DE1598945C3 - Verfahren zur Bestimmung von Proteinen und Polypeptiden - Google Patents

Verfahren zur Bestimmung von Proteinen und Polypeptiden

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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Proteinen und Polypeptiden, insbesondere Hormonen, in einer wäßrigen Probe durch konkurrierende Binde-Technik, indem die Probe mit Antikörpern gegen das zu bestimmende Protein oder Polyper.tid und mit einer bestimmten Menge des mit einem radioaktiven Isotop markierten Proteins oder Polypeptids zusammengebracht wird, anschließend der an den Antikörper gebundene Anteil des markierten und nicht markierten Proteins oder Polypeptids vom jeweils ungebundenen Anteil abgetrennt, und die Radioaktivität eines der beiden Anteile bestimmt wird.
Aus Nature, Vol. 201, 1964, Nr. 4920, S. 679 bis 682, ist ein radioimmunologisches Verfahren zur Be-Stimmung von Proteinen bekannt, das auf der sogenannten konkurrierenden Binde-Technik beruht. Derartige radioimmunologische Verfahren beruhen im allgemeinen auf der Fähigkeit eines Antikörpers, sein Proteinantigen ohne Rücksicht darauf, ob das letztere mit einem radioaktiven Isotop markiert ist oder nicht, zu binden. Das Binden von markierten und nicht markierten Proteinantigenen findet im Verhältnis zur Konzentration der markierten bzw. nicht markierten Proteine statt. Die Radioaktivität des markierten Protcins, das an den Antikörpern gebunden ist und/oder des freien, markierten Proteins in der Flüssigkeitsprobe wird gemessen. Die Menge des nicht markierten Proteins kann aus den erhaltenen Werten durch Berechnung oder direkten Vergleich mit einer Eichkurve bestimmt werden.
Im Prinzip können radioimmunologische Verfahren bei Proteinen und Polypeptiden verwendet werden, die Antigene sind und gereinigt und mit einem radioaktiven Isotop markiert werden können. Das an dem Antikörper gebundene Protein muß von dem nicht gebundenen Protein getrennt werden. Dieses Trennverfahren wurde bisher durch eine große Anzahl von verschiedenen Methoden, wie z. B. Papierchromatographie, Elektrophorese, Niederschlag mit einem Salz oder Äthylalkohol, Ausfällen von Antikörpern durch Antikörper gegen die letzteren oder Gelfiltration bewirkt. Diese Verfahren sind kompliziert, zeitraubend, unpraktisch und lür Routinctcsts, z. B. in üblichen Krankenhauslabors, unzuverlässig.
Aufgabe der Erfindung war es deshalb, ein einfach durchführbares, zuverlässiges Trennverfahren, zu finden, mit Hilfe dessen Proteine und Polypeptide in einer Probe, die zusätzlich eine Vielzahl an anderen Proteinen bzw. Polypeptiden enthält, deren Art und Menge unbekannt sind, auch in sehr kleinen Mengen genau bestimmt werden können.
Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß an Teilchen von wasserunlöslichen Polymeren durch kovalente Bindungen gebundene Antikörper verwendet werden, so daß ein Zweiphasensystem entsteht, mit einer fester. Phase, die den gebundenen Anteil des markierten unc nicht markierten Proteins oder Polypeptids enthält, und einer flüssigen Phase, die den jeweils nicht gebundenen Anteil enthält.
An Polymerteilchen kovalent gebundene Antikörper sind grundsätzlich nicht neu.
So ist aus J. of Immunology, Vol. 85, 1960, S. 375 bis 386, ein Verfahren zur Bestimmung von radioakth markierten Antikörpern in einer wäßrigen Probe unter Verwendung einer festen Phase bekannt, bei dem eine Fraktion der zu untersuchenden Probe hergestellt unc der gesamte Inhalt der Fraktion mit radioaktiven Isotopen markiert wird. Zu dieser Fraktion wird cir Überschuß von an die feste Phase gebundenen bestimmten Antigen gegeben, wodurch sämtliche gegen da* Antigen gerichteten markierten Antikörper an da~ Antigen gebunden werden. Überraschenderweise wur de nun gefunden, daß die Abtrennmethode mit HiIf^ einer festen Phase sich auf das radioimmunlogisclu Bestimmungsverfahren auf Basis der konkurrierende! Binde-Technik mit sehr großer Genauigkeit zur Be Stimmung von kleinsten Mengen an speziellen Proteinen und/oder Polypeptiden in einer Probe, die nocl eine Vielzahl an anderen Proteinen und/oder PoK-peptiden enthält, anwenden läßt.
Dies war umso überraschender, als aus lctztgenann ter Litcraturstelle bekannt war, daß einige Protein^ unspezifisch so fest vom Trägerpolymer adsorbier werden, daß sie unter den Bedingungen, unter denei spezifisch an das Antigen gebundene Antikörper eluier werden, fest auf dem Träger sitzen bleiben und dal man vermutet, daß das physikalisch adsorbierte Anti gen (das zusammen mit dem chemisch gebundcnei Antigen am Träger vorliegt) der Hauptfaktor für di Aktivität des Anligen-Träger-Komplexcs sei.
Danach mußte man erwarten, daß bei einer Metho de, bei der (markiertes und nicht markiertes) Antigei an einen Antikörper, der seinerseits an einen Träge gebunden ist, gebunden werden soll, eine unspezifisch Bindung eines Teils des zu bestimmenden Antigen
sowie anderer Proteine direkt an den Träger stattfinden würde. Dabei würde der Teil des unspezifisch gebundenen Antigens je nach Menge und Art der vorhandenen anderen Proteine und der entsprechenden Affinität der Proteine gegenüber dem Träger, welches alles unbekannte Faktoren sind, schwanken. Es mußte außerdem erwartet werden, daß in Folge des sorgfältigen, zur Entfernung des gesamten unspezifisch gebundenen Materials erforderlichen Auswaschens einerseits ein Teil des an die Antikörper gebundenen Anti- ίο gcns sowie am Träger adsorbierte Antikörper mit ausgewaschen würden und andererseits trotz sorgfältigen Auswaschens unspezifisch am Träger direkt adsorbiertes Antigen auf dem Träger sitzen bleiben würde.
Das heißt also, man mußte erwarten, daß markiertes Antigen sich unspezifisch in einer Menge an den Träger binden würde, die von Fall zu Fall je nach Zusammensetzung der Proteine und/oder Polypeptide der Probe verschieden sein würde und man mit einer solchen Methode keine genauen Ergebnisse erzielen würde.
Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß unter bestimmten Umständen Proteine und Polypeptide allgemein in der Lage sind, als Antigene zu wirken, d.h. die Bildung von Antikörpern zu verursachen. Sie beruht fernerauf der Tatsache, daß radioimmunologische Verfahren auf der Basis der konkurrierenden Binde-Technik sehr empfindlich und zur Bestimmung von verschiedenen Proteinen und Polypeptiden, die in sehr niedriger Konzentration in Körperflüssigkeiten zügegen sind, sehr geeignet sind.
Unter Proteinen und Polypeptiden in einer wäßrigen Probe versteht man z. B. eine Probe aus Körperflüssigkeiten, wie z. B. Blutserum oder Urin, oder aus anderen Quellen, wie z. B. verschiedenen Drüsenextrakten.
Das Verfahren kann sowohl für die qualitative als auch die quantitative Bestimmung verwendet werden.
Der große Vorteil des vorliegenden Verfahrens beruht darauf, daß die Antikörper fest an einem unlösliehen Träger gebunden sind, und daß das markierte Protein, das sich mit den zu bestimmenden Antikörpern umsetzt und an diese gebunden wird, auf diese Weise leicht von dem nicht gebundenen, markierten Protein, z. B. durch einfaches Zentrifugieren oder Filtrieren, getrennt werden kann. Die Trennung ist dabei unempfindlich gegenüber Veränderungen in der Salz- und Proteinkonzentration der Flüssigkeit innerhalb der physiologischen Grenzen. Der Test ist leicht durchzuführen, da bekannte Mengen an Teilchen zusammen mit daran gebundenen Antikörpern vorher in Reagenzgläser gegeben werden und ohne Verlust der Bindefähigkeit gelagert werden können. Das ganze Verfahren, einschließlich der Trennung der freien markierten Proteine und der an den Antikörpern gebundenen markierten Proteine kann in dem gleichen Reagenzglas vorgenommen werden, ohne daß eine weitere Zugabe von Fällungsmitteln od.dgl. notwendig ist.
Das Verfahren erfordert den Zugang zu dem zu bestimmenden Protein oder dem Polypeptid, um Antikörper sowie radioaktive markierte Proteine oder Polypeptide und ferner zweckmäßigerweise Eichlösungen, z. B. für die Eichkurven, herstellen zu können.
Beispiele für Proteine und Polypeptide, gegen die Antikörper erhalten werden können, sind Plasmaproteine, Enzyme und viele Hormone. Beispiele für derartige Hormone sind Insulin, Gonadotropine, Wachstumshormone, ACTH, Thyrotropin und Parathormon.
Die Antikörper gegen das Protein oder das Polypeptid können nach einem beliebigen bekannten Verfahren durch Immunisieren von Versuchstieren, beispielsweise durch wiederholte subkutane Injektion von kleinen Mengen des Antigenproteins oder -polypeptids, möglicherweise kombiniert mit einem sogenannten Hilfsmittel, wie z. B. einer Mineralölemulsion nach Freund, erhalten werden. Die in den Tieren erzeugten Antikörper können aus dem Blutserum derselben gewonnen werden. Die Proteinfraktion, die das Antiserum enthält, kann nach herkömmlichen Verfahren, z. B. durch Fällen des Serums mit geeigneten Mengen einer gesättigten wäßrigen Ammoniumsulfatlösung, erhalten werden.
Die Markierung des Proteins oder Polypeptids mit einem radioaktiven Isotop kann auf herkömmliche Weise mit einem geeigneten Isotop, z. B. I123, I131, C14 oder H3, erfolgen. Ein besonders geeignetes Isotop ist ein radioaktives Isotop des Jods, wie z. B. I125, da das Markieren mit diesem Isotop einfach ist und beispielsweise viele Krankenhauslabors heutzutage die notwendige Vorrichtung haben, um diesen Isotopen zu messen.
Teilchen von wasserunlöslichen Polymeren werden als Träger für die Antikörper verwendet. Das Polymere wird so ausgewählt, daß es geeignete reaktionsfähige Gruppen, wie z. B. Aminogruppen, Hydroxylgruppen und Carboxylgruppen enthält oder mit diesen versorgt wird, um die Bindung der Antikörper an den Polymeren durch Brücken mit kovalenten Bindungen leicht möglich zu machen.
Besonders geeignet sind Polymerenteilchen, mit einer dreidimensionalen Struktur, die durch kovalente Bindungen zusammengehalten wird. Solche Teilchen sind, obgleich sie in Wasser quellen, völlig wasserunlöslich und daher nicht in der Lage, das polymere Material oder die daran durch kovalente Bindungen gebundene Substanz, beispielsweise während Waschverfahren, freizugeben. Beispiele für derartige Polymerenteilchen sind Körner von Mischpolymeren, die durch vernetzende Substanzen erhalten werden, weiche eine Vielzahl von Hydroxylgruppen enthalten, wie z. B. Carbohydrate und Zuckeralkohole, wiez. B. Dextran, Stärke, Dextrine und andere Polysaccharide und Polyvinylalkohol mit einer bifunktionalen Substanz, z. B. bifunktionale Substanzen des Typs H—R—Z, wobei beispielsweise H und Z jeweils eine Halogen- oder eine Epoxygruppe bedeuten und R der Rest der bifunktionalen Substanz, z. B. ein aliphatisches Radikal, mit 3 bis einschließlich IO Kohlenstoffatomen bedeutet.
Körner des im Handel erhältlichen Produkts Sephadex, bei dem es sich um Dextran handelt, das durch Glyzerinätherbrücken vernetzt ist, und das durch Behandlung von Dextran mit Epichlorhydrin erhalten wird, können beispielsweise für diesen Zweck verwendet werden. Sephadex und Produkte, die auf ähnliche Weise erhalten werden, sind Gelkörner, die in der Lage sind, in Wasser anzuschwellen, jedoch wasserunlöslich sind. Sie enthalten Hydroxylgruppen und können daher leicht durch andere Gruppen substituiert werden, z. B. Gruppen, die Aminogruppen oder Carboxylgruppen enthalten, und sind daher gut zur Bildung von Brücken durch kovalente Bindungen an den Antikörpern geeignet.
Zweckmäßigerweise werden kleine Teilchen ausgewählt, so daß ein weiter Kontaktbereich erhalten wird.
Die Antikörper werden an den Trägerteilchen mit kovalenten Bindungen unter milden Bedingungen gebunden, so daß die immunochemische Reaktionsfähigkeit der Antikörper nicht wesentlich nachläßt. Wegen der kovalenten Bindung können sich die Antikörper nicht lösen und werden von den Teilchen auch nicht abgewaschen. Reaktionsfähige Gruppen, wie z. B. Aminogruppen, Hydroxylgruppen und Carboxylgruppen werden für die chemische Bindung des Antikörperproteins mit den polymeren Teilchen verwendet. Eine Brücke mit kovalenten Bindungen wird zwischen dem Antikörperprotein und den Polymerenteilchen gebildet, die z. B. die folgende Struktur haben kann:
Antikörper— NH · CS · NH · Polymerenteilchen Antikörper— NH · CO · NH · Polymerenteilchen Antikörper — N = N — Polymerenteilchen.
Bei der Analyse wird ferner eine Lösung des Proteins oder Polypeptids von bekannter Konzentration zweckmäßigerweise als Eichlösung verwendet.
Die radioaktiven Bestimmungen können nach bekannten Verfahren, beispielsweise durch Strahlungsdetektoren, vorgenommen werden.
Die Menge der Teilchen mit Antikörpern wird unter anderem mit Hinsicht auf den bei dem Test erforderliehen Empfindlichkeitsgrad ausgewählt.
Die Menge des markierten Proteins oder Polypeptids, z. B. Il25-Hormon, die der Umsetzung zugesetzt wird, wird so ausgewählt, daß beispielsweise etwa 40 bis 60 % des markierten Hormons an den Antikörpern gebunden werden können, wenn kein damit konkurrierendes, nicht markiertes Hormon zugegen ist. Die Inkubation wird vorzugsweise bei Temperaturen zwischen -!-4 und - 37 C und gewöhnlich bei Raumtemperatur vorgenommen. Es ist nicht notwendig, daß die Umsetzung zwischen dem Antigen und den Antikörpern zum Abschluß kommt. Die Umsetzung wird nach beispielsweise 24 h unterbrochen, kann jedoch auch früher, beispielsweise nach 2 bis 4 h, beendet werden. Es ist von Bedeutung, daß die Reaktionszeit und die Temperatur für die Probelösungen und die Eichlösungen gleich bleiben.
Da das Verfahren einfach, schnell und praktisch ist, und zu genauen Analysenrcsultaten führt, ist es gut geeignet für die quantitative Bestimmung sowie für Routinetests und erlaubt die Bestimmung von selbst sehr kleinen Mengen an Probesubtsanzen.
Die Erfindung wird im nachfolgenden an Hand der Beispiele weiter erläutert.
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Beispiel 1
Bestimmung von Gonadotropin in Urin
A) Herstellung von Antikörpern
Kaninchen wurden subkutan mit 0,5 mg menschlichem Gonadotropin in 2 cm3 eines Hilfsmittels nach Freund injiziert. Die Immunisierung wurde jede Woche während vier Wochen wiederholt. Nachdem eine weitere Wcohe vergangen war, wurde den Kaninchen Blut abgenommen. Ein Antiserum wurde aus dem Blut abgenommen. Ein Antiserum wurde aus dem Blut dadurch erhalten, daß man dasselbe gerinnen ließ und die Blutklumpen entfernte.
Die Antikörperfraktion wurde aus diesem Antiserum durch Behandlung mit einer gesättigten wäßrigen Ammoniumsulfatlösung gefällt, wobei 2,5 cm3 der gesättigten Lösung zu 5 cm3 Serum zugegeben wurden.
Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren abgetrennt und in Wasser gelöst. Das Fällen mit Ammoniumsulfatlösung wurde zweimal wiederholt. Nach dem dritten Mal wurde der Niederschlag in 0,1 cm3 wäßriger Natriumbicarbonatlösung gelöst, woraufhin die Dialyse gegen 0,1 m-Natriumbicarbonatlösung stattfand. Diese Antikörperfraktion wurde zur Kopplung verwendet.
B) Herstellung von Teilchen mit kovalent gebundenen Antikörpern
Fein gekörnte Teilchen des Produkts Sephadex (G 25, superfein) wurden als Ausgangsmaterial verwendet. Das Produkt bestand aus Dextran, das mit Glyzerinätherbrücken vernetzt und mit p-Nitrophenoxyhydroxypropyläthergruppen zu einem Substitutionsgrad von 200 μΐηοΙ Nitrogruppen pro Gramm Trockensubstanz substituiert war. (Das Produkt wurde durch Umsetzung von Sephadex G 25 superfein mit 2,3-Epoxy-l-(4-nitrophenoxy)-propan in alkalischem Medium erhalten). 10 g des substituierten Sephadex-Produkts wurden zusammen mit 50 cm3 Wasser in einen Zweihalskolben gegeben und das Gemisch bei 35 C gehalten. Das Gemisch wurde gerührt, und zur gleichen Zeit wurden 25 cm3 einer 5 η-Natronlauge und 6 g Natriumdithionit zugeführt, um die Nitrogruppen zu Aminogruppen zu reduzieren. Nach etwa 30 min wurden weitere 5 g Natriumdithionit zugegeben. Das Reduktionsverfahren wurde nach etwa I h unterbrochen, dann fand die Neutralisation mit verdünnter Salzsäure statt, wobei die feste Substanz abfiltriert und mit destilliertem Wasser auf einem Saugfilter gewaschen wurde.
10 g des vorstehend erhaltenen Sephadex-Produkts, das mit p-Amino-phenoxy-hydroxy-propyl-Gruppen substituiert war, wurden in einen Rcaktionskolben zusammen mit 100 cm3 einer 10%igen Thiophosgenlösung in Tetrachlorkohlenstoff gegeben. Der Kolben wurde mit einem Pfropfen verschlossen, und das Gemisch wurde etwa 2 h gerührt. Das erhaltene Gemisch wurde in einem Eisbad gekühlt, dann wurde der Kolben geöffnet und der Inhalt filtriert. Der Filtrationsrückstand wurde mit 0,1 Mol wäßriger Natriumwasserstoffcarbonatlösung, destilliertem Wasser und Aceton gewaschen. Der Rückstand wurde dann in einem Trockenofen bei 60 bis 80 C getrocknet. Das Sephadex-Produkt, das nach dem vorstehenden Verfahren erhalten und mit p-Isothiocyanatphenoxyhydroxypropylgruppen substituiert worden war, wurde in 30 cm3 einer 0,1 m wäßrigen Lösung von Natriumbicarbonat zum Quellen gebracht. Dann wurde wieder gerührt und es wurden 5 cm3 der dialysierten Antikörperlösung nach A) tropfenweise zugesetzt.
Das Gemisch wurde 24 h bei 20 C gerührt und dann filtriert. Der Filterrückstand wurde mit 0,5m-Natriumbicarbonatlösung gewaschen, um die nicht gebundenen Substanzen zu entfernen. Das Produkt kann sorgfältig getrocknet werden, beispielsweise durch Lyophilisation.
C) Herstellung von markiertem Gonatropin
Menschliches Gonadotropin wurde mit I125 nach dem folgenden Verfahren markiert: 2 mC I125 in Form von NaI wurden mit Chloramin T in Gegenwart von 5 μg Gonadotropin nach dem von Hunter und Greenwood beschriebenen Verfahren (Nature/London, Bd. 194, 1962, S. 495) oxydiert. Nach dem Markieren wurde Natriumdithionit zugesetzt, um die ver-
bleibende Jodmenge in lösliches Jod umzuwandeln. Das mit I125 markierte Gonadotropin wurde von Produkten mit niedrigem Molekulargewicht durch Gelfiltrieren auf einem Mischpolymeren von Dextran und Epichlorhydrin (Sephadex G-50) getrennt. Das auf diese Weise markierte Gonadotropin hat eine spezifische Aktivität von 200 bis 300 mC pro mg. 1 cm3 der markierten Proteinfraktion wurde in ein kleines Gefäß gefüllt, das '/a cm3 einer Lösung von 50 mg Rinderplasma und Albumin pro cm3 enthielt. Das markierte Hormon wurde in kalter Umgebung gelagert und vor der Verwendung verdünnt.
D) Bestimmung
Die Analysen werden zweckmäßigerweise in Glasoder Plastikröhrchen von 50 · 10 mm vorgenommen.
einer weiteren Woche wurde den Meerschweinchen Blut entnommen, und aus dem Blut wurde Antiserum dadurch gewonnen, daß man das Blut koagulieren ließ und die Blutklumpen entfernte.
Die Antikörperfraktion wurde aus diesem Antiserum durch Behandlung mit einer gesättigten wäßrigen Lösung von Ammoniumsulfat gefällt, wobei 2,5 cm3 des letzteren zu 5 cm3 Serum gegeben wurden.
Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren abgetrennt und in Wasser gelöst. Das Fällen mit Ammoniumsulfatlösung wurde zweimal wiederholt. Nach dem dritten Mal wurde der Niederschlag in 0,1 cm3 einer wäßrigen Lösung von Natriumbicarbonat gelöst. Anschließend fand die Dialyse gegen 0,1 m-Natriumbicarbonatlösung statt. Diese Antikörperfraktion wurde für die Kopplung verwendet.
35
1. I cm3 einer Suspension von Polymerenteilchen (ζ. B. I mg/cm3), an die die Antikörper gebunden worden waren, wurde in alle Gefäße gegeben.
2. 0,25 cm3 der Urinprobe, die zu untersuchen war, wurde einem Röhrchen zugesetzt.
3. 0,25 cm3 einer Eichlösung mit verschiedenen Hormonkonzentrationen, z.B. 100, 50, 25, 10, 5 und 2,5 I E/l und 0 I E/l wurden jeweils zu einem Gefäß zugegeben.
4. Die Inkubation fand während 20 h bei Raumtemperatur statt, wobei die Gefäße langsam während der Inkubationszeit rotiert wurden.
5. 0,1 cm3 der I12S-Gonadotropin enthaltenden Lösung (etwa 1 ng/cm3) wurde zu allen Gefäßen zugegeben.
6. Die Inkubation fand wie unter 4. statt, jedoch während 4 h.
7. Die Teilchen wurden bei 3000 U/min während 5 min zentrifugiert.
8. Die Teilchen wurden zweimal mit 0,9"„iger wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen. Nach der letzten Entfernung der überstehenden Flüssigkeit durch Absaugen wurden die Röhrchen in Zählrohre gesetzt, um die }'-Strahlung der an den Antikörpern gebundenen und markierten Hormone zu bestimmen.
9. In einem Diagramm wurden die »Zählungen« (counts) der Eichlösungen pro Zeiteinheit linear gegen den Logarithmus der Konzentration der Eichlösungen aufgetragen. Aus diesem Diagramm — siehe beigefügtes Diagramm 1 — kann dann die Gonadotropinmenge in den unbekannten Proben bestimmt werden.
Anschließend an das Zentrifugieren in 7. kann auch I cm3 der überstehenden Flüssigkeit in ein Zählgefäß überführt werden, woraufhin die y-Strahlung des freien markierten Hormons bestimmt werden kann. Diese »Zählungen« können in gleicher Weise in Abhängigkcit von der Konzentration in ein Diagramm eingetragen werden, aus dem die Menge an Gonadotropins in den unbekannten Testproben dann graphisch ermittelt werden kann.
6o
Beispiel 2
Bestimmung des Wachstumshormons im Blutplasma A) Herstellung der Antikörper
Meerschweinchen erhielten eine subkutane Injektion von 0,5 mg menschliches Hormon in 2 cm3 eines Hilfsstoffs nach Freund. Die Immunisierung wurde jede Woche 4 Wochen lang wiederholt. Nach Ablauf
B) Herstellung von Teilchen mit kovalent gebundenen Antikörpern
Die Herstellung findet auf die gleiche Weise wie in Beispiel I B) statt.
C) Herstellung des markierten Wachstumshormons
Menschliches Hormon wurde nach dem folgenden Verfahren mit I125 markiert: 2 mC I125 in Form von NaI wurde mit Chloramin T in Gegenwart von 5 μg Wachstumshormon nach dem von Hunter und Greenwood beschriebenen Verfahren oxydiert (siehe Nature/London, Bd. 194, 1962, S. 495). Anschließend an das Markieren wurde Natriumdithionit zugegeben, um die verbleibende Jodmenge in lösliches Jodid umzuwandeln. Das erhaltene, mit I125 markierte Hormon wurde von den Produkten mit niedrigem Molekulargewicht durch Gelfiltration auf einem Dextranmischpolymeren mit Epichlorhydrin (Sephadex G-50) abgetrennt. Das auf diese Weise markierte Wachstumshormon hatte eine spezifische Aktivität von 200 bis 300 mC/mg. 1 cm3 der markierten Proteinfraktion wurde in ein kleines Gefäß gefällt, das V2 cm3 einer Lösung von Rinderplasma und Albumin im Verhältnis von 50 mg/cm3 enthielt. Das markierte Hormon wurde in kalter Umgebung aufbewahrt und vor der Verwendung verdünnt.
D) Bestimmung
Die Analysen werden zweckmäßigerweise in Glasoder Plastikgefäßen von 50 · 10 mm vorgenommen.
1. 1 cm3 einer Suspension von Polymerenteilchen (z. B. I mg/g), an die die Antikörper gebunden worden waren, wurde in alle Gefäße gegeben.
2. 0,1 cm3 des zu untersuchenden Plasma wurden in ein Gefäß gegeben.
3. 0,1 cm3 der Eichlösung mit verschiedenen Hormonkonzentrationen, z. B. 20, 10, 5, 2, 1, 0,5 und 0,2 ng/cm3, und 0 ng/cm3 wurden jeweils zu einem Gefäß zugegeben.
4. Die Inkubation fand während 20 h bei Raumtemperatur statt, wobei die Gefäße langsam während der Inkubationszeit rotiert wurden.
5. 0,1 cm3 der 112S-Wachstumshormon (etwa 2 ng/ cm3) enthaltenden Lösung wurde zu allen Gefäßen gegeben.
6. Die Inkubation fand wie unter 4. statt, jedoch während 4 h.
7. Die Teilchen wurden bei 4000 U/min 1 min lang zentrifugiert.
8. Die Teilchen wurden zweimal mit einer 0,9%igen wäßrigen Natriumchloridlösung gewaschen. Nach
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der letzten Entfernung der überstehenden Flüssigkeit durch Absaugen wurden die Gefäße in Zählgefäße gebracht, um die y-Strahlung der an den Antikörpern gebundenen und markierten Hormonen zu messen.
9. In einem Diagramm wurden die »Zählungen« (counts) der Eichlösungen pro Zeiteinheit linear gegen den Logarithmus der Konzentration der Eichlösungen aufgetragen. Aus diesem Diagramm — siehe beigefügtes Diagramm 2 — kann dann die Gonadotropinmenge in den unbekannten Proben bestimmt werden.
Anschließend an das Zentrifugieren unter 7. kann auch 1 cm3 der überstehenden Flüssigkeit in die Zählgefäße überführt werden, woraufhin die y-Strahlung des freien markierten Hormons bestimmt werden kann. Diese »Zählungen« können ebenfalls in ein Diagramm der beschriebenen Art eingetragen werden. Die Menge des Wachstumshormons in den unbekannten Testproben kann dann graphisch ermittelt werden.
Beispiel 3
Bestimmung von Insulin im Blutplasma
A) Herstellung von Antikörpern
Meerschweinchen erhielten eine subkutane Injektion von 0,5 mg Schweineinsulin in 2 cm3 eines Hilfsstoffs nach Freund. Die Immunisierung wurde jede Woche während 4 Wochen wiederholt. Nach Ablauf einer weiteren Woche wurde den Meerschweinchen Blut entnommen, und aus dem Blut wurde Antiserum dadurch gewonnen, daß man das Blut koagulieren ließ und die Blutklumpen entfernte.
Die Antikörperfraktion wurde aus diesem Antiserum durch Behandlung mit einer gesättigten wäßrigen Ammoniumsulfatlösung gefällt, wobei 2,5 cm3 der letzteren zu 5 cm3 Serum gegeben wurden.
Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren abgetrennt, in Wasser gelöst, und das Fällen mit Ammoniumsulfatlösung wurde zweimal wiederholt. Anschließend an das dritte Fällen wurde der Niederschlag in 0,1 cm3 einer wäßrigen Natriumbicarbonatlösung gelöst, woraufhin die Dialyse gegen 0,1 m-Natriumbicarbonatlösung stattfand. Die Antikörperfraktion wurde zur Kopplung verwendet.
B) Herstellung von Teilchen mit kovalent gebundenen Antikörpern
Diese Herstellung wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 B) vorgenommen.
C) Herstellung von markiertem Insulin
Schweineinsulin wurde nach dem folgenden Verfahren mit I125 markiert: 2 mC I125 in Form von NaI wurden mit Chloramin T in Gegenwart von 5 μg Insulin nach dem von Hunter und Greenwood beschriebenen Verfahren (Nature/London, Bd. 194, 1962, S. 495) oxydiert. Anschließend an das Markieren wurde Natriumdithionit zugegeben, um die verbleigende Jodmenge in lösliches Jodid umzuwandeln. Das
erhaltene, mit I125 markierte Insulin wurde mit Rinderplasma und Albumin gemischt und von den Produkten mit niedrigem Molekulargewicht sowie von Denaturierungsprodukten von Insulin, die an das Plasma-Albumin-Gemisch gebunden waren, durch Gelfiltration auf einem Mischpolymeren von Dextran mit Epichlorhydrin (Sephadex G-50) getrennt. Das auf diese Weise markierte Insulin hat eine spezifische Aktivität von 100 bis 200 mC/mg. Die zweite Fraktion des markierten Proteins wurde in einem kleinen Gefäß aufgefangen, das V2 cm3 einer Lösung von Rinderplasma und Albumin im Verhältnis von 50 mg/cm3 enthielt. Das gekennzeichnete Hormon wurde in kalter Umgebung aufbewahrt und vor der Verwendung verdünnt.
D) Bestimmung
Die Analysen wurden zweckmäßigerweise in Glasoder Plastikgefäßen von 50 · 10 mm durchgeführt.
1. 1 cm3 einer Suspension von Polymerenteilchen (z. B. 1 mg/cm3), an denen Antikörper gebunden waren, wurde in alle Gefäße gegeben.
2. 0,1 cm3 des zu untersuchenden Plasmas wurde in ein Gefäß gegeben.
3. 0,1 cm3 einer Eichlösung mit verschiedenen Hormonkonzentrationen, z. B. 200, 100, 50, 25, 10, 5 und 2,5 μΕ/cm3 und 0 μΕ/cm3 wurden jeweils in ein Gefäß gegeben.
4. 0,1 cm3 einer I125-Insulin enthaltenden Lösung (etwa 1 ng/cm3) wurde in alle Gefäße gegeben.
Das weitere Verfahren der Bestimmung sowie der graphischen Darstellung der Eichkurve — Diagramm 3 — entsprach völlig der in den Beispielen 1 D) und 2 D) dargestellten Methode. Dies gilt auch für die Möglichkeit, an Stelle der Aktivität der festen Teilchen die Radioaktivität der überstehenden Flüssigkeit zu messen und in Abhängigkeit von der Konzentration der Eichlösung graphisch darzustellen und für die Bestimmung der Probelösungen auszuwerten.
Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims (3)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Bestimmung von Proteinen und Polypeptiden, insbesondere Hormonen, in einer wäßrigen Probe durch konkurrierende Binde-Technik, indem die Probe mit Antikörpern gegen das zu bestimmende Protein oder Polypeptid und mit einer bestimmten Menge des mit einem radioaktiven Isotop markierten Proteins oder Polypeptids zusammengebracht wird, anschließend der an den Antikörper gebundene Anteil des markierten und nicht markierten Proteins oder Polypeptids vom jeweils ungebundenen Anteil abgetrennt und die Radioaktivität eines der beiden Anteile bestimmt wird, dadurch gekennzeichnet, daß an Teilchen von wasserunlöslichen Polymeren durch kovalente Bindungen gebundene Antikörper verwendet werden, so daß ein Zweiphasensystem entsteht, mit einer festen Phase, die den gebundenen Anteil des markierten und nicht markierten Proteins oder Polypeptids enthält, und einer flüssigen Phase, die den jeweils nicht gebundenen Anteil enthält.
2. Verfahren nach Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung quantitativ durch Vergleich des gemessenen Wertes mit einer Eichkurve durchgeführt wird.
3. Reagenz zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 oder 2, enthaltend Antikörper gegen das zu bestimmende Protein oder Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper durch kovalente Bindungen an Teilchen aus wasserunlöslichen Polymeren gebunden sind.
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