DE3003301C2

DE3003301C2 - Verfahren zur Bestimmung von tumorassoziierten, glykosidische Bindungen enthaltenden Substanzen (TAGS) in einer Körperflüssigkeitsprobe und Reagenz zur Durchführung des Verfahrens

Info

Publication number: DE3003301C2
Application number: DE3003301A
Authority: DE
Inventors: Masakazu Takasaki Gunma Adachi
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1979-01-30
Filing date: 1980-01-30
Publication date: 1983-12-01
Also published as: ES488747A0; IT8047743A0; US4389392A; IT8047743A1; SE451508B; DE3003301A1; NL8000536A; IT1165552B; SE8000705L; FR2461256B1; FR2461256A1; DK36980A; ES8102679A1; GB2043890A; CH645728A5; GB2043890B

Description

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Die Erfindung betrifft die Bestimmung von tumorassoziierten, glykosidische Bindungen enthaltenden Substanzen, z. B. Glykoproteide oder Glykolipide, (nachfolgend TAGS genannt) in einer Körperflüssigkeitsprobe.

Die Bestimmung der Menge von spezifischen Glykoproteiden in Körperflüssigkeitsproben von Krebskranken ist bekannt. Bei diesem Verfahren macht man von der Antigenität hauptsächlich des Proteinteils von Glykoproteiden Gebrauch. Zum Beispiel bestimmt man öti-Foetoproteinmengen und die Mengen an krazinoembryonalem Antigen zur Bestimmung von primären Hepatomen und von Krebs der Verdauungsorgane, insbesondere Rektumkrebs und dergleichen (siehe Igaku no Ayumi, Bd. 106, Nr. 5, Fifth Saturday Special Issue. S. 235-250 (1978)). Diese Verfahren sind jedoch nicht befriedigend, weil sie nur für bestimmte Krebs- und Tumortypen anwendbar sind.

Aus DE-OS 28 06 146 ist der Nachweis von tumorspezifischen Glykoproteiden für die Erkennung von tumorigen Krebsen bekannt, wobei die dort zu bestimmenden Glykoproteide (abgekürzt als TSGP bezeichnet) einen Sialinsäuregehalt von 30 Gew.-% aufweisen. TSGP hat eine Affinität zu konjugiertem Weizenkeimagglutinin, und diese Affinität geht bei der Behandlung mit Sialidase verloren.

Die dortige diagnostische Nachweismethode beruht auf den bestimmten Strukturmerkmalen des Glykoproteids (TSGP), nämlich u. a. auf dem hohen Sialsäuregehalt Die Bestimmung wird vorgenommen, indem man den Gehalt an N-Acetylneuraminsäure (Sialsäure) bestimmt Der hohe Sialsäuregehalt des TSGP ist somit für das Nachweisverfahren wesentlich. Die Spezifität bei der Bestimmung von Sialsäure im Blut von tumorverdächtigen Patienten ist jedoch beschränkt Denn Sialsäure bildet sich auch bei einer Reihe von Entzündungsvorgängen, die keineswegs krebs- bzw. tumorartig sind.

Aufgabe der ErPndung ist es, ein einfaches, billiges und quantitatives Verfahren zur Bestimmung von TAGS-N iveaus in Körperflüssigkeiten zu zeigen.

Diese Aufgabe wird durch das Verfahren gemäß Patentanspruch 1 gelöst

Im Nachfolgenden wird die Erfindung anhand der Zeichnung näher erläutert

F i g. 1 ist eine grafische Darstellung der Menge an TAGS, bestimmt gemäß Beispiel l.und

F i g. 2 ist eine grafische Darstellung der TAGS-Menge, bestimmt gemäß Beispiel 2.

Es können verschiedene Körperflüssigkeiten verwendet werden, z. B. Blut, Gewebeflüssigkeiten, Lymphe, Hydrotorax, Axcites, amniotische Flüssigkeiten, Magensaft, Urin, Pankreassaft cerebrospinale Flüssigkeiten oder Speichel. Besonders bevorzugt, insbesondere in Form von Serum oder Plasma, ist Blut.

Erfindungsgemäß kann die Bestimmung von TAGS-Niveaus in einer Körperflüssigkeitsprobe entweder dadurch durchgeführt werden, daß man TAGS aus der Körperflüssigkeit durch Umsetzung mit dem Lectin unter Bildung eines TAGS-Lectin-Komplexes isoliert und daß man die Menge des TAGS-Lectin-Komplexes oder an nicht-umgesetztem Lectin nach dessen Abtrennung mißt oder indem man ein markiertes Lectin direkt einer Körperflüssigkeitsprobe zugibt unter Bildung eines markierten TAGS-Lectin-Komplexes, worauf man den markierten TAGS-Lectin-Komplex oder das nicht-umgesetzte markierte Lectin abtrennt und dessen Menge bestimmt.

Zum Abtrennen der TAGS-Fraktion aus der Körperflüssigkeitsprobe können übliche Extraktions- oder Trennverfahren für Glykoproteide enthaltende Substanzen angewendet werden, z. B. Aussalzen, Ausfällen, Lösungsmittelextraktion, Zentrifugieren, Dialyse, Molekularsiebe oder enzymatische Inaktivierung oder eine Kombination von einem oder mehreren dieser Verfahren. Zum Beispiel kann man eine TAGS-Fraktion durch Zugabe einer die Ausfällung oder die Denaturierung bewirkende Menge von Sulfosalicylsäure.Trichloressigsäure oder Zinksulfat zu Blutserum oder -plasma oder durch Erhitzen von Blutserum oder-plasma unter Ausfällung von Albumin und lmmunoglobulin gewinnen, worauf man die ausgefällten Proteine durch Filtrieren abtrennt und das Filtrat dialysiert.

Wendet man ein markiertes Lectin an, so können Körperflüssigkeiten, die nicht Blut sind, gesammelt und als Testprobe (nachfolgend als Probe bezeichnet) verwendet werden. Vorzugsweise gibt man jedoch ein Protein mit einem niedrigen Zuckergehalt, wie Rinderserumalbumin (BSA) und dergleichen als Schutzprotein zu, um eine Denaturierung der Probe zu vermeiden und gleichzeitig die Umsetzung mit Lectin zu beschleunigen.

Insbesondere gibt man vorzugsweise eine ausreichende Menge des Schutzproteins zu der Probe, nachdem man Albumine und Immunoglobuline aus der Probe entfernt ha», weil dies die Bestimmung unter kontrollierteren Bedingungen ermöglicht

Bei der Verwendung von Blutproben kann man als Probe Blutserum, das durch übliche Biutserum-Sanunelmethoden gewonnen wurde, oder Blutplasma, das durch übliche Bluiplasma-Sammelmethoden gewonnen wurde, unter Venvendung eines Antikoagulationsmittels, wie Heparin, EDTA oder Zitronensäure, wobei man vorzugsweise Blutplasma, das unter Verwendung von Heparin als Antikoagulationsmittel gesammelt wurde, verwendet Die Proben können gegebenenfalls, sofern erwünscht, mit Wasser oder geeigneten wäßrigen Pufferlösungen verdünnt werden, z. B. in solchen Fällen, in denen das TAGS-Niveau verhältnismäßig hoch ist, wie in Asciten.

Erfindungsgemäß werden solche Lectine, die sich spezifisch mit Galactose-^ 1 - 3 oder ,3 1 - 4)-N-Acetylglucosamin binden, verwendet z. B. Erdnußlectin oder Ricinuslectin. Solche Lectine sind bekannt aus J. B. C, 250, 8518-8523 (1975); Biochem. Biophys. Res. Comm. 62, 144 (1975); Z. Immunitaetsforch., 138, 423-433 (1969); Br. J. Exp. Pathol. 27, 228-236 (1946); Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 75, Nr. 5, S. 2215-2219 (1978); Biochemistry 13,196-204(1974).

Substanzen, die zum Markieren der Lectine verwendet werden können, um diese durch Radiometrie, Fluorimetrie oder Kolorimetrie und dergleichen nachweisbar zu machen, sind Enzyme, fluoreszierende Substanzen und radioaktive Substanzen. Geeignete Enzyme sind z.B. Glukoamylase, Glukoseoxidase, Peroxidase, Alkaliphosphatase und Hämoctapeptide und deren aktive Fragmente. Beispiele für geeignete fluoreszierende Substanzen sind Fluoreszein, Fluoreszeinisothioeyanat, Rhodamin und Dansylchlorid (5-Dimethylamino-1-naphthalinsulfonylchlorid) Beispiele für geeignete radioaktive Substanzen sind radioaktives Jod und Tritium. Um Lectine mit den vorerwähnten Markierungssubstanzen zu markieren, können alle üblichen Methoden zum Markieren von Proteinen, wie Antigenen und Antikörpern, mit Enzymen, Fluoreszierungsmittel und radioaktive Substanzen verwendet werden. Beispielsweise kann man Lectine mit radioaktiven Isotopen nach dem in »Radioimmunoassay«, S. 45-56 (1978), veröffentlicht von der Asakura Publishing Co., Tokyo, beschriebenen Verfahren markieren.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden markierte oder unmarkierte Lectine vorzugsweise in Mischung mit geeigneten Lösungsmitteln verwendet. Alle Lösungsmittel, welche markierte oder nicht-markierte Lectine nicht denaturieren, z. B. physiologische Kochsalzlösung, Wasser, 0,1 m Tris-HCl-Pufferlösung (pH etwa 7,5) oder 0,1 m Phosphatpufferlösung (pH etwa 7,4), können verwendet werden. Die Menge des in dem Lösungsmittel oder Verdünnungsmittel enthaltenen Lectins kann je nach den Agglutinationswerten (die durch die End- oder Maximalverdünnung von Serienzweifachverdünnten-Proben definiert wird), der Art der Markierung oder der nachzuweisenden Substanzen gewählt werden und liegt im allgemeinen bei etwa 0,01 bis etwa 100 μ§/πιΙ, vorzugsweise 0,03 bis 40 μg/ml. Die vorerwähnten markierten oder unmarkierten Lectinlösungen können weiter verdünnt werden.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine vorbestimmte Menge einer TAGS-Fraktion oder einer Körperflüssigkeit per se mit einer gegebenen Menge des Lectins oder des markierten Lectins vermischt, und die erhaltene Mischung läßt man bei etwa 45° C oder darunter, vorzugsweise etwa 4 bis 40⁰C und insbesondere etwa 20 bis 40⁰C, zum Reagieren stehen. Der TAGS-nicht-markiertes oder -markiertes-Lectin-Komplex oder das n?cht-umgesetzte nicht-markierte oder markierte Lectin können von dem Reaktionsgemisch in üblicher Weise abgetrennt werden, z. B. chromatografisch, elektrophoretisch, durch Aussalzen, durch Fraktionieren, Dialyse, Gelfiltration oder durch Absorption oder durch eine Kombination dieser Trennverfahren, oder mittels einer Trennmethode unter Anwendung von Agargel, Agarosegel oder Polyacrylamidgel.

Zur Abtrennung des nicht-umgesetzten markierten oder unmarkierten Lectins aus dem Reaktionsgemisch wird eine geeignete Menge des Fällungsmittels für den TAGS-Lectin-Komplex zu der obigen Reaktionsmischung zugegeben, und der entstandene Komplex kann z.B. durch Zentrifugieren abgetrennt werden, wobei man die nicht-umgesetzte markierte oder nicht-markierte Lectinfraktion als überstehende Flüssigkeit erhält Typische Ausfällmittel sind Polyäthylenglykol, Ammoniumsulfat (bis zur Sättigung) und Rivanol (Acrinol). Die Zentrifugierbedingungen können je nach der Art des verwendeten Ausfällmittels gewählt werden. Wird z. B. Polyäthylenglykol als Fällungsmittel verwendet, so wird die Zentrifugierung vorzugsweise bei etwa 1000 g etwa 30 bis 60 Minuten durchgeführt.

In den Fällen, in denen der TAGS-markiertes oder unmarkiertes Lectin-Komplex von dem nicht-umgesetzten Lectin abgetrennt wird, erfolgt die Abtrennung des Komplexes von dem nicht-umgesetzten Lectin einfach, indem man von dem Unterschied in der Diffusionsgeschwindigkeit des Komplexes und dem nicht-umgesetzten Lectin in Agargel, Agarosegel oder Polyacrylamidgel Gebrauch macht. Gibt man die Reaktionsmischung zu einem Gel in einem Gefäß, so diffundiert nicht-umgesetztes Lectin in das Gel, während der TAGS-Lectin-Komplex auf dem Gel, d. h. außerhalb des Gels verbleibt, ohne daß er eindiffundiert. Deshalb können beide voneinander in üblicher Weise einfach getrennt werden. Hinsichtlich der Zubereitung der Gele liegen keine Beschränkungen vor, und die üblichen Verfahren können für diesen Zweck angewendet werden, z. B. kann man eine bestimmte Menge Agar, Agarose oder Polyacrylamid zu einem Verdünnungsmittel, welches die Proteine nicht denaturiert, geben, beispielsweise destilliertes Wasser, Zitrat oder Tris-HCl-Pufferlösung (pH etwa 7,5) und anschließend unter schwachem Rühren auf 60 bis 8O⁰C zum Zwecke der Auflösung erwärmen und dann die Lösung in ein geeignetes Gefäß, wie ein Reagenzglas, gießen und dort abkühlen lassen, wobei sie wie Gelee erstarrt. Man wählt die Konzentration des Gels in Abhängigkeit von der Dimension (d.h. dem Molekulargewicht, der Stereostruktur und dergleichen) der Markierungssubstanz und des markiertes Lectin-Komplexes. Erfindungsgemäß verwendet man im allgemeinen Gele von etva 0,4 bis 2,0 Gew.-%, vorzugsweise 0,7 bis 1,0 Gew.-%. Erforderlichenfalls kann das gebildete Gel ein Konservierungsmittel enthalten. Die Oberfläche des so hergestellten Gels kann flach oder konkav sein, wobei man die letztere Form bevorzugt, weil die gebildeten Komplexe nicht an den Wandungen des Gefäßes anhaften.

Zum Messen der Menge an restlichem, nicht-markier-

ten Lectin, sind verschiedene Methoden geeignet. Vorzugsweise gibt man jedoch zu den Proben eine Substanz, die in der Lage ist, mit dem Lectin spezifisch unter Agglutination oder Ausfällung zu reagieren, wobei man dann die Änderung visuell oder durch Messen mittels optischer Analyse, z. B. der optischen Dichte, beobachtet. Beispiele für geeignete Lectinagglutinierende Substanzen sind Glykoproteine mit einer Galactose-^ 1 — 3 oder β 1 -*4)-N-acetylglukosamin-Endgruppe, z, B. Kaninchenerythrocyten, Erythrociten von Neuraminidase-behandelten Schafen sowie Sephadex und Glasperlen, die mit den vorerwähnten Glykoproteinen bedeckt s;ind.

In der Praxis kann man das Verfahren in der nachfolgenden Weise anwenden. Die vorerwähnte Reaktionsmischung wird serienmäßig mit jeweils zweifacher Verdünnung mit einem Verdünnungsmittel /.. B. mit 0,15 m Phosphat pufferlösung oder physiologische Kochsalzlösung verdünnt, und Aliquote der Verdünnung werden auf Platten oder Objektträger oder kleine Reagenzgläser gegeben, und jeder Aliquot wird mit einer Substanz, die fähig ist, das Lectin spezifisch unter Rühren zu agglulinieren, vermischt, und die Platten oder anderen Träger, welche die Mischung enthalten, läßt man dann bei 45°C oder weniger, vorzugsweise 4 bis 40°C, während 30 Minuten oder mehr, vorzugsweise 60 bis 90 Minuten, stehen, um die End- oder Maximalverdünnung, bei welcher eine Agglutination noch stattfindet, zu beobachten. Diese Maximalverdünnung wird als Agglutinationswert be- JO zeichnet. Die bei der Erfindung verwendbaren Lectine weisen im wesentlichen den gleichen Agglutinationswert auf.

Bei der Verwendung von markierten Lectinen kann die Bestimmung des TAGS-Niveaus vorgenommen werden, indem man markierte Substanzen für Lectine mißt. Zum Beispiel kann man nach der Trennung von TAGS-Lectin-Komplex und nicht-reagiertem markierten Lectin voneinander die Menge des TAGS-markierten Lectin-Komplexes oder nicht-umgesetztes markier- -w tes Lectin durch Auswahl eines geeigneten Substrates für ein Enzym, welches Kolorimetrisch oder fluorimetrisch analysiert werden kann, bestimmen.

Wird z. B. ein Enzym (wie Peroxidase) zum Markieren des Lectins verwendet, so wird eine vorbestimmte ⁴¹> Menge des Reaktionsgemisches auf die Oberfläche des Gels in einem Reagenzglas getropft und dort bei etwa Raumtemperatur, vorzugsweise bei 4 bis 25°C, 1 bis 48 Stunden stehen gelassen. Dann gibt man eine gegebene Menge eines geeigneten Substrats für das Enzym (z. B. Wasserstoffperoxid) zu dem Reaktionsgemisch, bei dem durch diese Behandlung eine Enzymreaktion bewirkt wird, und stoppt diese dann nach einer geeigneten Zeit ab und mißt die optische Dichte der erhaltenen Mischung, falls erforderlich, unter Verwendung eines ⁵^ Farbstoffs oder Farbbildners (z. B. o-Phenylendiamin). Wird eine fluoreszierende Substanzen zur Markierung des Lectins verwendet, so wird eine vorbestimmte Menge eines Verdünnungsmittels, wie eine Pufferlösung, zu dem Reaktionsgemisch auf dem Gel nach der' w Inkubierung gegeben, und die Intensität der Fluoreszenz der erhaltenen Mischung wird gemessen.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein Reagenz verwendet, das ein sich spezifisch mit Galactose-(j9 1 — 3 oder β 1 -4)-N-Acetylglucos- <v amin-Bindungen bindendes Lectin enthält.

Das Lectinreagenz kann auch einen Stabilisator und/oder ein Konservierungsmittel für das Lectin, wie ein Protein mit niedrigem Zuckergehalt, z. B. Rinderserumalbumin, enthalten. Bevorzugt ist das Pflanzenlcctinreagenz gefriergetrocknet und wird zum Gebrauch mit einem Rekonstituierungsmittel, enthaltend ein auf Wasser aufgebautes oder mit Wasser mischbares Lösungsmittel (pH etwa 6 bis 7,8, vorzugsweise 7 bis 7,2) wiederaufbereitet. Gewünschtenfalls kann das Reagenz auch Puffer zur Aufrechterhaltung eines bestimmten pH-Wertes in dem rekonstituierten Reagenzsystem und Konservierungsmittel und/oder Stabilisatoren, die einen Abbau des Materials vor der Anwendung verhindern, enthalten. Ein pH von etwa 6 bis 7,8, insbesondere ein pH von 7 bis 7,2, kann angewendet werden, um das erfindungsgemäße Verfahren durchzuführen. Das Rekonstituierungsmittel kann vorzugsweise Wasser als Lösungsmittel enthalten und kann z. B. eine physiologische Kochsalzlösung oder Phosphatpufferlösung sein. Ein wassermischbares Lösungsmittel, das die Reaktion nicht beeinträchtigt, kann ebenfalls zugegeben werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ist zur Diagnose aller Krebs- und Tumorarten, wie Magenkrebs, Brustkrebs, Dickdarmkrebs. Rektumkrebs, Eierstockkrebs, Mundhöhlenkrebs, Zungenkrebs, Luftröhrenkrebs, Prostatakrebs, Liposarkom, bösartiges Melanom, bösartiges Lymphom, primäres Magensarkom, Hepatom in frühen oder spaten Stadien anwendbar und deshalb besonders zum Nachweis von Krebs im Frühstadium geeignet. Die Erfindung wird in den Beispielen näher erläutert. Wenn nicht anders angegeben, sind alle Teile oder Prozentsätze auf das Gewicht bezogen.

Beispie! 1

Bestimmung unter Verwendung der
Inhibierungsreaktion von Blutzellenagglutionation

(1) Herstellung der Testprobe

Blut wurde von 7 Patienten mit Magenkrebs. 4 Patienten mit Lungenkrebs, 3 Patien mit Brustkrebs und jeweils 1 Patienten mit Darmkrebs. Rektumkrebs. Eierstockkrebs, Mundhöhlenkrebs, Zungenkrebs, Luftröhrenkrebs, Gebärmutterkrebs, Prostatakrebs, bösarti-

, _m K4_ni_nnnm 1 in^cor-Lf-im h^cartiapm l.vmnhom und

primärem Magensarkom sowie 7 gesunden Personen gesammelt, und die Plasmaproben wurden in üblicher Weise zubereitet. Zu den Plasmaproben wurde eine 6%ige wäßrige Sulfosalicylsäurelösung anteilartig unter Rühren zugegeben, bis das Verhältnis des Additivs zum Plasma 1 :1 Vol.-% betrug. Nach ausreichendem Rühren wurde die Mischung mit 3000 bis 3500 Upm während 10 Minuten zentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit wurde mit Wasser und 0,15 m Phosphatpufferlösung während 24 Stunden unter Zubereitung der Testprobe dialysiert

(2) Bestimmung

Zu jeder der gemäß (1) erhaltenen Testproben wurde ein gleiches Volumen von 0,15 m Phosphatpufferlösung. in welcher 0.8 .ug/ml Erdnußlectin gelöst waren, gegeben, und die Mischung wurde 30 Minuten unter Rühren bei 20 bis 27°C umgesetzt Das Reaktionsgemisch wurde mit einer 0.15 m Phosphatpufferlösung verdünnt unter Ausbildung einer Zweifach-Verdünnungsserie, von denen jede auf eine V-förmige Platte in ■ einer Menge von 50 μΐ gegeben wurde und mit 50 μΐ Kaninchenerythrocyten (1x10" bis 2XlO⁸ Zellen/ml) unter Rühren vermischt wurde. Nachdem man die Verdünnung bei 37° C während 1 Stunde behandelt

hatte, wurde das Auftreten von Agglutination von Erythrocyten in jeder der Verdünnungen untersucht. Maximale Verdünnungswerte, bei denen noch eine Agglutination auftrat, wurden als Agglutinationswert

Tabelle 1

bezeichnet, und die Bestimmung wurde unter Anwendung dieses Wertes durchgeführt. Die erzielten Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben.

Aggluti

Krankheit

II

III

IV

V

VI

VlI

VIII

IX

X

XI

XII

XIII

XIV

XV

XVl

nations-

zahl

I

Anmerkung:

I gesunde Person II Magenkrebs III Brustkrebs IV Lungenkrebs V Colonkrebs VI Rektumkrebs VII Eierstockkrebs VIII Mundhöhlenkrebs IX Zungenkrebs X Luftröhrenkrebs XI Gebärmutterkrebs XII Prostatakrebs

(3) Beobachtung

Aus den Ergebnissen in Tabelle 1 wird ersichtlich, daß alle gesunden Personen Agglutinationswerte von 128 oder darüber aufwiesen, während von Krebs befallene Patienten wesentlich geringere Agglutinationswerte hatten als die Gesunden: 6 von 7 Patienten mit Magenkrebs zeigten einen Äggiuiionaiionswcri von S oder darunter, während der andere einen solchen von 32 zeigte. Alle 4 Patienten mit Lungenkrebs zeigten einen Agglutinationswert von 1. Hinsichtlich der anderen Krebsarten wiesen nahezu alle Patienten einen Agglutinationswert von 8 oder darunter auf, mit Ausnahme des Agglutinationswertes von 32 der bei einem Patienten mit Uteruskrebs und einem anderen mit primärem Magensarkom festgestellt wurde. Wie schon erwähnt, betrugen die Agglutionationswerte bei Patienten mit bösartigen Tumoren oder Krebs in allen Fällen 32 oder weniger, während gesunde Personen einen solchen von 128 oder darüber aufweisen. Deshalb stellt dieses Verfahren eine wirksame Methode dar, um Niveaus in einer Probe der Körperflüssigkeit außerhalb des Körpers zu bestimmen und kann vorteilhaft zur Diagnose verschiedener bösartiger Tumore oder Krebsarten angewendet werden.

Beispiel 2

Bestimmung unter Verwendung von
Enzym-markiertem Lectin

(1) Aktivierung von Peroxidase

Zu 1 ml einer 03 m wäßrigen Natriumhydrogencarbonatlösung, in welcher 5 mg Peroxidase aus Meerret-

XIII Liposarkom XIV bösartiges Melanom XV bösartiges Lymphom XVI primäres Magensarkom

tich gelöst waren, wurde 0,1 ml einer 0,1 m Fluorodinitrobenzoläthanollösung gegeben, und die Mischung wurde schwach während 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde zu der Mischung 1 ml einer 0,06 m wäßrigen NaJOi-Lösung gegeben, und die Lösung wurde während 30 Minuten schwach bei Raumtemperatur gerührt. Die erhaltene Mischung wurde dann mit ΐ iTll einer 0,1 ϊϊϊ Wäufigcn AiiiyicngiyKöilöSüiig Vcfmischt und 1 Stunde schwach bei Raumtemperatur gerührt, und anschließend wurde die Reaktionsmischung mit 0,01 m Kohlensäure/Natriumhydrogencarbonat-Pufferlösung (pH 9,5) bei 4°C während eines Tages dialysiert unter Erhalt einer aktivierten Peroxidasezubereitung.

(2) Markierung von Lectin i

5 mg Lectin (Erdnußlectin) wurden in 3 ml der gemäß (1) zubereiteten Peroxidasezubereitung gelöst, und die Mischung wurde während 2 bis 3 Stunden unter schwachem Röhren bei Raumtemperatur umgesetzt Nach Zugabe von 5 mg NaBHi zum Reaktionsgemisch ließ man dieses während 3 Stunden bei 4° C stehen, und die erhaltene Lösung wurde mit 0,1 m Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,4) 1 Tag lang dialysiert und anschließend durch Sephadex G 150 Gei-Säulenchromatografie einer Gelfiltration unterworfen (Eluiermittel: 0,1 m Tris-HCl-Pufferlösung, pH 7,4). Die optischen Dichten (OD₂So und OA03) jeder Fraktion wurden gemessen und die Fraktionen, bei denen sich die Peaks von OEhso und OD403 überlappten, wurden gesammelt

(3) Zubereitung von Agarosegel
Agarose wurde in 0,01 m Tris-HCl-Pufferlösung

(pH 7,5) in einer Menge von 1 Vol.-% suspendiert, und die Suspension wurde unter Auflösung auf 70 bis 80⁰C erhitzt. Zu dieser Lösung wurden 0,01 w/w % Thimerosal gegeben, und die erhaltene Lösung wurde in Reagenzgläser in einer Menge von 1 ml/Reagenzglas gegeben und anschließend bei Raumtemperatur stehen gelassen, wobei man 1 w/w % Agarosegel erhielt.

Beispiel 2-1

Polyäthylenglykolmethode

(1) Herstellung der Testprobe

5 ml Blut wurden mittels einer mit Heparin (500 Einheiten) behandelten Blutentnahmevorrichtung jeweils von 25 Krebspatienten, 2 Patienten mit Krankheiten, die anders als Krebs waren, und 23 gesunden Personen entnommen und mit 2000 Upm während 10 Minuten zentrifugiert. Das überstehende Plasma wurde als Testprobe verwendet.

(2) Bestimmung

Die gemäß (1) erhaltenen Testproben wurden in 2 Reagenzgläser in einer Menge von 200 μΙ/Reagenzglas gegeben, und dazu wurden jeweils 50 μΐ der Peroxidasemarkierten Lectin-Zubereitung, enthaltend 3,5 μg/ml Lectin in Tris-HCl-Pufferlösung (pH etwa 7,5), hergestellt gemäß Beispiel 2, gegeben. Nach schwachem ~ Rühren ließ man die Mischung 1 Stunde bei 20 bis 3O⁰C

zur Umsetzung stehen. Dann wurden zu einem der Ji Reagenzgläser 250 μΐ einer Lösung von 8% (w/v)

;p Polyäthylenglykol (Molekulargewicht: 6000) in 0,1 m

ti Tris-HCl-Pufferlösung gegeben, und die Mischung

§ wurde schwach gerührt und stellte die Probe A dar, und

250 μΐ einer 0,1 m Tris-HCl-Pufferlösung wurde zu dem anderen Reagenzglas gegeben, und die Mischung wurde schwach gerührt und bildete dann die Probe B. Beide Proben A und B wurden 30 bis 60 Minuten bei 20 bis 3O⁰C umgesetzt und dann 40 bis 60 Minuten mit 1000 g auf einem Schwingrotor zentrifugiert. 50 μΐ der überstehenden Flüssigkeit wurden gesammelt, und dazu wurden 2 ml einer zuvor hergestellten physiologischen Kochsalzlösung gegeben. Nach ausreichendem Rühren wurde die Mischung mit 500 μΙ einer Substratlösung, enthaltend 0,1 m Zitrat-Pufferlösung. o-Phenylendiamin (Endkonzentration 6 Gew.-%) und 0,1 Gew.-°/o Wasserstoffperoxid vermischt und im Dunklen 30 Minuten bei 20 bis 30⁰C umgesetzt. Die Substratlösung war zuvor hergestellt und vorzugsweise bei 4° C aufbewahrt worden. Anschließend wurde 1 ml einer 2 η Chlorwasserstoffsäure zu dem Reaktionsgemisch gegeben, um die Umsetzung abzubrechen, und die Farbe der Probe wurde spektrofotometrisch, ausgedrückt durch die optische Dichte bei 492 nm, bestimmt.

Die Menge an TAGS-Lectin-Komplex, ausgedrückt als Differenz (c), erhalten durch Abziehen der optischen Dichte (a) von Probe A von der optischen Dichte (b) der Probe B, wurde in Fig. 1 aufgetragen, in welcher das Symbol O für gesunde Personen steht und die Ziffern (I)-(27) folgende Patienten bezeichnen: (1) und (18) Magenkrebs, (2), (6), (9), (16) und (17) Lungenkrebs, (3), (5), (7), (8), (13) Magenkrebs (Frühstadium), (4) und (14) fortgeschrittener Magenkrebs, (10) Herzversagen, (11) Lymphadenitis, (12) Dickdarmkrebs mit Lebermetastasen, (15) Gebärmutterkrebs mit Lungenmetastasen, (19) Hydatidenmole, (20) Dickdarmkrebs, (21) Gebärmutterkrebs, (22) und (26) Eileiterkrebs, (23) Rektalkrebs, (24) Prostatakrebs, (25) Harnröhrenkrebs,(17) Hepatom.
Aus den Ergebnissen, die in F i g. 1 gezeigt werden, ist

ersichtlich, daß die Proben mit C-Werten höher als bei den Proben von gesunden Personen TAG in Mengen enthielten, die höher waren als bei den Proben der gesunden Personen. Daraus läßt sich mit großer Wahrscheinlichkeit ableiten, daß die Personen mit hohen C-Werten Tumor- oder Krebszellen haben.

Beispiel 2-2
Gelfiltrationsmethode

(1) Blut wurde von 14 Krebspatienten und 8 gesunden Personen gesammelt, und die Testproben wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 2 behandelt.

(2) Bestimmung

5 μΙ einer Verdünnung der Testprobe, die gemäß (1) hergestellt worden war und 1O»fach mit H-Lösung. bestehend aus destilliertem Wasser mit darin gelöst 8% Natriumchlorid, 0,4% Kaliumchlorid, 0,05% Natriumhydrogenphosphat, 0,06% Kaliumdihydrogenphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat, 0,05% Magnesiumchlorid, 0,1% Kalziumchlorid und 1% Glukose, verdünnt worden war, wurden mit 50 μΐ der gemäß Beispiel 2 hergestellten Peroxidase-markierten Lectin-Zubereitung, lOOfach verdünnt mit 0,1 m Phosphat-Pufferlösung (pH 7,4) versetzt und auf einem Wasserbad bei 23°C 15 Minuten inkubiert. Die inkubierte Mischung wurde dann vorsichtig auf die Oberfläche eines gemäß Beispiel 2 hergestellten Agarosegels gegeben. Nach Inkubierung des den Gel enthaltenden Reagenzglases auf einem Wasserbad von 23⁰C während 1 Stunde, wurden zu dem Agarosegel 2 ml einer 0,1 m Phophat-Pufferlösung (pH etwa 7,4) gegeben und dabei geruht. Die übersiehende Flüssigkeit wurde unmittelbar darauf in ein sauberes Reagenzglas gegeben zu dem dann 400 μ! der Substratlösung der Peroxidase-Zubereitung gemäß Beispiel 2 gegeben wurden. Nach ausreichendem Rühren ließ man die Mischung 15 Minuten bei Raumtemperatur reagieren. Die Enzymreaktion wurde durch 1 ml 1 η Chlorwasserstoffsäure abgebrochen, und das Reaktionsgemisch wurde in einem Thermomischer odei dergleichen ausreichend gerührt. Die optische Dichte der so behandelten Mischung wurde mit einem Spektrofotometer bei 492 nm gemessen. Als Blindprobe wurde eine Mischung aus 400 ml der Substratlösung und 1 ml einer 1 η Chlorwasserstoffsäure verwendet. Die gemessenen Werte der optischen Dichte wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 2-1 bewertet, und die berechnete Menge von TAG-Lectin wurde in Fig.2 aufgetragen, in welcher das Symbol O für gesunde Personen steht und die Zahlen (1) bis (1) folgende Patienten bedeuten:

(1) Magenkrebs,

(2) Hydatidenmole,

(3) Dickdarmkrebs,

(4) Uteruskrebs,

(5) Eierstockkrebs,

(6) Rektalkrebs,

(7) Prostatakrebs,

(8) Harnröhrenkrebs,

(9) Hepatom und
(1) Brustkrebs.

Aus den in F i g. 2 gezeigten Ergebnissen geht hervor,

daß ein merklicher Unterschied im Niveau von TAG in der Körperflüssigkeit bei gesunden Personen und

Patienten, die unter verschiedenen Krebsarten leiden,

besteht

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Bestimmung von tumorassoziierten, glykosidische Bindungen enthaltenden Substanzen (TAGS) in einer Körperflüssigkeitsprobe, dadurch gekennzeichnet, daß man die TAGS in einer Probe der Körperflüssigkeit mit einem sich spezifisch mit Galactoie-(j3 1 — 3 oder β 1 -♦ 4)-N-Acetylglucosamin-Bindungen bindenden Lectin unter Bildung eines TAGS-Lectinkomplexes umsetzt und die Menge des TAGS-Lectinkomplexes oder an nicht reagiertem Lectin bestimmt.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein markiertes Lectin verwendet.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zu der Körperflüssigkeit ein Schutzprotein gibt

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung bei 4 bis 4O⁰C durchgeführt wird.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Lectin Erdnußlectin oder Ricinuslectin ist.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Menge an nicht-umgesetztem Lectin durch Agglutination des nicht-umgesetzten Lectins bestimmt.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man das nicht-umgesetzte Lectin mit einem Galactose-^ 1 ->· 3 oder β 1 -^J-N-Acetylglucosamin-Endgruppen enthaltendem Glykoprotein oder Sephadex oder Glasperlen, die damit beschichtet sind, agglutiniert wird.

8. Reagenz zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es ein sich spezifisch mit Galactose {β 1 -^ 3 oder β 1 — 4)-N-Acetylglucosamin-Bindungen bindendes Lectin enthält.

9. Reagenz nach Anspruch 8, dadurch gekenn- ao zeichnet, daß das Lectin Erdnußlectin oder Ricinuslectin ist.