DE3114641A1

DE3114641A1 - Immunosuppresives mittel in einer dosierungseinheit und verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE3114641A1
Application number: DE19813114641
Authority: DE
Inventors: Takao Tokyo Ando; Masahiko Fujii; Tohru Kawagoe Saitama Hirai; Kenichi Matsunaga; Yoshiharu Yono Saitama Oguchi; Norio Urawa Saitama Takahashi; Chikao Kunitachi Tokyo Yoshikumi
Original assignee: Kureha Corp
Current assignee: Kureha Corp
Priority date: 1980-04-11
Filing date: 1981-04-10
Publication date: 1982-02-11
Also published as: GB2078229B; FR2480122B1; JPS56145297A; FR2480122A1; JPS6346760B2; GB2078229A

Description

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2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die isoelektrische Fokussierung unter Verwendung einer Säule durchgeführt wird.

3. Mittel nach Anspruch 1_f dadurch gekennzeichnet, daß die isoelektrische Fokussierung unter Einsatz eines körnigen Gels durchgeführt wird.

4. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Serum oder die Ascites von einem an einer Krebskrankheit leidenden Patienten gesammelt worden sind.

5. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Serum oder die Ascites aus einem Warmblüter gesammelt worden sind, in welche Krebszellen oder Krebsgewebe transplantiert worden sind.

6. Verfahren zur Herstellung eines Glykoproteins mit einer immunosuppressiven Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß das Serum oder die Ascites von Menschen oder Warmblütern einer isoelektrischen Fokussierung unterzogen werden und die Fraktion bei einem isoelektrischen Punkt zwischen 2,6 und 3,6 gesammelt wird.

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Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Glykoproteins mit einer immunosuppressiven Aktivität aus dem Serum oder den Asciten von Menschen oder Warmblütern sowie das auf diese Weise erhaltene Glykoprotein.

Das charakteristische Merkmal der vorliegenden Erfindung liegt in der Gewinnung eines Glykoproteins mit einer immunosuppressiven Aktivität durch isoelektrische Fokussierung von Seren oder Ascites von Menschen oder Warmblütern und Sammeln der Fraktion bei einem isoelektrischen Punkt zwischen 2,6 und 3,6.

Die Erfindung wird durch die beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 Das Infrarotabsorptionsspektrum des Glykoproteins, das erfindungsgemäß erhalten worden ist,

Fig. 2 das UV-Absorptionsspektrum des Glykoproteins.

Bisher wurde bei der Diagnose von Krebsen sowie bei der Bestimmung des Ausmaßes des Fortschreitens von Krebskrankheiten auf dem klinischen Gebiet der Cancerologie das fötale Protein, das in dem Serum eines krebskranken Patienten auftritt, beispielsweise (X-Fetoprotein und carcinoembryonisches Antigen (CEA), die Empfindlichkeit des Patienten gegenüber Tuberkulin (PPD) und 2,4-Dinitrochlorbenzol und das Ausmaß der Blastogenese von Lymphocyten in dem peripheralen Blut des Patienten infolge von Phytohemagglutinin bestimmt.

Diese Bestimmungen sowie die Testreaktion werden auf der Grundlage einer Beziehung zwischen der Verminderung der Immunität des krebskrankon Patienten und dem Fortschreiten der Krebskrankheit des Patienten durchgeführt. In den ver-

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gangenen Jahren erschienen Arbeiten, welche das Vorliegen von Substanzen mit einer immunosuppressiven Aktivität von Menschen und Warmblütern in den Seren von Menschen und Warmblütern beschrieb. Beispielsweise beschrieben Cooperband et al. immunoreguläres Ct-Globulin als vorstehend erwähnte Substanz (vgl. "Transplantation Proceedings", Band 8, Nr. 2 (1976) S. 225 bis 242), während Ishida et al. ein saures Protein als vorstehend erwähnte Substanz ansahen (XXXV Jährliches Treffen der Japanese Cancer Association, 1976).

Diese Substanzen mit einer immunosuppressiven Aktivität unterdrücken die Zellimmunität und die humorale Immunität von Menschen und Warmblütern und unterdrücken auf diese Weise eine Transpl antatabstoßung. Daher eignet sich eine derartige Substanz zur Verhinderung und zur Behandlung einer Abstoßung im Falle von Transplantationen.

Gemäß Ishida et al. wird das saure Protein mit einer immunosuppressiven Aktivität dadurch hergestellt, daß Seren oder Ascites von Menschen oder Warmblütern einer Anionenaustauscherchromatographie unterzogen werden und die Fraktion gesammelt wird, die bei einem pH zwischen 2,9 und 3,3 eluiert wird (vgl. die JP-OS 53-44611/1978, die am 6. November 1980 unter der Nr. 55-43479/1980 veröffentlicht worden ist). Das von Ishida et al. erwähnte saure Protein wird fraktionell durch Adsorption und Eluierung der Seren oder Ascites gesammelt. Die Methode ist jedoch mit dem Nachteil behaftet, daß eine relativ kleine Menge des sauren Proteins mit einer relativ geringen Aktivität bezüglich der Unterdrückung der Immunität infolge der in der Praxis schwierig durchzuführenden Stufen erhalten wird.

Die Erfindung hat sich daher die Aufgabe gestellt, ein einfacheres Verfahren zur Gewinnung eines Glykoproteins mit einer hohen Aktivität bezüglich einer Unterdrückung

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der Immunität aus Seren oder Ascites von Menschen oder Warmblütern in großen Mengen zur Verfügung zu stellen.

Durch die Erfindung wird ein Glykoprotein mit einer hohen immunosuppressiven Aktivität in Menschen oder Warmblütern sowie ein Verfahren zur Herstellung des Glykoproteins aus Serum oder Ascites von Menschen oder Warmblütern in großen Mengen geschaffen.

Die Erfindung wird nachfolgend näher erläutert:

Als Ausgangsmaterial zur Durchführung der Erfindung können beispielsweise Seren oder Ascites von Krebspatienten oder Warmblütern verwendet werden, in welche Krebszellen oder Krebsgewebe transplantiert worden sind.

Um die Seren oder Ascites einer isoelektrischen Fokussierung unterziehen zu können, werden beispielsweise in dem Falle, daß die Ascites eines Krebspatienten verwendet werden, diese zentrifugiert oder filtriert, um die darin nicht gelösten festen Materialien zu entfernen, worauf die gereinigten Ascites in einer Säule einer isoelektrischen Fokussierung oder einer isoelektrischen Fokussierung mittels eines körnigen Gels bei einem pH zwischen 2,6 und 3,6 unterzogen werden.

Zur Durchführung der isoelektrischen Saulenfokussierung wird ein amphoterer Träger mit einem pH von 2,5 bis 6,0, wie Ampholine ^ (hergestellt von der LKB Company, Schweden) in Wasser aufgelöst, worauf die Lösung und eine wäßrige Lösung von Rohrzucker, Ethylenglykol oder Glycerin zur Herstellung einer Lösung mit einem Dichtegradienten in einem Glasrohr verwendet wird. In einer derartigen Säule werden die gereinigten Seren oder Ascites einer isoelektrischen Fokussierung bei einer konstanten Energie von 3 bis 20 W unterzogen, worauf die Fraktion bei einem isoelektrischen Punkt von 2,6 bis 3,6 gesammelt wird.

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Im Falle einer isoelektrischen Fokussierung unter Einsatz eines körnigen Gels wird eine Platte unter Einsatz von Ampholine und einer Gelsubstanz, wie Sephadex ^νάν G-75 (hergestellt von der Pharmacia Company, Schweden) hergestellt, worauf gereinigte Seren oder Ascites nach einer isoelektrischen Fokussierung·auf der Platte fraktioniert werden.

Die amphotere Substanz sowie die Substanz zur Herstellung des Dichtegradienten, welche in der gesammelten Fraktion verblieben sind, werden dadurch entfernt, daß die Fraktion einer Dialyse oder Ultrafiltration zur Reinigung der Fraktion unterzogen wird.

Die auf diese Weise erhaltene Elektrophoresefraktion wird zur Gewinnung des Glykoproteins gefriergetrocknet.

Das erfindungsgemäß erhaltene Glykoprotein besitzt folgende physikalische Eigenschaften:

1. Aussehen:

Weißes Pulver

2. Löslichkeit:

Löslich in Wasser, einer wäßrigen physiologischen Salzlösung sowie einer Phosphorsäure-Pufferlösung, unlöslich in Methanol, Ethanol, Propanol, Butanol, Aceton, Chloroform, Ether und Ethylacetat.

3. Isoelektrischer Punkt:

pH 2,6 bis 3,6 (bestimmt durch isoelektrische Fokussierung in einer flachen Platte).

4. Farbreaktion:

Positiv gegenüber der Lowry-Folin-Reaktion, dor Ehrlich-Reaktion, der Buret-Reaktion, der Ninhydrinreaktion sowie der Molisch-Reaktion (Phenolschwefelsäurereaktion) .

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5. Infrarotabsorptionsspektrum: Vgl. Fig. 1, erhalten nach der

KBR-Methode, wobei die Konzentration 0,2 Gew.-% beträgt.

6. UV-Absorptionsspektrum: Vgl. Fig. 2, in reiner wäßriger

Lösung in einer Konzentration von 0,01 %.

Die Aktivität der erfindungsgemäßen Substanz zur Unterdrückung der Immunität wird nachfolgend erläutert:

Eine Untersuchung der immunosuppressiven Aktivität der erfindungsgemäßen Substanz auf die Unterdrückung einer Blastogenese von Lymphocyten in menschlichem perhipheralen Blut und Mäusemilzzellen durch Phytohemagglutinin (PHA) hat ergeben, daß 1,0 mg der erfindungsgemäßen Substanz in 1 ml einer Unterdrückung von 100 % im ersteren Falle und 90 % im letzteren Falle ergeben, und daß sogar 0,1 mg der erfindungsgemäßen Substanz in 1 ml eine Unterdrückung von 80 % im ersteren Falle und 55 % im letzteren Falle bedingen.

Eine Untersuchung der verzögerten foot-pad-Reaktion gegenüber Schaferythrocyten in ICR-Mäusen hat ergeben, daß die intraperitoneale Verabreichung von 100 Mikrogramm pro Tier die Reaktion um ungefähr 50 % unterdrückt im Vergleich zu einem Vergleichstest, bei dessen Durchführung die erfindungsgemäße Substanz nicht verabreicht worden ist.

Aus den vorstehend erwähnten Ergebnissen ist zu ersehen, daß die erfindungsgemäße Substanz eine hohe immunosuppressive Aktivität besitzt.

Daher ist festzustellen, daß sich die erf indungsgemäße Substanz zur Verhinderung und zur Behandlung der immunologischen

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Abstoßung im Falle von chirurgischen Transplantationen eignet.

Um das erfindungsgemäß erhaltene Glykoprotein zur Verhinderung und zur Behandlung der immunologischen Abstoßung im Falle einer Operation oder Transplantation einzusetzen, wird dieses durch intraperitoneale Injektion ungefähr 24 h vor der Operation verabreicht, wobei die intraperitoneale Verabreichung des Glykoproteins auch nach der Operation fortgesetzt wird. Die Dosis beträgt im allgemeinen 20 mg/kg/Tag einmal vor der Operation, wobei die gleiche Menge kontinuierlich 14 Tage nach der Operation verabreicht wird.

Die akute Toxizität des Glykoproteins wird nach folgendem Test ermittelt:

Eine Reihe wäßriger Lösungen des Glykoproteins wird intraperitoneal in 15 DKI-Mäuse injiziert, um ihre Mortalität 1 Woche nach der Injektion zu untersuchen. Sogar in.der höchsten Konzentration, die 1000 mg/kg Körpergewicht entspricht, werden keine Todesfälle bei den behandelten Mäusen festgestellt.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Nachdem man 10 ml des Blutes, das aus einem Patienten mit einem hepatischen Krebs entnommen worden ist, in der vorliegenden Form 30 bis 60 min stehengelassen hat, wird dieses Blut mit ungefähr 1500 G 10 min zentrifugiert, wobei 5 ml einer übestehenden Flüssigkeit erhalten werden.

Getrennt werden 2 wäßrige Lösungen von Ampholine (siehe oben) mit einem pH von 2,5 bis 4,0 bzw. 4,0 bis 6,0 zu einer wäßrigen Lösung eines amphoteren Trägers mit einem pH von 2,6 bis 6,0 vermischt (nachfolgend

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- 9 als Ampholine-Lösung bezeichnet).

Dann werden zwei Arten einer flüssigen Mischung, und zwar eine dichte Flüssigkeit (1) und eine leichte Flüssigkeit (2) hergestellt, und zwar die Flüssigkeit (1) durch Vermischen von 11 ml der AmpHoline-Lösung mit 137 ml destilliertem Wasser, das 108 g Rohrzucker enthält, und die Flüssigkeit (2) durch Vermischen von 3,6 ml der Ampholine-Lösung mit einer Lösung, die hergestellt worden ist durch Auflösen von 5 ml der überstehenden Flüssigkeit der Probe (des Blutes) in destilliertem Wasser unter Einstellung einer Lösung mit einem Volumen von 211 ml und weiteres Auflösen von 10,8 g Rohrzucker in der Lösung. Diese zwei Arten einer flüssigen Mischung werden in ein Glasrohr mit einem Fassungsvermögen von 440 ml (Glassäule für isoelektrische Fokussierung, Typ 8102, hergestellt von der LKB Company, Schweden) nach einem Vermischen in einem geeichten "Gradientenmischer" eingefüllt. Die isoelektrische Fokussierung wird bei einer Spannung von 550 V, einem Strom von 9,1 mA gestartet und bei einer konstanten Leistung von 5 W während 23 h fortgesetzt und bei einer Spannung von 1500 V abgestoppt.

Nachdem die isoelekrische Fokussierung beendet ist wird die Fraktion mit einem pH zwischen 2,6 und 3,6 aus der Glassäule gesammelt, gegen fließendes Wasser zur Entfernung von Ampholine und Rohrzucker, die noch in der Fraktion verblieben sind, dialysiert und gefriergetrocknet, wobei das gereinigte Glykoprotein in einer Menge von 5,2 mg/10 ml der Probe (des Blutes) erhalten wird.

Eine Untersuchung der Unterdrückung einer Blastogenese der Lymphocyten in menschlichem peripheralen Blut sowie der Milzzellen von Mäusen infolge von PHA ergibt, daß das Ausmaß der Unterdrückung der Blastogenese der Lymphocyten sowie der Milzzellen jeweils 100 bzw. 90 % in einer Konzentration von 1,0 mg des Glykoproteins/ml und 80 bzw. 55 % in einer Konzentration von 0,1 mg des Glykoproteins/ml

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beträgt.

Zur weiteren Untersuchung der Unterdrückung durch das Glykoprotein wird dieses intraperitoneal in ICR-Mäuse in einer I-Ienge von 100 μg/Tier eingespritzt und die verzögerte Foot-Pad-Reaktion infolge von Schaferythrocyten ermittelt. Das Ausmaß der Unterdrückung wird zu 49 % ermittelt.

Beispiel 2

25 ml Ascites, die aus einem menschlichen Patienten, der an Dickdarmkrebs litt, gesammelt,wurden, wurden in einer KühlZentrifuge mit 10 000 G 30 min zur Gewinnung einer überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert.

Die auf diese Weise erhaltene überstehende Flüssigkeit wurde einer isoelektrischen Fokussierung in einer isoelektrischen Fokussiervorrichtung des Plattentyps (hergestellt von der LKB Company, Schweden) unter Verwendung einer Platte, hergestellt gemäß Beispiel 1 aus einer Lösung von Ampholine mit einem pH von 2,5 bis 6,0 und Sephadex G-75 bei einer konstanten Leistung von 8 W während 40 h, wohrtai bei einer Spannung von 300 V und einem Strom von 26,7 mA gestartet wurde, unterzogen. Nachdem die Fokussierung eine Spannung von 1200 Volt erreicht hat, wird die Fraktion mit einem pH von 2,6 bis 3,6 zusammen mit Sephadex G-75 gesammelt und mit Wasser zum Auswaschen der Fraktion gewaschen. Die auf diese Weise erhaltene Flüssigkeit wird gegenüber fließendem Wasser zur Entfernung von Ampholine dialysiert und das Dialysat zur Gewinnung von 24 mg Glykoprotein gefriergetrocknet .

Eine Untersuchung der immunosuppressiven Aktivität des auf diese Weise erhaltenen Glykoproteins gemäß Beispiel 1 zeigt, daß das Ausmaß der Unterdrückung einer Blastogenese der Lymphocyten in dem menschlichen peripheralen Blut infolge PHA 100 % bei einer Konzentration von 1,0 mg des Glyko-

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proteins/ml beträgt.

Beispiel 3

Es wird eine Reihe von Tiervorsuchen zur Untersuchung der verhindernden Wirkung des Glykoproteins/ das auf den Krebspatienten gemäß Beispiel 1 zurückgeht, auf die immunologische Abstoßung im Falle einer chirurgischen Transplantation untersucht.

Mäuse des DKI-Stammes werden zur Durchführung des Experiments eingesetzt. In 15 dieser Mäuse werden 20 mg/kg des Glykoproteins intraperitoneal vor der Transplantation eines Hautstückes aus einer C3H/He-Maus injiziert. In andere 15 Mäuse werden 0,2 ml/kg einer wäßrigen physiologischen Kochsalzlösung intraperitoneal zu Vergleichszwecken ebenfalls vor der Transplantation injiziert.

Nach der Transplantationsoperation wird das Glykoprotein intraperitoneal in einer Dosis von 20 mg/kg/Tag 14 Tage lang in die Versuchsmäuse injiziert, während die physiologische Kochsalzlösung intraperitoneal in einer Dosis von 0,2 ml/kg/Tag während der gleichen Anzahl von Tagen in die Vergleichsgruppe eingespritzt wurde.

Es wurde keine Abschälung des transplantierten Hautstückes auf den Versuchsmäusen festgestellt, an die das Glykoprotein während und sogar 2 Wochen nach Beendigung der Verabreichung verabreicht wurde. Andererseits schälte sich auf allen Tieren der Vergleichsgruppe das transplantierte Hautstück 10 Tage nach der Transplantation ab.

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Claims

MÜLLER-BOBE · DEUFEL · SCHÖN · HEKTEL PATKSTANWlLTS SVBOFEAN PATKNT ATTOBHBTS DR. WOLFGANG MÜLLER-BORE (PATENTANWALT VON 1927 - 1975) DR. PAUL DEUFEL. DIPL.-CH EM. DR. ALFRED SCHÖN. DIPL.-CHEM. WERNER HERTEL. DIPL.-PHYS. K 1542 Kureha Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha 9-11 Horidonic-cho 1-chomo, Nnhonbashi, Chuo-ku, Tokyo / Japan Immunosuppressives Mittel in einer Dosierungseinheit und Verfahren zu seiner Herstellung Patentansprüche

1. Immunosuppressives Mittel in einer Dosierungseinheit, gekennzeichnet durch ein Glykoprotein mit einem isoelektrischen Punkt von 2,6 bis 3,6, das dadurch erhalten worden ist, daß das Serum oder die Ascites von Menschen oder Warmblütern einer isoelektrischen Fokussierung unterzogen werden und dann die Fraktion beim isoelektrischen Punkt zwischen 2,6 und 3,6 gesammelt wird.

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