DE2065867A1 - Carcinoembryonales antigen und verfahren zu seiner gewinnung - Google Patents
Carcinoembryonales antigen und verfahren zu seiner gewinnungInfo
- Publication number
- DE2065867A1 DE2065867A1 DE2065867*A DE2065867A DE2065867A1 DE 2065867 A1 DE2065867 A1 DE 2065867A1 DE 2065867 A DE2065867 A DE 2065867A DE 2065867 A1 DE2065867 A1 DE 2065867A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- cea
- gel
- molecular weight
- tissue
- electrophoresis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 58
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims description 15
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims description 15
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims description 15
- 238000000605 extraction Methods 0.000 title description 6
- 108010022366 Carcinoembryonic Antigen Proteins 0.000 claims description 63
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 49
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 41
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 33
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 28
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 28
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 19
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 19
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 13
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 claims description 13
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 13
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 12
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 102000008857 Ferritin Human genes 0.000 claims description 11
- 108050000784 Ferritin Proteins 0.000 claims description 11
- 238000008416 Ferritin Methods 0.000 claims description 11
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 claims description 11
- 239000011630 iodine Substances 0.000 claims description 11
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 10
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 9
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 9
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 claims description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 9
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 8
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 7
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 claims description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 7
- 230000002494 anti-cea effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 claims description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 6
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 claims description 6
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 5
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 claims description 5
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 5
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000005012 migration Effects 0.000 claims description 4
- 238000013508 migration Methods 0.000 claims description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 3
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 claims description 3
- 238000012817 gel-diffusion technique Methods 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 2
- PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N iodine Chemical compound II PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 102100025475 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Human genes 0.000 claims 13
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims 1
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 claims 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 claims 1
- 102000012406 Carcinoembryonic Antigen Human genes 0.000 description 58
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 13
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 8
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N chloramine T Chemical compound [Na+].CC1=CC=C(S(=O)(=O)[N-]Cl)C=C1 VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 229960001479 tosylchloramide sodium Drugs 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 3
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920005479 Lucite® Polymers 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000036783 anaphylactic response Effects 0.000 description 2
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 201000010897 colon adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 2
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 2
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 210000004798 organs belonging to the digestive system Anatomy 0.000 description 2
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 2
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 2
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 2
- HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L sodium disulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)S([O-])(=O)=O HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000004296 sodium metabisulphite Substances 0.000 description 2
- 235000010262 sodium metabisulphite Nutrition 0.000 description 2
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 2
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 235000009161 Espostoa lanata Nutrition 0.000 description 1
- 240000001624 Espostoa lanata Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 229920002274 Nalgene Polymers 0.000 description 1
- 241000283977 Oryctolagus Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- OEERIBPGRSLGEK-UHFFFAOYSA-N carbon dioxide;methanol Chemical compound OC.O=C=O OEERIBPGRSLGEK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 210000000883 ear external Anatomy 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010985 leather Substances 0.000 description 1
- 238000012792 lyophilization process Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- IYDGMDWEHDFVQI-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;trioxotungsten Chemical compound O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.OP(O)(O)=O IYDGMDWEHDFVQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RWPGFSMJFRPDDP-UHFFFAOYSA-L potassium metabisulfite Chemical compound [K+].[K+].[O-]S(=O)S([O-])(=O)=O RWPGFSMJFRPDDP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000004297 potassium metabisulphite Substances 0.000 description 1
- 235000010263 potassium metabisulphite Nutrition 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- -1 sodium chloride Chemical class 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000010414 supernatant solution Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
- A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
- A61K51/04—Organic compounds
- A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
- A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
- A61K51/1045—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants
- A61K51/1048—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants the tumor cell determinant being a carcino embryonic antigen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3007—Carcino-embryonic Antigens
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57473—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving carcinoembryonic antigen, i.e. CEA
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2123/00—Preparations for testing in vivo
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/961—Chemistry: molecular biology and microbiology including a step of forming, releasing, or exposing the antigen or forming the hapten-immunogenic carrier complex or the antigen per se
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/804—Radioisotope, e.g. radioimmunoassay
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/811—Test for named disease, body condition or organ function
- Y10S436/813—Cancer
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
PATENTANWÄLTE
DR;A.VAN DERWERTH DR. FRANZ LEDERER REINER F.MEYER
DIPL.-ING. (1934-1974) DIPL.-CHEM. ^V/^ C Q C
8000 MÜNCHEN 80
LUCILE-GRAHN-STRASSE 22
TELEFON: (089) 472947 TELEX: 524624 LEOER O
TELEGR.: LEDERERPATENT
P 20 65 867.7 30· April 1976
F. HOFFMANN-LA ROCHE & CO. AKTIENGESELLSCHAFT,
Basel / Schweiz
Careinoembryonales Antigen und Verfahren zu seiner Gewinnung
In der deutschen Patentanmeldung P 20 29 499.9 wird ein Verfahren
zum Nachweis der Anwesenheit von carcinoembryonalen Antigenen im Blut offenbart. Dieses Verfahren ist durch die
folgenden Verfahrensstufen gekennzeichnet:
a) Zusatz einer abgemessenen Menge von Anti-CEA-Antiserum zu
einer Probe von mit Perchlorsäure extrahiertem Blutserum,
b) Inkubieren des Gemisches
c) Zufügen einer abgemessenen Menge von radioaktiv markiertem
CEA zum inkubierten Gemisch,
d) Inkubieren des Gemisches,
e) Zusatz eines Proteinfällungsmittels zum inkubierten Gemisch, wobei alle CEA-Anti-CEA-Komplexe copräzipitiert werden und
f) Messen der Radioaktivität des Copräzipitates oder des Überstandes
j
609838/089 8
wobei zur Herstellung des Anti-CEA-Antiserums reines CEA verwendet
wird, das ein Molekulargewicht von etwa 200 000 und ein Absorptionsmaximum bei 28O nm aufweist, das mit seinem spezifischen Antikörper in nicht absorbiertem Antiserum beim Geldiffusionstest
eine einzige Präzipitationslinie bildet und das wie folgt erhältlich ist:
g) Homogenisieren eines Adenokarzinomgewebes auf Verdauungssystemepitheltumoren,
h) Behandlung des Homogenisates mit einem Glycoprotein-Lösungsmittel,
i) Abtrennung des Niederschlages und Klären der erhaltenen Lösung,
j) Dialyse der geklärten Lösung,
k) Konzentrieren des Dialysats,
1) Klären der erhaltenen Lösung,
m) Trocknen der geklärten Lösung,
n) Chromatographie des erhaltenen Materials an zwei verschiedenen Gelsäulen, von denen die erste ein Agarosegel mit etwa 4 Gew.-%
Agarose und einer Teilchengröße von 40-190 si und die zweite ein
hydrophiles wasserunlösliches quervernetztes Dextrangel darstellt,
o) Sammeln und Konzentrieren der Fraktionen des Eluats mit einem Absorptionsmaximum bei 280 nm und einem Molekulargewicht von
etwa 200 000,
p) präparative Elektrophorese der gesammelten Eluate durch eine Blockalektrophorese, durchgeführt bei 300-500 V und etwa 20 inA
mit Farritin als Standard, Lösung des Aktivmaterials in einem Boratpuffer vom pH 8,2 - 9,2 und einer Ionenstärke von 0,0125-0,
10, und Verwendung eines wasserunlöslichen, hydrophilen, quervernetzten Dextrangels mit einer Ausschlußgrenze von 5000, einer
Wasseraufnahmekapazität von 2,5^ 0,2 g/g Trockensubstanz und
einer Korngröße von 20 - 80>u als elektrophoretisches Trägermaterial
und
r) Sammeln derjenigen Fraktionen, die bei der Elektrophorese von
der Startzone etwa 1O-14 cm in anodischer Richtung gewandert sind, wenn gleichzeitig Ferritin vom Kathodenende 18 cm in anodischer
Richtung wandert.
609838/0898
-3-
Die vorliegende Erfindung betrifft das carcinoembryonale
Antigen (CEA) per se wie auch mit Jod radioaktiv markiertes CEA, ein Verfahren zu seiner Gewinnung und die für CEA spezifischen
Antikörper.
Das CEA wird isoliert und gereinigt durch Homogenisieren von Adenokarzinomgewebe aus primären oder metastatischen Tumoren, die
ihren Ursprung im Verdauungssystem haben.
Um das mit dem homogenisierten Tumorgewebe vergesellschaftete
Antigen zu isolieren, ist es erforderlich, alle anderen Substanzen aus dem Homogenisat abzutrennen . Dies erreicht man durch chemische
und physikalische Extraktions- und Reinigungsverfahren.
Wenn die Extraktions- und Reinigungsverfahren beendet sind, muß die Identität der isolierten Fraktion als CEA bestätigt werden.
Dies wird mittels verschiedener bekannter Techniken erreicht, zum Beispiel doppelte Diffusion an Agargel, Immunoelektrophorese,
Hämagglutination, passive kutane Anaphylaxie und dergleichen.
Um diese Techniken anzuwenden, muß bei den verwendeten Antikörpern
nachgewiesen werden, daß sie für CEA spezifisch sind. Antikörper die mit diesem Kriterium übereinstimmen, können durch immunologische
Toleranz- oder Absorptionstechniken gewonnen werden.
Bei der Absorptionstechnik wird das Antitumorantiserum an normalem
Gewebe absorbiert, um antinormale Komponenten des Antiserums zu entfernen. Zurückbleibende Antikörperaktivität bei dem absorbierten
Antiserum, das gegen das Tumormaterial gerichtet ist, wird dann als tumorspezifisch bezeichnet. Dieses Verfahren ist nicht fehlerfrei,
da die Möglichkeit besteht, daß tumorspezifische Antikörper entfernt oder durch normale Gewebekomponenten inaktiviert werden
können, ähnlich den - jedoch nicht mit ihnen identischen - Tumorantigenen,
die ursprünglich die Antikörperbildung anregten.
Bei der immunologischen Toleranztechnik werden Tiere während des
Neugeborenenlebensabschnittes gegen normale Gewebe immunologisch widerstandsfähig (tolerant) gemacht. Die Widerstandsfähigen
609838/0R98
— 4"
Tiere werden dann mit Tumorpräparaten der gleichen Spenderarten
immunisiert. Wo eine entsprechende Unterdrückung der immunen Reaktion gegen normale Gewebebestandteile erreicht worden ist,
ist die Entwicklung von für den Tumor anscheinend spezifischen Antikörpern erreicht worden. Bei Studien von menschlichem Krebs
eröffnet diese Technik eine mögliche Fehlinterpretation, da die Quellen des normalen und des Tumormaterials verschiedene Spender
sind. Wenn jedoch Extrakte von Geweben verwendet werden, ist dieses Problem nicht signifikant, da alle Extrakte im wesentlichen
ähnlich sind.
Es wurde nun gefunden, daß Tumorgewebe vom Adenokarzinom und normales Colongewebe von dem gleichen Individium verwendet werden
können, weil sich ein Colonkarzinom praktisch niemals submukös mehr als 6 - 7 cm auf jeder Seite eines sichtbaren Tumors
im allgemeinen ausdehnt.
Das Tumorgewebe des Colonadenokarzinoms und normales Colongewebe
von dem gleichen Individium werden zwar getrennt, jedoch in paralleler Weise behandlet. Das Gewebe wird gemahlen, in einem Puffer
suspendiert und dann homogenisiert. Das Homogenisat wird dann zur Entfernung fester Teilchen behandelt. Ein Zentrifugieren oder
Filtrieren durch allmählich kleiner v/erdende Filteröffnungen werden bevorzugt. Dies erfolgt zu dem Zweck, alle Teilchen von etwa
0,22/u oder größer zu entfernen, wobei alle Bakterien gleichzeitig
mit entfernt werden. Das tiberstehende oder das Filtrat wird dadurch
sterilisiert zur Sicherung gegen bakterielle Verseuchung.
In geeignete Gruppen eingeteilte Versuchstiere werden dann mit den Extrakten immunisiert, und nach einem geeigneten Zeitintervall
nimmt man von den Tieren ein Serum. Das Vorliegen von Antikörpern in den Prüfseren wird entweder durch die Ouchterlony-Technik
einer doppelten Diffusion in Agargel, durch Immunoelektrophorese, durch Hämagglutinationsreaktionen oder durch
passive kutane Anaphylaxie bewiesen. Die bevorzugte praktische Methode ist wegen ihrer Einfachheit und reproduzierbaren Ergebnisse
die Ouchterlony-Technik.
609838/0898
—5—
Wenn man die Anwesenheit von Antikörpern bewiesen hat, ist es möglich, das Antigen zu bestimmen, wenn tatsächlich eine besondere
Extraktionstechnik eine Fraktion isolieren läßt, die CEA enthält.
Es wurde eine Extraktions- und Reinigungstechnik gefunden, die eine Fraktion ergibt, die stets eine Präzipitationslinie bei
der Ouchterlony-Technik erzeugt, wenn sie gegen den Antikörper geprüft wird, der für CEA spezifisch ist, oder wenn sie gegen
nicht absorbierte Antiseren geprüft wird.
Wie oben angegeben worden ist, wird das CEA nach vorliegender Erfindung aus primärem oder metastatischem Adenokarzinomgewebe
isoliert und gereinigt, das seinen Ursprung im Verdauungssystemepithel
hat, das sich von embryonalen entodermalen Zellen ableitet. Man kann das CEA nach vorliegender Erfindung auch aus embryonalen
Verdauungsorganen von Feten im zweiten bis siebenten Schwangerschaftsmonat isolieren und reinigen. Die nachstehende
Beschreibung ist auf die Extraktion von Krebsgewebe gerichtet, jedoch kann das Verfahren auch auf embryonales Gewebe angewendet v/erden.
CEA enthaltendes Gewebe, das entweder embryonales Gewebe aus Verdauungsorganen aus dem ersten und zweiten Trimester oder
Adenokarzinomgewebe von Tumoren ist, das seinen Ursprung innerhalb des Verdauungssystemepithel hat, wie oben beschrieben worden ist,
wird mit einem Glycoprotein-Lösungsmittel extrahiert, in dem das CEA löslich ist. Dies ist erforderlich, so daß fällbare normale
Proteine und störende antigenische Materialien vom CEA-Material
getrennt werden können. Geeignete Glycoprotein-Lösungsmittel sind
zum Beispiel Perchlorsäure, Trichloressigsäure"; Phosphorwolframsäure und dergleichen. Perchlorsäure wird jedoch wegen ihrer
leichten Verfügbarkeit und Anwedbarkeit bevorzugt.
Das zu prüfende Gewebe wird mit Wasser homogenisiert, um das Antigen zu solubilisieren. Die Menge des verwendeten Wassers
sollte ausreichend sein, um das gesamte CEA zu lösen. Im all-
609838/0898 ~6~
-e- 2085867
gemeinen sind etwa 2 Liter Wasser pro Kilogramm Gewebe ausreichend.
Man kann mehr Wasser verwenden, jedoch ist dies im allgemeinen nicht erforderlich.
Eine beliebige Temperatur unterhalb Raumtemperatur ist für die Zugabe des Glycoprotein-Lösungsmittels zum Gewebehomogenisat
geeignet. Vorzugsweise wendet man jedoch Raumtemperatur, zum Beispiel 20 - 25°C, an. Die Temperatur des Glycoprotein-Lösungsmittels , das dem Gewebehomogenisat zugefügt wird, kann
ebenfalls variJaren, jedoch wird Raumtemperatur bevorzugt. Im
allgemeinen wird eine konzentrierte Säure als Glycoprotein-Lösungsmittel
verwendet, beispielsweise von einer Konzentration von 0,5 η bis etwa 2 n, wobei 2 η-Säure bevorzugt wird. Das
Lösungsmittel wird in etwa dem gleichen Volumen zum Homogenisat zugefügt. Die Zeit, in der dies erreicht wird, beträgt gewöhnlich
etwa 10 - 30 Minuten. Längere Zeiten können zum Verlust der Antigenwirksamkeit führen.
Man erhält ein Präzipitat. Dieses Präzipitat wird von dem überstehenden
abgetrennt, das das gelöste CEA enthält. Man kann beliebige übliche Trennungsverfahren anwenden, wie Zentrifugieren,
Filtrieren oder dergleichen.
Man bevorzugt das Zentrifugieren, v/eil es schneller durchführbar ist und weil dabei eine ausreichende Kraft entwickelt werden
kann, um im wesentlichen alle festen Teilchen zu entfernen. Im allgemeinen sind zum Erreichen dieser Wirkung etwa 3000 bis
etwa 8000 Umdrehungen pro Minute (UpM) ausreichend. Dieses Zentrifugieren wird vorzugsweise bei niedrigen Temperaturen, wie
etwa 4 - 10°C durchgeführt, da bei diesen Temperaturen die Sedimentationszeit wesentlich herabgesetzt wird.
Perchlorsäure, Salze, wie Natriumchlorid, und andere Substanzen von niedrigem Molekulargewicht werden dann entfernt, um das System
weiter zu reinigen. Obwohl es möglich sein kann, dies durch Ausfällen der verbleibenden Proteine zu erreichen, hat
man gefunden, daß eine Dialyse durch eine semipermeable Membran
609838/0898
-7-
20S5867
gegen Wasser am geeignetsten ist. Die Dialyse ist ein kritischer Teil des Verfahrens, da sie alle diffusionsfähige lösliche
Substanzen mit Ausnahme der Substanzen von höherem Molekulargewicht, die die CEA-Fraktion einschließen, entfernt. Die
Dialyse kann zuerst mit Leitungswasser etwa 24 - 48 Stunden durchgeführt werden. Dann kann die nachfolgende Dialyse mit
kaltem destilliertem Wasser bei Temperaturen von etwa 4 - 10°C durchgeführt werden. Jedoch ist es möglich, lediglich destilliertes
Wasser bei der Dialyse zu verwenden, vorausgesetzt, daß die Temperatur niedrig bleibt und daß das Wasser häufig gewechselt
wird. Das vollständige Dialyseverfahren nimmt etwa 48-96 Stunden in Anspruch.
Die trübe Lösung, die nach der Dialyse zurückbleibt, wird dann
getrocknet. Man kann ein Sprühtrocknen anwenden, jedoch ist die Lyophylisierung das bevorzugte Verfahren, Wasser zu entfernen.
Es sind beliebige Lyophylisierungsverfahren geeignet. Das bevorzugte Verfahren besteht darin, daß das Material zuerst
Schalen-gefroren und dann lyophylisiert wird. Dies nimmt etwa
32-36 Stunden für das zu lyophylisierende Produkt bis zur vollständigen Trockene in Anspruch. Bei einer bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens wird jedoch die Lyophylisierung etwa 24 - 30 Stunden durchgeführt, so daß das Produkt
nicht vollständig trocken ist. Obwohl diese Verfahrensstufe für die schließliche Isolierung des reinen CEA nicht kritisch
ist, wird sie bevorzugt, da sie Zeit spart.
Das teilweise lyophylisierte Material kann dann bei Raumtemperatur
oder höherer Temperatur, wie etwa 37 C, aufgetaut werden. Es kann auch durch Verdünnen mit einer sehr geringen Menge Wasser aufgetaut
werden. Danach werden die zurückbleibenden Teilchen entfernt. Es ist auch gefunden worden, daß, wenn das Volumen auf einem Minimum
gehalten wird, die Klärung durch Filtrieren und/oder Zentrifugieren erreicht werden kann. Alle Teilchen einer Größe, die nicht
durch ein 0,22 ,»u-Filter gehen (d.h. einer Größe der kleinsten.
Bakterien), werden demnach unter Klären und Reinigen der Lösung entfernt.
ß09838/0898
-a- 20S5867
Das bevorzugte Verfahren besteht darin, die Lösung bei einer hohen Geschwindigkeit, d.h. mit etwa 14 000 bis 30 000 UpM,
vorzugsweise etwa 14 000 UpM, bei Temperaturen unterhalb etwa 100C, d.h. etwa 4 - 10°C, etwa 15-45 Minuten lang zu zentrifugieren.
Höhere Temperaturen sind anwendbar, jedoch verzögern sie die Sedimentationsgeschwindigkeit und sind daher nicht
zweckmäßig. Nach dem Zentrifugieren ist es erforderlich, die überstehende Lösung weiter zu klären und zu sterilisieren.
Dies kannman durch Filtrieren durch Filter von sich allmählich verringender Porengröße erreichen, um im wesentlichen verbleibende
Feststoffe und Bakterien zu entfernen. Die Porengröße der Filter kann von etwa 1,2 - 0,20 /α variieren. Bevorzugt
verwendet man Filter mit 1,2/i, 0,45 λι, 0,22 /α in der angegebenen
Reihenfolge.
Die Abtrennung eines Teils des erhaltenen lyophylisierten, das
CEA unter Ausschluß anderer Substanzen enthaltenden Pulvers wird nach vorliegender Erfindung durch Chromatographie mit zwei
verschiedenen Gelsäulen und anschließende Elektrophorese erreicht.
Es wurde gefunden, daß die eluierten Fraktionen aus der Säulenchromatographie,
die ein Molekulargewicht von etwa 200 000 und ein definiertes Maximum bei der spektrophotometr is chen Abi;orptionswellenlänge
von 280 nyu besitzen, das CEA enthalten. Es wurde weiter gefunden, daß wenn die das CEA enthaltenden Fraktionen
einer Elektrophorese unterworfen werden, sie ein charakteristisches Wanderungsbild, das anodisch zur Aufbringung«zone
an der Kathode ist, bei pH 8,6 mit einem Boratpuffer mit einer Ionenstärke von 0,05 haben. Das Ausmaß der Wanderung hängt von
der angewendeten Stromstärke und Spannung, wie auch vom pH-Wert, vom Puffer und von der Ionenstärke des Puffers ab. Wenn beispielsweise
400 V und 20 mA angewendet werden, wandert das CEA etwa 10 - 14 cm in anodischer Richtung (anodisch) zur Aufbringungszone
in der gleichen Zeit, wie das als Markierungsmittel verwendete Ferritin (ein gefärbtes Protein) anodisch 18 cm wandert, wenn es
am kathodischen Ende aufgebracht wird. Man kann andere Markierungs-
609838/0898
-9-
_9_ 2085867
mittel verwenden, jedoch müssen dann die Elektrophoresebedingungen
geändert und die Wanderung des CEA und des Markierungsmittels aufeinander abgestimmt werden.
Die SäulenChromatographie kann in der Weise durchgeführt werden,
daß man das lyophylisierte Material in Lösung der anschließenden Chromatographie an zwei verschiedenen Gelsäulen in beliebiger
Reihenfolge unterwirft. Zweckmäßieerweise jedoch ist eine Gelsäule, die erfindungsgemäß verwendet wird, ein Agarose-Gel.
Agarose ist der neutrale Anteil von Agar. Das Gelmaterial ist von der Firma AB Pharmacia, Uppsala (Schweden), unter dem Warenzeichen
"Sepharose" handelsüblich erhältlich. Die Gele sind als wäßrige Suspensionen in 0,02 %-igem Natriumazid als Schutzmittel
erhältlich. Die Gelstruktur ist einer Wasserstoffbindung zu danken.
Das Gel wird in Perlform mit einer ausgewählten Teilchengröße und einem Prozentsatz Agarose hercfestellt. Die Konzentration
der Agarose im Gel bestimmt seinen Fraktionierungsbereich.
Die zur erfindungs gemäß en Verwendung zweckmäßigsten Gele besitzen
eine Teilchengröße von etwa 40 - 190 /o. und enthalten 4 Gew.-%
Agarose. Diese als "Sepharose 4B" bezeichneten Materialien haben einen Fraktionierungsbereich von 3x10 bis 3x10 . Beim
erfindungsgemäßen Verfahren wird "Sepharose 4B" verwendet, da sie die Abtrennung der das CEA enthaltenden Fraktion von Freradmaterialien
mit höherem oder niedrigerem Molekulargewicht als auch kolloidalen Teilchen gestattet.
Die zweite Säule enthält ein Gelfiltermaterial, das ein hydrophiles
wasserunlösliches vernetztes Dextranpolymergel ist. Dieses Material und sein Herstellungsverfahren sind in der britischen
Patentschrift 854 715 beschrieben. Das Gelmaterial, das von der Firma AB Pharmacia, Uppsala (Schweden), unter dem
Namen "Sephadex" handelsüblich erhältlich ist, besteht aus einem dreidimensionalen makroskopischen Netzwerk von miteindander verbundenen
oder vernetzten Dextransübstanzen, die beim Absorbieren
von Wasser quellen können. Die Fähigkeit des Gelmaterials,
Wasser aufzunehmen, ist dem Vernetzungsgrad der Dextransubstan-
609838/Q898 -ίο-
20S5867
zen im Gelmaterial umgekehrt proportional. Das Gelmaterial ist in einer Vielzahl von Graden erhältlich, die sich im Hinblick
auf den Porositätsgrad unterscheiden. Das bei der erfindungsgemäßen
Verwendung bevorzugte Gel hat eine annähernde Molekular-
zu gewichtsausshlußgrenze von 200 000, ein Wasserxückhaltevermögen
von 20 + 2,0 g H_O/g trockenes Gel, eine Teilchengröße von
40 - 120/1 und ein Bettvolumen/ml/g trockenes Gel von 30 - 40.
Das Gel trägt die Bezeichnung "Sephadex G-200".
"Sephadex G-200" wird zur weiteren Reinigung der das CEA enthaltenden
Fraktion verwendet. Da die Säule ein größeres Auftrennungsvermögen
als die erste Säule für den Molekulargewichtsbereich von 150 000 bis 250 000 besitzt, wird eine weitere Abtrennung
des CEA von Substanzen mit höherem oder niedrigerem Molekulargewicht
erreicht. Die zweite Säule sollte in praktischer Hinsicht nur verwendet werden, nachdem die kolloidalen Teilchen
durch die erste Säule entfernt worden sind, da diese Teilchen die Säule verstopfen und sie unwirksam machen. Die Chromatographie
wird durch Lösen des lyophylisierten Materials in einem wäßrigen Puffer bei einem pH-Wert, bei dem das CEA elektrisch
neutral ist, d.h. pH 4,5, dann durch Leiten der Lösung durch die erste Säule, durch Sammeln, durch Dialysieren, wie oben beschrieben,
und Lyophylisieren der aktiven Fraktion zur Entfernung von Salzen, dann durch Wiederlösen der gesammelten aktiven
Fraktion in einem wäßrigen Puffer bei einem pH-Wert, bei dem das CEA elektrisch neutral ist, durch Leiten der Lösung durch
die zweite Säule, durch Sammeln der aktiven Fraktionen, durch Dialysieren wie oben und durch Lyophylisieren durchgeführt. Der
Grund, das CEA elektrisch neutral zu machen (herzustellen), liegt darin, die Wechselwirkung des Antigens mit den Säulen und die nachfolgende
überlagerung der Fremdstoffe bei den aktiven Fraktionen herabzusetzen. Obwohl beliebige wäßrige übliche Puffer geeignet
sind, wird die Verwendung einer mit Phosphat gepufferten Salzlösung (0,9%) bevorzugt. Der Vorteil der Anwendung niedriger
Temperaturen, d.h. von etwa 4-10°C, liegt darin, daß man ein verbessertes Auflösevermögen erreicht. Die aus der zweiten Säule
gesammelten Fraktionen haben ein Molekulargewicht von 200 000
609838/0898 -11"
und ein Maximum bei 280 nyu im UV-Absorptionsmeßgerät. Die aus
der ersten Säule gesammelten Fraktionen werden auf den gleichen Kriterien basierend ausgewählt, jedoch enthalten sie Materialien,
die ein etwas höheres oder etwas niedrigeres (bis herunter zu 70 000) Molekulargewicht als 200 000 haben.
Die aktiven Fraktionen aus der zweiten Säule werden einer Elektrophorese
unterworfen, um das CEA von Verunreinigungen weiter zu befreien. Dies erreicht man durch Auflösen der aktiven, zuvor
konzentrierten Fraktion in einem Puffer bei einem pH von etwa 8,2 - 9,2 und einer Ionenstärke von etwa 0,0125 - 0,10.
Obwohl beliebige wäßrige Puffer mit diesen Eigenschaften geeignet sind, verwendet man vorzugsweise einen Puffer, der die Beweglichkeit
der aktiven Fraktion steigert, d.h. einen Boratpuffer vom pH etwa 8,6 und einer Ionenstärke von etwa 0,05.
Diese Eigenschaften lassen das CEA in der gleichen Weise wie das verwendete bevorzugte Markeirungsmittel, d.h. Ferritin,
wandern.
Die angewendete Stromstärke und Spannung bestimmen das Ausmaß
der Trennung der Moleküle in der Fraktion. Es wurde gefunden, daß bei dem bevorzugten Verfahren, der Blockelektrophorese, etwa
300 - 500 V, vorzugsweise 400 V, mit einer Stromstärke von etwa 20 mA zweckmäßig sind. Man kann andere Stromstärken und Spannungen
anwenden, jedoch werden die oben genannten bevorzugt.
Die Blockelektrophorese ist die bevorzugte Elektrophoresemethode, weil sie die Gewinnung der gewünschten Fraktion erleichtert. Jedoch
kann man andere Typen der Elektrophorese ebenfalls anwenden.
Das bei der Blockelektrophorese verwendete Material sollte das zu -prüfende Material tragen und elektrisch leitend sein, wenn es mit
einem Puffer imprägniert wird. Typische geeignete Materialien
sind Papier und Gele. Bei dem bevorzugten Elektrophoreseverfahren
wird ein vernetztes Dextrangel, zum Beispiel "Sephadex G-25 fine"mit einer annähernden Molekulargevnichtsausschlußgrenze von
5000, einem Wasserzurückhaltevermögen von 2,5 ± 0,2 g E^O/q trok-
6 098 3.8/Oft 9 8 -12-
kenes Gel, einer Teilchengröße von 20 - 80/α und einem Bettvolumen/ml/g
trockenes Gel von 5, in dem Puffer angequollen und auf einem nichtleitfähigen Block, zum Beispiel "Lucite", angeordnet.
Bei dem bevorzugten Verfahren wird das Gel mit dem gleichen Puffer,
in dem auch die aktive Fraktion gelöst wird, in dem Block angeordnet und dann die Papierkontakte auf dem Gel angebracht. Der
Block wird dann in dem gleichen Puffer in einem Elektrophoresegerät unter Arbeitsbedxngungen ins Gleichgewicht gebracht. Nachdem
die Gleichgewichtseinstellung durchgeführt worden ist, wird ein Streifen des Gels entfernt und mit der gepufferten,·lyophylisierten
CEA-Fraktion aus der zweiten Säule vermischt. Die erhaltene
Aufschlämmung wird dann auf den Block an die gleiche Stelle gegossen, von der der Streifen entfernt worden war, vorzugsweise
in der Mitte des Blocks. Das geeignete Markierungsmittel, zum Beispiel Ferritin, ein Eisen enthaltendes Protein, wird
dann am Kathodenende des Blocks aufgetupft. Nachdem die Elektrophorese eine vorbestimmte Zeitdauer betrieben worden ist, in
diesem Falle etwa 24 Stunden, wird der die CEA-Aktivität enthaltende Bereich, d.h. 10 - 14 cm anodisch zur Aufbringungszone,
entfernt. Dieser Bereich wird nur entfernt, wenn sich das Markier ungsnitt el eine zuvor bestimmte Entfernung bewegt hat, in
diesem Falle 18 cm in anodischer Richtung. Die CEA-Aktivität wird unter Saugen durch ein verfügbares 0,20/U-Celluloseacetatfilter
eluiert und vorzugsweise durch Dialyse gegen destilliertes Wasser zur Entfernung des bei der Eluierung verwendeten Salzes
gewonnen. Man erhält ein Material, das im wesentlichen reines CEA ist. Dies wird entweder durch die Prewcipitin-Inhibition
oder unmittelbar durch die Ouchterlony-Prüfung gegen nicht-absorbiertes Tumor-Antiserum gezeigt. Eine einzelne Präzlpitationslinie
zeigt reine CEA-Aktivität an.
In der deutschen Patentanmeldung P 20 29 499.9 wird ein Verfahren zur Bestimmung der Höhe des CEA-Gehaltes in Körperflüssigkeiten
von Personen mit Krebs oder KrebsVermutung durch eine Radioimmuntecknik,
die einfach durchzuführen ist und einen hohen Reproduzierbar keitsgr ad hat und spezifisch ist, offenbart.
609838/0898 -13-
Bei der Radioimmuntechnik ist es wichtig, daß das radioaktive Atom ausreichend reaktionsfähig mit dem zu kennzeichnenden
Molekül ist, um eine entsprechende Konzentration der Radioaktivität zur Bestimmung zu schaffen, und daß das radioaktive
Atom eine ausreichende Zerfallszahl pro Zeiteinheit zur Verfügung stellen muß, um eine ausreichende Empfindlichkeit für genaue
Bestimmungen zu schaffen. Weiterhin darf die Antigenwirksamkeit durch die Verbindung des radioaktiven Atoms mit dem Antigen
nicht schädlich beeinflußt werden.
Das CEA kann durch radioaktive Atome markiert werden, die mit
dessen chemisch reaktionsfähigen Gruppen reagieren können und
nicht wesentlich die Antigenwirksamkeit herabsetzen. Es wurde
125
gefunden, daß Jod besonders geeignet ist.
Das CEA kann mittels in der Technik bekannter Verfahren mit geringen
Modifikationen bezüglich der Konzentration und der Volumina mit radioaktivem Jod umgesetzt (radiojodiert) werden. Die
"Chloramine-T-Methode" von Hunter und Greenwood, Biochem. J (1964) , Seit
vorteilhaft.
vorteilhaft.
125 (1964), Seite 46, unter Verwendung von Jod ist besonders
Dieses Verfahren ergibt eine Radiojodierungswirksamkeit von etwa 20-50%. Beim Radiojodieren von CEA wird gereinigtes CEA verwendet.
Die Reaktion wird zum Beispiel unter Verwendung von 200 /ul einer 100 ,ug "Chloramine-T" (Natriumsalz des p-Toluolsulfo-chloramins)
enthaltenden Reaktionslösung, von 0,25 - 0,4 mg
125
gereinigtem CEA und von 4 mCi Jod in Form von KJ oder NaJ
durchgeführt. Die Reaktion verläuft bei Raumtemperatur in etwa einer Minute und wird durch Zugabe von Natrium-metabisulfit unterbrochen.
Die Funktion des "Chloramine-T" besteht darin, das Jodid im Salz zu Jod zu oxidieren. Die Funktion des Natrium-
125 metabisulfits besteht darin, das nicht umgesetzte Jod zum
Jodid zu reduzieren. Man kann auch andere Reduktionsmittel, wie Kalium-metabisulfit, verwenden. Die verwendeten Oxidationsund
Reduktionsmittel sollten nicht so stark sein, daß sie das
609838/0898
-14-
CEA schädigen. Das Produkt kann vom nicht umgesetzten Jod durch Chromatographie in einer Säule mit vernetztem Dextrar.gel,
zum Beispiel "Sephadex G-IOO", abgetrennt werden, wobei das Gel eine annähernde Molekulargewichtsausschlußgrenze von 100 000,
ein Wasserzurückhaltevermögen von 10,0 ■+- 1,0 g H2O/g trockenes
Gel, eine Teilchengröße von 40 - 120/u und ein Bettvolumen/ml/
g trockenes Gel von 15-20 hat. Man entfernt das Rohr mit der größten Radioaktivität im ersten Maximum. Das Produkt hat die
folgenden Eigenschaften:
Es ist mit einem spezifischen Antikörper reaktionsfähig, hat das
CEA-Elektrophoresebild, ein Molekulargewicht von etwa 200 000
und eine spezifische Aktivität von etwa 1000 - 25 000 dpra/ng,
vorzugsweise von etwa 10 000 - 20 000 dpm/ng, d.h. etwa 5-10 nvuCi/ng CEA.
Um die Radioimmunprüfung wirksam zu leiten, muß eine Zufuhr von CEA-spezifischen Antikörpern gewährleistet sein. Dies wird durch
Immunisieren von Tieren mit gereinigter CEA in üblicher Weise erreicht.
Man fügt dem CEA in einer Salzlösung ein Emulgiermittel zuf zum
Beispiel Freund's Adjuvans (vollständig). Die Emulsion kann bei Tieren in den Fußballen intramuskulär und/oder subkutan injiziert
werden. Geeignete Tiere sind Geflügel, Kaninchen, Pferde, Ziegen, Schafe und ähnliche. Die Regel bei Kaninchen ist zum Beispiel,
wöchentlich zwei bis fünf Injektionen zu machen. Nach der letzten Injektion wird vom Tier Blut entnommen. Das Serum
aus diesem Blut ist nichtabsorbiertes Anti-CEA-Antiserum.
Bei einem Verfahren werden 400 Mg CEA in 1 ml Salzlösung (0,9%)
verwendet. Die Injektion erfolgt intramuskulär unter Verwendung eines etwa viermaligen Volumens, das in den Fußballen injiziert
wird.
Dar in dem Antiserum vorhandene Antikörper ist nach Absorption an normalen Gewebebestandteilen in seiner Aktivität gegen CEA
unter Ausschluß von anderen Antigenen spezifisch, -15-
609838/0898
Die nachstehenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
Es wird Tumorgewebe vom Adenokarzinom des Colon herausgeschnitten und soviel wie möglich normales Gewebe abgeschnitten. Das
restliche Tumorgewebe wird durch einen Fleischwolf getrieben und in 1000 g-Mengen bei -20°C gelagert. 1000 g des zerkleinerten
Gewebes wird in destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 4000 ml suspendiert und bei 15 000 Umdrehungen pro
Minute eine Stunde in einem wassergekühlten Homogenisator homogenisiert.
Unter ständigem Rühren fügt man ein gleiches Volumen 2 n-Perchlorsäure
bei 4 C langsam zu. Diese Suspension rührt man 30 Minuten bei Raumtemperatur und zentrifugiert dann 30 Minuten
bei 4°C mit 6000 UpM in einer gekühlten Zentrifuge (6 χ 250 ml,
feststehender Winkelrotor). Das überstehende wird entfernt
und in einen flachen, etwa 7,62 cm weiten Dialysierschlauch
gegeben, der zuvor 1 Stunde in destilliertes Wasser getaucht worden ist, um ihn geschmeidiger zu machen. Die Dialyse wird
48 Stunden gegen kaltes Leitungswasser und dann gegen ständige Wechsel von großen Mengen destillierten Wassers bei 4 C während
weiteren 48 Stunden durchgeführt. Der dialysierte Rückstand wird in 5000 ml fassende Rundkolben gegeben, und zwar jeweils
1500 ml pro Kolben, in einem Methanol-Trockeneis-Bad Schalengefroren
und dann auf einem Lyophylisiergerät mit einer Kapazität von 8 Litern lyophylisiert. Unmittelbar vor der vollständigen
Lophylisation (24 - 30 Stunden) werden die Kolben herausgenommen, der teilweise trockene rohe Extrakt aufgetaut
und die erhaltene Lösung in einer gekühlten Zentrifuge (8 χ 30 ml, feststehender Winkelrotor) 30 Minuten bei 14 000 UpM
bei 4°C zentrifugiert. Das überstehende wird entfernt und dann nacheinander durch Membranfilter von 1,2/i, 0,45 /i und
0,22 Ak Milliporen filtriert. Die geklärte Lösung wird Schalengefroren
und zur Trockene lyophylisiert.
609838/0898
1,5 g des getrockneten rohen Extraktes löst man in 50 ml eines
0,05 m-NaHJPO^-Puffers (pH 4,5) in normaler Salzlösung. Der
Phosphat-Salz-Puffer vom pH 4,5 dient als Eluierungslösung
bei allen nachfolgenden Säulenchromatographien. Die Probe wird dann durch eine "Sepharose 4-B"-säule geleitet. Die verwendete
Säule ist eine "Pharmacia K 100/100" (100 cm χ 10 cm) mit einer
Bettlänge von 89 cm. Durch einen Umwälzkühler wird die Temperatur auf 4 - 5°C gehalten. Die Lösung wird mit einer Aufwärts —
flxeßgeschwindigkeit von 150 ml/Stunde mittels einer konstanten Ströraungspumpe (LKB "Varioperpex 1200" Peristaltic
Pump) gepumpt. Man sammelt 25 ml-Fraktionen in einem Fraktionssammler (LKB "Ultrorac 7000"). Die Fraktionen werden
laufend bei 280 nju in einem UV-Absorptionsmeßgerät überprüft.
Die aktive Fraktion wird nach der Eluierung von 4750 ml aufgefangen. Der Versuch dauert annähernd 47 Stunden.
Das Gesamtvolumen der aktiven Fraktion beträgt 750 ml. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt, 48 Stunden bei 4°C gegen
zahlreiche Wechsel großer Volumina destillierten Wassers dialysiert, Schalen-gefroren und lyophylisiert.
200 mg des getrockneten Materials aus der "Sepharose 4-B"-Säule
werden dann in 10 ml des Standard-Puffers gelöst und durch eine "Sephadex G-200"-Säule geschickt. Die verwendete
Säule ist eine "Pharmacia K 50/100" (100 cm χ 10 cm) mit einer Bettlänge von 90 cm. Durch einen Umwälzkühler wird
die Temperatur auf 4°C gehalten. Die Lösung wird mit einer Aufwärtsflxeßgeschwindigkeit von 40 ml/Stunde mittels einer
konstanten Strömungspumpe (LKB "Perpex 10200" Peristaltic
Pump) gepumpt. 10 ml-Fraktionen werden laufend bei 280 mu
in einem UV-Absorptionsmeßgerät überprüft. Die' aktive Fraktion
wird nach der Eluierung von 820 ml aufgefangen.
Die Dauer dieses Versuchs beträgt 30 Stunden und das Gesamtvolumen
der aktiven Fraktion 190 ml. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt, 48 Stunden bei 4°C gegen zahlreiche Wechsel
großer Volumina destillierten Wassers dialysiert, Schalen-gefroren und lyophylisiert.
609838/0898
-17-
Das Blockelektrophoresemedium "Sephadex G-25 Fine" wird zwei
Stunden bei 80 C in Wasser gequollen und durch Dekantieren mit Borat vom pH 8/6 und einer Ionenstärke von 0,05 gewaschen
und dann durch eine gesinterte Glasplatte saugend filtriert.
Man gießt eine dicke Gelaufschlämmung auf einen "Lucite"-Blockträger
mit den Ausmaßen 61 cm χ 7,5 cm χ 1 cm und läßt
sie sich gleichmäßig über die Platte bis zu einer Tiefe von 1 cm verteilen. Die Oberfläche wird dann mit einem Wattebausch
abgewischt, bis sie fest aber nicht vollständig trokken ist.
Der Block wird dann mit 3 mm-Chromatographiepapierkontakten
(Whatman) versehen, die alle in der gleichen Fließrichtung des Papiers ausgerichtet sind. Den Block ordnet man dann
in dem Elektrophoresegerät an und läßt es sich während einer Stunde unter den Betriebsbedingungen von 400 V mit einer konstanten
Stromstärke von -20 mA bei 4°C ins Gleichgewicht bringen. Dann entfernt man von der Mitte des Blocks einen Streifen
von 1 cm und vermengt ihn gut mit 60 mg trockenem CEA aus Beispiel 1, das zuvor in einer Mindestmenge von 0,05 m-Borat,
annähernd 0,5 ml, gelöst worden ist. Die erhaltene Aufschlämmung wird dann in den Mittelstreifen gegossen. Dann
tupft man 1-2 Tropfen Ferritin (6-mal umkristallisiert) bei einer Konzentration von 100 mg/ml auf da,s Kathodenende
des Blocks. 24 Stunden nach Versuchsbeginn bewegt sich das Ferritin-Markierungsmittel 18 cm in anodischer Richtung.
Gleichzeitig wird der Block aus dem Elektrophoresegerät entnommen. Streifen von 2 cm zwischen der Aufbringungszone und
dem Anodenende werden mit 2 m-NaCl eluiert, die durch eine 0,20 /u. ungebundene Gittermembran ("Nalgene") geleitet worden
war. Die Aktivität wird bei 10 - 14 cm in anodischer Rieh -
609838/0898
tung zur Aufbringungszone lokalisiert, wobei eine schwächere
Aktivität bei 8 - 10 cm in anodischer Richtung zur Aufbringung szone gefunden wurde.
Jeder aktive Streifen wird eluiert und in einem eingeweichten l-3/16"-Dialysierschlauch gegen zahlreiche Wechsel großer Volumina
destillierten Wassers 48 Stunden bei 4°C dialysiert. Das Dialysat wird Schalen-gefroren und zur Trockene lyophylisiert.
Das getrocknete, gereinigte CEA wird unter vermindertem Druck über Calciumchlorid bei 4 C gelagert. Das
Produkt hat die folgenden charakterisierenden Eigenschaften:
Es bildet eine einzige Präzipitationslinie mit nichtabsorbiertem
Antiserum bei Geldiffusionsprüfungen, ist in Perchlosäure löslich, wandert bei der Blockelektrophorese anodisch
10 - 14 cm, wobei gleichzeitig ein Ferritin-Markierungsmittel
anodisch 18 cm wandert, wenn ein Borat-Puffer vom pH 8,6 und einer Ionenstärke von 0,05 und 400 V und 20 mA die Bedingungen
der Blockelektrophorese sind, es hat weiterhin ein Molekulargewicht
von 200 000 und es zeigt ein Spektrophotometerabsörptionsmaximum bei einer Wellenlänge von 280 ιφχ.
12 ausgewachsene, männliche, weiße Neu-Seeland-Kaninchen mit
einem Gewicht von 2,0 kg werden in 3 Gruppen zu je 4 Tiaren
eingeteilt. Die verschiedenen Gruppen v/erden mit den folgenden Materialien immunisiert; normaler Colongewebeextrakt, Tumorgewebeextrakt
des gleichen Individuums, von dem der normale Gewebeextrakt erhalten worden war, angesammeltes menschliches
Plasma. Der Tumorgewebeextrakt stammt von Tumorproben, die diagnostiziert und bestätigt worden waren, daß sie ein Adenokarzinom
des Colon sind. Die normalen Gewebeextrakte und die Tumorgewebeextrakte v/erden nach dem in Beispiel 1 beschriebenen
Verfahren gebildet. Das vereinigte menschliche Plasma wurde von 30 normalen Spendern erhalten, die alle Hauptblutgruppen
repräsentieren.
609838/0898 -19-
Die Injektionen, die 4 Wochen lang zweimal wöchentlich gegeben
wurden, enthielten 3 mg Protein in 0,6ml Gewebeextrakt oder Plasma, die in dem gleichen Volumen Freund's Adjuvans
(vollständig) emulgiert waren. Injektionen von 0,1 - 0,2 ml wurden in einem Fußballen und der Rest intramuskulär in die
Flankengegend gegeben. 12 Tage nach den letzten Injektionen wurde den Tieren Blut aus ihren äußeren Ohrvenen entnommen,
und die von jeder Gruppe erhaltenen Seren zu Prüfzwecken gesondert
gesammelt.
Die Seren von jeder Gruppe wurden an normalem Gewebe absorbiert und das erhaltene Präzipitat abgetrennt. Die überstehenden
Lösungen wurden dann der Ouchterlony-Technik einer doppelten Diffusion in Agargel unterworfen. Diese wurde in 1% Agar-in-Salzlösung
mit Merthiolat durchgeführt, das als Schutzstoff zu einer Endkonzentration von 1/10 000 zugefügt wurde. Die
Proben wurden in den Gelplatten geschnitten, so daß die zentralen und peripheren Vertiefungen 1 cm von einander angeordnet waren.
Jede Vertiefung wurde mit 0,15 ml des zu untersuchenden Materials gefüllt. Die verwendete Antigenkonzentration betrug
10 mg Eiweiß pro ml. Die Anfangsinkubation der Platten wurde in einer feuchten Umgebung 24 Stunden bei 37 C durchgeführt,
um die Difiiasion des Materials aus den Zwischenräumen (Vertiefungen)
heraus zu unterstützen. Man ließ die Proben sich in der gleichen feuchten Atmosphäre 7 Tage bei 25 C entwickeln.
Die Proben aus den Seren von den Tieren, die mit dem Tumorgewebeextrakt immunisiert worden waren, zeigten eine einzige
Linie, die angibt, daß das Serum für den Tumor spezifische Antikörper enthält. Keine Proben wurden aus den Seren von
Tieren entwickelt, die mit normalem Gewebe oder normalem menschlichen Plasma immunisiert worden waren.
Es wird eine 500 /al- Reaktionsmis chung gebildet, die 100/ig
125
"Chloramine-T", 250/ig CEA aus Beispiel 2 und 4 mCi Jod
609838/089 8 on
in Form von KJ enthält. Man läßt die Reaktion 1 Minute bei Raumtemperatur ablaufen und unterbricht sie durch Zugabe von
125
240 /ag Natrium-metabisulfit. Das erhaltene Produkt J-CEA
125
wird vom restlichen niohtreagierten Jod durch Chromatographie
an einer "Sephadex G-lOO"-Säule abgetrennt. Das Produkt
hat eine spezifische Aktivität von etwa 5
609838/0898
Claims (22)
1. Carcinoembryonales Antigen,g ekennzeichnet
durch die Bildung einer einzigen Präzipitationslinie mit seinem spezifischen Antikörper in unabsorbierten Antiserum
bei Geldiffusionsprüfungen, durch eine Löslichkeit in Perchlorsäure, durch Wandern von 10 - 14 cm in anodischer
Richtung bei der Blockelektrophorese, wobei gleichzeitig ein Ferritin-Markierungsmittel 18 cm in anodischer Richtung
wandert, unter Verwendung von 400 V und etwa 20 mA mit einem Borat-Puffer vom pH 8,6 und einer Ionenstärke von 0,05, durch
ein Molekulargewicht von etwa 200 000 und durch ein spektrophotometrisches
Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von 28 0 πιμ.
2. Antigen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß es mit radioaktivem Jod umgesetzt ist, die gleichen Eigenschaften wie CEA und eine spezifische Aktivität
von etwa 5-10 n^Ci/ng CEA hat.
3. Antikörper, dadurch gekennzeichnet , daß sie spezifisch für menschliches CEA nach Anspruch 1 sind.
4. Verfahren zur Gewinnung eines menschlichen carcinoembryonalen
Antigens nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrensstufen:
(a) Homogenisieren eines Adenokarzinomgewebes von Tumoren,
die im Verdauungssystemepithel entstehen, das sich von
einem embryonalen entodermalen Gewebe ableitet,
(b) Behandeln des Homogenisats mit einem Glycoprotein-Lösungsmittel,
609838/0898
(c) Abtrennen des Niederschlags und Klären der erhaltenen Lösung,
(d) Dialysieren der geklärten Lösung,
(e) Konzentrieren des Dialysats,
(f) Klären der erhaltenen Lösung,
(g) Trocknen der geklärten Lösung,
(h) Unterwerfen des erhaltenen Materials einer anschließenden Chromatographie an zwei verschiedenen Gelsäulen, von denen
die erste ein Agarosegel mii?etwa 4 Gew.-% Agarose und
einer Teilchengröße von 40 - 190μ und die zweite ein hydrophiles wasserunlösliches vernetztes Dextranpolymerisatgel
darstellt,
(i) Sammeln und Konzentrieren der Eluate, die ein spektrophotometrisches
Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von 280πιμ und ein Molekulargewicht von etwa 200 000 haben,
(j) Unterwerfen der gesammelten Eluate einer Elektrophorese,
(k) Sammeln der Fraktionen, die von der Aufbringungszone in
anodischer Richtung etwa 10 - 14 cm wandern, wobei gleichzeitig
ein Ferritin-Markierungsmittel vom Kathodenende in anodischer Richtung 18 cm wandert.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennz eichn
e t , daß in Stufe (b) als Glycoprotein-Lösungsmittel Perchlorsäure mit einer Konzentration von 0,5 bis etwa 2
normal verwendet wird.
6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
daß in Stufe (c) der Niederschlag abgetrennt und die erhaltene Lösung durch Zentrifugieren geklärt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
daß in Stufe (d) die Lösung gegen Wasser dialysiert wird.
609838/0898
8. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
daß in Stufe (e) das Dialysat durch etwa 24 - 30 stündiges partielles Lyophylisieren konzentriert wird.
9. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
daß in Stufe (f) die Lösung durch Hochgeschwindigkeitszentrifugieren mit etwa 12 000 bis 16 000 Umdrehungen pro
Minute und anschließendem Filtrieren mit Filtern mit sich verringernden Porengrößen von etwa 1,2 μ bis zu etwa 0,20 μ
geklärt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
daß in Stufe (g) die geklärte Lösung vor einem Trocknen durch Lyophylisieren Schalen-gefroren wird.
11. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
daß in Stufe (h) das Material zuerst in einem wäßrigen Puffer vom pH etwa 4,5 gelöst wird, dann durch die Agarosegelsäule
läuft, man die das CEA enthaltende Fraktion von Materialien mit höherem oder niedrigerem Molekulargewicht
und von kolloidalen Teilchen abtrennt, die Eluate mit einem spektrophotometrischen Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge
von 280 πιμ und einem Molekulargewicht von etwa 200 000
sammelt, dialysiert und lyophylisiert, das Lyophylisat in einem wäßrigen Puffer vom pH etwa 4,5 löst und es durch eine
zweite Säule mit vernetzten* Dextrangel laufen läßt, die ein höheres Abtrennungsvermögen als die erste Säule besitzt, und
schließlich das CEA von Materialien mit höherem und niedrigerem Molekulargewicht abtrennt.
12. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
daß in Stufe (j) als Elektrophorese-die Blockelektrophorese
angewendet wird, wobei die aktive Fraktion in einem Borat-Puffer vom pH etwa 8,2 bis 9,2 und mit einer Ionenstärke von
etwa 0,0125 bis 0,10 gelöst wird und wobei eine Spannung von etwa 300 - 500 V, eine Stromstärke von etwa 20 mA und als
Markierungsmittel Ferritin angewendet wird.
609838/0898
13. Verfahren zur Herstellung eines Antigens nach Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet , daß man CEA mit 125 Jod umsetzt.
14. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
daß man mittels aufeinanderfolgender Chromatographie an einer ersten und einer zweiten Gelsäule Fraktionen von
Adenokarzinomgewebe von Tumoren sammelt, die im Verdauungssystemepithel
entstehen, das sich von embryonalem entodermalen Gewebe ableitet, wobei diese Fraktionen ein spektrophotometrisches
Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von 280 χημ
und ein Molekulargewicht von etwa 200 000 haben und wobei die erste Gelsäule ein Agarosegel mit etwa 4 Gew.-% Agarose und
einer Teilchengröße von 40 - 190 μ und einem Fraktionierungsbereich von 3x10 bis 3x10 enthält und wobei die zweite
Gelsäule ein hydrophiles, wasserunlösliches vernetztes Dextrangel mit einer Molekulargewichtsausschlußgrenze von etwa 200
besitzt.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet,
daß die erste Gelsäule die das CEA enthaltende Fraktion von Materialien mit niedrigerem und höherem Molekulargewicht
und kolloidalen Teilchen abtrennt und die zweite Gelsäule die das CEA enthaltende Fraktion von Materialien mit
höherem und niedrigerem Molekulargewicht abtrennt, das von der ersten Säule nicht abgetrennt worden ist.
16. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
daß man mittels Elektrophorese Fraktionen von Adenokarzinomgewebe von Tumoren sammelt, die im Verdauungssystemepithel
entstehen, das sich von embryonalem entodermalen Gewebe ableitet, wobei diese Fraktionen von-.der Aufbringungszone in anodische^feichtung etwa 10 - 14 cm wandern, wobei
gleichzeitig ein Ferritin-Markierungsmittel vom Kathodenende in anodischer Richtung 18 cm wandert, wenn ein Borat-Puffer
vom pH 8,6 und von einer Ionenstärke von 0,05, eine Spannung von 4 00 V und eine Stromstärke von etwa 20 mA verwendet werden.
609838/ Π Β 98
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet,
daß als Elektrophoresemedium ein wasserunlösliches hydrophiles vernetztes Dextranpolymerisatgel mit einer
Molekulargewichtsausschlußgrenze von etwa 5000, einem Wasserzurückhaltungsvermögen
von 2,5 + 0,2 g H^O/g trockenes Gel und einer Teilchengröße von 20 - 80 μ verwendet wird.
18. Verfahren zur Gewinnung von für menschliches carcinoembryonales
Antigen nach Anspruch 1 spezifischen Anti-CEA-Antiserum, dadurch gekennzeichnet , daß man
mit normalem Colongewebeextrakt ein Serum von Tieren behandelt, die mit behandeltem Adenokarzinomgewebe immunisiert
worden sind, das im Verdauungssystemepithel entsteht, das
sich von embryonalem entodermalen Gewebe ableitet.
19. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
daß man ein homogenisiertes Adenokarzinomgewebe, das im Verdauungssystemepxthel entsteht, das sich von
embryonalem entodermalen Gewebe ableitet, mit einem Glycoprotein-Lösungsmittel
behandelt, in dem das carcinoembryonale Antigen löslich ist.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet,
daß als Lösungsmittel Perchlorsäure mit einer Konzentration von etwa 2-normal verwendet wird.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 4-12, dadurch gekennzeichnet , daß man das Dialysat eines geklärten
Perchlorsäureextraktes teilweise lyophylisiert.
22. Verfahren zur Gewinnung von für menschlichen carcinoembryonales
Antigen spezifischen Antikörpern nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet , daß man ein warmblütiges
Tier mit im wesentlichen reinem menschlichem carcinoembryonalen Antigen immunisiert und dann das bei diesem Tier
gebildete Anti-CEA Antiserum sammelt.
609838/0898
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US3806970A | 1970-06-01 | 1970-06-01 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE2065867A1 true DE2065867A1 (de) | 1976-09-16 |
DE2065867B2 DE2065867B2 (de) | 1980-06-04 |
Family
ID=21897920
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE2065867A Withdrawn DE2065867B2 (de) | 1970-06-01 | 1970-06-15 | Carcinoembryonales Antigen und Verfahren zu seiner Gewinnung |
DE2029499A Expired DE2029499C3 (de) | 1970-06-01 | 1970-06-15 | Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit von carcinoembryonalen Antigenen im Blut |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE2029499A Expired DE2029499C3 (de) | 1970-06-01 | 1970-06-15 | Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit von carcinoembryonalen Antigenen im Blut |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US3663684A (de) |
JP (4) | JPS5122047B1 (de) |
BE (1) | BE767800A (de) |
CA (1) | CA964580A (de) |
CH (2) | CH615439A5 (de) |
DE (2) | DE2065867B2 (de) |
DK (1) | DK144591C (de) |
FR (1) | FR2095728A5 (de) |
GB (4) | GB1321997A (de) |
IL (2) | IL34722A (de) |
IT (1) | IT995014B (de) |
NL (2) | NL7107501A (de) |
SE (1) | SE400124B (de) |
ZA (1) | ZA704069B (de) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2806146A1 (de) * | 1977-02-18 | 1978-08-24 | Research Corp | Tumor-spezifische gylkoproteine und methode zum nachweis von tumorigenen krebsarten |
EP0092223A2 (de) * | 1982-04-21 | 1983-10-26 | Bartos Patent Development and Holding Company Limited | Zytosol-CEA-Messung als Test für die Prognose von Krebs, insbesondere Brustkrebs |
Families Citing this family (34)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3867363A (en) * | 1970-06-01 | 1975-02-18 | Hans John Hansen | Carcinoembryonic antigens |
US4180499A (en) * | 1971-01-27 | 1979-12-25 | Hoffmann-La Roche Inc. | Carcinoembryonic antigens |
US3956258A (en) * | 1972-05-12 | 1976-05-11 | Hoffmann-La Roche Inc. | Carcinoembryonic antigens |
US3927193A (en) * | 1973-05-18 | 1975-12-16 | Hoffmann La Roche | Localization of tumors by radiolabelled antibodies |
US4022876A (en) * | 1973-06-21 | 1977-05-10 | Stanford Research Institute | Mass spectrometric immunoassay |
US4132769A (en) * | 1974-10-30 | 1979-01-02 | Osther Kurt B | Cancer antigen, cancer therapy, and cancer diagnosis |
DE2456224A1 (de) * | 1974-11-28 | 1976-08-12 | Karl Dr Med Theurer | Verwendung von nativen antikoerpern oder von antikoerper-fragmenten mit kovalent gebundenen oder konjugierten zytostatisch und/bzw. oder zytotoxisch wirkenden substanzen fuer die krebstherapie |
US3999944A (en) * | 1975-02-28 | 1976-12-28 | Hoffmann-La Roche Inc. | Detection of breast cancer |
US4043757A (en) * | 1975-05-20 | 1977-08-23 | Ortho Pharmaceutical Corporation | Method for detection of human mammary carcinoma |
US4152410A (en) * | 1975-09-03 | 1979-05-01 | Eisai Co., Ltd. | Diagnosis reagent for neoplasm and method for diagnosis of neoplasm |
US4086217A (en) * | 1976-03-03 | 1978-04-25 | Hoffmann-La Roche Inc. | Carcinoembryonic antigens |
US4132767A (en) * | 1976-04-05 | 1979-01-02 | Eisai Co., Ltd. | Preparation of α-L antibody, purification of α-L antigen and reagent for detection of α-L antibody and α-L antigen |
US4140753A (en) * | 1976-04-30 | 1979-02-20 | Scripps Clinic & Research Foundation | Diagnostic method and reagent |
US4145336A (en) * | 1976-04-30 | 1979-03-20 | Scripps Clinic And Research Foundation | Carcinoembryonic antigen isomer |
US4160817A (en) * | 1976-09-29 | 1979-07-10 | Research Corporation | Application of protein-protein interaction as an assay for the detection of cancer |
GB1598811A (en) * | 1977-01-12 | 1981-09-23 | Hoffmann La Roche | Carcinoma-associated antigens |
US4180556A (en) * | 1977-03-09 | 1979-12-25 | Abbott Laboratories | Pretreatment method for carcinoembryonic antigen assay |
JPS548714A (en) * | 1977-06-16 | 1979-01-23 | Saikin Kagaku Kenkiyuushiyo Kk | Production of specific antiserum |
US4234476A (en) * | 1978-03-07 | 1980-11-18 | Research Corporation | Application of protein-protein interaction as an assay for the detection of cancer |
US4241044A (en) * | 1978-12-28 | 1980-12-23 | Abbott Laboratories | Method of diagnosing cancer by detecting elevated anti-T antibody activity |
US4349528A (en) * | 1979-11-21 | 1982-09-14 | The Wistar Institute | Monocolonal hybridoma antibody specific for high molecular weight carcinoembryonic antigen |
US4299815A (en) * | 1980-02-08 | 1981-11-10 | Hoffmann-La Roche Inc. | Carcinoembryonic antigen determination |
US4317877A (en) * | 1980-06-05 | 1982-03-02 | Sloan Kettering Institute | Process for detecting the presence of malignant and pre-malignant cells in humans |
US4559311A (en) * | 1981-08-27 | 1985-12-17 | Stenman Ulf Hakan | Diagnostic method using oncofetal peptide as a tumor marker |
FR2520235A1 (fr) * | 1982-01-27 | 1983-07-29 | Bel Fromageries | Procede de separation d'immunoglobulines a partir de colostrum |
DE3230299A1 (de) * | 1982-08-14 | 1984-02-16 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Carcinoembryonales antigen, verfahren zu seiner isolierung und seine verwendung |
DK557483A (da) * | 1982-12-06 | 1984-06-07 | Hoffmann La Roche | Fremgangsmaade til bestemmelse af cea |
US6013772A (en) * | 1986-08-13 | 2000-01-11 | Bayer Corporation | Antibody preparations specifically binding to unique determinants of CEA antigens or fragments thereof and use of the antibody preparations in immunoassays |
JPS63187697U (de) * | 1987-05-26 | 1988-12-01 | ||
CA2116640A1 (en) * | 1993-03-25 | 1994-09-26 | Alexey Terskikh | Carcinoembryonic antigen derivatives |
US5635361A (en) * | 1994-10-25 | 1997-06-03 | Sahasrabudhe; Madhao B. | Diagnosis of cancer using tumor-mimetic cell surface antigen from chemically modified normal cells |
US5705351A (en) * | 1994-10-25 | 1998-01-06 | Sahasrabudhe; Madhao B. | Diagnosis of cancer using tumor-mimetic cell surface antigen from chemically modified normal cells |
EP1803814A1 (de) | 2005-12-27 | 2007-07-04 | SIGMA-TAU Industrie Farmaceutiche Riunite S.p.A. | Methode zur Verbesserung der Antikörperselektionskapazität in einer Phagen-Display-Bibliothek |
JP7060510B2 (ja) * | 2016-09-06 | 2022-04-26 | 富士レビオ株式会社 | 腫瘍マーカーの測定方法及び測定試薬 |
-
1970
- 1970-06-01 US US38069A patent/US3663684A/en not_active Expired - Lifetime
- 1970-06-15 GB GB2877070A patent/GB1321997A/en not_active Expired
- 1970-06-15 DE DE2065867A patent/DE2065867B2/de not_active Withdrawn
- 1970-06-15 ZA ZA704069A patent/ZA704069B/xx unknown
- 1970-06-15 DE DE2029499A patent/DE2029499C3/de not_active Expired
- 1970-06-15 GB GB5321672A patent/GB1322000A/en not_active Expired
- 1970-06-15 IL IL34722A patent/IL34722A/xx unknown
- 1970-06-15 JP JP45051838A patent/JPS5122047B1/ja active Pending
- 1970-06-15 GB GB5321572A patent/GB1321999A/en not_active Expired
- 1970-11-09 GB GB5321472A patent/GB1321998A/en not_active Expired
-
1971
- 1971-05-14 CH CH720471A patent/CH615439A5/de not_active IP Right Cessation
- 1971-05-21 DK DK248871A patent/DK144591C/da active
- 1971-05-24 SE SE7106677A patent/SE400124B/xx unknown
- 1971-05-28 BE BE767800A patent/BE767800A/xx not_active IP Right Cessation
- 1971-05-29 IT IT25225/71A patent/IT995014B/it active
- 1971-06-01 NL NL7107501A patent/NL7107501A/xx unknown
- 1971-06-01 FR FR7119730A patent/FR2095728A5/fr not_active Expired
- 1971-06-01 CA CA114,464A patent/CA964580A/en not_active Expired
-
1973
- 1973-06-15 IL IL42508A patent/IL42508A0/xx unknown
-
1975
- 1975-07-03 JP JP8234175A patent/JPS5327334B1/ja active Pending
- 1975-07-03 JP JP8234075A patent/JPS5516267B1/ja active Pending
- 1975-07-03 JP JP8233975A patent/JPS5617619B1/ja active Pending
-
1978
- 1978-02-10 NL NL7801570A patent/NL7801570A/xx unknown
- 1978-06-09 CH CH631478A patent/CH611629A5/xx not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (9)
Title |
---|
Cancer Research, 29, 1969, S. 1961-1964 * |
Cancer Research, 34 (1974), 2125-2130 * |
Cancer Reseece, 1969, S. 1961-1964 * |
Cancer, Bd. 20, 1967, S. 1663-1667 * |
Clinical Chemistry, Vol. 19, No. 10, 1973, S. 1214-1220 * |
Handbook of Experimental, 1967, S. 400-414 * |
J. Exp. Med., 128, 1968, S. 387-398 * |
Nature, 215, 1967, S. 67-68 * |
Nature, Bd. 215, 1967, A. 67-68: J. Exp. Med., Bd. 128, 1968, S. 387-398 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2806146A1 (de) * | 1977-02-18 | 1978-08-24 | Research Corp | Tumor-spezifische gylkoproteine und methode zum nachweis von tumorigenen krebsarten |
EP0092223A2 (de) * | 1982-04-21 | 1983-10-26 | Bartos Patent Development and Holding Company Limited | Zytosol-CEA-Messung als Test für die Prognose von Krebs, insbesondere Brustkrebs |
EP0092223A3 (en) * | 1982-04-21 | 1983-12-07 | Bartos Patent Development And Holding Company Limited | Cytosole-cea-measurement as predictative test in carcinoma, particularly mammacarcinoma |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CH615439A5 (de) | 1980-01-31 |
DE2065867B2 (de) | 1980-06-04 |
ZA704069B (en) | 1972-01-26 |
DE2029499A1 (de) | 1971-12-16 |
JPS5122047B1 (de) | 1976-07-07 |
JPS5327334B1 (de) | 1978-08-08 |
JPS5516267B1 (de) | 1980-04-30 |
GB1321997A (en) | 1973-07-04 |
DK144591C (da) | 1982-09-20 |
IL42508A0 (en) | 1973-08-29 |
JPS5617619B1 (de) | 1981-04-23 |
NL7801570A (nl) | 1978-06-30 |
NL7107501A (de) | 1971-12-03 |
IL34722A (en) | 1974-03-14 |
US3663684A (en) | 1972-05-16 |
CH611629A5 (de) | 1979-06-15 |
BE767800A (fr) | 1971-11-29 |
FR2095728A5 (de) | 1972-02-11 |
DE2029499B2 (de) | 1976-10-28 |
IL34722A0 (en) | 1970-08-19 |
GB1321999A (en) | 1973-07-04 |
GB1321998A (en) | 1973-07-04 |
CA964580A (en) | 1975-03-18 |
IT995014B (it) | 1975-11-10 |
DE2029499C3 (de) | 1983-12-22 |
GB1322000A (en) | 1973-07-04 |
DK144591B (da) | 1982-04-05 |
SE400124B (sv) | 1978-03-13 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE2065867A1 (de) | Carcinoembryonales antigen und verfahren zu seiner gewinnung | |
DE2720704C2 (de) | Neues Glycoprotein, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung | |
DE2126680B2 (de) | Carcinoembryonales Antigen | |
EP0123307A2 (de) | Gewebeprotein PP4, Verfahren zu seiner Gewinnung sowie seine Verwendung | |
EP0000134B1 (de) | Glykoprotein, Verfahren zu seiner Herstellung, seine Verwendung zur Gewinnung von Antiserum sowie das Antiserum | |
DE2640387C3 (de) | Gewebespezifisches Protein und Verfahren zu dessen Herstellung | |
EP0060491B1 (de) | Protein (PP16), Verfahren zu seiner Anreicherung und Gewinnung sowie seine Verwendung | |
EP0014756B1 (de) | Plazentaspezifisches Gewebsprotein PP10 und Verfahren zu seiner Anreicherung | |
EP0033000B1 (de) | Neues Protein PP15, ein Verfahren zu seiner Herstellung sowie seine Verwendung | |
EP0101603B1 (de) | Neues Protein (PP13), Verfahren zu seiner Anreicherung und Gewinnung sowie seine Verwendung | |
EP0009715A1 (de) | Neues ubiquitäres Gewebsprotein PP8 und Verfahren zu seiner Anreicherung | |
EP0037963B1 (de) | Neues Protein PP9, Verfahren zu seiner Gewinnung sowie seine Verwendung | |
EP0100522A2 (de) | Neues Protein (PP17), Verfahren zu seiner Anreicherung und Gewinnung sowie seine Verwendung | |
DE3418888A1 (de) | Gewebeprotein pp(pfeil abwaerts)1(pfeil abwaerts)(pfeil abwaerts)8(pfeil abwaerts), verfahren zu seiner gewinnung sowie seine verwendung | |
EP0141326B1 (de) | Neues Protein PP20, Verfahren zu seiner Gewinnung sowie seine Verwendung | |
EP0029191B1 (de) | Neues Protein PP11, ein Verfahren zu seiner Gewinnung und seine Verwendung | |
DE3410694C2 (de) | ||
DE2732587A1 (de) | Polypeptid mit thymischer wirksamkeit | |
DE2714751A1 (de) | Herstellung von alpha-l-antikoerpern, reinigung von alpha-l-antigenen und reagenz fuer die bestimmung von alpha-l-antikoerpern und alpha-l-antigenen | |
DE3404563A1 (de) | Gewebeprotein pp(pfeil abwaerts)1(pfeil abwaerts)(pfeil abwaerts)9(pfeil abwaerts), verfahren zu seiner gewinnung sowie seine verwendung | |
CH615512A5 (en) | Method for the determination of carcinoembryonic antigen | |
DE2157610B2 (de) | Verfahren zu seiner Isolierung und seine Verwendung für die Herstellung von Antiseren | |
AT330358B (de) | Diagnostisches mittel zum nachweis und zur uberwachung einer schwangerschaft | |
AT330357B (de) | Verfahren zur herstellung eines anti-schwangerschaftsspezifischen -beta 1- glykoprotein-serums |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
OI | Miscellaneous see part 1 | ||
8228 | New agent |
Free format text: LEDERER, F., DIPL.-CHEM. DR. MEYER-ROXLAU, R., DIPL.-ING., PAT.-ANW., 8000 MUENCHEN |
|
8228 | New agent |
Free format text: LEDERER, F., DIPL.-CHEM. DR., PAT.-ANW., 8000 MUENCHEN |
|
8239 | Disposal/non-payment of the annual fee |