确认了本发明的肉豆蔻假种皮提取物表现出了与公知抗老化化合物——维生素C相似的活性，从而可有效地抑制基质金属蛋白酶-1的表达，并且本发明的肉豆蔻假种皮提取物也显示出了对抗衰老标记基质金属蛋白酶-1表达的抑制作用。
测试实施例3：用法拉格林A处理时细胞中基质金属蛋白酶-1 (MMP-1)表达水平的测量
为了测定法拉格林A对基质金属蛋白酶-1(MMP-1)抑制活性，这里相比的对象为用不同浓度(3，5及10μM)法拉格林A处理的实验组、经0.01％二甲亚砜处理的阴性对照组以及经0.01％二甲亚砜和20J/cm2紫外线处理的阳性对照组。
其结果如图3所示，法拉格林A以剂量依赖方式抑制了基质金属蛋白酶-1的表达，并且与20J/cm2紫外线处理的阳性对照组相比，每个处理浓度下均显示出了显著差异(＊＊，p＜0.01；＊，p＜0.05)。比如当分别以10μM处理时，作为比较化合物的维生素C对基质金属蛋白酶-1的表达抑制与阴性对照组相比高出20％，而对于本发明的肉豆蔻假种皮提取物而言，抑制活性则高出65％。因此，本发明人确认了本发明的法拉格林A表现出了与公知抗老化化合物——维生素C相似的活性，从而可有效地抑制基质金属蛋白酶-1的表达，并且本发明的法拉格林A也显示出了对抗衰老标记基质金属蛋白酶-1表达的抑制作用。
测试实施例4：用奥斯托百木酚素7处理时细胞中基质金属蛋白 酶-1(MMP-1)表达水平的测量
为了测定奥斯托百木酚素7对基质金属蛋白酶-1(MMP-1)抑制活性，这里相比的对象为用不同浓度(3，5及10μM)奥斯托百木酚素7处理的实验组、经0.01％二甲亚砜处理的阴性对照组以及经0.01％二甲亚砜和20J/cm2紫外线处理的阳性对照组。
其结果如图4所示，奥斯托百木酚素7以剂量依赖方式抑制了基质金属蛋白酶-1的表达，并且与20J/cm2的紫外线处理的阳性对照组相比，每个处理浓度下均显示出了显著差异(＊＊，p＜0.01；＊，p＜0.05)。比如当分别以处理10μM处理时，作为比较化合物的维生素C对基质金属蛋白酶-1的表达抑制与阴性对照组相比高出20％，而对于本发明的奥斯托百木酚素7而言，抑制活性则高出约65％。因此，本发明人确认了本发明的奥斯托百木酚素7表现出了与公知抗老化化合物质——维生素C相似的活性，从而可有效地抑制基质金属蛋白酶-1的表达，并且本发明的奥斯托百木酚素7也显示出了对抗衰老标记基质金属蛋白酶-1表达的抑制作用。
实施例4：用肉豆蔻假种皮乙醇提取物处理时细胞中基质金属蛋 白酶-1(MMP-1)表达水平的测量
将100g干燥且经粉碎的肉豆蔻假种皮添加至400ml乙醇中，并且在室温下放置两天。过滤所提取的溶液后进行真空浓缩，从而制备了肉豆蔻假种皮乙醇提取物(13.98g)。
对上述乙醇提取物，以与上述实施例3相同的方式进行对基质金属蛋白酶-1(MMP-1)表达水平的测量，结果是与用20J/cm2紫外线处理的阳性对照组相比，以10μg/Ml乙醇提取物进行处理的组的基质金属蛋白酶-1表达水平减少了65％。
实施例5：用肉豆蔻假种皮己烷提取物处理时细胞中基质金属蛋 白酶-1(MMP-1)表达水平的测量
将100g干燥且经粉碎的肉豆蔻假种皮添加至400ml己烷中，并且在室温下放置两天。过滤所提取的溶液后进行真空浓缩，从而制备了肉豆蔻假种皮己烷提取物(16.73g)。
对上述己烷提取物，以与上述实施例3相同的方式进行对基质金属蛋白酶-1(MMP-1)表达水平的测量，结果是与用20J/cm2紫外线处理的阳性对照组相比，以10μg/Ml己烷提取物进行处理的组的基质金属蛋白酶-1表达减少了55％。
实施例6到9：制备含有本发明的抗老化以及抗皱用组合物的化 妆水
利用上述实施例4的肉豆蔻假种皮乙醇提取物制备了具有实施例6-9组成成分的化妆水。
以10.0重量％、1.0重量％、0.1重量％和0.01重量％的浓度将所述提取物溶解于乙醇中，用乙醇调节重量。然后均匀地搅拌所述溶液(见表4)。
【表4】
  成分  实施例6  实施例7  实施例8  实施例9
  1.乙醇提取物(％)   10.0   1.0   0.1   0.01
  2.丙三醇(％)   2.0   2.0   2.0   2.0
  3.丙二醇(％)   2.0   2.0   2.0   2.0
  4.磷酸钾(％)   0.1   0.1   0.1   0.1
  5.磷酸氢二钠(％)   0.05   0.05   0.05   0.05
  6.香料(％)   0.02   0.02   0.02   0.02
  7.乙醇(96％)(％)   20   20   20   20
  8.纯净水(％)   余量   余量   余量   余量
  9.防腐剂(％)   适量   适量   适量   适量
实施例10到13：制备含有肉豆蔻假种皮提取物的化妆膏
利用上述实施例4的肉豆蔻假种皮乙醇提取物制备了具有实施例10-13组成成分的化妆膏。首先把物质(2)-(6)在75-80℃下溶解，再把物质(7)-(10)以相同温度条件溶解。把物质(7)-(10)乳化到物质(2)-(6)中，然后将所述粗提取物以10.0wt％、1.0wt％、0.1wt％和0.01wt％的浓度分别加入，并且搅拌所述化妆膏。最后放入香料并且加入纯净水补足余量(见表5)。
【表5】
  成分   实施例10   实施例11   实施例12   实施例13
  1.乙醇提取物(％)   10.0   1.0   0.1   0.01
  2.丙三醇   2.0   2.0   2.0   2.0
  3.丙二醇   2.0   2.0   2.0   2.0
  4.十二烷基硫酸钠   8.0   8.0   8.0   8.0
  5.硬脂   5.4   5.4   5.4   5.4
  6.矿物油   4.5   4.5   4.5   4.5
  7.香料   0.02   0.02   0.02   0.02
  8.鲸蜡醇   6.5   6.5   6.5   6.5
  9.纯净水   余量   余量   余量   余量
  10.防腐剂   适量   适量   适量   适量
实施例14到17：制备含有法拉格林A的化妆水
利用本发明的法拉格林A制备了具有实施例14-17组成成分的化妆水。把法拉格林A以5.0wt％、0.1wt％、0.01wt％和0.001wt％4种浓度溶解到水中，再与磷酸溶液混合。将所述溶液与乙醇、丙三醇、丙二醇、所添加的香料和防腐剂混合，然后用水调节重量。然后均匀地搅拌所述溶液(见表6)。
【表6】
成分   实施例14   实施例15   实施例16   实施例17
  1.法拉格林A(％)   5.0   0.1   0.01   0.001
  2.丙三醇(％)   2.0   2.0   2.0   2.0
  3.丙二醇(％)   2.0   2.0   2.0   2.0
  4.磷酸钾(％)   0.1   0.1   0.1   0.1
  5.磷酸氢二钠(％)   0.05   0.05   0.05   0.05
  6.香料(％)   0.02   0.02   0.02   0.02
  7.乙醇(96％)(％)   20   20   20   20
  8.纯净水(％)   余量   余量   余量   余量
  9.防腐剂(％)   适量   适量   适量   适量
实施例18到21：制备含有法拉格林A的化妆膏
利用本发明的法拉格林A制备了具有实施例18-21组成成分的化妆膏。首先在75-80℃下，溶解物质(2)-(6)并且在相同温度下溶解物质(7)-(10)。把物质(7)-(10)乳化到物质(2)-(6)中，然后把法拉格林A以5.0wt％、0.1wt％、0.01％和0.001％的浓度分别加入，并搅拌所述乳液。最后，添加香料并且用纯水补足余量(见表7)。
【表7】
  成分   实施例18   实施例19   实施例20   实施例21
  1.法拉格林A(％)   5.0   0.1   0.01   0.001
  2.丙三醇   2.0   2.0   2.0   2.0
  3.丙二醇   2.0   2.0   2.0   2.0
  4.十二烷基硫酸钠   8.0   8.0   8.0   8.0
  5.硬脂   5.4   5.4   5.4   5.4
  6.矿物油   4.5   4.5   4.5   4.5
  7.香料   0.02   0.02   0.02   0.02
  8.鲸蜡醇   6.5   6.5   6.5   6.5
  9.纯净水   余量   余量   余量   余量
  10.防腐剂   适量   适量   适量   适量
实施例22到25：制备含有奥斯托百木酚素7的化妆水
利用本发明的奥斯托百木酚素7制备了具有实施例22-25组成成分的化妆水。把奥斯托百木酚素7以5.0wt％、0.1wt％、0.01wt％和0.001wt％4种浓度分别溶解到水中，再与磷酸溶液混合。将所述溶液与乙醇、丙三醇、丙二醇、所添加香料和防腐剂混合，然后用水调节重量。然后均匀地搅拌所述溶液(见表8)。
【表8】
成分   实施例22   实施例23   实施例24   实施例25
  1.奥斯托百木酚素7(％)   5.0   0.1   0.01   0.001
  2.丙三醇(％)   2.0   2.0   2.0   2.0
  3.丙二醇(％)   2.0   2.0   2.0   2.0
  4.磷酸钾(％)   0.1   0.1   0.1   0.1
  5.磷酸氢二钠(％)   0.05   0.05   0.05   0.05
  6.香料(％)   0.02   0.02   0.02   0.02
  7.乙醇(96％)(％)   20   20   20   20
  8.纯净水(％)   余量   余量   余量   余量
  9.防腐剂(％)   适量   适量   适量   适量
实施例26到29：制备含有奥斯托百木酚素7的化妆膏
利用本发明的奥斯托百木酚素7制备了具有实施例26-29组成成分的化妆膏。首先在75-80℃下溶解物质(2)-(6)并且在相同温度下溶解物质(7)-(10)。把物质(7)-(10)乳化到物质(2)-(6)，然后把奥斯托百木酚素7以5.0wt％、0.1wt％、0.01％和0.001％的浓度分别加入并且搅拌所述乳液。最后添加香料并且用纯净水补足余量(见表9)。
【表9】
  成分   实施例26   实施例27   实施例28   实施例29
  1.奥斯托百木酚素7(％)   5.0   0.1   0.01   0.001
  2.丙三醇   2.0   2.0   2.0   2.0
  3.丙二醇   2.0   2.0   2.0   2.0
  4.十二烷基硫酸钠   8.0   8.0   8.0   8.0
  5.硬脂   5.4   5.4   5.4   5.4
  6.矿物油   4.5   4.5   4.5   4.5
  7.香料   0.02   0.02   0.02   0.02
  8.鲸蜡醇   6.5   6.5   6.5   6.5
  9.纯净水   余量   余量   余量   余量
  10.防腐剂   适量   适量   适量   适量
测试实施例4：含有肉豆蔻假种皮提取物的组合物的胶原合成体 内测定
对无毛小鼠(hairless mouse)每天1次照射20J/cm2紫外线，持续4周，然后把100ml实施例6-13的含肉豆蔻假种皮提取物的组合物涂抹在小鼠背部。然后对小鼠进行活组织切片检查，从组织学上测定了所述活组织检查组织中的胶原形成。在本申请中，对新生成的胶原量的测定是通过先将所述组织免疫染色，然后对经免疫染色的组织进行影像分析来进行。测定结果见表10。
【表10】
  结果   胶原增加率(％)
  对照   0
  化妆水实施例6   34.8
  化妆水实施例7   21.2
  化妆水实施例8   8.4
  化妆水实施例9   3.5
  对照   0
  化妆膏实施例10   35.7
  化妆膏实施例11   23.1
  化妆膏实施例12   10.2
  化妆膏实施例13   4.1
如表10所示，肉豆蔻假种皮乙醇提取物含量的增加导致胶原合成量的增加，与化妆水相比化妆膏中提取物活性更高。人们相信这是因为化妆膏在皮肤中的保留高于化妆水。
测试实施例5：体内测定含有法拉格林A的组合物的胶原合成量
对无毛小鼠每天1次照射20J/cm2紫外线，持续4周，然后把100ml实施例14-21的含法拉格林A的各组合物涂抹在小鼠背部。然后对小鼠进行活组织切片检查，从组织学上测定了所述活组织检查组织中的胶原形成。在本申请中，对新生成的胶原量的测定是通过先将所述组织免疫染色，然后对经免疫染色的组织进行影像分析来进行。结果见表11。
【表11】
  结果   胶原增加率(％)
  对照   0
  化妆水实施例14   75.4
  化妆水实施例15   32.7
  化妆水实施例16   18.3
  化妆水实施例17   8.9
  对照   0
  化妆膏实施例18   77.6
  化妆膏实施例19   38.1
  化妆膏实施例20   20.8
  化妆膏实施例21   9.0
如表11所示，法拉格林A的含量增加导致胶原合成量的增加，并且与化妆水相比化妆膏中所述提取物的活性更高。人们相信这是因为化妆膏在皮肤中的保留高于化妆水。
测试实施例6：体内测定含有奥斯托百木酚素7的组合物的胶原 合成量(In vivo)
对无毛小鼠每天1次照射20J/cm2紫外线，持续4周，然后把100ml实施例22-29的含奥斯托百木酚素7的组合物涂抹在小鼠背部。然后对小鼠进行活组织切片检查，从组织学上测定了所述活组织检查组织中的胶原形成。在本申请中，对新生成的胶原量的测量通过先将所述组织免疫染色，然后对经免疫染色的组织进行影像分析的方式来进行。测定结果见表12。
【表12】
  结果   胶原增加率(％)
  对照   0
  化妆水实施例22   68.7
  化妆水实施例23   30.4
  化妆水实施例24   16.1
  化妆水实施例25   7.9
  对照   0
  化妆膏实施例26   70.1
  化妆膏实施例27   36.3
  化妆膏实施例28   18.8
  化妆膏实施例29   8.5
如表12所示，奥斯托百木酚素7的含量增加导致胶原合成量的增加，并且与化妆水相比化妆膏中所述提取物的活性更高。人们相信这是因为化妆膏在皮肤中的保留高于化妆水。
实施例30：从肉豆蔻假种皮分离和纯化利卡灵E
<30-1>利卡灵E的分离和纯化
将100g(干重)干燥且经粉碎的肉豆蔻假种皮加入至400ml95v/v％乙醇中，并且在室温下放置两天。用沃特曼(Whatman)2号滤纸将所提取的溶液过滤2次。然后，将所述乙醇过滤液真空浓缩并且冻干，从而制备了肉豆蔻假种皮乙醇粗提取物(26.61g)。用乙酸乙酯、丁醇和水依次将所述提取物分级分离。得到了乙酸乙酯级分(18.44g)。利用硅胶柱色谱(Merck Kieselgel 66；70-230mesh)以氯仿与乙酸乙酯(9∶1(v/v))的混合溶液对乙酸乙酯级分进行洗脱得到了级分II(3.04g)。用真空旋转浓缩机彻底去除溶剂，从而制备了肉豆蔻假种皮粗提取物。之后利用硅胶柱色谱以氯仿、己烷、乙酸乙酯和丙酮(15∶10∶0.1∶0.1(v/v/v/v))的混合溶剂对级分II进行处理，得到了级分II-B。利用制备型高效液相色谱以100％甲醇洗脱级分II-B得到了单一物质级分II-B-2(0.016g)。图5图示了上述分离工艺。
<30-2>结构分析
为了确定所述分离的单一物质III-B-2的结构，分别在600MHz和150MHz测量了所述物质的1H-NMR光谱和13C-NMR光谱(溶剂：DMSO)，并测定了DEPT光谱。对1H-NMR和13C-NMR的综合分析结果总结在表13中。
【表13】
  Carbon No.   δC   δH
  1
2 93.0
  3   45.5   1.35(3H，d7-CMa)
  3a   132.7   5.48(1H，s，-CH)
4 113.0 6.82(1H，d)
5 131.8 6.70(1H，dd)
  6   109.2   5.15(d，3)
  7   143.7   3.2-3.7(m)
  7a   146.2   1.35(3H，d，7)
  3-Ma   17.6   5.92
  OMa   55.7
  1′   134.0
  2′   106.3   3.80(6H，s)
  3′   147.5   3.88(s)
  4′   147.2
  5′   107.7   6.40(2H，3，5′-H)
  6′   119.7   3.80(6H，s，2′-CMa，6′-CMa)
  α   130.6   3.34(2H，d)
  β   122.9   5.32-6.02(1H，m)
  γ   18.1   1.84(3H，d，5)
<30-3>质量分析
为了分析所述单一物质的质量，测定了FAB/MS，并在FAB/MS中在m/z 324上观测到所述单一物质的[M]+，表明了分子量为324且分子式为C20H20O4。
根据上面的1H-NMR13、C-NMR、DEPT以及FAB/MS的结果和之前发表的参考文献(Harvey D.J.，J.Chromatogr.，110：91-102，1975)，可以确认所分离的单一物质是用通式3表示的利卡灵E：
[通式3]
测试实施例7：用利卡灵E处理时细胞中基质金属蛋白酶-1 (MMP-1)的表达水平的测定
为了测定利卡灵E对基质金属蛋白酶-1(MMP-1)的活性抑制效果，利用上述实施例3的蛋白质印迹法比较了分别以不同浓度(3、5和10μM)的利卡灵E处理的测试组，结果是与UV 20J/cm2处理的阳性对照组相比，它们分别显示了35％、47％以及73％的基质金属蛋白酶-1的活性抑制效果。
这表明本发明的利卡灵E表现出对抗衰老标记基质金属蛋白酶-1表达的抑制作用。
实施例31到34：制备含有利卡灵E的化妆水
利用本发明的利卡灵E制备了具有实施例31-34组成成分的化妆水。把利卡灵E以5.0wt％、0.1wt％、0.01wt％和0.001wt％4种浓度溶解到水中，再与磷酸溶液混合。将所述溶液与乙醇、丙三醇、丙二醇所添加的香料和防腐剂混合，然后用水调节重量。然后均匀地搅拌所述溶液(见表14)。
【表14】
成分   实施例31   实施例32   实施例33   实施例34
  1.利卡灵E(％)   5.0   0.1   0.01   0.001
  2.丙三醇(％)   2.0   2.0   2.0   2.0
  3.丙二醇(％)   2.0   2.0   2.0   2.0
  4.磷酸钾(％)   0.1   0.1   0.1   0.1
  5.磷酸氢二钠(％)   0.05   0.05   0.05   0.05
  6.香料(％)   0.02   0.02   0.02   0.02
  7.乙醇(96％)(％)   20   20   20   20
  8.纯净水(％)   余量   余量   余量   余量
  9.防腐剂(％)   适量   适量   适量   适量
实施例35到38：制备含有利卡灵E的化妆膏
利用本发明的利卡灵E制备了具有实施例35-38组成成分的化妆膏。首先在75-80℃下溶解物质(2)-(6)并且在相同温度下溶解物质(7)-(10)。把物质(7)-(10)乳化到物质(2)-(6)中，然后把利卡灵E以5.0wt％、0.1wt％、0.01％和0.001％的浓度分别放入并且搅拌所述乳液。最后添加香料并且用纯净水补足余量(见表15)
【表15】
  成分   实施例35   实施例36   实施例37   实施例38
  1.利卡灵E(％)   5.0   0.1   0.01   0.001
  2.丙三醇   2.0   2.0   2.0   2.0
  3.丙二醇   2.0   2.0   2.0   2.0
  4.十二烷基硫酸钠   8.0   8.0   8.0   8.0
  5.硬脂   5.4   5.4   5.4   5.4
  6.矿物油   4.5   4.5   4.5   4.5
  7.香料   0.02   0.02   0.02   0.02
  8.鲸蜡醇   6.5   6.5   6.5   6.5
  9.纯净水   余量   余量   余量   余量
  10.防腐剂   适量   适量   适量   适量
测试实施例8：体内测定含利卡灵E的组合物的胶原合成量
对无毛小鼠每天1次照射20J/cm2紫外线，持续4周，然后把100ml实施例31-38的含利卡灵E的组合物涂抹在小鼠背部。然后对小鼠进行活组织切片检查，从组织学上测定了所述活组织检查组织中的胶原形成。在本申请中，对新生成的胶原量的测量通过先将所述组织免疫染色，然后对经免疫染色的组织进行影像分析来进行。测定结果见表16。
【表16】
结果   胶原增加率(％)
  对照   0
  化妆水实施例31   73.4
  化妆水实施例32   31.6
  化妆水实施例33   17.9
  化妆水实施例34   8.5
  对照   0
  化妆膏实施例35   77.2
  化妆膏实施例36   38.0
  化妆膏实施例37   19.6
  化妆膏实施例38   8.9
如表16所示，利卡灵E的含量增加导致胶原合成量的增加，并且与化妆水相比化妆膏中所述提取物的活性更高。人们相信这是因为化妆膏在皮肤中的保留高于化妆水。
实施例39：从肉豆蔻分离和纯化肉豆蔻衣木酚素
<39-1>肉豆蔻衣木酚素的分离和纯化
将100g(干重)干燥且经粉碎的肉豆蔻加入至400ml 75％甲醇中，并且在室温下放置两天。过滤所提取的溶液后进行真空浓缩，从而制备了肉豆蔻甲醇提取物(7g)。把所述提取物用乙酸乙酯、丁醇和水进行分级分离。得到了乙酸乙酯级分(4.2g)。利用硅胶柱色谱(Merck Kieselgel 66；70-230mesh)以己烷与乙酸乙酯(10∶1(v/v))的混合溶液对乙酸乙酯级分进行洗脱，得到了级分III(1g)。通过柱色谱以己烷与乙酸乙酯(20∶1(v/v))的混合溶剂对所述级分III进行处理，得到了级分III-B(0.52g)。之后利用制备型Rp-18柱色谱(MerckLiChroprep；25-40μm)通过80％甲醇对级分III-B进行洗脱，得到了单一物质级分III-B-2(0.5g)。图6中图示了上述分离工艺。
<39-2>结构分析
为了确定所述分离的单一物质III-B-2的结构，分别在600MHz和150MHz测量了所述物质的13C-NMR光谱和1H-NMR光谱(溶剂：DMSO)。为了以13C-NMR光谱和1H-NMR光谱的结果为基础测定1H-1H的相关关系和1H-13C的相关关系，测定了1H-1H COSY光谱和1H-13C HMBC光谱。1H-NMR、13C-NMR、1H-1HCOSY和1H-13C HMBC的综合分析结果表示在表17中。
【表17】
位置   13C-NMR 1H-NMR 1H-1H COSY 1H-13C HMBC
  1   135.4
  2   109.2   6.72brs   C-7，C-6，C-4，C-3
  3   147.3
  4   145.1
  5   107.9   6.79d(7.8)   6.61   C-6，C-4，C-3，C-1
6 121.7 6.61dd(7.8) 6.79   C-7，C-5，C-4，C-2，C-1
7 38.2   2.23dd(13.2，9.3)2.66dd(13.2，4.8)   1.64，2.661.64，2.23   C-8，C-6，C-2，C-1C-9，C-8，C-6，C-2，C-1
  8   38.7   1.64brs   0.75，2.23，2.66   C-7
  9   16.0   0.75d(6.3)   1.64   C-8，C-7
  1′   132.4
  2′   112.9   6.66brs   C-7′，C-6′，C-4′，C-3′
  3′   147.1
  4′   144.4
  5′   115.2   6.66d(7.9)   6.53   C-6′，C-4′，C-3′，C-1′
6′ 121.0 6.53d(7.9，1.1) 6.66   C-7′，C-5′，C-4′，C-2′，C-1′
7′ 38.0   2.17dd(13.2，9.3)2.66dd(13.2，4.8)   1.64，2.661.64，2.17   C-8′，C-6′，C-2′，C-1′C-9′，C-8′，C-6′，C-2′，C-1′
  8′   38.7   1.64brs   0.75，2.17，2.66   C-7′
  9′   16.1   0.75d(6.3)   1.64   C-8′，C-7′
  OMe   55.5   3.72(s)
  O-CH2-O   100.6   5.95d(4.8)   C-3，C-4
<39-3>质量分析
为了分析所述单一物质III-B-2的质量，测定了EI/MS，且在EI/MS中在m/z328上观测到所述单一物质的[M]+，表明了分子量为328且分子式为C20H24O4。
<39-4>比旋光度测定
把20mg所述单一物质III-B-2溶解在2ml氯仿(CHCl3)中，并且用比旋光度测定仪(Polarimeter；Automatic Polarimeter，APIII-589，Rodulph，NJ，USA)检测比旋光度([α]D)。结果是，比旋光度为[α]D＝+4.0(CHCl3，c＝1.0)。
通过上面的1H-NMR、13C-NMR、1H-1H COSY、1H-13CHMBC、EI/MS和[α]D的结果和已发表的参考文献(Woo，W.S.et al.，Phytochemistry，26：1542-1543，1987)，发现所述单一物质是用通式4所表示的肉豆蔻衣木酚素：
[通式4]
Figure GPA00001027113800331
测试实施例9：用肉豆蔻衣木酚素处理时细胞中基质金属蛋白酶 -1(MMP-1)的表达水平的测定
为了测定肉豆蔻衣木酚素的基质金属蛋白酶-1(MMP-1)抑制活性效果，利用上述实施例3的蛋白质印迹法比较了分别以不同浓度(3、5和10μM)的肉豆蔻衣木酚素处理的测试组，结果是与UV 20J/cm2处理的阳性对照组相比，它们分别显示了31％、42％以及63％的对基质金属蛋白酶-1的抑制活性效果。
这表明本发明的肉豆蔻衣木酚素示出了对抗衰老标记基质金属蛋白酶-1表达的抑制作用。
实施例40：测定当用肉豆蔻乙醇提取物处理时细胞中基质金属 蛋白酶-1(MMP-1)的表达水平
将100g干燥且经粉碎的肉豆蔻加入至400Ml乙醇中，并且在室温下放置两天。过滤所提取的溶液后进行真空浓缩，从而制备了肉豆蔻乙醇提取物(12.7g)。
对该乙醇提取物，以与实施例3相同的方法进行对基质金属蛋白酶-1(MMP-1)表达水平的测量，结果是与用20J/cm2照射紫外线处理的阳性对照组相比，以5μg/Ml和10μg/Ml乙醇提取物处理的组的基质金属蛋白酶-1(MMP-1)的表达水平分别降低了38％和75％。
实施例41：测定当用肉豆蔻己烷提取物处理时对细胞中基质金 属蛋白酶-1(MMP-1)的表达水平
将100g干燥且经粉碎的肉豆蔻100g加入至400Ml己烷，并且在室温下放置两天。过滤所提取的溶液后进行真空浓缩，从而制备了肉豆蔻己烷提取物(26.6g)。
对上述己烷提取物，以与实施例3相同的方法进行对基质金属蛋白酶-1(MMP-1)表达水平的测量，结果是与用20J/cm2紫外线处理的阳性对照组相比，以5μg/Ml和10μg/Ml己烷提取物处理的组的基质金属蛋白酶-1的表达水平分别降低了32％和68％。
测试实施例10：体内验证肉豆蔻提取物以及肉豆蔻衣木酚素的 抗皱效果
在实验前使6周龄的无毛小鼠(Skh:HR-1)适应一个星期，并且注意维持温度为23±3℃，相对湿度为50±5％以及12小时的明暗周期(07:00-19:00/照明时间)。使用了小鼠专用饲料和自来水喂养它们。每周三次紫外线(UV)照射相同时间，UV照射量为第1周50mJ/cm2，第2周100mJ/cm2，第3周200mJ/cm2，第4周以及第4周后为250mJ/cm2。分为4组。分别是对照组、UV对照组、UV/肉豆蔻组和UV/肉豆蔻衣木酚素组。
在本实验中，涂抹各50μl的6％肉豆蔻提取物和20mM肉豆蔻衣木酚素溶液。对于本实验，肉豆蔻提取物与肉豆蔻衣木酚素均溶解在乙醇∶聚乙二醇中(7∶3(v/v))。
实验之后，为了确定抗皱效果，利用硅胶聚合物(SILFLOimpression material)从无毛小鼠的背部印模(replica)取样，结果如图7所示，确认了在照射UV后涂抹肉豆蔻提取物和肉豆蔻衣木酚素的组与紫外线阳性组相比，皱纹得到抑制。在图7中，A是正常组，B是UV照射组，C是肉豆蔻提取物涂抹组，而D是肉豆蔻衣木酚素涂抹组。
测试实施例11：体内验证肉豆蔻提取物及肉豆蔻衣木酚素经口服 给药时的抗皱效能
在实验前使6周龄的无毛小鼠(Skh:HR-1)适应一个星期，并且注意维持温度为23±3℃，相对湿度为50±5％以及12小时的明暗周期(07:00-19:00/照明时间)。使用了小鼠专用饲料和自来水喂养它们。每周三次紫外线(UV)照射相同时间，UV照射量为第1周50mJ/cm2，第2周100mJ/cm2，第3周200mJ/cm2，第4周以及第4周后为250mJ/cm2。分为4组。分别是对照组、UV对照组、UV/肉豆蔻组和UV/肉豆蔻衣木酚素组。分别经口给予200mg/kg肉豆蔻和20mg/kg肉豆蔻衣木酚素。对于本实验，将肉豆蔻提取物和肉豆蔻衣木酚素溶解在0.25％CMC(羧甲基纤维素)溶液中。
实验之后，为了确定抗皱效果，利用硅胶聚合物(SILFLOimpression material)在无毛小鼠的背部印模(replica)取样，结果如图8所示，确认了在照射UV后经口给予肉豆蔻提取物和肉豆蔻衣木酚素的组与紫外线阳性组相比，皱纹得到抑制。在图8，中A是正常组，B是UV照射组，C是肉豆蔻提取物给药组，而D是肉豆蔻衣木酚素给药组。
实施例42到45：制备含有肉豆蔻衣木酚素的化妆水
利用本发明的肉豆蔻衣木酚素制备了具有实施例42-45组成成分的化妆水。把肉豆蔻衣木酚素以5.0wt％、0.1wt％、0.01wt％和0.001wt％4种浓度溶解到水中，再与磷酸水溶液混合。将所述溶液与乙醇、丙三醇、丙二醇、所添加的香料和防腐剂混合，然后用水调节重量。然后均匀地搅拌所述溶液(见表18)。
【表18】
成分   实施例42   实施例43   实施例44   实施例45
  1.肉豆蔻衣木酚素(％)   5.0   0.1   0.01   0.001
  2.丙三醇(％)   2.0   2.0   2.0   2.0
  3.丙二醇(％)   2.0   2.0   2.0   2.0
  4.磷酸钾(％)   0.1   0.1   0.1   0.1
  5.磷酸氢二钠(％)   0.05   0.05   0.05   0.05
  6.香料(％)   0.02   0.02   0.02   0.02
  7.乙醇(96％)(％)   20   20   20   20
  8.纯净水(％)   余量   余量   余量   余量
  9.防腐剂(％)   适量   适量   适量   适量
实施例46到49：制备含有肉豆蔻衣木酚素的化妆膏
利用本发明的肉豆蔻衣木酚素制备了具有实施例46-49组成成分的化妆膏。首先在75-80℃下溶解物质(2)-(6)并且在相同温度下溶解物质(7)-(10)。把物质(7)-(10)乳化到物质(2)-(6)中，然后把肉豆蔻衣木酚素以5.0wt％、0.1wt％、0.01％和0.001％的浓度分别放入其中并且搅拌所述乳液。最后添加香料并且用纯水补足余量(见表19)。
【表19】
  成分   实施例46   实施例47   实施例48   实施例49
  1.肉豆蔻衣木酚素(％) 5.0 0.1 0.01 0.001
  2.丙三醇   2.0   2.0   2.0   2.0
  3.丙二醇   2.0   2.0   2.0   2.0
  4.十二烷基硫酸钠   8.0   8.0   8.0   8.0
  5.硬脂   5.4   5.4   5.4   5.4
  6.矿物油   4.5   4.5   4.5   4.5
  7.香料   0.02   0.02   0.02   0.02
  8.鲸蜡醇   6.5   6.5   6.5   6.5
  9.纯净水   余量   余量   余量   余量
  10.防腐剂   适量   适量   适量   适量
测试实施例11：体内测量含有肉豆蔻衣木酚素的组合物的胶原 合成量
对无毛小鼠每天1次照射20J/cm2紫外线，持续4周，然后把100ml实施例40-47的含肉豆蔻衣木酚素的组合物涂抹在小鼠背部。然后对小鼠进行活组织切片检查，从组织学上测定了所述活组织检查组织中的胶原形成。在本申请中，对新生成的胶原量测量通过先将所述组织免疫染色，然后对经免疫染色的组织进行影像分析来进行。测定结果见表20。
【表20】
  结果   胶原增加率(％)
  对照   0
  化妆水实施例42   66.9
  化妆水实施例43   29.2
  化妆水实施例44   16.4
  化妆水实施例45   7.5
  对照   0
  化妆膏实施例46   69.8
  化妆膏实施例47   35.9
  化妆膏实施例48   17.8
  化妆膏实施例49   8.1
如表20所示，肉豆蔻衣木酚素的含量增加导致胶原合成量的增加，并且与化妆水相比化妆膏中所述提取物的活性更高。人们相信这是因为化妆膏在皮肤中的保留高于化妆水。
实施例50到53：制备含有本发明的肉豆蔻衣木酚素的饮料
按照一般的饮料制备方法，混合表21所示的成分(总体积：1000ml)并且在85℃下搅拌1小时，然后通过对上述溶液进行杀菌而制备成含有本发明的肉豆蔻衣木酚素的饮料。
【表21】
  成分  实施例50   实施例51   实施例52   实施例53
  本发明木酚素化合物  法拉格林A1000mg   奥斯托百木酚素71000mg   利卡灵E1000mg   肉豆蔻衣木酚素1000mg
  柠檬酸  1000mg   1000mg   1000mg   1000mg
  低聚糖  100g   100g   100g   100g
  牛磺酸  1000mg   1000mg   1000mg   1000mg
  纯水  余量   余量   余量   余量
产业上的可利用性
从上文中可以看出，本发明的肉豆蔻提取物、肉豆蔻假种皮提取物以及从所述提取物分离和纯化得到的法拉格林A、奥斯托百木酚素7、利卡灵E和肉豆蔻衣木酚素具有抑制胶原分解酶-1(MMP-1，基质金属蛋白酶-1)和诱导新胶原(I型原胶原)生成的活性，从而具有抗皱作用。因此，本发明的肉豆蔻提取物、肉豆蔻假种皮提取物以及从所述提取物分离和纯化得到的法拉格林A、奥斯托百木酚素7、利卡灵E和肉豆蔻衣木酚素可用于预防或治疗由光老化引起的皱纹。

Claims (6)

1.一种木酚素化合物用于制备减少皱纹的试剂的用途，所述木酚素化合物选自由通式1表示的法拉格林A、由通式2表示的奥斯托百木酚素7以及由通式3表示的利卡灵E：
[通式1]
Figure FDA00003067316600011
[通式2]
Figure FDA00003067316600012
[通式3]
Figure FDA00003067316600013
2.一种木酚素化合物用于制备诱导胶原合成的试剂的用途，所述木酚素化合物选自由通式1表示的法拉格林A、由通式2表示的奥斯托百木酚素7、由通式3表示的利卡灵E以及通式4表示的肉豆蔻衣木酚素，
[通式4]
Figure FDA00003067316600021
3.一种木酚素化合物用于制备抑制胶原分解的试剂的用途，所述木酚素化合物选自由通式1表示的法拉格林A、由通式2表示的奥斯托百木酚素7、由通式3表示的利卡灵E以及通式4表示的肉豆蔻衣木酚素。
4.肉豆蔻提取物或肉豆蔻假种皮提取物用于制备减少皱纹的试剂的用途。
5.肉豆蔻提取物或肉豆蔻假种皮提取物用于制备诱导胶原合成的试剂的用途。
6.肉豆蔻提取物或肉豆蔻假种皮提取物用于制备抑制胶原分解的试剂的用途。
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