DE2806146C2

DE2806146C2 - Tumor-spezifisches Glykoprotein und dessen Verwendung zur Krebsdiagnose beim Menschen

Info

Publication number: DE2806146C2
Application number: DE2806146A
Authority: DE
Inventors: Sally DeLong Hummelstown Pa. Bolmer; Eugene A. Davidson
Original assignee: Research Corp
Current assignee: Research Corp
Priority date: 1977-02-18
Filing date: 1978-02-14
Publication date: 1984-01-26
Also published as: DE2806146A1; IT1102384B; US4146603A; JPS6218869B2; CA1087979A; IT7848072A0; JPS53127822A; FR2381058A1; CH658317A5; FR2381058B1; CH648330A5; GB1591561A; JPS60155975A; JPS6129464B2

Description

2. Tumor-spezifisches Glykoprotein nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Radiomarkierung trägt.

3. Verfahren zur Herstellung des Tumor-spezifischen Glykoproteins nach Anspruch !,gekennzeichnet durch die Verfahrensschritte i) bis n).

4. Verwendung des Glykoproteins nach Anspruch 1 bis 3 zur Krebsdiagnose beim Menschen.

5. Verwendung des Tumor-spezifischen Glykoproteins nach Anspruch 1 zur Herstellung von Antikörpern oder radiomarkierten Antikörpern.

Die Erfindung betrifft ein Tumor-spezifisches Glykoprotein (TSGP), das aus den Blutseren von menschlichen Patietnten isoliert und zur Krebsdiagnose beim Menschen verwendet werden kann.

Untersuchungen haben gezeigt, daß Tierzellen in Gewebekulturen unter Bedingungen gezüchtet werden können, die es ihnen ermöglichen, charakteristische Eigenschaften, die typisch für das Gewebe sind, aus dem sie stammen, beizubehalten. In anderen Worten bedeutet dies, daß z.B. Knorpelzellen in Gewebekulturen gezüchtet werden können und dabei typische Produkte der Knorpelmatrix produzieren. Zu den Produkten, denen besonderes Interesse gewidmet wurde, zählen eine Gruppe von komplexen Sacchariden, die normalerweise als Sekretionsprodukte der Zellen angesehen werden, da man sie in der extrazellulären Matrix, in der sich faserartige und zelluläre Elemente befinden, findet. Diese Verbindungsklasse hat etwa 6 Vertreter mit gewissen gemeinsamen Merkmalen, insbesondere negativen Ladung. Die zuletzt genannte Eigenschaft hinsichtlich ihres Molekulargewichtes und einer hohen dient häufig dazu, diese spezielle Gruppe zu isolieren und zu identifizieren.

Es wurden Untersuchungen durchgeführt, wobei ein direkter Vergleich zwischen einer normalen Zeil-Linie und der gleichen Zeil-Linie nach Infektion mit einem viralen Agens, das die Zelle tumorigen machte, gezogen werden konnte. Über diese Arbeit wurde in Proc. Nat.

ίο Acad. Sei., USA, Band 70, No. 1, Seiten 53-56, Januar 1973, berichtet.

Es wurde festgestellt, daß kein qualitativer Unterschied zwischen den Saccharidprodukten bestand, wohl aber ein quantitativer Unterschied durch die Virustransformation einsetzte, und zwar insbesondere was die Synthese eines der charakteristischen Saccharide betraf. Diese quantitative Veränderung ist bei Untersuchungen in Zellkultursystemen nützlich, könnte jedoch niemals bei Tierversuchen angewandt werden, da das spezielle Produkt normalerweise in den meisten Geweben des Körpers gefunden wird, nicht-antigen ist und unter keinen Umständen als charakteristisch für eine Tumorzelle angesehen werden kann. Nichtsdestoweniger waren qualitative Unterschiede von Interesse, die jedoch ganz allgemeiner Art waren.

Es konnte die Folgerung gezogen werden, daß die Umwandlung einer Zeil-Linie durch Virustransformation zumindest eine Veränderung bei der Synthese der komplexen Saccharide mit sich brachte.

Wie in Biochemistry (1974) Band 13, S. 1233, berichtet, wurde eine ähnliche Versuchsserie mit Bl6 Melanoma-Zellen von Mäusen und einer Kontroll-Population von normalen Melanocyten, die aus der Iris von Mäusen erhalten wurden, durchgeführt. Die beobachteten Unterschiede zwischen den Melanom-Zellen und der Kontrollzüchtung waren etwas stärker ausgeprägt, als bei den Versuchen mit den oben beschriebenen normalen und Virus-transformierten Paaren. Diese Unterschiede können kurz wie folgt zusammengefaßt werden:

1. Beim Vergleich der Tumorzellen mit den normalen Zellen lag sowohl ein qualitativer als auch ein quantitativer Unterschied in der Produktion von komplexen Sacchariden vor.

2. Insbesondere wurde ein wesentliches Produkt der normalen Zellen, Hyaluronsäure, von dertumorigenen Linie überhaupt nicht erzeugt.

3. Von der Tumorlinie wurde ein sulfatiertes PoIysaccharid mit ungewöhnlich hohem Molekulargewicht produziert, welches bei den normalen Zellen nicht auftrat.

Das sulfatierte Polysaccharid unterscheidet sich von den normalen Komponenten des Gewebes einzig in der Molekulargröße und nicht in seinem molekularen Aufbau. Das heißt, daß die Struktur des Saccharides mit den Strukturen identisch war, die normalerweise in Geweben gefunden werden und lediglich das Molekulargewicht etwas höher war. Diese Versuche

«o sind geeignet für Studien bei Zellkulturbedingungen; als eine diagnostische Methode sind sie jedoch weitgehend unbrauchbar, da die in Frage kommende Verbindung durch eine Vielzahl von Zellen in den Wirtstieren schnell metabolisiert wird. Sobald eine solche Verbindung im Kreislauf aufträte, würde sie schnell wieder herausgefiltert und von Leberzellen, Zellen der Niere, Fibroblasten etc. abgebaut. Aus diesem Grunde bietet die Anwesenheit oder die Produktion dieses Sacchari-

des durch die Tumorzellen keine Anwendungsmöglichkeit, und zwar sowohl aus den obengenannten Gründen als auch aufgrund der Tatsache, daß die Verbindung selbst nicht-antigen ist.

In einer Veröffentlichung in Cancer Research, 36, 424-431, Februar 1976, (E. A. Davidson) wurde über die Ergebnisse einer Untersuchung des komplexen Saccharides menschlicher Zellen berichtet, die in vieler Hinsicht ähnlich den bei Mäusen erhaltenen Ergebnissen sind. Die menschlichen Melanomzellen produzieren weniger Hyaluronsäure als die Kon troll melanocyten und ein hochmolekulares sulfatiertes Polysaccharid, ähnlich dem, wie es in den Mauszellen produziert wird.

Weitere Untersuchungen mit Mäusen brachten die Anwesenheit eines ungewöhnlichen Glykoproteins zutage. Aus diesem Grunde war man bemüht, die Art des Glykoproteins in Mäusen näher kennenzulernen und zwar insoweit als dessen Eigenschaften, Struktur und biologische Funktion bestimmt werden konnten. Viele der chemischen Eigenschaften des Moleküls werden in der Veröffentlichung von E. A. Davidson in »Biochemical and Biophysical Research Communications«, Bd. 70, No. 1, Mai 1976 beschrieben. Die Anwesenheit eines ungewöhnlichen Glykoproteins in menschlichen Melanomzellen oder dessen Produktion durch dieselben wird in dieser Veröffentlichung nicht angesprochen.

Die vorliegende Erfindung betrifft das Auffinden, die Isolierung und Identifizierung eines Glykoproteins, das von menschlichen Krebszellen produziert wird, und die Erkenntnis, daß diese Art eines Glykoproteins von Normalzellen nicht produziert wird. Außerdem wurde gefunden, daß dieser einzigartige Typ eines Glykoproteins in den Seren von Krebspatienten vorliegt und daß aufgrund dessen dieses Phänomen in der Diagnose von Krebs nützlich sein würde. ,

Dieses Tumor-spezifische Glykoprotein ist im Tumor anwesend, wird von den Tumorzellen produziert, abgesondert und erscheint im Kreislauf des Wirts, bei Tieren sowie bei Menschen, und zwar etwa zu der Zeit, als eine fühlbare Tumormasse nachgewiesen werden kann. Das TSGP kann auch in einem beliebigen früheren Stadium auftreten.

Das TSGP wird von den Tumorzellen gebildet, ohne Rücksicht um welchen Tumor es sich dabei handelt, und erscheint im Kreislaufsystem von Menschen, die an Lungen·, Brust-, Dickdarm-, Uterus- und Magenkarzinomen, Melanomen und ähnlichen leiden. Leukämien und andere Blutkrankheiten stellen einen Defekt in der Reifekontrolle dar, wodurch eine abnorme Zahl von Zellen auftritt, wie man sie normalerweise in den metabolen Bildungsschritten findet. Aus diesem Grunde wird bei vielen oder den meisten dieser Blutkrankheiten kein TSGP produziert, da die Zellen selbst nicht tumorig sind. Außerdem ist es gut möglich, Leukämien durch mikroskopische Untersuchung einer Blutprobe nachzuweisen, so daß Leukämien vom diagnostischen Standpunkt kein Problem darstellen.

Die Wachstumscharakteristika und andere Eigenschaften von Tumoren mit unterschiedlichem zellulären Ursprung (und von verschiedenen Personen) sind im allgemeinen nicht gleich. Jedoch scheint es, daß der hier beschriebene Glykoprotein-Typ charakteristischerweise von einer großen Anzahl von Tumoren produziert wird. Die chemischen und physikalischen Eigenschaften von TSGP eines beliebigen Tumortyps sind einander genügend ähnlich, um durchwegs die Anwendung von Standard-Isolationsmethoden zu erlauben.

Das erfindungsgemäße aus dem Blutserum von krebsinfizierten menschlichen Patienten isolierte Tumorspezifische Glykoprotein ist gekennzeichnet durch

a) die Löslichkeit in 0,6 M Perchlorsäure,

b) einen Sialinsäuregehalt von 30 Gew.-% bezogen auf das Gesamtgewicht von Glucosamin, Galactosamin und Sialinsäure,

c) einen Pronase-resistenten Kern mit einem Molekulargewicht im Bereich von 10 000 bis 15 000,

d) die Affinität für Weizenkeim-Agglutinin,

e) die Fähigkeit von DEAE-Sephadex A-25 mit 0,4 M Pyridinacetatpuffer pH 5,2 eluiert zu werden,

f) Einschluß auf Sephadex G-150 in 0,1 M Pyridinacetatpuffer pH 5,2,

g) ein Molekulargewicht im Bereich von 50 000 bis 70 000, bestimmt durch Elektrophorese in 6% Polyacrylamidgel in Gegenwart von 0,1% Natriumdodecylsulfat,

h) einen isoelektrischen Punkt im Bereich von 4,2 bis 4,6,

und ist erhältlich dadurch, daß man

i) Blutseren von einem Tumor-Patienten mit Perchlorsäure oder Trichloressigsäure mischt, j) die unlösliche Fraktion abtrennt, k) die säurelösliche Fraktion neutralisiert, 1) das bei der Neutralisation gebildete Salz abtrennt, m)den löslichen Anteil dialysiert und J₀ n) den dialysierten löslichen Anteil konzentriert.

Weitere charakteristische Eigenschaften des erfindungsgemäßen TSGP sind:

Löslichkeit in Trichloressigsäure (5%) bei 0° C.

>r> Die Sialinsäure ist in TSGP an Galaktose gebunden und kann auch an N-Acetylgalaktosamin gebunden sein.

TSGP enthält eine neutrale Hexose, hauptsächlich Galaktose; es ist keine Glukose anwesend.

-to Der Hauptanteil an Kohlenhydrat von TSGP, der die Hauptmenge an Sialsäure enthält, ist mit der Polypeptidkomponente über eine O-glykosidische Bindung verknüpft und zwar von einem einzelnen N-Acetylgalactosaminyl-Rest zur Hydroxylgruppe von Serin oder

"5 Threonin (als Partialsequenz kann angesehen werden: Galactosyl-N-Acetylgalactosamin, jeweils in den 3- und 6-Stellungen mit Sialsäureresten substituiert).

Die gesamte Saccharid-Kette kann von dem Polypeptid durch Behandeln mit 0,01 N Natriumhydroxid, 16

•ίο Stunden bei 20° C, abgespalten werden. Die sich ergebende Saccharid-Kette kann auf einer G25-Sephadex-Säule (1,2 X 60 cm) abgetrennt werden und wird bei 1,15 x dem Ausschlußvolumen (kalibriert mit Dextranblau) eluiert.

Die Aminosäurezusammensetzung der TSGP-Fraktion nach Chromatographie auf DEAE-Sephadex A25 ergibt Glutaminsäure, Prolin, Asparaginsäure, Threonin und Leucin als hauptsächliche Aminosäuren. Eine Anzahl der verwendeten Produkte ist im Handel erhältlich. »Sephadex«-Produkte werden von Pharmacia Fine Chemicals A. B., Uppsala, Schweden hergestellt und vertrieben. Es handelt sich um vernetzte Dextrane mit unterschiedlicher Porosität oder Substituenten. »Scpharose« ist ein in kugelförmigen Partikeln geformtes Agarose-Gel. »DEAE-Sephadex A25 oder A50« wird aus Sephadex G25 oder G50 durch chemische Substituierung von Diäthylaminoathyl-Gruppen hergestellt. Letztere sind schwach basische Anio-

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nenaustauscher. Sie haben einen Kugeldurchmesser von 40 bis 120 Mikron und quellen zu einem Säulenvolumen von 89 (15-35) ml pro Gramm Trockengel. Sephadex G150 hat einen Kugeldurchmesser von 40 bis 120 Mikron, einen Fraktionierungsbereich von 5 bis 150 000 Molekulargewicht und ein Säulenvolumen von 20 bis 30 ml pro Gramm Trockengel. Sepharose 4B weist eine Agarose-Konzentration von 4% und einen Naßkugeldurchmesser von 40 bis 190 Mikron auf.

TSGP kann von carcino-embryonischem Antigen, wie in US-PS 36 63 684 beschrieben, u. a. unterschieden werden durch Einschluß von TSGP auf Sephadex G150, die Affinität von TSGP für ein konjugiertes Weizenkeim-Agglutinin, immobilisiert auf einem Sepharose-Träger, sowie durch das Molekulargewicht. Carcinoembryonisches Antigen weist keine dieser Eigenschaften auf.

TSGP erlaubt die Anwendungsmöglichkeiten:

Frühdiagnose von Personen mit irgendeiner Art von bösartiger Tumorerkrankung sowie den . Nachweis oder Analyse des in seiner Art einzigartigen TSGP in einer menschlichen Blutprobe mittels radioimmunologischer oder anderer Nachweismethoden als ein Mittelfur die Diagnose von Krebs. Weitere Anwendungsmöglichkeiten sind:

Individualisierte Therapie durch Isolierung von TSGP von Patienten mit fortgeschrittenem Krebs in größeren Mengen durch Plasmapherese oder eine andere Methode, Verwendung dieses Materials zur direkten Antikörperherstellung in einem Wirtstier oder dem Patienten und Verwendung.dieses Antikörpers zur direkten Immunotherapie. Eine Kopplung dieses Antikörpers mit Agenzien, die auf die Krebszellen toxisch wirken, würde eine gezielte Einführung von lethalen Agenzien in Krebszellen ermöglichen.

Verwendung des von einem Krebspatienten isolierten TSGP zur Herstellung von gegebenenfalls radiomarkierten Antikörpern die die Oberfläche der Tumorzelle angreifen können, wodurch eine von Antikörper vermittelte Lyse durch das normale Immunsystem des Wirts möglich ist, bzw. Änderungen auf der Oberfläche der Tumorzellen hervorgerufen werden, wodurch übliche therapeutische Agenzien wirksamer angreifen könnten.

Bestimmung des Glykoproteinspiegels im Serum eines Patienten und Auswertung dieser Information als direkter Index für eine therapeutische Behandlung.

Der ursprüngliche analytische Nachweis für TSGP basiert auf den folgenden Eigenschaften desselben:

1. Das Glykoprotein hat eine sehr hohe negative Ladung.

2. Die negative Ladung ist in der Hauptsache, wenn nicht ausschließlich, auf die Anwesenheit von N-Acetylneuraminsäure zurückzuführen.

3. Die N-Acetylneuraminsäure war auf den Saccharid-Ketten angeordnet, die die Tendenz zeigen, sich zusammenballen und eine Kernstruktur auszubilden, die gegenüber Proteolyse resistent ist.

4. Das stark saure Gebilde war in einer geeigneten «> Konzentration von Perchlorsäure oder Trichloressigsäure oder einem anderen geeigneten Lösungsmittel löslich.

5. Das Glykoprotein weist eine Affinität für Weizenkeim-Agglutinin, welches an Sepharose immobilisiert ist, auf.

6. Das Glykoprotein kann aufgrund seiner hohen negativen Ladung an einer Vielzahl von anionischen Austauschen! fraktioniert werden, einschließlich Diäthylaminoäthyl-CeHulose, Diäthylaminoäthyl-Sephadex, Ecteola-Cellulose, und starken und schwachen Anionenaustauschharzen, wie Dowex 1 oder Dowex 2.
7. Der hohe Kohlenhydratgehalt des Glykoproteins und seine Ladung erlauben eine Identifizierung durch Polyacrylamid- oder andere Gel-Elektrophorese-Methoden, sowie Anfärben entweder durch übliche Proteinfarbstoffe oder durch Farbstoffe für die Kohlenhydratkomponente unter Verwendung von Perjodsäure-Schiff-Reagens oder andere Reagenzien.

Kurz zusammengefaßt basiert die diagnostische Nachweismethode auf den generalisierten und allgemeinen Strukturmerkmalen des Glykoproteins, d. h. den hohen Sialsäuregehalt, den Pronase-beständigen Kern, die Affinität für Weizen-Agglutinin und die charakteristische elektrophoretische und chromatographische Mobilität.

Die allgemein anwendbare Methode zur Bestimmung der Anwesenheit von TSGP im menschlichen Blutserum umfaßt die Beschaffung einer Serumprobe von einem menschlichen Patienten, Behandeln der Serumprobe mit einem TSGP-Lösungsmittel, wie Perchlorsäure, Tri chloressigsäure oder einem anderen geeigneten Lösungsmittel, Entfernung des gebildeten Niederschlages durch eine geeignete Methode zur Fest-Flüssig-Trennung, wie Dekantierung, Filtration oder Zentrifugation; Neutralisierung der löslichen Fraktion mit einem alkalischen Material, wie Kaliumhydroxid, Analysieren des löslichen Anteiles auf den Gehalt an N-Acetylneuraminsäure und Protein, und Vergleich der gefundenen Werte für N-Acetylneuraminsäure und Protein mit Grundlinien-Parametern, aufgestellt für Normal- und Krebsseren.

Die" Analyse auf Sialinsäure (N ANA) kann durch eine der üblichen bekannten Methoden erfolgen, einschließlich der Perjodat-Resorcinol-, Thiobarbitursäure oder der direkten Ehrlich-Methode (G. W. Jourdain et al, J. Biol.Chem., 246,431 (1971); L. Warren, J. Biol. Chem., 234,1971 (1959); und I. Werner et al, Acta Med. Soc. Uppsala, 57, 230 (1952).

Die Proteinbestimmungen können z. B. durch ein modifiziertes Coomasie-Blau-G-Verfahren oder durch die Methode nach Lowry oder durch Bestimmung der Absorption bei 280 nm erfolgen [O. H. Lowry et al, J. Biol. Chem., 193, 265 (1951) und M. M. Bradford, Anal. Biochem., 72, 248 (1976)].

Auf der Grundlage der zusammengestellten Daten von 370 menschlichen Serumproben wurden die folgenden Parameter zur Feststellung des Vorliegens von bösartigen Tumoren bei Menschen festgelegt (basierend auf der Analyse der Perchlorsäure-löslichen Fraktion, bezogen auf das Volumen der ursprünglichen Serumprobe):

(1) Ein Sialsäuregehalt (NANA) von über etwa 0,065 mg/ml weist auf die Möglichkeit eines Tumors hin; ein Sialsäuregehalt von über etwa 0,080 mg/ml indiziert einen wahrscheinlichen Tumor.

(2) Ein Proteingehalt von über etwa 0,35 mg/ml weist auf einen möglichen Tumor, ein Proteingehalt von über etwa 0,4 mg/ml auf das wahrscheinli ehe Vorliegen eines Tumors hin.

Es wurde eine Ausgangsuntersuchung mit 59 Proben durchgeführt, wobei die Perjodat-Resorcinol-Methode und die direkte Ehrlich-Methode für N-Acetylneuraminsäure-Spiegel und das Lowry-Verfahren für Protein-

Spiegel angewandt wurden. Es wurde festgestellt, daß zwischen 30 Krebspatienten und 29 Normalkontrollen ein vollständige Unterscheidung im Gehalt der Sialsäure bestand. Das heißt, der höchste Normalspiegel war immer noch niedriger als der niedrigste Spiegel, s der bei einem Patienten mit diagnostizierter bösartiger Erkrankung festgestellt wurde. Diese Ausgangsuntersuchung schloß eine Anzahl von Erkrankungen verschiedener Art, Lungen-, Brust-, Dickdarm·, Lymphom- und Melanom-Patienten ein, davon ausgehend, daß die Pro- ι ο duktion eines Perchlorsäure-löslichen Glykoproteins eine allgemeine Eigenschaft einer Anzahl von Tumoren darstellt. Die statistische Analyse dieser Werte zeigte, daß die Zufallswahrscheinlichkeit dieser Ergebnisse geringer als 1 in 1000 ist.

Unter Auswertung der in der vorangehend beschriebenen Untersuchung erhaltenen Spiegel als parametrische Kriterien, wurde eine viel größere Untersuchung mit etwa 311 Patienten durchgeführt, die sowohl an bösartigen Erkrankungen und einer Reihe von nichtmalignen Beschwerden litten sowie einer Anzahl von normalen Kotroll personen. Lediglich basierend auf die Gehalte an Protein und Sialsäure (N-Acetyl-neuraminsäure) wurde eine über 95%ige Unterscheidung zwischen Normalpersonen und nicht-bösartig erkrankten Personen einerseits und Patienten mit Tumor andererseits erhalten. Außerdem bestand kein signifikanter Unterschied zwischen normal- und nicht-bösartig erkrankten Personen oder zwischen Männern und Frauen. Es wurde eine Reihe andere statistischer Tests jo durchgeführt, wobei die Daten von dieser Gruppe stammen. Es sei hier nur angeführt, daß die Zufallswahrscheinlichkeit zur Unterscheidung zwischen der Krebsgruppe und der anderen Gruppe geringer ist als 1 in 1000. Es besteht auch eine deutliche Korrelation mit dem Fortschritt der Erkrankung. So haben Personen mit ausgestreuter, verbreiteter metastatischer Erkrankung höhere Spiegel an zirkulierendem TSGP als solche mit lokalisierter Erkrankung; Personen, die sich in Remission befinden, bzw. Personen nach einer chirurgischen und/oder chemotherapeutischen oder Strahlungsbehandlung tendieren dazu, niedrigere Spiegel an zirkulierendem Glykoprotein zu haben.

Diese Ergebnisse führten zu einer Reihe von weiteren Untersuchungen. Zuerst wurde das Augenmerk auf die wenigen falschen positiven Bestimmungen, die sich in dieser Gruppe zeigten, gerichtet. Es zeigte sich, daß mehrere derselben von asthmatischen Patienten herrührten und können in der Tat auf einen Faktor, der mit dieser Krankheit assoziiert ist, bezogen werden.

Dementsprechend wurde eine weitere Untersuchung mit den falschen Positiven, mit Normalproben und verschiedenen Patienten mit diagnostiziertem Krebs durchgeführt, um festzustellen, ob die gefundenen qualitativen Unterschiede im Zellkultursystem auch in der Serumprobe wiederholt werden konnten. Statt nur einfach die Spiegel an N-Acetyl-neuraminsäure in der Perchlorsäure-löslichen Fraktion zu berücksichtigen, wurde das Perchlorsäure-lösliche Material einer Gel-Elektrophorese unterzogen (wie insbesondere im nach- w folgenden Beispiel 2 beschrieben) zum Nachweis des charakteristischen Tumor-Glykoproteins (TSGP). Das Tumor-spezifische Glykoprotein hat einen isoelektrischen Punkt von etwa 4,2 bis 4,6 und ein Molekulargewicht von etwa 50 000 bis 70000, allgemein etwa 60000.

Nach Durchführung dieser zweiten Untersuchung reduzierte sich die Anzahl an falschen Positiven auf Null; lediglich Patienten mit diagnostiziertem Tumor zeigten eine charakteristische Glykoprotein-Bande auf der Gel-Elektrophorese. Obwohl einige wenige der Personen mit Erkrankungen (insbesondere Leukämien) N-Acetyl-neuraminsäure-Spiegel aufwiesen, die nicht in die anormalen Gruppe fielen, traten keine Normalen oder nicht-bösartig erkrankten Normalen in der positiven Gruppe nach der zweiten Untersuchung auf. Darüber hinaus konnte die Anwesenheit des charakteristischen Glykoproteins bei solchen Personen mit bösartiger Erkrankung gezeigt werden, die niedrigere Spiegel an N-Acetyl-neuraminsäure aufwiesen.

Zusammengefaßt zeigt die entwickelte Nachweismethode folgendes:

1. Es besteht ein ungewöhnlich hoher Wahrscheinlichkeitsgrad in der Voraussage des Vorliegens eines Tumors sowie des Erkrankungsstadiums, basierend lediglich auf der Messung der N-Acetylneuraminsäure- und Protein-Spiegel in der Perchlorsäure-löslichen Fraktion des Serums.

2. Die sehr kleine Anzahl von falschen Positiven kann vollständig durch eine zweite Untersuchung, die eine Gel-Elektrophorese und Untersuchung der Gele auf das Vorliegen des charakteristischen Tumor-spezifischen Glykoproteins umfaßt, eliminiert werden.

3. Der Voraussagewert dieser Methode ist mindestens ebenso gut oder besser als irgendeine der gegenwärtigen oder früher beschriebenen Methoden, einschließlich dem carcinoembryonischen Antigen, wie es in der US-PS 36 83 684 beschrieben wird.

Das erfindungsgemäße Tumor-spezifische Glykoprotein kann in üblicher Weise eine Radiomarkierung tragen.

Die Gewinnung des Tumor-spezifischen Glykoproteins erfolgt durch die Verfahrensschritte i) bis n) im Patentanspruch 1.

Beispiel

A. Reinigung und Isolierung des Tumor-spezifischen Glykoproteins

Serumproben von Patienten mit diagnostizierten festen Tumoren (Lungen-, Magen- und Brustkarzinom und Melanom wurden verwendet, die jeweils eine ähnliche chromatographische und elektrophoretische Mobilität zeigten) wurden wie folgt behandelt:

70 Mikroliter einer 60%igen Perchlorsäure wurden pro ml Serum zugegeben und die Lösung gemischt. Zu dieser Lösung werden 0,93 ml 0,6 M Perchlorsäure pro ml Serum zugegeben. Diese Lösung wird gut gemischt und eine Stunde (45 bis 90 Min. sind ausreichend) bei 0° C stehengelassen. Das Gemisch wird dann bei 8000 g 10 Min. lang (6 bis 12 Min.) zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit durch Dekantieren vom Niederschlag getrennt.

Die erhaltene überstehende Lösung wird mit 1,2 M Kaliumhydroxid auf pH 6 bis 7 eingestellt und 10 Min. bei 0°C stehengelassen. Das Kaliumperchiorat wird wie oben durch Zentrifugation (Filtration ist ausreichend) abgetrennt und die überstehende Flüssigkeit 24 Stunden lang (16 bis 36 Stunden sind ausreichend) gegen 10"³ M Pyridinacetat, pH 5,2, dialysiert.

Eine DEAE-Sephadex-A-25-SäuIe (1,5 x 40 cm) wird entsprechend den Anweisungen des Herstellers bereitet und mit 0,1 M Pyridinacetat, pH 5,2, äquilibriert.

Die Probe des dialysierten Perchlorsäure-Überstandes wird (vorzugsweise) durch Lyophilisation oder Ultrafiltration auf etwa das Zehnfache konzentriert. Ein Aliquot mit bis zu 5 mg Sialsäure und bis zu 30 mg Protein wird auf die Säule aufgebracht und diese daraufhin mit einem linearen Gradienten aus 0,01 M bis 1,0 M Pyridinacetat, pH 5,2, (das gesamte Gradientenvolumen beträgt 600 ml) eluiert.

Bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 30 ml pro Stunde werden Fraktionen gesammelt (5 bis 6 ml Fraktionen). Diese Fraktionen werden dann auf ihren Protein- und Sialsäuregehalt nach Lowry et al und mittels der Perjodat-Resorzinol-Methode analysiert. Die Sialsäure-positiven Fraktionen, die den Hauptanteil dieser Säure enthalten, und bei einer Gradientkonzentration von etwa 0,4 M eluiert werden, werden vereinigt, bei 0° C 24 Stunden lang gegen destilliertes Wasser dialysiert und durch Lyophilisation konzentriert. Diese Fraktion enthält das Tumor-spezifische Glykoprotein und kann etwas a-1-saures Glykoprotein, eine normale Serumkomponente, enthalten.

Eine weitere Reinigung des Tumor-spezifischen Glykoproteins kann durch isoelektrische Fokussierung oder Chromatographie über DEAE-Sephadex A-50 erreicht werden.

Die nach der oben beschriebenen Chromatographie erhaltene Fraktion, die die Sialsäure enthält, wird auf eine 1,2 X 50 cm Säure aus DEAE-Sephadex A-50 aufgebracht und die Säule mit einem linearen Pyridin-Acetat-Gradienten (0,01 M bis 0,5 M, pH 5,2, 400 ml) eluiert. Es werden zwei Sialsäure-positive Fraktionen erhalten, die jeweils bei den Gradientenkonzentrationen 0,42 und 0,46 M eluiert werden. Die zweite Fraktion enthält das Tumor-Glykoprotein und ist im wesentlichen frei von anderen Verunreinigungen. Diese Fraktion wird durch 24 Stunden lange Dialyse gegen destilliertes Wasser bei 0° C entsalzt und durch Lyophilisation konzentriert.

Alternativ wird die Fraktion mit dem Tumor-spezifischen Glykoprotein, wie sie von der DEAE-Sephadex-A-25-Säule erhalten wird, einer Gel-isoelektrischen Fokussierung in einem pH 3,5 bis 7,0 Ampholin-Gradienten mit Hilfe eines LKB-Multiphorgerätes von LKB Instruments, Inc., unterworfen. Kontaminierende saure Glykoproteine weisen isoelektrische Punkte von 3,5 bis 3,8 auf und werden deutlich von dem Tumor-spezifischen Glykoprotein getrennt, das einen isoelektrischen Punkt bei 4,4 (4,2 bis 4,6) besitzt. Nach demselben Prinzip kann präparativ gearbeitet werden, indem eine 110 ml Ämpholin-Säule (LKB) und der oben beschriebene pH-Gradient verwendet wird. Der Bereich zwischen pH 4,2 und 4,6 wird gesammelt, gegen destilliertes Wasser dialysiert und durch Lyophilisation konzentriert. Das Produkt kann in 0,01 M Natrium- oder Kaliumchlorid, das 0,005 M Phosphatpuffer, pH 6,5 enthält, gelöst werden.

Eine letzte Reinigung sowie eine Prüfung auf Verunreinigungen kann durch Affinitätschromatographie des Glykoproteins auf einer Weizenkeim-Agglutinin-Sepharosesäule erreicht werden.

Die Glykoproteinlösung (in Natriumchlorid/Phosphat 0,01 M/0,005 M pH 6,5) wird auf eine 1 X 10 cm Säule mit Sepharose 4 B, das mit Weizenkeim-Agglutinin konjugiert ist, und die mit der gleichen Lösung äquilibriert wurde, gegeben. Die Säule wird mit 3 bis 5 Volumen des äquilibrierenden Puffers gewaschen (von dem Tumor-Glykoprotein sollte dabei nichts von der Säule eluiert werden). Das Tumor-Glykoprotein kann

mit einem scharfen, symmetrischen Peak mit 0,01 M N-Acetylglucosamin eluiert werden. Der Zucker wird durch Dialyse gegen destilliertes Wasser entfernt und das Glykoprotein durch Lyophilisation konzentriert.

B. Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese
Lösung A wird durch Vermischen von 0,24 g Acrylamid (zweimal aus Aceton umkristallisiert) mit 0,73 g Ν,Ν'-Methylenbisacrylamid und 100 ml Wasser hergestellt. Lösung B bereitet man durch Auflösen von 150 mg Kalium- oder Ammoniumpersulfat in 100 ml Wasser. Lösung C enthält 7,7 g NaH₂PO₄ · H₂0,38,6 g Na₂HPO₄ ■ 7H₂O,4gNatriumdodecylsulfatund 1,15ml Ν,Ν,Ν',Ν'-Tetramethyläthylendiamin pro Liter. Das Gel wird hergestellt durch Mischen von einem Teil der

Lösung A mit zwei Teilen der Lösung B und einem Teil der Lösung C. Das Gemisch wird sofort in ein 5 x 75 mm Gel-Röhrchen mit einer Höhe von 55 mm gegeben. Das Gel wird 10 mm mit H₂O überschichtetund das auf diese Weise hergestellte Röhrchen eine Stunde lang bei

25° C stehengelassen. Das Röhrchen wird daraufhin in ein Reservoir eingegeben. Eine Probe, 10 bis 25 μΐ, die 5 bis 20 ^g Glykoprotein enthält, wird auf das obere Ende der Gelöberfläche überschichtet und ein Elektrophoreselauf bei 70 Vzwei Stunden lang durchgeführt. Das Gel wird herausgenommen und mit 10%iger Trichloressigsäure 3 Min. lang fixiert und dann 0,3%igem Coomassie Brilliantblau R in 10% Essigsäure/45% Methanol/45% H₂O zwei Stunden lang bei 40° C gefärbt. Das Material wird daraufhin mit 7% Essigsäure/30% Methanol/63%

Wasser fünfmal zwei Stunden lang bei 40° C (oder bei 25° C entsprechend langer) entfärbt. Die Färbemethode für Glykoprotein entspricht der von Zacharius et al, Anal. Biochem., 30,148 (1969), beschriebenen.

C. Bestimmung von Sialsäure- (NANA) und

Protein-Spiegel in den Perchlorsäure-löslichen
Glykoproteinfrakttonen von Krebs- bzw.
normalen Patienten .

Es wurden Serumproben gesammelt von 30 Krebspatienten (einschließlich Brust-, Lungen-, Dickdarm-, Lymphom- und Melanomkrebs) sowie von 29 normalen, als Kontrolle dienenden Personen. Die Serumprobe jedes Patienten sowie die Kontrollproben wurden mit Perchlorsäure gemischt, die lösliche Fraktion nach Entfernung des Niederschlages gewonnen, und diese lösliche Fraktion neutralisiert, wie es im vorangehenden Beispiel 1 beschrieben wird. Die neutralisierte Perchlorsäure-iöshche Fraktion wird auf Protein nach der Methode von Lowry et al und auf Sialsäure nach dem

so direkten Ehrlich-Verfahren analysiert.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 1 bis 4 aufgeführt.

F i g. 1 zeigt die in der Perchlorsäure-löslichen Fraktion gefundene Proteinmenge (mg/ml) sowohl der normalen als auch der Krebsproben. Der durchschnittliche Proteingehalt für Normalpersonen beträgt 0,35 mg/ml und der durchschnittliche Proteingehalt für Krebspatienten 0,79 mg/ml. Der Unterschied ist signifikant mit einem Wert von weniger als 0,001 (weniger als 1 Chance in 1000, daß es sich dabei um einen Zufall handelt).

F i g. 2 zeigt die Menge (mg/ml) an gefundener Sialsäure (NANA) in der Perchlorsäure-löslicher Fraktion der Proben von den Normalpersonen sowie den Krebspatienten. Der durchschnittliche Sialsäuregehalt für Normalpersonen betrug 0,034 gegenüber dem Durchschnittswert für Krebspatienten mit 0,162 (α « 0,001). F i g. 3 zeigt wiederum die Daten von F i g. 2₄ indem sie den Bereich des Sialsäuregehaltes sowohl bei Nor-

malpersonen als auch bei Krebspatienten und einen Vergleich derselben wiedergibt.

F i g. 4 zeigt den Bereich des Sialsäuregehaltes von Normalpersonen und Personen mit Brustkrebs.

D. Bestimmung des Sialsäure-(NANA) und

Proteinspiegels in Perchlorsäure-löslichen Glykoproteinfraktionen von Krebs- und Normalpatienten

Es wurde eine zweite Serie mit 311 Individuen unter ι ο Anwendung eines unsichtbaren, kontrollierten Codesystems durchgeführt. Die Personengruppe schloß solche mit festen und Bluttumoren (Leukämie) ein. Die Gruppe der Krebspatienten umfaßte die folgenden Krebstypen: Lymphom-, Brust-, Darm-, Melanom-, Sarkorn-, Testikular-, Rhabdomyosarkom-, Lungen-, Nieren- und Cervilcalkrebs. Eine Anzahl der untersuchten Personen litt an einen großen Bereich umfassenden, nicht-bösartigen Krankheiten oder Zuständen, einschließlich: Schwangerschaft, Geschwüre, Asthma, 2c Infektionskrankheiten, Trauma, Herzbeschwerden. Andere der Individuen stellten gesunde Normalpersonen dar. Die Serumproben von sämtlichen der 311 Personen wurden, wie im Beispiel 3 beschrieben, behandelt und analysiert.

Basierend auf den in Beispiel 3 erhaltenen Daten, wurden Bereiche fur Normalspiegel an Sialsäure und Protein in der Perchlorsäure-löslichen Fraktion ermittelt. Es wurden Bereiche aufgestellt für »möglichen Tumor«: Sialsäure über 0,065 mg/ml und Protein über 0,35 mg/ml. Proben, die über diesem Bereich liegen, wurden als möglicher Tumor diagnostiziert. Proben mit einem Sialsäuregehalt von über 0,080 mg/ml und einem Proteinspiegel über 0,4 mg/ml wurden als sehr wahrscheinlicher Tumor diagnostiziert.

Die Ergebnisse der Diagnosen, die sich auf den Sialsäure- und Proteingehalt beziehen, sind folgende:

Prozent korrekt diagnostizierte maligne Krankheit : 83%, mit einer 95%igen Genauigkeit, basierend auf den oben angegebenen sehr wahrscheinlichen Gehalten. Es wird daraufhingewiesen, daß eine Reihe von Patienten mit Krebs eine Chemotherapie oder Bestrahlungsbehandlung erhielten. Die Gesamtzahl in dieser Gruppe war zu niedrig, um sicherzustellen, daß eine der letztgenannten einen direkten Effekt auf die NANA-Gehalte im Serum oder die Anwesenheit von TSGP hatten. Der Prozentsatz an »falschen« Positiven betrug 12%.

Die falsche positive Gruppe wurde desweiteren unter- $0 sucht, indem die Serumproben der Patienten einer Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese, wie in Beispiel 2 beschrieben, unterworfen wurden.

Das Tumor-spezifische Glykoprotein wurde in keinem dieser untersuchten Proben gefunden, einschließ- lieh den asthmatisch nicht-malignen Kranken.

E. Radioimmuno-Bestimmung zum Nachweis des Tumor-spezifischen Glykoproteins

Unter Verwendung ausreichender Mengen an Mate· rial, das von menschlichen Patienten mit breitem Erkrankungsbereich und hohen Glykoproteingehalten erhalten wurde, kann das Tumor-spezifische Glykoprotein durch Kombination einer Reihe von Methoden gereinigt werden, einschließlich Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, isoelektrische Fokussierung und andere, und ein Antikörper zu diesem Glykoprotein entwickelt werden unter Anwendung

40 einer Reihe von immunologischen Methoden. Anfangs werden Kaninchen, Meerschweinchen oder Hamster als Wirtstiere für die Entwicklung eines Antikörpers erster Stufe verwendet. Obwohl dies geeignet ist, mag es wünschenswert sein, das Tumor-spezifische Glykoprotein in an sich bekannter Weise durch Modifikation der Sialsäure, z. B. durch Reaktion mit Aminen oder Hydraziden nach der Perjodatbehandlung oder durch partielle Entfernung oder Hydrolyse der Sialsäure (unter Verwendung von Sialidase aus einer Anzahl von Quellenvibrio cholera, hemophilus influenzae, clostridium species, diploccocus pneumoniae u. a.) zu modifizieren, um darüber hinaus Kohlenhydrat-Gruppierungen freizulegen, die immunologisch reaktionsfähiger sein können.

Nachdem der Antikörper zu dem Tumor-spezifischen Glykoprotein in einem geeigneten Wirtstier erhalten worden ist, werden Antikörper zu diesem durch Injektion der Globulinfarktion des Wirts in eine Ziege hergestellt. Auf diese Weise wird z. B. Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper erhalten, der mit Radiojod oder durch andere geeignete Methoden radioaktiv markiert wird. Alternativ kann TSGP radioaktiv mit ¹²⁵I oder ³H nach R. O. Hynes, Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 70, 3170 (1973) oder Liao et al, J. Biol Chem. 248, 8247 (1973) markiert werden. Auf diese Weise erhält man einen radioimmunologischen Nachweis zur Bestimmung geringerer Mengen an Glykoprotein mit Hilfe von hochspezifischen immunologischen Methoden. Auf diese Weise erhält man eine Empfindlichkeit, die 100 bis 10 000 -mal größer ist als die Empfindlichkeit, die mit den rein-chemischen Verfahren erreicht wird.

F. Antikörperproduktion

Gereinigtes Tumor-spezifisches Glykoprotein, (0,5 mg in 1 ml 0,15 M NaCI) wird mit einem geeigneten Agens (Freunds-Adjuvanz) vermischt und in ein geeignetes Tier injiziert. Die Injektion kann erfolgen: subkutan, intramuskulär (größere Volumen, 3 bis 4 x) iu die Fußsohle (foot pad) oder durch entsprechende Kombination. Auf diese Weise können Kaninchen, Meerschweinchen, Pferde und Ziegen behandelt werden. Bei Kaninchen würde sich die Injektion in wöchentlichen Abständen über eine Periode von 6 Wochen wiederholen, worauf von dem Kaninchen Blut abgenommen und das Serum hergestellt wird. Dieses Serum ist ein nichtabsorbiertes TSGP- (Tumor-spezifisches Glykoprotein) Serum. Dies kann dann mit Hilfe eines normalen Serums absorbiert und ein sich bildender Niederschlag abgetrennt werden. Der Überstand wird den Antikörper, spezifisch für TSGP, enthalten.

G. Modifikation von funktioneilen Gruppen am TSGP

Man kann eine selektive struktuelle Modifizierung des Tumor-spezifischen Glykoproteins durchführen, um seine immunologischen Eigenschaften zu verstärken und um einen Mechanismus zu schaffen für das Binden von spezifischen funktionellen Gruppen. Die TSGP-Probe wird in einer Konzentration von 1 mg/ml in 0,1 M Acetatpuffer, pH 5,0 (Natrium oder Kalium) hergestellt. Diese Lösung wird mit einm äquivalenten Volumen einer Lösung vermischt, die 2 bis 4 μΜοΙ Natriummetaperjodat im gleichen Puffer enthält. Das Gemisch läßt man 30 Min. lang bei 0° C stehen und zerstört das restliche Perjodat durch Zugabe von 5 μΜοΙ Natriumarsenit. Das modifizierte TSGP kann nun mit einem der verschiedenen Amine oder Hydrazide, wie von K. Itaya et al, Biochem. Biophys., Res. Comm. 64,

1028 (1975) beschrieben, umgesetzt werden. Dieses Verfahren ändert spezifisch die Sialsäuregrupierungen auf dem Molekül und erlaubt ihre Umwandlung zu einer immunologisch stärker responsiven Gruppierung.

Das derivatisierte TSGP kann dann, wie oben beschrieben, für die Antikörper-Herstellung verwendet werden.

H. Hywdrolyse von Sialsäuregruppierungen
am TSGP

Im Handel erhältliche Sialidase aus Vibrio cholerae oder Clostridiumperfingens wird mittels Affinitätschromatographie [s. P. Cuatrecasas, Biochem. Biophys. Res, Comm., 38,947 (1970)] gereinigt. Das TSGP wird in einer Konzentration von 1 bis 2 mg/ml in pH 5,0 Acetatpuffer (Kalium), der 2 mM Calciumacetat enthält, hergestellt. Diese Lösung wird mit einer Lösung vermischt, die 50 Millieinheiten gereinigter Sialidase im gleichen Puffer enthält. Das Gemisch wird 18 Stunden (12 bis 24 Stunden) bei 37° C inkubiert. Das modifizierte TSGP wird von der frei gewordenen Sialsäure durch Chromatographie auf einer vernetzten Dextrangelsäure (1 X 60 cm) in pH 5,0 Acetatpuffer (z. B. Sephadex G-50, das eine Ausschlußgrenze des Molekulargewichtes von etwa 50 000 und eine Teilchengröße von 30 bis 100 Mikron besitzt) abgetrennt. Das modifizierte TSGP erscheint im Ausschlußvolumen (erster Proteinpeak). Nach Dialyse gegen destilliertes Wasser (24 Stunden) und Konzentrierung durch Lyophilisation kann das Material direkt für die Antikörper-Produktion, wie oben beschrieben, verwendet werden,

Für die in G und H beschriebenen Derivate wird kein Schutz beansprucht.

Radioimmuno-Bestimmung

Verschiedene Arten von Radioimmuno-Bestimmungsmethoden können zum Nachweis von TSGP im Serum angewandt werden. Typische Beispiele stellen die Methoden der direkten Kompetition, der Vorbindung und der Doppel-Antikörper-Bindung dar und werden nachfolgend beschrieben.

Bei der Methode der direkten Kompetition verwendet man TSGP, radioaktiv markiertes TSGP (³H oder ¹²⁵I-Material) und TSGP-Antikörper (z. B. von Kaninchen). Man stellt eine Standard-Titrationskurve auf, indem eine Reihe von bekannten TSGP-Konzentrationen in eine Anzahl von Reagenzgläser gegeben wird, die Aliquot des Perchlorsäure-Uberstandes von normalem Serum enthalten, wobei dieses äquivalent dem zu analysierenden Serumvolumen ist (typischerweise 1 bis 5 ml). Dieses Gemisch wird in 0,1 M Natriumkaliumphosphatpuffer, ph 7,2, hergestellt. Daraufhin wird ein Aliquot eines TSGP-Antiserums in jedes Reagenzglas gegeben, und zwar in ausreichender Menge, um mit dem gesamten vorliegenden TSGP im Reagenzglas mit der höchsten Konzentration zu reagieren. Dieses Gemisch wird 16 Stunden lang bei 4° C stehengelassen, worauf eine bestimmte Menge (5 X 10³ - 2 x 10⁴ Counts pro Minute) an radiomarkiertem TSGP zugegeben wird. Nach Inkubation für zwei Stunden bei 37° C werden der Antikörper und der Antigen-Antikörper-Komplex durch Zugabe eines geeigneten Agens, wie gesättigtes Ammoniumsulfat oder Ziegenanti-Kaninchenanti-Serum (s. unten) präzipitiert. Freies TSGP bleibt in Lösung und die Menge an radiomarkiertem TSGP in der löslichen Fraktion kann durch Bestimmung der radioaktiven Counts in einem Flüssig-Scintillationspektrometer (³H) oder einem gamma-Scintillationszähler (¹²⁵I) bestimmt werden. Mit Hilfe dieser Daten läßt sich

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60 eine Standard-Titrationskurve aufstellen, aus der die TSGP-Konzentration einer unbekannten Serumprobe, die demselben Verfahren unterworfen wurde, abgeleitet werden kann.

Die radioimmunologische Methode der Vorbindung geht davon aus, daß der TSGP-Antikörper an einen unlöslichen Matrixträger, wie Sepharose 4B, gekoppelt wird, wodurch ein wiederverwendbarer gebundener, Partikel-Antikörper gebildet wird (AB-Sepharose). Diese Präparation wird dann mit bekannten Mengen an TSGP und radiomarkiertem TSGP wie oben beschrieben inkubiert und eine Standard-Titrationskurve aufgestellt. Der TSGP-Antikörper-Sepharose-Komplex kann durch Filtration und Waschen mit 0,15 M NaCl, um mechanisch eingeschlossenes Material zu entfernen, wiedergewonnen werden. Das Eluieren des gebundenen TSGP kann (mit 10"³M KOH oder einem geeigneten Puffer) ohne Zerstörung der AB-Sepharose (wodurch sich diese wiederverwenden läßt) erreicht werden. Die Radioaktivität der eluierten TSGP-Fraktion wird bestimmt und aufgrund dieser Daten eine Standard-Titrationskurve wie oben aufgestellt. Zur Durchführung der radioimmunologischen Bestimmung wird die auf TSGP zu untersuchende Testprobe dann mit dem markierten Antigen und dem Antikörper inkubiert und die Radioaktivität der eluierten Fraktion, wie oben beschrieben, bestimmt.

Anstelle von Sepharose als Träger, kann der Antikörper an Kunststoffoberflächen, wie Scheiben oder Reagenzgläser in der von Catt, Science, 158, (1967) S. 1570 oder US-PS 36 46 346 beschriebenen Weise gebunden werden, wobei die in den genannten Druckschriften beschriebenen Verfahren angewandt werden können.

Bei der Doppel-Antikörper-Methode ist es erforderlich, daß ein Antikörper zum TSGP-Antikörper (z. B. Ziegenanti-Kaninchen) hergestellt wird. Dies dient dazu, um den TSGP-TSGP-Antikörper-Komplex zu präzipitieren, wobei Spiegel von TSGP-Antikörper verwendet werden, die weit unter den oben beschriebenen liegen. Die Standardkurven werden auf ähnliche Weise (direkte Kompetition) hergestellt, mit der Ausnahme, daß ein Zehntel bis ein Hundertstel der Mengen an TSGP-Antikörper eingesetzt werden. Die Fällung des TSGP-Antikörper-Komplexes wird durch Zugabe eines zweiten (Ziegen)Antikörpers und Inkubation für zwei Stunden bei 4° C durchgeführt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugation abgetrennt, mit Salzlösung gewaschen und dessen Radioaktivität bestimmt.

Anstelle der Radiomarkierung von TSGP kann der TSGP-Antikörper markiert werden und die in einer Versuchsprobe vorliegende Menge an TSGP durch Inkubation und Bestimmung der Radioaktivität der gebundenen und nicht-gebundenen Fraktionen bestimmt werden. Der markierte Antikörper kann auf eine feste Oberfläche oder auf geeignete Trägerteilchen aufgebracht (coated) werden, und dient als Reagenz, das mit TSGP-enthaltenden Testproben in Kontakt gebracht wird.

Die vorangehend beschriebenen Verfahren dienen dazu, um mittels radioimmunologischer Bestimmung sehr geringe Mengen von TSGP mit hoher Spezifität nachzuweisen. Dementsprechend kann eine frühzeitige Identifizierung der Anwesenheit von malignen Herden möglich gemacht werden, die auf routinemäßig durchgeführte radioimmunoiogtsche Bestimmungs-Analysen von Serumproben basiert. Das Auftreten von TSGP sollte als ein Signal für die Möglichkeit eines sich bildenden Tumors und der Notwendigkeit, für weitere diagnostische Untersuchungen dienen.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Tumor-spezifisches, aus dem Blutserum von krebs-infizierten menschlichen Patienten isolierbares Glykoprotein, gekennzeichnet durch,

a) die Löslichkeit in 0,6 M Perchlorsäure,

b) einen Sialinsäuregehalt von 30 Gew.-% bezogen auf das Gesamtgewicht von Glucosamin, Galactosamin und Sialinsäure,

c) einen Pronase-resjstenten Kern mit einem Molekulargewicht im Bereich von 10 000 bis 15 000,

d) die Affinität für Weizenkeim-Agglutinin,

e) die Fähigkeit von DEAE-Sephadex A-25 mit 0,4 M Pyridinacetatpuffer pH 5,2 eluiert zu werden,

f) Einschluß aufSephadexG-150 in 0,1 MPyridinacetat-Puffer pH 5,2,

g) ein Molekulargewicht im Bereich von 50 000 bis 70 000, bestimmt durch Elektrophorese in 6% Polyacrylamidgel in Gegenwart von 0,1% Natriumdodecylsulfat,

h) einen isoelektrischen Punkt im Bereich von 4,2

bis 4,6, das dadurch erhältlich ist, daß man
i) Blutseren von einem Tumor-Patienten mit Perchlorsäure öder Trichloressigsäure mischt,
j) die unlösliche Fraktion abtrennt,
k) die säurelösliche Fraktion neutralisiert,
1) das bei der Neutralisation gebildete Salz abtrennt,

m) den löslichen Anteil dialysiert und
n) den dialysierten löslichen Anteil konzentriert.