DE2126680B2 - Carcinoembryonales Antigen - Google Patents
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- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J47/00—Ion-exchange processes in general; Apparatus therefor
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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- C07K16/3007—Carcino-embryonic Antigens
-
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Description
Die Patentanmeldung P 2065 867.7 betrifft ein carcinoembryonales Antigen, erhältlich durch:
(a) Homogenisieren eines Adenokarzinomgewebes von Tumoren, die im Verdauungssystemepithel entstehen, das sich von einem embryonalen entodermalen Gewebe ableitet,
(a) Homogenisieren eines Adenokarzinomgewebes von Tumoren, die im Verdauungssystemepithel entstehen, das sich von einem embryonalen entodermalen Gewebe ableitet,
(b) Behandeln des Homogenisats mit einem Glycoprotein-Lösungsmittel,
(c) Abtrennen des Niederschlags und Klären der erhaltenen Lösung,
(d) Dialysieren der geklärten Lösung gegen Wasser,
(e) Konzentrieren des Dialysats,
ίο (f) Klären der erhaltenen Lösung,
(g) Trocknen der geklärten Lösung und Aufarbeiten
durch Chromatographie und Elektrophorese,
wobei das Verfahren weiter gekennzeichnet ist durch die Verfahrensschritte:
wobei das Verfahren weiter gekennzeichnet ist durch die Verfahrensschritte:
(h) Unterwerfen des erhaltenen Materials einer Chromatographie an zwei verschiedenen Gelsäulen,
von denen die erste ein Agarosegel mit 4 Gew.-% Agarose und einer Teilchengröße von
40-190 μ und die zweite ein hydrophiles wasserunlösliches vernetztes Dextranpolymerisatgel
(Sephadex G-200) darstellt, unter jeweiligem Sammeln und Konzentrieren der Eluate, die ein
spektrophotometrisches Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von 280 πιμ und ein MoIekulargewicht
von etwa 200000 haben,
(i) Unterwerfen der gesammelten Eluate einer Elektrophorese,
(k) Sammeln der Fraktionen, die von der Aufbringungszone unter Verwendung von 400 V und
.κι etwa 20 mA mit einem Borat-Puffer von pH 8,6
und einer Ionenstärke von 0,05 in anodischer Richtung etwa 10 bis 14 cm wandern, wobei
gleichzeitig ein Ferritin-Markierungsmittel vom Kathodenende in anodischer Richtung 18 cm
wandert.
In Abwandlung der Erfindung der Hauptpatentanmeldung
betrifft die vorliegende Erfindung ein carcinoembryonales Antigen, erhältlich durch
a) Homogenisierung von Adenocarzinomgewebe und Abtrennung der festen Partikel aus dem Homogenat;
b) Behandlung der erhaltenen Lösung mit einem Glykoprotein-Lösungsmittel, in dem CEA löslich
ist;
c) Abtrennung des Niederschlages und Klären der Lösung gemäß Patentanmeldung P 2065867.7,
wobei das Verfahren weiter gekennzeichnet ist durch die Verfahrensschritte
d) Dialyse der geklärten Lösung gegen ein PoIy-5« äthylenglykol mit einem mittleren Molekulargewicht
von 15000-20000 und einem Erweichungspunkt von 60° C;
e) Lösen des Dialysates in einem wäßrigen Puffer mit einem pH-Wert zwischen 5 und 9;
f) Subsequente Gclchromatographie an zwei Säulen, von denen die erste ein Agarosegel mit etwa
6 Gew.-% Agarose und einer Partikelgröße von 40-210 μ und die zweite ein hydrophiles, wasserunlösliches
quervernetztes Dextrangel (Se-
wi phadex G-H)O) enthält unter jeweiligem Sammeln
und Konzentrieren derjenigen Fraktionen des Eluates, die ein Absorptionsmaximum bei
280 nm und ein Molekulargewicht von 200 000-500 000 besitzen und
fts g) Chromatographie der gesammelten und konzentrierten
Dextrangeleluate an einer Mischbett-Ionenaustauschersäule mit einer Lösung von Ammoniumacetat
in wäßrigem Natriumchlorid,
wobei das Austauschermaterial eine Mischung von trockener oder verquollener Carboxymethylcellulose
mit einer Partikelgröße von 20 bis 60 μ, einer Kapazität von 1,0 ±0,1 mAequiv./g
und einer Wasseraufnahmekapazität von 2,3—2,7 g/g Trockensubstanz und mikrogranulierter
Diäthylaminoäthylcellulose in freier basischer Form mit einer Partikelgröße von 20 bis
60 μ, einer Kapazität von 1,0 ±0,1 mAequiv./g und einer Wasseraufnahmekapazität von
2,3-2,8 g/g Trockensubstanz ist.
Der Ausdruck »Carcinom«, wie er in der vorliegenden Beschreibung gebraucht wird, soll alle Carcinome und Adenocarcinome des Menschen umfassen. Der Ausdruck »carcinoembryonisches Antigenmaterial« umfaßt dasjenige Material mit carcinoembryonischer Aktivität.
Der Ausdruck »Carcinom«, wie er in der vorliegenden Beschreibung gebraucht wird, soll alle Carcinome und Adenocarcinome des Menschen umfassen. Der Ausdruck »carcinoembryonisches Antigenmaterial« umfaßt dasjenige Material mit carcinoembryonischer Aktivität.
Obgleich die vorliegende Erfindung Antigene betrifft, die mit Carcinomen allgemein zusammenhängen,
beziehen sich die im folgenden beschriebenen Methoden der Isolierung und Reinigung auf Coloncarcinomgewebe
und auf Meconium, die jedoch als repräsentativ anzusehen sind für die Behandlung von
Material, das CEA bzw. die Komponenten A und/ oder B enthält.
Zur Isolierung von carcinoembryonischem Antigenmaterial
gemäß vorliegender Erfindung wird Adenocarcinomgewebe aus primären oder metastatischen
Tumoren, vorzugsweise solchen des Verdauungssystems, wie z. B. Coiontumoren oder Meconium homogenisiert
Zur Isolierung des carcinoembryonischen Antigenmaterials der Komponenten A und/oder B ist es notwendig,
zunächst alle anderen Komponenten des Homogenats zu entfernen, um dann aus dem erhaltenen
Material die einzelnen Komponenten zu isolieren. Dies wird durch an sich bekannte chemische und physikalische
Extraktions- und Reinigungsverfahren erreicht. Sollte beispielsweise nur Komponente A oder
Komponente B im Homogenat anwesend sein, dann entfällt die Fraktionierung des erhaltenen carcinoembryonischen
Antigenmaterials.
Nach Abschluß der Extraktion und Reinigung muß die Identität der schließlich isolierten Fraktionen als
carcinoembryonisches Antigenmaterial bzw. einer Komponente bestätigt werden. Dies kann durch verschiedene
bekannte Techniken erfolgen, z. B. durch doppelte Agargeldiffusion, durch Immunoelektrophorese,
Hämagglutination, passive kutane Anaphylaxie u. dgl.
Die AnwendungdieserTechniken setzt voraus, daß die verwendeten Antikörper erwiesenermaßen spezifisch
sind für CEA-Material, Komponente A und/ oder Komponente B. Antikörper, die diese Bedingung
erfüllen, können durch immunologische Toleranz- oder Absorptionstechniken hergestellt werden.
Bei der immunologischen Toleranztechnik werden Tiere während des Neugeborenenlebensabschnittes
gegen normale Gewebe immunologisch tolerant gemacht. Die toleranten Tiere werden dann mit Tumorpräparaten
der gleichen Spenderarten immunisiert. Wo eine angemessene Unterdrückung der Immunreaktion
gegen normale Gewebebestandteile beobachtet werden konnte, ist die Entwicklung von für den
Tumor anscheinend spezifischen Antikörpern erreicht worden.
Beider Absorptionstechnik wird das Antitumorantiserum
von normalem Gewebe und von normalen Flüssigkeiten (Speichel, Serum, Plasma) absorbiert,
um antinormale Komponenten des Antiserums zu entfernen. Zurückbleibende Antikörperaktivität des
absorbierten Antiserums, die gegen das Tumormaterial gerichtet ist, wird dann als tumorspezifisch bezeichnet.
Dieses Verfahren ist nicht fehlerfrei, da die Möglichkeit besteht, daß tumorspezifische Antikörper
entfernt oder durch normale Gewebekomponenten inaktiviert werden können, die ähnlich, jedoch nicht
ίο identisch sind mit den Tumorantigenen, die ursprünglich
die Antikörperbildung anregten.
Zur Illustrierung der immunologischen Toleranztechnik kann Adenocarzinomgewebe aus Tumoren
des Colons und normales Colongewebe desselben Individuums verwendet werden, weil sich ein Coloncarzinom
im allgemeinen praktisch niemals submukös mehr als 6 bis 7 cm auf jeder Seite eines sichtbaren
Tumors ausdehnt.
Das Tumorgewebe des Colonadenocarzinoms und normales Colongewebe des gleichen Individuums
werden zwar getrennt, jedoch in gleicher Weise behandelt. Das Gewebe wird gemahlen, in einem Puffer
suspendiert und dann homogenisiert. Aus dem Homogenat werdsn dann feste Teilchen, die größer als
0,22 μ sind und worunter auch alle Bakterien fallen, entfernt. Dies geschieht vorzugsweise durch Zentrifugieren
oder Filtrieren durch allmählich kleiner werdende Filteröffnungen. Es wird hiermit eine Sterilisierung
des Überstandes oder Filtrates erreicht.
M) In geeignete Gruppen eingeteilte Versuchstiere
werden dann mit den Extrakten immunisiert. Nach einem geeigneten Zeitintervall entnimmt man den
Tieren ein Serum. Das Vorliegen von Antikörpern in den Testseren kann entweder durch die Ouchter-
.15 lony-Technik der zweidimensionalen Agargeldiffusion,
durch Immunoelektrophorese, Hämagglutinationsreaktionen oder durch passive kutane Anaphylaxie
bewiesen werden. Bevorzugt in der Praxis ist wegen ihrer Einfachheit und ihrer reproduzierbaren
4« Ergebnisse die Ouchterlony-Technik.
Ist die Anwesenheit von Antikörpern einmal bewiesen, dann ist es möglich, eine besondere Extraktionsmethode
auszuarbeiten, die es gestattet, eine Fraktion zu isolieren, die carcinoembryonisches Antigenmaterial,
Komponente A oder Komponente B, enthält.
Es wurde nun eine Extraktions- und Reinigungsmethode entwickelt, die schließlich zwei getrennte
Fraktionen liefert, von denen jede stets eine einzige
so Präzipitationslinie bei Anwendung der Ouchterlony-Technik liefert, wenn sie gegen nicht absorbierte Antiseren
geprüft wird. Die erfindungsgemäße Methode gibt auch ein Mittel an die Hand, mit Hilfe dessen
die Komponenten A und B von CEA sowohl voneinander als auch von Material mit dem gleichen Molekulargewicht
getrennt und in im wesentlichen reiner Form erhalten werden können.
Das carcinoembryonale Antigenmaterial, bzw. die Komponenten A und B, werden nach der bevorzugten
M) Ausführungsform der Erfindung aus primärem oder
metastatischem Carzinomgewebe isoliert und gereinigt.
Carcinoembryonales Antigenmaterial, bzw. Komponente A oder B in Adenocarcinomgewebe, wird mit
fts. einem Glycoprotein-Lösungsmittel, in dem CEA und
die Komponenten A und B löslich sind, extrahiert. Dies ist erforderlich, damit präzipitierbare normale
Proteine und störende antigenische Materialien vom
CEA-Material oder den Komponenten A und B abgetrennt
werden können. Hierfür geeignete Glycoprotein-Lösungsmittel sind z. B. Perchlorsäure, Trichloressigsäure,
Phosphorwolframsäiire u. dgl., wobei Perchlorsäure bevorzugt wird.
Vor dem Zusatz des Glycoprotein-Lösungsmittels wird das zu behandelnde Material in Wasser homogenisiert,
um das CEA-Material oder die Komponenten A und/oder B zu solubilisieren. Es sollte eine zur
Solubilisierung des gesamten CEA-Materials bzw. der Komponenten A und/oder B ausreichende Menge
Wasser verwendet werden. Im allgemeinen ist eine Menge von etwa 2 Liter Wasser pro kg zu behandelndem
Material ausreichend. Eine größere Menge Wasser ist im allgemeinen nicht notwendig. Vorzugsweise
wird destilliertes Wasser verwendet, da damit die Gefahren einer Kontamination herabgesetzt werden. Die
Homogenisierung kann bei Temperaturen von etwa 4° bis etwa 60° C, vorzugsweise bei Temperaturen
von etwa 4° bis etwa Raumtemperatur (20-25° C), vorgenommen werden.
Aus dem Homogenat, das das CEA-Material bzw. die Komponenten A und B in gelöster Form enthält,
werden alle festen Partikel entfernt. Dies kann nach einem der bekannten Verfahren erfolgen, beispielsweise
durch Filtration, Zentrifugieren oder ähnliches. Zur Abtrennung wird Zentrifugieren bevorzugt, da
dies schnell geht, im allgemeinen mit etwa 3000 bis 8000 Umdrehungen pro Minute. Um einen Aktivitätsverlust
zu vermeiden, wird vorzugsweise bei niedrigen Temperaturen, etwa bei 4-10° C getrennt. Bei
diesen Temperaturen nimmt auch die Sedimentationsgeschwindigkeit zu. Der Überstand wird dann mit
einem Glycoprotein-Lösungsmittel zwecks Entfernung von Proteinen und störenden antigenischen Materialien
behandelt.
Jede Temperatur von Raumtemperatur und darunter ist für die Zugabe des Glycoprotein-Lösungsmittels
zum Überstand des Homogenates geeignet. Vorzugsweise jedoch arbeitet man bei einer Temperatur
von 4° C bis etwa Raumtemperatur. Die Temperatur des Glycoprotein-Lösungsmittels, das dem Überstand
zugefügt wird, kann ebenfalls variieren, jedoch wird auch hier vorzugsweise die gleiche Temperatur wie
bei der Extraktion angewandt. Als Glycoprotein-Lösungsmittel wird im allgemeinen eine konzentrierte
Säure, beispielsweise mit einer Normalität von etwa 0,5-2, vorzugsweise 2 verwendet. Dem Überstand
wird zweckmäßigerweise innerhalb von etwa 30 Minuten die etwa gleiche Volumenmenge Lösungsmittel
zugefügt. Ein langsamerer Zusatz kann zum Verlust der Antigenwirksamkeit führen.
Man erhält ein Präzipitat. Das Präzipitat wird vom Überstand, der gelöstes CEA-Material Üizw. die Komponenten
A und/oder B enthält, nach einer der üblichen Trennungsmethoden, z. B. Filtration oder Zentrifugieren,
vorzugsweise durch Zentrifugieren, nach den bereits oben beschriebenen Methoden abgetrennt.
Zur weiteren Reinigung, d. h.zur Entfernung von niedermolekularen Substanzen, wie Perchlorsäure
oder Salzen, wie Natriumchlorid, hat sich die Dialyse gegen Polyäthylenglykol mit einem mittleren Molekulargewicht
von etwa 15000-20000 und einem Erweichungspunkt von 60° C als am geeignetsten erwiesen.
Ein für diese Dialyse geeignetes Handelsprodukt ist 2OM Carbowachs der Firma Mann Research Laboratories.
Die Dialyse ist ein kritischer Teil des Verfahrens, da durch sie alle diffusionsfähigen löslichen Substanzen
mit Ausnahme der Substanzen von höherem Molekulargewicht, wozu auch die CEA-Fraktion gehört,
entfernt werden. Die Dialyse kann bei Temperatüren von 4 bis 10° C, vorzugsweise bei 4° C, durchgeführt
werden und dauert etwa 18 Stunden. Das gesamte Verfahren bis zu diesem Punkt nimmt etwa
24 Stunden in Anspruch.
Die Verwendung von Polyälhylenglykol mit einem
ίο Molekulargewicht von 15 0OO bis 20000 in der Dialyse
ist ein kritisches Merkmal der Erfindung, da dadurch eine schnellere Isolierung des CEA-Materials bzw.
der Komponenten A und/oder B erreicht wird. Durch die einmalige Dialyse unter Verwendung von PoIyäthylenglykol
wird eine mehrfache Dialyse gegen Wasser sowie die Notwendigkeit der Lyophylisierung
des Rückstandes vermieden. Der erhaltene Rückstand hat überwiegend festen Charakter und enthält verschiedene
Verbindungen mit sowohl höherem wie niedrigerem Molekulargewicht als das CEA-Material
bzw. die Komponenten A und/oder B.
Die Abtrennung des CEA-Materials bzw. der Komponenten A und/oder B aus dem erhaltenen
Rückstand kann erfindungsgemäß durch subsequente Chromatographie an 2 verschiedenen Gelsäulen und
anschließende Chromatographie an einem Ionenaustauscher erfolgen. Diejenigen Fraktionen der nach
Durchführung der Säulenchromatographie erhaltenen Eluate, die ein Molekulargewicht von etwa 200000
so bis 500000 und ein definiertes Absorptionsmaximum bei 280 nm aufweisen, enthalten das CEA-Material
bzw. die Komponenten A und/oder B.
Die Säulenchromatographie kann in der Weise erfolgen, daß man den gelösten Rückstand der subsequenten
Säulenchromatographie an zwei verschiedenen Gelen in beliebiger Reihenfolge unterwirft.
Ausgehend vom Carzinomgewebe wird man jedoch zweckmäßigerweise so vorgehen, daß man zunächst
eine Agarosegelsäule verwendet. Agarose ist der neutrale Anteil von Agar. Das Gel ist unter dem Warenzeichen
Sepharose der Firma AB Pharmacia, Uppsala, Schweden, im Handel erhältlich, und zwar in Form
von wäßrigen Suspensionen in 0,02%iger Natriumazidlösung
als Schutzmittel. Die Struktur des Gels beruht auf Wasserstoff-Brückenbindungen. Die Eigenschaften
des Gels werden bestimmt durch die Partikelgröße und den Anteil an Agarose, wobei dieser
Agaroseanteil den Fraktionierungsbereich des Gels bestimmt.
so Die erfindungsgemäß geeigneten Gele sind diejenigen mit einer Teilchengröße von 40 bis 210 μ und
6 Gewichtsprozent Agarose. Dieses Material, genannt »Sepharose 6B«, hat einen solchen Fraktionierungsbereich,
daß Verbindungen mit einem Molekulargewicht von 4 x 106 oder weniger abgetrennt werden.
Sepharose 6B wird darum erfindungsgemäß verwendet, weil es die Abtrennung von CEA-Material bzw.
der Komponenten A und/oder B aus Carzinomgewebe von fremden Komponenten mit wesentlich höherem
oder niedrigerem Molekulargewicht sowie von Koloidpartikeln erlaubt.
Die zweite Säule enthält ein hydrophiles wasserunlösliches quervernetztes Dextrangel. Dieses Material
und die Methode zu seiner Herstellung sind im britisehen Patent No. 854 715 beschrieben. Dieses Gelmaterial,
das unter dem Namen »Sephadex« der Firma AB Pharmacia, Uppsala, Schweden, im Handel erhältlich
ist, besteht aus einem dreidimensionalen ma-
kroskopischen Netzwerk von quervernetzten oder gebundenen Dextransubstanzen, das unter Quellung
Wasser absorbieren kann. Die Fähigkeit der Wasseraufnahme des Gels ist umgekehrt proportional dem
Quervernetzungsgrad der Dextransubstanzen. Es sind verschiedene Sorten des Gelmaterials mit unterschiedlichem
Porositätsgrad erhältlich. Das bei der erfindungsgemäßen Verwendung bevorzugte Gel hat
eine annähernde Ausschiußgrenze von 100000, ein Wasserretentionsvermögen von 10 ± 1,0 g F^O/g
trockenes Gel, eine Teilchengröße von 40-120 μ und ein Bettvolumen von 15 bis 20 ml/g trockenes Gel.
Dieses Gel trägt die Bezeichnung »Sephadex G-100«.
Sephadex G-100 wird zur weiteren Reinigung der das CEA-Material bzw. die Komponente A oder
Komponente B enthaltenden Fraktion verwendet. Da die Sephadex-G-100-Säule ein größeres Auftrennungsvermögen
für den Molekulargewichtsbereich von 100000-200000 als die Agarosegelsäule aufweist,
wird eine weitere Abtrennung von CEA-Material bzw. der Komponenten A oder B von Verbindungen
mit niedrigerem Molekulargewicht erreicht. Die zweite Säule sollte nur verwendet werden, nachdem
die kolloidalen Teilchen durch die erste Säule entfernt worden sind, da diese Teile die Sephadex-Säule sonst
verstopfen und sie unwirksam machen würden. Das gilt vor allem für die Behandlung von Tumorgewebe.
Die Chromatographie wird zweckmäßigerweise so ausgeführt, daß man den Rückstand in einem wäßrigen
Puffer bei einem pH-Wert von etwa 5 bis 9, vorzugsweise bei pH 7, löst. Ein typischer, für das erfindungsgemäße
Verfahren geeigneter Puffer besteht aus einer Lösung von 0,1 m Tris-OH in 0,135 m NaCl mit
0,02% Natriumazid als Schutzmittel und mit HCl auf einen pH-Wert von 7 eingestellt. Die mit diesem Puffer
von der ersten Säule eluierten Fraktionen, die CEA-Aktivität aufweisen, werden vereinigt und dann
gegen Polyäthylenglykol, wie oben beschrieben, dialysiert. Der Rückstand wird dann nochmals in dem
wäßrigen Tris-OH-Puffer vom pH 5 bis 9, der gleichen Zusammensetzung wie bereits oben beschrieben, gelöst,
die Lösung wird über die zweite Säule gegeben, und die mit dem Puffer eluierten Fraktionen, die
CEA-Aktivität aufweisen, werden gesammelt und, wie oben beschrieben, dialysiert.
Der Vorteil des Arbeitens bei tiefen Temperaturen, d. h. bei etwa 4 bis 10° C, ist der, daß Stabilität gewährleistet
ist und daß eine größere Trennschärfe erreicht wird. Es werden diejenigen Fraktionen des EIuats
der zweiten Säule gesammelt, die ein Molekulargewicht von 200 000 bis 500000 und ein Absorptionsmaximum bei 280 nm aufweisen. Aus dem Eluat der
ersten Säule wurden ebenfalls diejenigen Fraktionen, die diese Kriterien erfüllen, gesammelt, obgleich sie
auch noch Material mit höherem und geringerem Molekulargewicht (bis hinunter zu einem Molekulargewicht
von 70000) enthielten. Die gesammelten Fraktionen enthalten je nach Herkunft des Ausgangsmaterials
das CEA-Material bzw. die Komponenten A oder B, was entweder durch die Präzipitininhibition
oder direkt durch Ouchterlony-Prüfung gegen nicht absorbiertes Tumorserum bewiesen werden kann.
Eine einzige Präzipitationslinie zeigt reine CEA-Aktivität an.
Die nach der Gelchromatographie erhaltene Fraktion wird dann zwecks weiterer Reinigung und Fraktionierung
der Chromatographie an einer Ionenaustauschersäule unterworfen. Es hat sich herausgestellt,
daß in den meisten Fällen, bei denen von Adenocarcinomgewebe des Colons ausgegangen wurde, die die
CEA-Aktivität enthaltende Fraktion drei verschiedene Komponenten enthält (in einigen Fällen allerdings
wurde auch nur die Komponente A oder die Komponente B gefunden), die alle ein Molekulargewicht
zwischen etwa 200000 und 500000 besitzen. Eine dieser Komponenten, sie macht 5 Gew.% der
Fraktion aus, ist nicht reaktionsfähig. Die zweite
ίο Komponente, sie macht etwa 10 Gew.% der Fraktion
aus, besitzt antigenisch wirksame Stellen, die mit dem CEA-spezifischen Antikörper reagieren und wurde
hier als Komponente B von CEA identifiziert. Die dritte Komponente, die etwa 85 Gew.% der Fraktion
is ausmacht, hat ebenfalls antigenisch wirksame Stellen,
die mit dem CEA-spezifischen Antikörper reagieren und wurde hier als Komponente A von CEA identifiziert.
Es wurde ferner festgestellt, daß je nach Ausgangsmaterial, ζ. B. aus Meconium, Lungen- oder Brusttumoren,
unterschiedliche Gewichtsverhältnisse der einzelnen Komponenten vorliegen und daß diese generell
von Patient zu Patient und von Tumor zu Tumor variieren. Meconium z. B. weist nur die Komponente
B auf.
Um die reinen Komponenten der CEA-Aktivität zu erhalten, ist die Verwendung einer Ionenaustauschersäule
nötig. Wenn nur eine Komponente vorliegt, dient diese Ionenaustauschersäule lediglich zu
deren Reinigung und Bestätigung dieses Sachverhaltens.
Das für die gewünschte Trennung geeignete Ionen-■
austauschermaterial ist ein Gemisch aus einem Kationenaustauscher, z. B. Carboxymethylcellulose, und
einem Anionenaustauscher, z. B. Diäthylaminoäthylcellulose. Am geeignetsten für die Ausführung der
vorliegenden Erfindung ist eine Carboxymethylcellulose in mikrogranularer Form, mit einer Teilchengröße
von etwa 20 bis 60 μ, einer Kapazität von 1,0 ±0,1 mAequiv./g und einem Wasserretentionsvermögen
von 2,3 bis 2,7 g/g Trockensubstanz. Die bevorzugte Form ist die Natriumform. Ein geeigneter
Ionenaustauscher ist unter dem Warenzeichen »CM 52« der Firma H. Reevc Angel Inc., Clifton, New Jersey,
in vorgequollenem Zustand im Handel erhältlich. Eine andere geeignete Carboxymethylcellulose ist
»CM 32«, ebenfalls erhältlich von der Firma. H. Reeve Angel Inc., Clifton, New Jersey. Dieser Austauscher
unterscheidet sich von »CM 52« durch eine
so andere Kapazität pro Volumen; er ist ähnlich in der Teilchengröße, der Kapazität pro Gramm und dem
Wasserretentionsvermögen.
Die erfindungsgemäß geeignete Diäthylaminoäthylcellulose ist eine solche von mikrogranularer
Form mit einer Teilchengröße von etwa 20 bis 60 u, einer Kapazität von 1,0 ±0,1 mAequiv./g und einem
Wasserretentionsvermögen von 2,3-2,8 g/g Trockensubstanz in der freien basischen Form. Ein solcher
Austauscher ist beispielsweise unter dem Warenzeichen »DE 52« der Firma H. Reeve Angel Inc., Clifton,
New Jersey, im Handel erhältlich.
Die Mischbettsäule wird dadurch hergestellt, daß man die feinsten Artikel aus beiden Austauscherharzen
in üblicher Weise entfernt, jedem Harz eine Lösung aus Ammoniumacetat in 1,2 m Natriumchlorid
zufügt und gleiche Volumina der entstehenden Aufschlämmungen vermischt und in eine Säule mit den
Dimensionen 2,5 X 40 cm füllt, so daß ein Bett von
2,5 X 18 cm entsteht.
Das Eluat der Gelsäulen wird gegen Polyäthylenglykol,
wie oben beschrieben, dialysiert und das erhaltene Material dann in einem wäßrigen gepufferten
Lösungsmittel, das Proteine löst, aber keine Affinität für die Säule aufweist, gelöst. Ein typisches geeigentes
Lösungsmittel ist eine Ammoniumacetatlösung vom pH-Wert 4, die aus 0,1 m Essigsäure und aus Ammoniumhydroxyd
hergestellt werden kann.
Die erhaltene Lösung wird dann geklärt, vorzugsweise durch Zentrifugieren, wodurch alle nicht gelösten
Teilchen entfernt werden. Besonders geeignet ist Ultrazentrifugieren mit solchen Geschwindigkeiten,
daß mindestens die lOOOOOfache Erdbeschleunigung
erreicht wird.
Der resultierende Überstand wird auf die Mischbett-Ionenaustauschersäule
gegeben und mit einer Ammoniumacetat-Natriumchlorid-Lösung vom pH 4 eluiert. Andere Alkalimetallchloride, wie beispielsweise
Kaliumchlorid, sind ebenfalls geeignet. Es wird im Sinne einer diskontinuierlichen Gradientelution
gearbeitet, wobei Lösungen von Ammoniumacetat in 0,05, 0,1, 0,25 und 1,0 m Natriumchlorid verwendet
werden. Wie bereits oben erwähnt, variiert das Verhältnis der einzelnen Komponenten mit CEA-Aktivität
entsprechend dem Herkommen. Beispielsweise werden in einem typischen Fall, in dem Coloncarzinom
die Quelle der Antigenaktivität ist, etwa 85 Gew. % des Materials mit CEA-Aktivität mit einer
Lösung von Ammoniumacetat in 0,05 m Natriumchlorid eluiert; etwa 10 Gew.% des Materials mit
CEA-Aktivität werden mit einer Lösung von Ammoniumacetat in 0,1 m Natriumchlorid eluiert (Komponente
B). Das restliche Material wird mit Ammoniumacetat in 0,25 m Natriumchloridlösung eluiert. In
denjenigen Fällen, in denen nur die Komponente A oder die Komponente B anwesend ist, werden diese
mit denjenigen Elutionsmitteln eluiert, die auch nötig sind, um die entsprechenden Komponenten aus dem
Gemisch zu eluieren.
Charakteristische Daten der Komponente A von CEA sind: Molekulargewicht zwischen 120000 und
240000; gleiches elektrophoretisches Verhalten wie CEA, d. h. wenn bei Verwendung eines Boratpuffers
vom pH-Wert 8,6 und einer Ionenstärke von 0,05 bei 400 Volt und etwa 20 mA Ferritin als Standard 18 cm
anodisch wandert, wandert die Komponente A 10—14 cm anodisch; Elution von einer Mischbett-Ionenaustauschersäule
der oben beschriebenen Zusammensetzung mit einem Ammoniumacetat-Natriumchlorid-Lösungsmittel
vom pH-Wert 4 (Ammoniumacetat in 0,05 m Natriumchloridlösung); Absorptionsmaximum
bei 280 nm; Löslichkeit in Perchlorsäure und Bildung einer einzigen Präzipitationslinie
mit seinem spezifischen Antikörper in nichtabsorbiertem Antiserum im Geldiffusionstest.
Die Komponente B von CEA hat die folgenden charakteristischen Eigenschaften: Molekulargewicht
zwischen 120000 und 240000; gleiche elektrophoretische Eigenschaften wie CEA; Absorptionsmaximum
bei 280 nm; Löslichkeit in Perchlorsäure; Elution aus einer Mischbett-Ionenaustauschersäule der oben beschriebenen
Zusammensetzung mit einer Ammoniumazetat-Natriumchloridlösung vom pH-Wert 4 (Ammoniumacetat in 0,1 m Natriumchlorid) und Bildung
einer einzigen Präzipitationslinie mit seinem spezifischen Antikörper in nichtabsorbiertem Antiserum
in Geldiffusionstests.
Das CEA-Material oder seine Komponente A oder
B werden entweder durch die Präzipitininhibition oder direkt durch Guchterlony-Prüfung gegen nichtabsorbiertes
Tumorantiserum bestimmt. Eine einzige Präzipitationslinie ist ein Idiz für reine CEA-Aktivität.
Hieraus folgt also, daß jedes Material, das eine einzige Präzipitationslinie mit nichtabsorbiertem
CEA Antiserum entweder bei der Präzipitininhibition oder in der direkten Ouchterlony-Prüfung der zweidi-
K) mensionalen Agargeldiffusion liefert, unter die Erfindung fällt und damit geeignet ist, in dem diagnostischen
Test, wie hiervor beschrieben, verwendet zu werden.
Um die genannten Techniken der Präzipitininhibition oder Ouchterlony-Prüfung anwenden zu können,
muß gesichert sein, daß die verwendeten Antikörper spezifisch für CEA-Material bzw. die Komponenten
A und/oder B sind. Antikörper, die diese Bedingungen erfüllen, können durch immunologische ToIeranz-
oder Absorptionstechniken, wie bereits beschrieben, gewonnen werden.
Unter Anwendung dieser Techniken wurde gefunden, daß, wenn CEA-Material vorhanden ist, die
Komponenten A und B, die vom Mischbett-Ionen-
2s austauscher erhalten werden, praktisch die gesamte CEA-Aktivität, die vorhanden ist, enthalten. Die für
die Anwendung im Radioimmunoassay von CEA bevorzugte Komponente ist Komponente B, jedoch
können auch das CEA-Material oder die Komponente A mit Erfolg angewendet werden.
Bei Radioimmunoassay-Methoden ist es wichtig, daß das radioaktive Atom mit dem zu kennzeichnenden
Molekül hinreichend reagiert, um eine entsprechende Intensität der Radioaktivität für die Bestimmung
zu schaffen, und daß das radioaktive Atom eine hinreichend große Zerfallsrate besitzt, um eine ausreichende
Empfindlichkeit und Genauigkeit der Bestimmung zu gewährleisten. Weiterhin darf im Fall des
Radioimmunoassays von Antigenen die Antigenwirksamkeit durch die Bindung des radioaktiven Atoms
an das Antigen nicht beeinträchtigt werden.
Mittels der vorliegenden Erfindung ist es nun möglich, die Existenz menschlicher Carz;nome dadurch
festzustellen, daß man prüft, ob ein tumorspezifisches Antigen im Organismus zirkuliert. Die vorliegende
Erfindung erlaubt den Nachweis von mindestens 1 ng von CEA-Material bzw. der Komponenten A oder B
pro ml Serum oder Plasma. Diese Empfindlichkeit reicht aus, um abnorme Mengen von CEA-Aktivität
so zu erfassen. Geringere Mengen, beispielsweise unter 0,05 ng CEA-Aktivität pro ml, können unter normalen
Bedingungen vorliegen. Die Empfindlichkeit der Methode wird nur durch die spezifische Aktivität des
radioaktiven Atoms begrenzt.
Das carcinoembryonale Aktivität aufweisende Material kann mit solchen radioaktiven Atomen markiert
werden, die mit reaktiven Gruppen des Moleküls chemisch reagieren und die Antigenspezifität nicht wesentlich
herabsetzen. 125Jod hat sich als besonders geeignet
erwiesen.
Die Radiojodierung des die carcinoembryonale Aktivität aufweisenden Materials kann mittels bekannter
Verfahren unter Einschluß geringer Modifikationen bezüglich der Konzentrationen und VoIumina,
erfolgen. Die »Chloramin T-Methode« von Hunter und Greenwood (Biochem. J. 91, 46
[1964]), bei der 125Jod benutzt wird, ist besonders vorteilhaft;
die Jodierung erfolgt hier mit 20-50 %iger
Ausbeute. Die Radiojodierung kann sowohl auf das isolierte und gereinigte CEA-Material vor der Fraktionierung
in die Komponenten A und B als auch auf die einzelnen Komponenten selbst angewandt werden.
Bevorzugt ist jedoch die Verwendung der Komponente B.
Die Reaktion wird ausgeführt, beispielsweise unter Verwendung eines Gemisches, das 100 μg Chloramin
T, das ist Na[P-CH3-C6H4-SO2NCl], 0,025 bis
0,4 mg CEA-Material bzw. einer der Komponenten A oder B und 4 mCi 125Jod in der Form von KaIiumjodid
oder Natriumjodid enthält. Die Reaktion verläuft bei Raumtemperatur in etwa 1 Minute und
wird vorteilhaft durch Zugabe von Natrium- oder Kaliummetabisulfit unterbrochen. Die Funktion des
Chloramin T ist das Jodid zum Jod zu oxidieren, während das Metabisulfit nicht umgesetztes l25Jod zum
Jodid reduziert. Man kann auch andere Oxydationsund Reduktionsmittel verwenden, doch darf durch sie
das CEA-Material oder seine Komponenten nicht geschädigt werden. Das Produkt kann durch Chromatographie
an einer Säule mit einem vernetzten Dextrangel, z. B. »Sephadex G-100«, gereinigt werden. Das
erhaltene Produkt hat eine spezifische Aktivität von etwa 1000-25000, vorzugsweise von etwa 10000 bis
20000 Impulsen pro Minute und ng, d. h. etwa 5 bis 10 Ci/g.
150 g von gefrorenem primärem Adenocarcinomgewebe des Colons wurden in 5 Volumenteilen destillierten
Wassers bei 5° C 2 Minuten lang homogenisiert. Nach weiterer Behandlung des Homogenates in
einem Mischer während 5 Minuten wurde 30 Minuten lang bei 5000 U/min zentrifugiert. Der Überstand
wurde abdekantiert und mit einem Volumenteil einer 10%igen Perchlorsäurelösung versetzt. Das Gemisch
wurde i0 Minuten bei 5" C gerührt und dann 30 Minuten mit 5000 U/min zentrifugiert. Der Überstand
wurde abdekantiert, durch Glaswolle filtriert und das Filtrat durch Dialyse gegen eine Lösung von 20 M
Carbowax in einem Boratpuffer von pH 8,4 getrocknet. Der feste Rückstand wurde in 8 ml einer Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan/NaCl-Lösung
gelöst. Die Lösung wurde 30 Minuten mit 105000 X g zentrifugiert, 5 ml des erhaltenen Überstandes wurden
auf eine Sepharose-6B-Säule gegeben und mit der Tris-NaCl-Lösung eluiert. Es wurden 5-ml-Fraktionen
gesammelt bei einer Elutionsgeschwindigkeit von 0,5 ml/min. Die Fraktionen 45-57 wurden vereinigt
und durch Dialyse gegen 20 M Carbowax konzentriert. Das Konzentrat wurde auf eine Sephadex-G-100-Säule
gegeben und mit der Tris-NaCl-Lösung eluiert. Es wurden 5-ml-Fraktionen gesammelt. Die
4 Fraktionen, die den ersten Peak enthielten, wurden vereinigt und durch Dialyse gegen 20 M Carbowax
getrocknet. Das erhaltene feste Material wurde in 2 ml der Tris-NaCl-Lösung gelöst und 1 ml davon wurde
nach bekannten Methoden mit 12SJod markiert. Das
mit'25JOd markierte Material wurde auf eine Sepharose-6B-SäuIe
gegeben und mit der Tris-NaCl-Lösung eluiert. 5-ml-Fraktionen wurden gesammelt. Die
Fraktionen 45—57 wurden vereint, eingefroren und
bei —20° C aufbewahrt. [Bezeichnung: Tumorextrakt No. 1 (TE-I)], Bei der Geldiffusionsprüfung gegen
Ziegenantiserum erschien ein einziges starkes Band. Bei gewissen Tumorextrakten erschien noch ein
zweites kleineres Band.
2 ml von markiertem TE-I in 50 ml einer wäßrigen Ammoniumacetatlösung (pH 4) wurden auf eine
CM-52/DE-52-Säule aufgegeben. Die Säule wurde mit 150 ml Ammoniumacetat gewaschen. Fast das gesamte
l25Jod wurde zurückgehalten. Die Säule wurde
dann mit jeweils 50 ml von Ammoniumacetat-NaCl-Lösungen
(mit 0,05 m, 0,1m, 0,25 m und 1,0 m
hi NaCl) eluiert. Mit der 0,05-m-Lösung wurden zwei Peaks eluiert, von denen der erste der Komponente A
von CEA zuzuordnen war. Beim zweiten Peak schien es sich um zersetztes Material mit einem Molekulargewicht
von 120000 zu handeln, das M-120 genannt
is wurde. Ein weiterer großer Peak wurde mit 0,1-m-Lösung
eluiert, wobei es sich um ein reines Material mit einem Molekulargewicht von 240000 handelte,
das als Komponente B von CEA identifiziert wurde. Mit der 0,1-m-Lösung wurde noch ein weiterer großer
Peak eluiert, der mit dem Antiserum nicht reagierte, und daher wahrscheinlich eine normale Komponente
enthielt. Die Identität der Komponenten A und B mit CEA-Aktivität wurde durch eine einzige Präzipitationslinie
bei Geldiffusionstests an nichtabsorbiertem Antiserum nach der Ouchterlony-Technik bewiesen.
Bei der Blockelektrophorese unter Verwendung von Sephadex G-25, fein (ein quervernetztes Dextrangel
mit einer Ausschlußgrenze von etwa 5000, einer Teilchengröße von 20-80 μ, einem Wasserretentionsvermögen
von 2,5 ± 0,2 g Wasser pro g Trockensubstanz und einem Bettvolumen von 5 ml pro g trockenes
Gel), auf einem nichtleitenden Block, beispielsweise Lucite, verhielten sich die Komponenten A und B
identisch, und zwar:
Die Blockelektrophorese wurde folgendermaßen ausgeführt: Das Elektrophoresematerial, Sephadex
G-25, fein, wurde 2 Stunden bei 80° C in Wasser gequollen, mit Boratpuffer (pH 8,6; Ionenstärke 0,05)
gewaschen und dann durch eine gesinterte Glasplatte unter Anwendung von Unterdruck filtriert.
Die Gelaufschlämmung wurde gleichmäßig auf einem Lucite-Block (Maße 61 X 7,5 X 1 cm) verteilt
und die Oberfläche mit einem Wattebausch behandelt, bis sie fest, aber nicht vollständig trocken war.
Der Block wurde dann mit Chromatographiepapierkontakten (3 mm), die alle in Fließrichtung des
Papiers ausgerichtet waren, versehen und 1 Stunde unter den Betriebsbedingungen (400 V und etwa
20 mA) bei 4° C äquilibriert. Dann entfernte man von
so der Mitte des Blocks einen Streifen von 1 cm, vermengte das Material gut mit 60 mg CEA-Material,
das zuvor in 0,5 ml einer 0,05-m-Boratlösung gelöst worden war, und goß den erhaltenen Brei in den Mittelstreifen
zurück. Dann tupfte man 1—2 Tropfen einer Ferritinlösung (6 X umkristalliert; Konzentration
100 g/ml) auf das Kathodenende des Blocks und begann die Elektrophorese. Nach 24 Stunden hatte sich
der Ferritin-Standard etwa 18 cm in anodischer Richtung
bewegt. Nach beendeter Elektorphorese wurden aus dem Block Streifen von 2 cm zwischen der Startzone und dem Anodenend geschnitten, die mit 2 cm
NaCl-Lösung eluiert wurden. Die Hauptaktivität wurde in einer Entfernung von 10—14 cm von der
Startzone in anodischer Richtung lokalisiert; eine schwächere Aktivität ließ sich in einer Entfernung von
8-10 cm nachweisen.
Claims (3)
1. Carcinoembryonales Antigen, erhältlich
durch
a) Homogenisierung von Adenocarzinomgewebe und Abtrennung der festen Partikel aus
dem Homogenat;
b) Behandlung der Lösung mit einem Glykoprotein-Lösungsmittel,
in dem CEA löslich ist;
c) Abtrennung des Niederschlages und Klären der Lösung gemäß Patentanmeldung P
2065867.7, wobei das Verfahren weiter gekennzeichnet ist durch die Verfahrensschritte
d) Dialyse der geklärten Lösung gegen ein Polyäthylenglykol mit einem mittleren Molekulargewicht
von 15000-20000 und einem Erweichungspunkt von 60° C;
e) Lösen des Diafysates in einem wäßrigen Puffer
mit einem pH-Wert zwischen 5 und 9;
f) Subsequente Gelchromatographie an zwei Säulen, von denen die erste ein Agarosegel
mit etwa 6 Gew.-% Agarose und und einer Partikelgröße von 40-210 μ und die zweite
ein hydrophiles, wasserunlösliches quervernetztes Dextrangel (Sephadex G-100)® enthält
unter jeweiligem Sammeln und Konzentrieren derjenigen Fraktionen des Eluatcs, die ein Absorptionsmaximum bei 280 nm
und ein Molekulargewicht von 200000 bis 500000 besitzen und
g) Chromatographie der gesammelten und konzentrierten Dextrangeleluate an einer
Mischbett-Ionenaustauschersäule mit einer Lösung von Ammoniumacetat in wäßrigem
Natriumchlorid, wobei das Austauschermaterial eine Mischung von trockener oder vorgequollener
Carboxymethylcellulose mit einer Partikelgröße von 20-60 μ, einer Kapazität
von 1,0 ±0,1 mAequiv./g und einer Wasseraufnahmekapazität von 2,3-2,7 g/g Trockensubstanz und mikrogranulierter
Diäthylaminoäthyicellulose in freier basischer Form mit einer Partikelgröße von 20-60 μ, einer Kapazität von 1,0 ±0,1
mAequiv./g und einer Wasseraufnahmekapazität von 2,3-2,8 g/g Trockensubstanz ist.
2. Carcinoembryonales Antigen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die nach
Stufe c) erhaltene geklärte Lösung vor Stufe d) gegen Wasser dialysiert worden ist.
3. Carcinoembryonales Antigen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die
Mischbett-Ionenaustauschersäule in Stufe g) aus gleichen Gewichtsmengen von Diäthylaminoäthyl-
und Carboxymethylcellulose bestanden hat.
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8231 | Patent rejected |