EP0000134A1 - Glykoprotein, Verfahren zu seiner Herstellung, seine Verwendung zur Gewinnung von Antiserum sowie das Antiserum - Google Patents

Glykoprotein, Verfahren zu seiner Herstellung, seine Verwendung zur Gewinnung von Antiserum sowie das Antiserum Download PDF

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EP0000134A1
EP0000134A1 EP78100134A EP78100134A EP0000134A1 EP 0000134 A1 EP0000134 A1 EP 0000134A1 EP 78100134 A EP78100134 A EP 78100134A EP 78100134 A EP78100134 A EP 78100134A EP 0000134 A1 EP0000134 A1 EP 0000134A1
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protein
acetylated
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    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
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    • Y10S530/85—Reproductive organs or embryos
    • Y10S530/851—Placenta; amniotic fluid

Definitions

  • the invention relates to a new glycoprotein that can be detected in blood serum, urine and in the extract of human placentas and isolated therefrom, and a method for its production.
  • the protein solution obtainable by the aqueous extraction of human placentas contains a large number of components, some of which can be assigned to the serum proteins and some of which are tissue proteins.
  • the object of the invention is to isolate a serum glycoprotein, which is not yet known, from the extract of human placentas, so that antisera directed specifically against the new glycoprotein can be produced, with which the glycoprotein in the serum and in the urine can be qualitatively detected or quantified .
  • the invention relates to a new glycopronein; which is available from blood serum, urine and the extract of human placentas. It is characterized by a protein content, essentially consisting of ⁇ -amino acids of 75 ⁇ 6%, a carbohydrate content of 24.6 ⁇ 5.2 of which hexoses 8.9 ⁇ 2%, N-acetylated hexosamine 7.1 t 1.5%, fucose 0.2 ⁇ 0.2%, N-acetylated neuraminic acid 8.4 ⁇ 1.5%, a sedimentation coefficient s 20w of 2.5 ⁇ 0.3 S, a molecular weight of 35,000 ⁇ 5,000 based on the determination in the ultracentrifuge or a molecular weight of 65,000 ⁇ 10,000 based on the determination in the sodium dodezyl sulfate-containing Polyacrylamide gel, an isoelectric point of pH 3.4 ⁇ 0.4, an extinction coefficient E (280 nm) of 1.9 ⁇ 0.3, an electrophoretic mobility
  • the sediment equilibrium method and the polyacrylamide gel electrophoresis were used to determine the molecular weights.
  • the determination in the ultracentrifuge was carried out at 9,000 rpm.
  • the evaluation was carried out on the basis of a partial specific volume of 0.74 mg / g. In the Ultracentrifuge resulted in a molecular weight of 35,000 ⁇ 5,000.
  • the isoelectric point was determined using a column (440 ml) from LKB Sweden.
  • the so-called ampholine mixture had a pH range of 2.5 to 4.0 when examining the glycoprotein.
  • the electrophoretic mobility was examined in the micromodification by Beckmann Instruments on cellulose acetate films with sodium diethyl barbiturate buffer pH 8.6.
  • the amino acid analysis was carried out according to S. Moore, DH Spackmann, WH Stein, Anal. Chem. 30, page 1185, (1958), using the Multichrom B liquid chromatograph from Beckmann. 1/2 cystine was obtained after oxidation of the proteins with performic acid (S. Moore et al., Anal. Chem. 30, page 1185, (1958)) and subsequent chromatography (S. Moore, J.Biol.Chem. 238, page 235 , (1963)) as cysteic acid.
  • the tryptophan content is with direct photometric determination according to H. Edelhoch, Biochemistry 6, page 1948, (1967).
  • the simplest way of immunologically characterizing the substance is with a known diffusion method in which antigen, i.e. the glycoprotein and an antibody directed against the glycoprotein or the antiserum not enriched with respect to the antibodies against one another in a carrier medium, such as e.g. Agar, diffuse. If the two reaction components meet in a favorable ratio, a visible precipitate forms. According to this knowledge, it is obvious to the person skilled in the art that all immunological techniques for the detection and determination of both the new glycoprotein and the antibodies directed against the glycoprotein are possible.
  • the Laurell technique is a simple and generally sufficiently precise method for the quantitative determination of glycoprotein in body fluids or in tissue extracts. It is described in analyte. Biochem. (New York), 15, page 45 (1966).
  • the invention furthermore relates to a process for the preparation of the glycoprotein characterized above, characterized in that body fluids or extracts from organs which contain the glycoprotein are fractionated on the basis of the following criteria found according to the invention.
  • the glycoprotein can be precipitated with neutral salts.
  • ammonium sulfate usually used for such precipitations, it is precipitated at a saturation concentration of 30 to 60% of the salt in a pH range near the neutral point.
  • the glycoprotein can of substances with Molecular weights between 25,000 and 75,000 are suitable.
  • the methods of gel filtration or ultrafiltration are advantageously used for this.
  • the glycoprotein is adsorbed onto weakly basic ion exchangers at neutral or weakly alkaline pH.
  • a comparatively less concentrated buffer solution is advantageously used, because the adsorption can be prevented by increasing the salt concentration or also by lowering the pH.
  • this behavior is known, there is the possibility of adsorbing the glycoprotein and eluting it using more concentrated salt solutions or buffer solutions with a reduced pH.
  • the new glycoprotein is not precipitated with the water-soluble organic bases of the acridine and quinoline series, which are usually used for protein precipitation processes. It remains in the aqueous supernatant in the concentrations customary in this process. Thereafter, an acridine base such as 2-ethoxy-6,9-diaminoacridine lactate or a quinoline base such as bis (2-methyl-4-aminoquinolyl-6) carbamide hydrochloride can be used to precipitate accompanying proteins, the glycoprotein according to the invention excess remains.
  • an acridine base such as 2-ethoxy-6,9-diaminoacridine lactate or a quinoline base such as bis (2-methyl-4-aminoquinolyl-6) carbamide hydrochloride
  • hydroxyapatite as an adsorbent for proteins.
  • the new glycoprotein shows no affinity for hydroxyapatite, whereas a number of accompanying proteins are retained by hydroxyapatite.
  • the glycoprotein is therefore one of the hydroxylapatite-passing globulins.
  • the inventor suggests to call it hydroxylapatite passing globulin (HPG-2).
  • the preparative zone electrophoresis can be used for the enrichment or isolation of the glycoprotein.
  • the affinity of the glycoprotein due to its immunological behavior can be used to enrich the glycoprotein with the help of so-called immune adsorption processes.
  • an immunoadsorbent i.e. a carrier-bound antibody against which new glycoprotein are produced, which is able to bind the glycoprotein specifically.
  • the glycoprotein can then be eluted again by changing the milieu conditions, as described several times in the specialist literature.
  • the substances according to the invention can be isolated by means of a selected combination of the methods mentioned, which on the one hand lead to the enrichment of the glycoprotein and on the other hand to a separation of other accompanying proteins. Accordingly, the subject of the present invention is in the individual enrichment steps. to be seen for the new glycoprotein and in the processes for its purification resulting from the combination of the enrichment measures.
  • the guideline for the process for the production of the glycoprotein is that the portion is obtained which gives a positive immunological reaction with an antiserum directed against the new glycoprotein.
  • the glycoprotein is still contaminated by other immunologically detectable accompanying proteins.
  • the impurities are removed by their specific adsorption.
  • You use yourself common techniques of immunoadsorption in which, according to the methods described, antibodies bound to a carrier against the protein to be removed are used as adsorbents.
  • the largely pure new glycoprotein is still associated with traces of the pregnancy-specific ⁇ 1 glycoprotein and / or the ⁇ 1 B glycoprotein, also known as easily precipitated a 1 glycoprotein.
  • immunoglobulins directed against the proteins and which are covalently bound to crosslinked agar preparations such as, for example, SEPHAROSE, can be used.
  • the protein solution applied to a column which has been filled with the specific immunoadsorbent passes through the column undisturbed insofar as only those components against which the carrier contains an immunologically active partner are bound. In this way, the new glycoprotein can be freed from the impurities.
  • the new glycoprotein To produce the new glycoprotein, several of the measures listed are combined with one another and in each case the fraction is further processed in which the new glycoprotein can be detected immunologically, while the other fractions are discarded.
  • Any body fluid or organ extract can be used as the starting material for the production of the new glycoprotein, in which it is possible to detect the glycoprotein immunologically.
  • Extracts of human placentas are preferably used, which can be obtained by comminution and extraction with water or a dilute, advantageously a less than 10% salt solution, advantageously with a 0.5% neutral salt solution, such as sodium chloride. It is advisable to use about 1 - 5 liters of the extraction solution on 1 kg of placenta. The undissolved portions are separated from the extract by centrifugation or filtration.
  • the zone in question is cut out and eluted from the inert support material with the aid of water or aqueous salt solutions, for example a 0.5 to 1% saline solution.
  • the glycoprotein produced according to the invention has antigenic properties.
  • An immunization of animals carried out by known methods led to the formation of specific antibodies in the blood of the immunized animals. Their sera can be obtained by conventional methods and the antibodies contained therein can be enriched.
  • the antisera can be used in known immunological methods for the detection and determination of the new protein in body fluids, in particular in the blood serum.
  • 150 kg of frozen placenta are crushed and extracted with 150 l of a 0.5% aqueous sodium chloride solution.
  • the extract is adjusted to pH 8 with 2N sodium hydroxide and mixed with 50 liters of a 3% aqueous solution of diaminoethoxyacridine lactate.
  • the supernatant which contains the glycoprotein (HPG-2) according to the invention is siphoned off, mixed with 5% solid sodium chloride (11 kg) to separate the diaminoethoxyacridine lactate still in solution, filtered and obtained at 30% to the weight of the liquid - solid ammonium sulfate added and stirred well. After 1 hour the precipitate is filtered off.
  • 500 g of the precipitate collected on the filter are dissolved in 500 ml of distilled water and dialyzed against a 0.01 molar tris (oxymethyl) aminomethane-hydrochloric acid buffer solution of pH 7.0, which contains 0.05% sodium azide .
  • the dialyzed solution is centrifuged and the supernatant is made up to 2,000 ml with the same buffer solution, adjusted to pH 8.0 with 0.1N sodium hydroxide solution and stirred with 500 g of moist diethylaminoethyl cellulose (Serva, Heidelberg) for 1 hour.
  • diethylaminoethyl cellulose is separated from the solution by filtration, washed twice with 1 liter of 0.01 molar tris (oxymethyl) aminomethane-hydrochloric acid buffer with a pH of 8.0 and then three times with 500 ml of 0.02 molar Tris (oxymethyl) aminomethane hydrochloric acid buffer, pH 6.5, which contains: 0.85% sodium chloride and 0.05% sodium azide; eluted.
  • the eluates are then tested with specific antiserum, the fractions containing the glycoprotein (HPG-2) are collected and the proteins are precipitated again with 30% solid ammonium sulfate, as described above.
  • the precipitate is dissolved in 50 ml of water, dialyzed against a 0.005 m phosphate buffer, pH 6.8, and placed on a 3 ⁇ 23 cm column filled with hydroxyapatite.
  • the column is developed using the 0.005 m phosphate buffer, pH 6.8.
  • the glycoprotein (HPG-2) appears in the run; this is concentrated on an ultrafilter.
  • the concentrate is then dialyzed against a 0.01 M Tris-HCl buffer, pH 7.0, and adsorbed on DEAE-SEPHADEX (column 3 ⁇ 23 cm).
  • a NaCl gradient of 0-2% is used to elute and separate the adsorbed proteins.
  • the eluate fractions containing the glycoprotein (HPG-2) are concentrated together.
  • the concentrated eluate is taken up in a 0.075 m ammonium bicarbonate solution and subjected to preparative zone electrophoresis.
  • the zone containing the HPG-2 is cut out after separation and eluted with physiological saline; the eluates are then concentrated on the ultrafilter.
  • the ⁇ 1 B glycoprotein still present as an impurity is removed with the aid of an appropriate immunoadsorbent.
  • an appropriate immunoadsorbent antibodies against the a 1 B glycoprotein are covalently bound to Sepharose and the adsorbent thus obtained is brought into contact with the eluate in a batch process or in a column.
  • the a 1 B glycoprotein is adsorbed onto the carrier-bound antibodies, while the glycoprotein HPG-2 remains in solution.
  • the solution, which then only contains HPG-2, is dialyzed against water and lyophilized. About 10 to 30 mg of the new glycoprotein HPG-2 are obtained.

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Abstract

Gegenstand der Erfindung ist ein neues Glykoprotein, welches aus Blutserum, aus Urin und dem Extrakt menschlicher Plazenten erhältlich ist. Es ist gekennzeichnet durch einen Proteinanteil, im wesentlichen bestehend aus α-Aminosäuren, von 75 ± 6%, einen Kohlenhydratanteil, von 24,6 ± 5,2%, davon Hexosen 8,9 ± 2 %, N-acetyliertes Hexosamin 7,1 ± 1,5 %, Fucose o,2 ± 0,2 %, N-acetylierte Neuraminsäure 8,4 ± 1,5 %, einen Sedimentationskoeffizienten S20w von 2,5 ± 0,3 S, ein Molekulargewicht von 35 000 ± 5 000 aufgrund der Bestimmung in der Ultrazentrifuge bzw. ein Molekulargewicht von 65 000 ± 10 000 aufgrund der Bestimmung im Natriumdodezylsulfat-haltigen Polyacrylamidgel, einen isoelektrischen Punkt von pH 3,4 ± 0,4, einen Extinktionskoeffizienten E ??? (280 nm) von 1,9 ± 0,3, eine elektrophoretische Beweglichkeit im Bereich zwischen den α1- und den α2-Globulinen und eine spezifische immunologische Reaktion mit einem spezifisch gegen dea Glykoprotein gerichteten Antikörper. Man gewinnt das Glykoprotein, indem man Körperflüssigkeiten oder Extrakte von Organen, welche das Glykoprotein enthalten, fraktioniert. Zur Gewinnung von Antiseren werden Wirbeltieren mit dem Glykoprotein immunisiert.

Description

  • Die Erfindung betrifft ein neues Glykoprotein, das im Blutserum, im Urin und im Extrakt menschlicher Plazenten nachgewiesen und daraus isoliert werden kann sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung.
  • Die durch die wässrige Extraktion menschlicher Plazenten erhältliche Proteinlösung enthält bekanntlich eine Vielzahl von Komponenten, die teilweise den Serumproteinen zuzuordnen und zum anderen Teil Gewebeproteine sind.
  • Die Erfindung hat sich die Aufgabe gestollt, ein binher noch nicht bekanntes Serum-Glykoprotein aus dem Extrakt menschlicher Plazenten zu isolieren, damit spezifisch gegen das neue Glykoprotein gerichtete Antiseren herzustellen, womit das Glykoprotein im Serum und im Urin qualitativ nachgewiesen oder quantitativ bestimmt, werden kann.
  • Gegenstand der Erfindung ist ein neues Glykopronein; welches aus Blutserum, aus Urin und dem Extrakt menschlicher Plazenten erhältlich ist. Es ist gekennzeichnet durch einen Proteinanteil, im wesentlichen bestehend aus α-Aminosäuren von 75 ± 6 %,
    einen Kohlenhydratanteil von 24,6 ± 5,2 davon Hexosen 8,9 ± 2 %, N-acetyliertes Hexosamin 7,1 t 1,5 %, Fucose 0,2 ± 0,2 %, N-acetylierte Neuraminsäure 8,4 ± 1,5 %, einen Sedimentationskoeffizienten s20w von 2,5 ± 0,3 S, ein Molekulargewicht von 35 000 ± 5 000 aufgrund der Bestimmung in der Ultrazentrifuge bzw. ein Molekulargewicht von 65 000 ± 10 000 aufgrund der Bestimmung im Natriumdodezylsulfat-haltigen Polyacrylamidgel, einen isoelektrischen Punkt von pH 3,4 ± 0,4, einen Extinktionskoeffizienten E
    Figure imgb0001
     (280 nm) von 1,9 ± 0,3, eine elektrophoretische Beweglichkeit im Bereich zwischen den α1- und den α-2-Globulinen und eine spezifische immunologische Reaktion mit einem spezifisch gegen das Glykoprotein gerichteten Antikörper.
  • Zur Erläuterung der kennzeichnenden Merkmale des Glykoproteins sei folgendes ausgeführt:
    • Die Bestimmung der Sedimentationskoeffizienten wurde in einer analytischen Ultrazentrifuge der Firma Beckman (Spinco-Apparatur, Modell E) bei 6.000 UpM in Doppelsektorzellen mit Hilfe der UV-Scanner Technik bei 280 nm durchgeführt. Als Lösungsmittel diente ein 0,05 M Phosphatpuffer (pH 6,8) der 0,2 Mol/l NaCl enthielt. Die Proteinkonzentration betrug 2 %. Die Sedimentationskoeffizienten sind auf die Basis von Wasser bei 20°C umgerechnet worden.
  • Zur Ermittlung der Molekulargewichte wurde die Sedimentatiönsgleichgewichtsmethode und die Polyacrylamidgel-Elektrophorese herangezogen. Die Bestimmung in der Ultrazentrifuge wurde bei 9.000 UpM vorgenommen. Die Auswertung erfolgte unter Zugrundelegung eines partiellen spezifischen Volumens (partial specific volume) von 0,74 mg/g. In der Ultrazentrifuge ergab sich ein Molekulargewicht von 35.000 ± 5.000.
  • Für die Polyacrylamidgel-Elektrophorese wurden zwei Verfahren angewandt. Die Auftrennung im normalen Polyacrylamid (PAA)-Gel erfolgte nach der Methode von Zwisler und Biel, Z.klin. Chem. 4, Seite 58, (1966). Zur Untersuchung im Natriumdodecylsulfat-haltigen Gel wurde ein Gel mit 7,5 % PAA das 0,1 % Natriumdodecylsulfat (SDS) enthielt, verwendet. Zur Reduktion.sind die Proteine in 1 % SDS mit 1 % Merkaptoäthanol inkubiert worden. Das Anfärben der Proteine geschah mit Amidoschwarz. Aus der Wanderung im SDS-haltigen PAA-Gel wurde für das Glykoprotein ein Molekulargewicht von 65.000 ± 10.000 abgeleitet.
  • Die Bestimmung des isoelektrischen Punktes wurde mit einer Säule (440 ml) der Firma LKB Stockholm, durchgeführt. Das sogenannte Ampholin-Gemisch hatte bei der Untersuchung des Glykoproteins einen pH-Bereich von 2,5 bis 4,0.
  • Die Untersuchung der elektrophoretischen Beweglichkeit erfolgte in der Mikromodifikation von Beckmann Instruments auf Zelluloseazetatfolien mit NatriumdiäthylbarbituratPuffer pH 8,6.
  • Die Bestimmung der Kohlehydrate erfolgte nach der von H.E. Schultze,R. Schmidtberger, H. Haupt, Biochem. Z. 329, Seite 490, (1958), beschriebenen Methode.
  • Die Aminosäurenanalyse wurde nach S. Moore, D.H. Spackmann, W.H. Stein, Anal. Chem. 30, Seite 1185, (1958), unter Verwendung des Flüssigkeitschromatographen Multichrom B der Firma Beckmann durchgeführt. 1/2 Cystin wurde nach Oxydation der Proteine mit Perameisensäure (S. Moore et al., Anal. Chem. 30, Seite 1185, (1958)) und nachfolgender Chromatographie (S. Moore, J.Biol.Chem. 238, Seite 235, (1963)) als Cysteinsäure bestimmt. Der Tryptophangehalt ist mit der direekten photometrischen Bestimmung nach H. Edelhoch, Biochemistry 6, Seite 1948, (1967) ermittelt worden.
  • Die immunologische Charakterisierung der Substanz erfolgt am einfachsten mit einem bekannten Diffusionsverfahren, bei welchen Antigen, d.h. das Glykoprotein und ein gegen das Glykoprotein gerichteter Antikörper bzw. das hinsichtlich der Antikörper nicht angereicherte Antiserum gegeneinander in einem Trägermedium, wie z.B. Agar, diffundieren. ,Treffen die beiden Reaktionskomponenten in einem günstigen Verhältnis aufeinander, bildet sich ein sichtbares Präzipitat aus. Nach dieser Kenntnis ist es für den,Fachmann einleuchtend, daß alle immunologischen Techniken zum Nachweis und zur Bestimmung sowohl des neuen Glykoproteins-, als auch der gegen das Glykoprotein gerichtete Antikörper möglich sind.
  • Eine einfache und in der Regel ausreichend genaue Methode zur quantitativen Bestimmung des Glykoproteins in Körperflüssigkeiten oder in Gewebeextrakten stellt die sogenannte Laurell-Technik dar. Sie ist beschrieben in Analyt. Biochem. (New York), 15, Seite 45 (1966).
  • Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung des oben charakterisierten Glykoproteins, dadurch gekennzeichnet, daß Körperflüssigkeiten oder Extrakte von Organen, welche das Glykoprotein enthalten, unter Zugrundelegung folgender erfindungsgemäß gefundener Kriterien fraktioniert werden.
  • Das Glykoprotein ist mit Neutralsalzen fällbar. Mit dem üblicherweise für derartige Fällungen verwendeten Ammoniumsulfat wird es bei einer Sättigungskonzentration des.Salzes von 30 bis 60 % in einem pH-Bereich in der Nähe des Neutralpunktes gefällt.
  • Entsprechend seinem Molekulargewicht kann das Glykoprotein
    Figure imgb0002
    von Substanzen mit Molekulargewichten zwischen 25.000 und 75.000 geeignet sind, gewonnen werden. Vorteilhaft werden hierfür die Methoden der Gel-Filtration oder Ultrafiltration eingesetzt.
  • Das Glykoprotein wird bei neutralem oder schwach alkalischem pH-Wert an schwach basische Ionenaustauscher adsorbiert. Vorteilhaft wird dabei eine vergleichsweise wenig konzentrierte Pufferlösung verwendet., denn durch Erhöhung der Salzkonzentration oder auch durch Erniedrigung des pH-Wertes kann die Adsorption verhindert werden. Andererseits bietet sich bei Kenntnis dieses Verhaltens die Möglichkeit an, das Glykoprotein zu adsorbieren und unter Verwendung von höherkonzentrierten Salzlösungen bzw. von Pufferlösungen mit erniedrigtem pH-Wert zu eluieren.
  • Es hat sich gezeigt, daß das neue Glykoprotein mit den wasserlöslichen organischen Basen der Acridin- und Chinolinreihe, die für Protein-Fällungsverfahren üblicherweise Verwendung finden, nicht präzipitiert wird. Es bleibt in den bei diesem Verfahren üblichen Konzentrationen im wässrigen überstand. Danach kanneine Acridinbase, wie 2-Äthoxy-6,9-Diaminoacridinlactat oder eine Chinolinbase, wie Bis-(2-methyl-4-aminochinolyl-6)-carbamid-hydrochlorid, zur Fällung von begleitenden Proteinen verwendet werden, wobei das erfindungsgemäße Glykoprotein im überstand verbleibt.
  • Ähnliche Überlegungen können gelten bei Verwendung von Hydroxylapatit als Adsorbens für Proteine. Das neue Glykoprotein zeigt keine Affinität zum Hydroxylapatit, wohingegen eine Reihe von Begleitproteinen von Hydroxylapatit festgehalten wird. Das Glykoprotein gehört somit zu den Hydroxylapatit-passierenden Globulinen. Der Erfinder schlägt vor, es als Hydroxylapatit passierendes Globulin (HPG-2) zu bezeichnen.
  • Aufgrund der Kenntnis der elektrophoretischen Beweglichkeit kann für die Anreicherung bzw. Isolierung des Glykoproteins die präparative Zonenelektrophorese eingesetzt werden.
  • Die Affinität des Glykoproteins aufgrund seines immunologischen Verhaltens kann dafür eingesetzt werden, das Glykoprotein mit Hilfe von sog. Immun-Adsorptionsverfahren anzureichern. Hierfür kann in ansich bekannter Weise ein Immunadsorbens d.h. ein trägergebundener Antikörper, gegen das neue Glykoprotein hergestellt werden, welches das Glykoprotein spezifisch zu binden vermag. Das Glykoprotein kann danach durch Änderung der Milieubedingungen wieder eluiert werden, wie dies in der Fachliteratur mehrfach beschrieben ist.
  • Durch eine ausgewählte Kombination der genannten Methoden, die einerseits zur Anreicherung des Glykoproteins andererseits zu einer Abtrennung von übrigen Begleitproteinen führen, kann die Isolierung der erfindungsgemäßen Substanzen erfolgen. Demzufolge ist der Gegenstand der vorliegenden Erfindung in den einzelnen Anreicherungsschrit-. ten für das neue Glykoprotein und in den durch Kombination der Maßnahmen zur Anreicherung sich ergebenden Verfahren zu dessen Reinigung zu sehen.
    Die Leitlinie für das Verfahren zur Herstellung des Glykoproteins besteht darin, daß jeweils derjenige Anteil gewonnen wird, welcher eine positive immunologische Reaktion mit einem gegen das neue Glykoprotein gerichteten Antiserum ergibt.
  • Nach Durchführung der genannten Verfahrensschritte zeigt es sich zuweilen, daß das Glykoprotein noch von anderen immunologisch nachweisbaren Begleitproteinen verunreinigt ist. In diesem Falle werden die Verunreinigungen durch deren spezifische Adsorption entfernt. Man bedient sich dabei gängiger Techniken der Immunadsorption, bei welchen nach beschriebenen Verfahren an einen Träger gebundene Antikörper gegen das zu entfernende Protein als Adsorbenzien eingesetzt werden. Häufig ist das weitgehend reine neue Glykoprotein noch mit Spuren des schwangerschafts-spezifischen β1-Glykoproteins und/oder des α1 B-Glykoproteins, auch als leicht fällbares a1-Glykoprotein bezeichnet, vergesellschaftet. Zu deren Abtrennung können gegen die Proteine gerichteten Immunoglobuline, welche kovalent an vernetzte Agarpräparationen, wie z.B. SEPHAROSE, gebunden sind, verwendet werden.
  • Die auf eine Säule, welche mit dem spezifischen Immunadsorbens gefüllt wurde, aufgetragene Proteinlösung läuft insoweit unbehelligt durch die Säule, als nur diejenigen Komponenten gebunden werden, gegen die der Träger einen immunologisch aktiven Partner enthält. Das neue Glykoprotein kann auf diese Weise von den Verunreinigungen befreit werden.
  • Zur Herstellung des neuen Glykoproteins werden mehrere der angeführten Maßnahmen miteinander kombiniert und dabei jeweils diejenige Fraktion weiterverarbeitet, in der immunologisch das neue Glykoprotein nachgewiesen werden kann, während die übrigen Fraktionen verworfen werden.
  • Als Ausgangsmaterial für die Herstellung des neuen Glykoproteins kann jede Körperflüssigkeit oder jeder Organextrakt verwendet werden, in welchem es gelingt, das Glykoprotein immunologisch nachzuweisen. Bevorzugt werden Extrakte menschlicher Plazenten verwendet, die durch Zerkleinerung und Extraktion mit Wasser oder einer verdünnten, zweckmäßig einer weniger als 10 %igen Salzlösung, vorteilhaft mit einer 0,5 %igen Neutralsalzlösung, wie beispielsweise Natriumchlorid, gewonnen werden können. Zweckmäßig verwendet man auf 1 kg Plazenten etwa 1 - 5 Liter der Extraktionslösung. Die nicht gelösten Anteile werden durch Zentrifugation oder Filtration von dem Extrakt abgetrennt.
  • Das Verfahren zur Anreicherung ist gekennzeichnet durch die Anwendung mindestens einer der folgenden Maßnahmen auf Körperflüssigkeiten, welche das neue Glykoprotein enthalten und die anschließende Gewinnung der bezüglich des Glykoproteins angereicherten Fraktion:
    • a) Zugabe von wasserlöslichen Derivaten einer Apridin-oder Chinolinbase, vorzugsweise des 2-Äthoxy-6,9-Diaminoacridin-lactat, im pH-Bereich von 5 - 10, vorzugsweise bei etwa pH 8, bis zu einer Endkonzentration von etwa 0,8 % (Gewicht zu Volumen), wobei das Glykoprotein im wesentlichen im Überstand verbleibt:
    • b) Zugabe von Neutralsalzen bis zur Ausfällung des Glykoproteins, vorzugsweise vom Ammoniumsulfat bei etwa neutralem pH-Wert von 5 - 8 bis zu 30 - 60 % der Sättigungskonzentration des Ammoniumsulfats.
    • c) Adsorption des Glykoproteins an einem schwach-basischem Ionenaustauscher, wie Diäthylaminoäthyl-cellulose, bei einer Leitfähigkeit der Lösung von 0 - 2 mS und neutralem oder schwachalkalischem pH-Wert (6 - 9). Beispielsweise unter Verwendung eines etwa 0,01 M Puffers vom pH-Wert von etwa 8. Ein bevorzugt zu verwendender Puffer ist beispielsweise Tris-Hydroxy- ·methylaminomethan-HCl. Die Elution des Glykoproteins kann durch Senkung des pH-Wertes unter pH 7,0 oder durch Erhöhung der Leitfähigkeit über 5 mS erreicht werden.
    • d) Trennung aufgrund der Molekülgröße (Molekularsiebfraktionierung). Besonders geeignet ist die Gelfiltration in einer Säule gefüllt mit einem Polymeren entsprechender Porengröße, beispielsweise mit Epichlorhydrin-vernetztem Dextran, als SEPHADEX(R) hergestellt von der Firma Pharmacia, Uppsala, mit dem Ziel der Anreicherung von Proteinen mit einem Molekulargewicht von etwa 50.000. Aber auch Produkte wie ULTROGEL(R) von LKB, Bromma oder BIO-GEL(R) von Bio-Rad Laboratories, Richmond, Calif. können eingesetzt werden.
    • e) Durchführung einer Adsorption mit Hydroxylapatit. Da das Glykoprotein in verdünnter Phosphatpufferlösung von Hydroxylapatit nicht gebunden wird,_ ist Hydroxylapatit ein geeignetes Agens, um Begleitproteine des Glykoproteins aus der Lösung zu entfernen. Die Proteinlösung wird hierfür zweckmäßig auf einen pH-Wert um den Neutralpunkt eingestellt und die Leitfähigkeit der Lösung auf etwa 1 mS gehalten.
    • f) Präparative Zonenelektrophorese. Geeignet für die Durchführung einer Elektrophorese ist eine das Glykoprotein enthaltende Lösung, vorzugsweise eine alkalische Pufferlösung, beispielsweise in einem Natriumdiäthylbarbituratpuffer von pH 8,6, und einer Ionenstärke = 0,1. Die Lösung wird in eine Apparatur zur präparativen Elektrophorese eingetragen, wie sie beispielsweise von N. Heimburger und R. Schmidtberger in Behringwerke-Mitteilungen, Heft 43, Seite 83 ff., insbesondere auf Seite 119-120, beschrieben wird. Bei dem Gerät handelt es sich um die horizontale Anordnung einer Trägerelektrophorese in einem offenen.Trog, in welchem das Trägermaterial zur Abführung der bei der Elektrophorese auftretenden Joul'schen Wärme auf unter 10°C gekühlt wird. Als Trägermaterial dienen gegenüber Proteinen indifferente Substanzen, vorteilhaft Polyvinyl- chlorid; oder dessen Copolymerisate in Form eines Granulats.
  • Es ist empfehlenswert, die Elektrophorese im alkalischen pH-Bereich, vorteilhaft bei etwa pH 8,6, bei einer Ionenstärke von 0,08 - 0,12 und bei einer Feldstärke 4 - 6 Volt/cm vorzunehmen. Bei Verwendung von 0,1 M Natriumdiäthylbarbituratpuffer vom pH-Wert 8,6 wandert das Glykoprotein im elektrischen Feld in den zwischen a1- und a2-Globulinen liegenden Bereich der Plasmaproteine.
  • Für die Gewinnung des neuen Glykoproteins wird die betreffende Zone herausgeschnitten und vom inerten Trägermaterial mit Hilfe von Wasser oder wässriger Salzlösungen, beispielsweise einer 0,5 bis 1' %igen Kochsalzlösung, eluiert.
  • Das erfindungsgemäß hergestellte Glykoprotein hat antigene Eigenschaften. Eine damit durchgeführte Immunisierung von Tieren nach bekannten Methoden führte zur Bildung von spezifischen Antikörpern im Blut der immunisierten Tiere. Deren Seren könne nach üblichen Verfahren gewonnen und die darin enthaltenen Antikörper angereichert werden. Die Antiseren können in bekannten immunologischen Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung des neuen Proteins in Körperflüssigkeiten, insbesondere in dem Blutserum, Verwendung finden.
  • Die Erfindung wird in dem nachstehenden Beispiel näher erläutert.
    • Beispiel
  • 150 kg tiefgefrorene Plazenten werden zerkleinert und mit 150 1 einer 0,5 %igen wässrigen Natriumchloridlösung extrahiert. Der Extrakt wird mit 2n-Natriumhydroxyd auf pH 8 eingestellt und mit 50 1 einer 3 %igen wässrigen Lösung von Diaminoäthoxyacridin-lactat versetzt. Nach einer Wartezeit von 1 Stunde wird der überstand der das erfindungsgemäße Glykoprotein (HPG-2) enthält, abgehebert, mit 5 % festem Natriumchlorid (11 kg) zur Abscheidung des noch in Lösung verbliebenen Diaminoäthoxyacridin-lactats versetzt, filtriert und mit 30 % - bezogen auf das Gewicht der Flüssigkeit - festem Ammoniumsulfat versetzt und gut durchgerührt. Nach 1 Stunde wird der Niederschlag abfiltriert.
  • 500 g des auf dem Filter gesammelten Niederschlages werden in 500 ml destilliertem Wasser gelöst und gegen eine 0,01 molare Tris-(oxymethyl)-aminomethan-Salzsäure-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0, die 0,05 % Natriumazid enthält, dialysiert. Die dialysierte Lösung wird zentrifugiert und der überstand wird mit der gleichen PufferLösung auf 2.000 ml aufgefüllt, mit 0,1 n Natriumhydroxydlösung auf pH 8,0 eingestellt und mit 500 g feuchter Diäthylaminoäthylcellulose (Firma Serva, Heidelberg) 1 Stunde verrührt.
  • Dann wird die Diäthylaminoäthylcellulose durch Filtrieren von der Lösung abgetrennt, zweimal mit je 1 Liter 0,01 molarem Tris-(oxymethyl)-aminomethan-Salzsäure-Puffer vom pH-Wert 8,0 gewaschen und danach dreimal mit je 500 ml 0,02 molarem Tris-(oxymethyl)-aminomethan-Salzsäure-Puffer, pH 6,5, der :0,85'% Natriumchlorid und 0,05 % Natriumazid enthält; eluiert.
  • Den vereinigten Eluaten werden 30 % Ammonsulfat, bezogen auf das Flüssigkeitsgewicht, zugesetzt und das ganze wird
    Figure imgb0003
    . Der Niederschlag, der das Protein (HPG-2) entwird in 300 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Proteinlösung wird gegen Tris-Hydroxymethyl-Aminomethan-Salzsäure-Puffer von pH 8,0, der 1,0 Mol Natriumchlorid/l enthält, dialysiert und auf eine mit Sephadex G-150 gefüllte Säule (100 x 20 cm) aufgetragen und mit dem genannten Puffer eluiert. Während der Elution findet eine Fraktionierung der Proteine nach deren Molekülgröße statt.
  • Anschließend werden die Eluate mit spezifischem Antiserum getestet, die das Glykoprotein (HPG-2) einthaltenden Fraktionen werden gesammelt und daraus die Proteine nochmals, wie oben beschrieben, mit 30 % festem Ammonsulfat ausgefällt.
  • Zur Weiterreinigung wird die Fällung in 50 ml Wasser gelöst, gegen einen 0,005 m Phosphatpuffer, pH 6,8, dialysiert und auf eine mit Hydroxylapatit gefüllte Säule, 3 x 23 cm, gegeben. Die Entwicklung der Säule erfolgt mit dem 0,005 m Phosphatpuffer, pH 6,8.
  • Das Glykoprotein (HPG-2) erscheint im Durchlauf; dieser wird auf einem Ultrafilter eingeengt. Das Konzentrat wird anschließend gegen einen 0,01 M Tris-HCl-Puffer,- pH 7,0, dialysiert und an DEAE-SEPHADEX (Säule 3 x 23.cm) adsorbiert. Zur Elution und Auftrennung der adsorbierten Proteine dient ein NaCl-Gradient von 0 - 2 %. Die das Glykoprotein (HPG-2) enthaltenden Eluatfraktionen werden gesammelt eingeengt.
  • Zur Weiterreinigung wird das eingeengte Eluat in einer 0, 075 m Ammoniumbikarbonatlösung aufgenommen und einer präparativen Zonenelektrophorese unterworfen. Die das HPG-2 enthaltende Zone wird nach der Auftrennung herausgeschnitten und mit physiologischer Kochsalzlösung eluiert; die Eluate engt man anschließend auf dem Ultrafilter ein.
  • Das als Verunreinigung noch vorhandene α1B-Glykoprotein wird mit Hilfe eines entsprechenden Immunadsorbens entfernt. Zur Herstellung des Immunadsorbens werden Antikörper gegen das a1B-Glykoprotein kovalent an Sepharose gebunden und das so erhaltene Adsorbens mit dem Eluat im Batch-Verfahren oder in einer Säule in Berührung gebracht. Dabei wird das a1B-Glykoprotein an die trägergebundenen Antikörper adsorbiert, während das Glykoprotein HPG-2 in Lösung bleibt. Die Lösung, die dann nur noch HPG-2 enthält wird gegen Wasser dialysiert und lyophilisiert. Man erhält etwa 10 bis 30 mg des neuen Glykoproteins HPG-2.
  • Es zeigt folgende Aminosäure-Zusammensetzung (Häufigkeit mit Variationskoefizienten (VK in %) :
    Figure imgb0004

Claims (5)

1. Neues Glykoprotein gekennzeichnet durch
a) einen Proteinanteil von 75 ± 6 %;
b) einen Kohlenhydratanteil von 24,6 ± 5,2 % davon Hexosen 8,9 ± 2 %, N-acetyliertes Hexosamin 7,1 ± 1,5 %, Fucose 0,2 ± 0,2 %, N-acetylierte Neuraminsäure 8,4 ± 1,5 %.
c) einen Sedimentationskoeffizienten S20 w von 2,5 ± 0,3 S;
d) ein in der Ultrazentrifuge bestimmtes Molekulargewicht von 35 000 ± 5 000;
e) einen isoelektrischen Punkt von pH 3,4 ± 0,4;
f) einen Extinktionskoeffizienten E
Figure imgb0005
 (280 mm) von 1,9 ± 0,3 ;
g) eine elektrophoretische Beweglichkeit im Bereich zwischen a1- und den α2,-Globulinen ;
h) eine spezifische immunologische Reaktion mit einem spezifisch gegen das Glykoprotein gerichteten Antikörper.
2. Verfahren zur Anreicherung des Glykoproteins nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Proteinlösung, in welcher das.Glykoprotein immunologisch nachgewiesen werden kann, mindestens einer der folgenden Maßnahmen unterworfen wird und die bezüglich des Glykoproteins angereicherte Fraktion gewonnen wird:
a) Zugabe von Neutralsalzen bis zur Ausfällung des Glykoproteins;
b) Molekularsiebfraktionierung und Gewinnung der Fraktion mit einem Molekulargewicht von 25 000 bis 75 000;
c) Adsorption des Glykoproteins an einen schwach basischen Ionenaustauscher und Elution davon;
d) Zugabe von wasserlöslichen Derivaten einer Acridin-oder Chinolinbase im Bereich von pH 5 - 10 bis zu einer Endkonzentration von etwa 0,8 %;
e) Behandlung der Glykoproteinlösung mit Hydroxylapatit;
f) Präparative Zonelektrophorese und Gewinnung der Zone zwischen α1- und α2-Globulinen ;
g) Behandlung der Proteinlösung mit einem Immunadsorbens.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Proteinlösung ein Extrakt aus menschlichen Plazenten verwendet wird.
4. Verwendung des Proteins nach Anspruch 1 zur Gewinnung von Antiseren.
5. Antiserum erhältlich durch Immunisierung von Wirbeltieren mit einem Glykoprotein nach Anspruch 1.
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