Verfahren zur Herstellung von wachstumfördernde Stoffe enthaltenden Präparaten
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von wachstumfördernde Stoffe enthaltenden Präparaten für therapeutische Zwecke.
Es ist ein Verfahren zur Herstellung von Gewebeextrakten bekannt, die bei Degeneration, schlechter Regeneration, bei malignen Tumoren, etc. therapeutisch verwendet werden können. Die Gewinnung dieser Extrakte erfolgt in der Weise, dass man Tieren, die vorzugsweise noch nicht geschlechtsreif sind, oder Menschen Wundeffekte zufügt und nach eingetretener Heilung das in den Wunden gebildete Granulationsgewebe herausschneidet und in bekannter Weise extrahiert. Nach dem bekannten Verfahren kann man gegebenenfalls auch das Granulationsgewebe und andere Körpergewebe auf Nährplasma weiterzüchten, die so erhaltenen Gewebskulturen verletzen und anschliessend extrahieren.
Schliesslich kann man nach dem bekannten Verfahren auch aus den erhaltenen Extrakten ein Serum herstellen, indem man sie Tieren injiziert, nach einer gewissen Entwicklungszeit den behandelten Tieren Blut entnimmt und daraus in bekannter Weise ein Serum herstellt. Das bekannte Verfahren ist kostspielig und die Ausbeute an wirksamer Substanz nur gering.
Die Erfindung betrifft nun ein Verfahren zur Herstellung von wachstumfördernde Stoffe enthaltenden Präparaten für therapeutische Zwecke, welches Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass man das Mesenchym und/oder Parenchym von Organen mit innerer Sekretion von Wirbeltieren physikalisch und/oder chemisch reizt, aus diesen nach Erreichen einer erhöhten Aktivität noch im aktivierten Zustand exstirpierten Organen oder Teilen dieser Organe oder dem Blut oder dem Harn dieser Tiere einen Extrakt gewinnt und diesen Extrakt schonend von eiweissartigen Ballaststoffen befreit. Der enteiweisste Extrakt kann in eine hydrophile und eine lipophile Fraktion getrennt werden.
Bei den wachstumfördernden Stoffen, die in den Extrakten enthalten sind, handelt es sich u. a. um Hormone, die das normale Wachstum bis zur Vollentwicklung begünstigen oder den normalen Zellersatz, Zellstoffwechsel und die Zellregeneration im erwachsenen Organismus fördern. Diese Stoffe sind nicht eiweissartig. Die Wirkung des Präparates kann in bekannter Weise durch die relative Gewichtszunahme und die Erhöhung der Aktivität von Organen und Geweben festgestellt werden. Die erhöhte Aktivität ist z. B. durch die erhöhte Aufnahme radioaktiver Spurenelemente, z. B. C13 oder Tritium, nachweisbar. Das Wachstum erfolgt entweder durch raschere Neubildung von Zellen oder durch Bildung grösserer Zellen. Es sei diesbezüglich auf folgende Veröffentlichungen hingewiesen:
1.
Tünnerhoff und Schwabe: Arzneimittelforschung 8, 773-775 (1958)
2. Fritzsche: Zeitschrift für Haut- und Ge schlechtskrankheiten XXX, Heft 8, 235-261 (1961)
3. Jaeger etc.: Arzneimittelforschung 7, 750-754 (1965)
Unter der Bezeichnung reizen wird eine Beeinflussung des Ablaufs der Lebensvorgänge verstanden, wodurch ein Zustand erzielt wird, welcher als Erregung bekannt ist, und welcher durch die spezifische Erhöhung des Stoffwechsels des gereizten Organs erkennbar ist. Diese kann z. B. geprüft werden durch Erhöhung der Temperatur im gereizten Organ oder durch die erhöhte Aktivität, wie oben beschrieben.
In manchen Fällen können neben den wachstumfördernden Stoffen auch antagonistisch wirkende entstehen.
Als Beispiel für endokrine Drüsen von Wirbeltie ren, die der erfindungsgemässen Behandlung unterworfen werden, kommen vorzugsweise die Milz und die Thymusdrüse in Betracht.
Es ist bekannt, dass man durch Bestrahlung auf das Mesenchym oder Parenchym der verschiedensten Organe eine Reizwirkung ausüben und diese Organe in einen Zustand veränderter Aktivität versetzen kann. Vermutlich ist es der sich anschliessende Rege nerationsprozess, der für die Bildung der wachstumfördernden Stoffe der oben angegebenen Art verantwortlich ist. Zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens eignet sich daher jegliche Strahlungsenergie, von der kurzwelligsten Radiumstrahlung über die kurz-, mittel- und langweilige Röntgenstrahlung bis zu den Grenzstrahlen (Buckistrahlung).
Auch die Ultraviolettstrahlung, sichtbares Licht, Infrarotstrahlung und langwellige Wärmestrahlung ist zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens geeignet. Ferner sind auch Korpuskularstrahlen, wie Kanalstrahlen, schnelle Elektronen, Neutronen, Positronen und ähnliche Elementarteilchen, auch solche, die von radioaktiven Isotopen herrühren, bei dem erfindungsgemässen Verfahren anwendbar. Auch Ultraschallbestrahlung kann benutzt werden.
Der ausserordentliche Vorteil der Anwendung von Bestrahlung, um das Mesenchym oder Parenchym von endokrinen Drüsen in einen Zustand veränderter Aktivität zu versetzen, besteht darin, dass man die meisten Strahlungsarten fokussieren und damit auf eine bestimmte Körperebene konzentrieren kann. Da die Strahlung auch dosierbar ist, kann man die betreffenden Organe in jeden gewünschten und kontrollierbaren Zustand veränderter Aktivität versetzen.
In Verbindung mit der Bestrahlung oder auch gesondert, kann man den Zustand veränderter Aktivität auch durch Einverleibung chemischer Reizstoffe herbeiführen. Diese Einverleibung kann auf dem Weg der Injektion, der Einnahme bzw. Eingabe, der Einreibung oder Einatmung erfolgen. Man kann die betreffenden Reizstoffe in bestimmte Körperhöhlen einführen, sie mit Hilfe geeigneter mechanischer Hilfsmittel einschiessen oder perkutan zur Einwirkung bringen.
Chemische Reizstoffe, die sich zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens eignen, sind beispielsweise Farbstoffe, und zwar insbesondere solche, die einen spezifischen Fluoreszenzbereich besitzen; besonders geeignet sind solche Farbstoffe, deren Absorptionsspektrum im Bereich der angewandten Strahlung liegt. Auch an sich indifferente Substanzen wie Russ, Kohle, Kaolin, Kieselsäure und dgl. können zur Anwendung gebracht werden. Ferner eignen sich Stoffe, die als Medikamente Verwendung finden, vorzugsweise solche, die gespeichert werden können, wie Sulfonamide, Antibiotika, Röntgenkontrastmittel, schwermetallhaltige anorganische und organische Verbindungen, chemische Kampfstoffe und ihre Derivate, wie z. B.
Stickstofflost, Schlafmittel, Nucleinsäurederivate, insbesondere solche, die phosphoryliert sind, Anästhetica und deren Spaltprodukte, Impfstoffe, Sera, Pyrogene, Eiweisspaltprodukte, Stoffwechselprodukte (auch intermediäre), Desinfektionsmittel und dgl. Ausser den vorstehend erwähnten Stoffen sind dem Fachmann noch zahlreiche andere Reizstoffe tierischen oder pflanzlichen Ursprungs bekannt, die ebenfalls für die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens in Betracht kommen.
Als chemische Reizstoffe oder zweckmässiger als Aktivatoren für chemische Reizstoffe kommen auch radioaktive Elemente oder Verbindungen, wie z. B.
Radiokobalt, Radiojod oder Radiophosphor in Betracht.
Vorteilhaft ist es, solche chemischen Reizstoffe anzuwenden, die eine spezifische Organaffinität haben oder im Mesenchym gespeichert werden.
Wie schon erwähnt, übt die Bestrahlung und/oder Einverleibung chemischer Reizstoffe auf das Mesenchym und/oder Parenchym der endokrinen Drüsen eine Reizwirkung aus und fördert deren Aktivität.
Insbesondere fallen auch Verschiebungen des Aktivitätszustandes innerhalb einzelner Zellen unter diesen Begriff.
Man kann das Mesenchym oder Parenchym, das man durch Bestrahlung oder Einverleibung chemischer Reizstoffe gereizt hat, auf Nährböden in üblicher Weise, z. B. nach dem Carrell-Verfahren weiterzüchten und auf diese Weise ein Wachstum des Gewebes und damit eine Vermehrung der wachstumssteuernden Stoffe bei der anschliessenden Extraktion erzielen. Die Ausbeute an wachstumsfördernden Stoffen kann gegebenenfalls noch dadurch erhöht werden, dass man die Gewebe, bzw. den Gewebsbrei vor der Extraktion einem fermentativen Anreicherungsverfahren unterwirft.
Die bei dem erfindungsgemässen Verfahren vorgesehenen Extraktionen können in üblicher Weise durchgeführt werden, also beispielsweise durch Anwendung selektiv wirkender Lösungsmittel, z. B. Äthylalkohol, Adsorption an spezifisch wirkende Adsorbentien, wie Silikagel, Aluminiumhydroxyd, Floridin, Eiweissstoffe, Zellstoff und dgl. und anschliessende Elution.
Zweckmässig ist es, die erhaltenen Extrakte einer Reinigung zu unterwerfen, was nach den für die Reinigung von Enzymen und Hormonen entwickelten bekannten Methoden, wie Fällung mit spezifisch wirkenden Schwermetallsalzen, organischen Basen, anorganischen oder organischen Lösungsmitteln und dgl. geschehen kann. Als weitere Reingigungsmethoden seien u. a. die Dialyse, Chromatographie, die Gegenstromverteilung, erwähnt.
Bei der Extraktion wird durch Anwendung geeigneter Lösungsmittel zweckmässig eine Auftrennung in eine Lipoidfraktion und in eine wässrige Fraktion vorgenommen, die gesondert den üblichen Reinigungsverfahren unterworfen werden. Die Verfahrensprodukte können dann getrennt oder gemeinsam zur Anwendung gebracht werden. Auch können bei der Extraktion oberflächenaktive Stoffe mitverwendet werden. Während oder nach der Extraktions- und Reinigungsstufe kann man Aktivierungsvorgänge einschalten, wie sie allgemein üblich sind, also beispielsweise eine saure oder alkalische Hydrolyse, eine totale oder partielle fermentative Spaltung, eine Bestrahlung oder dgl.
Reaktivierungsmassnahmen empfehlen sich immer dann, wenn die wachstumsfördernden Stoffe in partiell oder total inaktivierter Form vorliegen oder ausgeschieden werden, wie es beispielsweise bei der Ausscheidung im Harn der Fall ist.
Die schonende Entfernung der eiweissartigen Ballaststoffe kann nach bekannten Methoden durchgeführt werden, z. B. mit Trichloressigsäure oder im Wege einer peptisch-tryptischen Fermentierung. Man kann auch eine fraktionierte alkoholische Fällung der Eiweissstoffe mitanwenden.
Statt direkt die behandelten Drüsen durch Extraktion aufzuarbeiten, kann man auch so vorgehen, dass man aus den betreffenden Drüsen durch Einführung von Kanülen oder Kathetern, durch Punktierung, durch Auswaschen und dgl. die in ihnen enthaltenen Körperflüssigkeiten entnimmt, aus denen dann die wachstumsfördernden Stoffe nach üblichen Extraktionsverfahren abgetrennt werden können. In geeigneten Fällen kann man die erhaltenen Körperflüssigkeiten, z. B. Blut nach entsprechender Vorbehandlung z. B. Enteiweissen, unmittelbar auf Serum verarbeiten.
Man kann die erfindungsgemäss erhaltenen, wachstumfördernde Stoffe enthaltenden Präparate Versuchstieren injizieren, um nach einer Inkubationszeit, deren Dauer empirisch durch Vorversuche zu bestimmen ist, ein Serum in üblicher Weise zu gewinnen.
Es lässt sich das Mesenchym und/oder Parenchym der endokrinen Drüsen von Wirbeltieren auch dadurch reizen, dass man die Sauerstoffaufnahme des zu verwendeten Organs mechanisch oder durch Einwirkung von Kälte (dosierter Erfrierungseffekt) drosselt.
Mit den nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhaltenen, wachstumfördernde Stoffe enthaltenden Präparaten lassen sich bei degenerativen und malignen Erkrankungen beachtliche therapeutische Erfolge erzielen.
Beispiel I
Eine gesunde Jungkuh erhält etwa 14 Tage vor der Schlachtung mehrere Injektionen einer 0,01-0,001 0/obige wässrige Tuschelösung von jeweils 1-100/o der zirkulierenden Blutmenge. Nach der Schlachtung des Tieres werden die endokrinen Drüsen mit sichtbarer Tuschspeicherung im Reticuloendoethel, wie z. B. Milz und Thymus, entnommen und aufbereitet.
Die Milz dieser behandelten Tiere zeigt in der histologischen Kontrolle eine nicht entzündliche Hyperplasie mit einer beträchtlichen Reticulose der roten Pulpa. Das Gewicht dieser Milz ist dementsprechend um etwa 50 O/o gegenüber dem Gewicht eines Kalbes gleichen Alters vergrössert.
Die feinvermahlene Milz wird mit der 4-fachen Menge 60 0/obigen Alkohol in der Kälte wiederholt extrahiert und die vereinigten alkoholischen Extrakte durch stufenweise Zugabe von reinem Alkohol fraktioniert enteiweisst, jeweils bis der Alkoholgehalt der Lösung 85 Vol. /o erreicht hat. Die alkoholische Lösung wird bei niedrigen Temperaturen im Vakuum vom Alkohol befreit. Aus 1 kg vorbehandelter Milz erhält man etwa 500 ml wässrigen Milzextrakt, der nach längerem Stehen in der Kälte über Filter geklärt wird. Die Enteiweissung des alkoholischen Rohextraktes wird durch peptisch/tryptische Fermenteinwirkung in der wässrigen Phase bei pH = 2 durchgeführt und die Wirkstoffe werden durch Dialyse in eine wässrige alkoholische Phase von höhermolekularen eiweissartigen Ballaststoffen befreit.
Die klare gelbliche Lösung des wässrigen Endproduktes mit 400ml Trockensubstanz /ml ist eiweissfrei (Hellersche Probe und Sulfosalizylsäure- Reaktion) und zeigt eine positive Glukose Oxydase-, Molisch-, Xantoproteinc, Millon'sche- und Ninhydrinreaktion. Das Absorptionsmaximum in salzsaurer Lösung liegt bei 247 m, u. Im Papierchromatogramm lassen sich die Desoxyriboside von Adenin, Urazil, Cytosin, Guanin, Hypoxanthin nachweisen, ferner die Aminosäuren Glutaminsäure, Asparaginsäure, Glykokol, Alanin, Serin, Valin und Leucin.
Der Milzextrakt zeigt in der Knochenmarkkultur eine depressive Wirkung auf die Proliferation und Ausreifung der Granulozyten und eine deutlich wachstumhemmende Wirkung auf bestimmte Tiertumor, wenn die Versuchstiere tgl. mit dem Extrakt parente- ral behandelt werden.
Die Thymusdrüsen des vorbehandelten Kalb es zeigen Hyperplasie mit Hypertrophie und Hyperplasie der Reticulumzellen im Markbereich. Das Mengenverhältnis zwischen Mark- und Rindenzellen ist zugunsten der ersteren verändert. Die Thymusdrüse wird in gleicher Weise wie die Milz aufgearbeitet, der erhaltene Extrakt zeichnet sich ebenfalls durch einen hohen Gehalt an Desoxyribosiden und Aminosäuren aus. Im Kaulquappentest zeigt er eine dosisabhängende Hemmung des Wachstums und der Metamorphose. Am Warmblüter wird der Stoffwechsel signifikant herabgesetzt. (Senkung der Mittelwerte der Kerntemperatur).
Im Radiojodtest an der Schilddrüse in vivo zeigt sich eine Hemmung der Jodaufnahme und der Thyrozin-Ausschüttung. In Übereinstimmung mit diesen experimentellen Befunden zeigt sich der Extrakt aus aktivierten Thymi wirksam bei Patienten mit Thyreotoxikosen.
Beispiel 2
Einem unter Narkose stehenden jungen Rind wird die Milz freigelegt, mit mehreren Radiumnadeln gespickt oder durch Röntgentiefenbestrahlung mit mindestens 2000 r bestrahlt. Nach Applikation dieser Röntgen- bzw. Radiumdosis wird die Operationswunde vernäht und das Tier 2-6 Tage später geschlachtet. Die Milz wird dann nach einem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren aufgearbeitet.